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In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, OTS-, MPTMS-, und MPTMS/OTS gemischte SAMs aus der Lösung auf SC-1 chemisch oxidierten Siliziumwafern („SiO2“) zu präparieren. Die Adsorption der OTS oder MPTMS SAMs auf SiO2 wird von zwei konkurrierenden Reaktionen bestimmt, d.h. „Selbstaggregation” in der Ausgangslösung und “Oberflächendehydration” des SiO2 -Substrates. Die beiden Alkylsiloxan-SAMs weisen unterschiedliches Bildungsverhalten auf. Die Reifungsdauer der Ausgangslösung vor der Adsorption wirkt sich signifikant auf die Bildung der OTS SAMs aus, demgegenüber ist bei MPTMS SAMs kein Einfluß zu beobachten. Für OTS SAMs sind große Dendriten oftmals von kleinen Rundinseln umgeben, dagegen für MPTMS SAMs treten prinzipiell nur sporadisch verteilte kleine Rundinseln auf. Die Abwesenheit des Chlor-Signals in XPS-Spektren bestätigt, dass innerhalb der Adsorption die Si-Cl Bindungen der OTS-Moleküle zum größten Teil hydrolysiert werden. Doch für MPTMS SAMs ist in C 1s-Spektren ein Peak bei 286.4 eV, der der unhydrolysierten Si-OCH3 Bindung entspricht, zu beobachten. Die Hydrolysefähigkeit der Si-Cl Bindung des OTS ist erwartungsgemäß stärker als jene der Si-OCH3 Bindung des MPTMS. Diese Tendenz samt dem Unterschied in der Alkylkettenlänge wirkt sich beträchtlich auf die Bildung und die Morphologie der adsorbierten Inseln aus. Bei gleicher Konzentration (5 mM) und Reifungsdauer der Ausgangslösung bilden sich OTS SAMs viel schneller als MPTMS SAMs bei Raumtemperatur. Sie hat auch eine größere Oberflächenbedeckung wegen der seitlichen Vernetzung zur Folge. Diese Beobachtung zeigt eine prognostizierbare kinetische Schwierigkeit zur Präparation der OTS/MPTMS gemischten SAMs durch Koadsorption. Grund hierfür ist, dass die Adsorption voraussichtlich von OTS-Molekülen dominiert wird. Darüber hinaus ist Aggregation zwischen hydrolysierten OTS- und MPTMS-Molekülen nicht ausgeschlossen. Neben der Koadsorption steht in der zweistufigen Adsorption ein weiteres herkömmliches Verfahren zur Verfügung. Das Endprodukt kann nach der Reaktionsreihe der Silane mit „OTS+MPTMS“ oder „MPTMS+OTS“ gemischte SAMs bezeichnet werden. Unter Berücksichtigung der individuellen Oberflächenbedeckung und Morphologie wurde eine Rezeptur aufgestellt, in der die Adsorption jeweils höchstens 30s (für OTS) und 20 min (für MPTMS) dauert. Angesichts der vielfältigen Inselstruktur, d.h. Monoschicht, polymerisierte Bälle, und sogar Multischicht, ist eine Phasenunterscheidung nach der Dicke, z.B. mittels AFM, nicht zu erwarten. Die Existenz der lateralen unvernetzten Si-OH Gruppen der adsorbierten OTS-Inseln könnte die Präparation der homogenen OTS+MPTMS gemischten SAMs erschweren. In diesem Fall ist es fraglich, ob die hydrolysierten MPTMS-Moleküle vollständig wie geplant mit oberflächnahen OH-Gruppen von SiO2 reagieren. Mit einer umgekehrten Reaktionsreihe löst sich das Problem von selbst, da die adsorbierten MPTMS-Inseln hauptsächlich unhydrolysierte seitliche Si-OCH3 Gruppen besitzen. Die morphologische Erkennbarkeit unterstützt die Machbarkeit der Präparation der MPTMS+OTS gemischten SAMs. Die unterschiedlichen Messmodi des AFM, mit denen die Morphologie der OTS SAMs aufgenommen wurde, ergaben deutliche Unterschiede in ihrem Erscheinungsbild. Im Vergleich zum Tappingmodus sind die Grenzen der OTS-Inseln auf Kontaktmodus-Bildern nur undeutlich erkennbar. Die großen Inseln erscheinen nicht so dendritisch. Die Ursache dieser Phänomene könnte am Wassermeniskus zwischen Spitze und Probe liegen, da die Messung nicht in Flüssigkeit, sondern an Luft durchgeführt wurde. Auf LFM-Bildern sind die adsorbierten OTS-Inseln heller als unbedecktes SiO2, während die MPTMS-Inseln dunkler als SiO2 aussehen. Eine ähnliche Auswirkung der Messmodi auf die Morphologie der MPTMS SAMs wurde nicht beobachtet. Durch die Adsorption von 1-Decanthiol lässt sich die Si3N4-AFM-Spitze modifizieren. Eine solche CH3-terminierte Spitze ist hydrophob und verursacht einen gegenteiligen Helligkeitskontrast auf LFM-Bildern der adsorbierten OTS-Inseln.
Diese Arbeit teilt sich in zwei Themenblöcke, deren zentrales Element Borat-Anionen darstellen, die unterschiedlichste Funktionen erfüllen. Durch entsprechende Wahl der Substituenten am Bor können sowohl Anionen mit schwach koordinierenden Eigenschaften erzeugt werden, als auch Borate, die sich zum Einsatz als Ligand in der Koordinationschemie eignen. ...
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die über die 1,´-Position phenylenverbrückten Bis(silolyl)verbindungen 120, 123, 125, 156, 158, 160, 135, 137 und 139, sowie die entsprechenden Phenylsilole 126, 163 und 141 (siehe Schema 4.1) zu synthetisieren und NMR-spektroskopisch, massenspektroskopisch und zum Teil auch durch Kristallstrukturen zu charakterisieren. Weiterhin ist es gelungen eine über die 3,3´-Position verknüpfte phenylenverbrückte Bis(silolyl)verbindung 175, sowie auch die Vorstufe zu einer 2,2´-verknüpften Bis(silolyl)verbindung 177 zu synthetisieren und zweifelsfrei zu charakterisieren.
Ionenkanäle bilden therapeutische Schlüsselstellen für viele Erkrankungen und sind daher vor allem für die pharmakologische und medizinische Forschung von herausragender Bedeutung. Der Forschungsbedarf ist enorm und dementsprechend groß auch die Nachfrage nach elektrophysiologischen Systemen, die eine Analyse von Ionenkanälen und/oder Wirkstoffen im Hochdurchsatz erlauben. Derzeitige Hochdurchsatzsysteme basieren zumeist auf modifizierten Patch-Clamp-Verfahren, weisen aber im Vergleich zu manuellen Patch-Clamp-Systemen noch einige Nachteile auf. In der vorliegenden Arbeit wurde daher im Rahmen eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten BioChancePlus-Projektes eine alternative Methode, die Fakir-Methode, entwickelt und ihre Einsatzmöglichkeit in Hochdurchsatzsystemen evaluiert. Bei der Fakir-Methode werden Zellen in einem inhomogenen, elektrischen Wechselfeld mit Hilfe dielektrophoretischer Kräfte zu Metallnanoelektroden hin beschleunigt, aufgrund ihrer Bewegungsenergie von letzteren penetriert und dadurch elektrisch kontaktiert. Dies ermöglicht die anschließende, intrazelluläre Messung in physiologischer Lösung. Im Vergleich zur Patch-Clamp-Methode hat die Fakir-Methode die Vorteile, dass das Zytoplasma der Zelle erhalten bleibt und dass mit einer geringen Zelldichte gearbeitet werden kann. Auf der anderen Seite polarisiert die Elektrode schnell und die genaue, intrazelluläre Zusammensetzung während der Messung ist nicht bekannt. Für die Realisierung der Fakir-Methode im Experiment wurde eine Mikrofluidikkammer mit austauschbaren Metallmikro- und Metallnanoelektroden- Chips entwickelt, die die mikroskopische Beobachtung des Kontaktierungsprozesses ermöglichte. Die Charakterisierung der Elektroden erfolgte sowohl durch Potentialmessungen als auch mit Hilfe von Impedanzspektroskopie. Um die dielektrophoretische Attraktion von Zellen genauer steuern zu können, wurde zudem ein Amplitudenmodulator entwickelt. Zellen konnten sowohl einzeln, als auch in Gruppen kontaktiert werden. Intrazelluläre Potentialmessungen von HEK293-Zellen, die den blaulichtgesteuerten Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (ChR2) exprimierten, zeigten, dass mit Hilfe der Fakir-Methode von Membranproteinen verursachte Spannungsänderungen gemessen werden können. Beim Fakir-Modell auftretende Schwierigkeiten wurden analysiert und die Ergebnisse genutzt, um ein Konzept für eine hochreproduzierbare Herstellung von Nanoelektroden-Arrays unter Verwendung der 2-Photonenpolymerisations- Technolgie (2PP) zu entwerfen. Für den Einsatz als Biosensoren sind große Zellen besonders geeignet. Eine effektive Vergrößerung von Zellen kann durch die Multi-cell-Elektrofusion erreicht werden. Diese Art der Herstellung von Riesenzellen ist insbesondere deshalb so interessant, weil die Elektrofusion problemlos in ein automatisiertes Mikrofluidiksystem eingebunden werden kann. Neben HEK293-Zellen konnten nach Entwicklung geeigneter Protokolle für die Herstellung von Protoplasten auch Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris zu Riesenzellen elektrofusioniert werden. Solche Riesenzellen wurden im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch charakterisiert. Neben Kapazitätsmessungen zeigten sowohl die Expression von YFP in den Membranen als auch die Verwendung von fluoresceinhaltiger Patch-Clamp- Pipettenlösung, dass es sich bei den Riesenzellen um einheitliche Kompartimente handelte und somit die gesamte Membranfläche für elektrophysiologische Experimente zur Verfügung stand. Vergleichende Patch-Clamp-Messungen von ChR2-exprimierenden Ursprungs- und Riesenzellen ergaben nicht nur, dass das überexprimierte Protein auch nach der Elektrofusion noch funktional war, sondern auch, dass die Expressionsdichte unverändert blieb. Damit bilden elektrofusionierte Riesenzellen weit über ihre Einsatzmöglichkeiten in Hochdurchsatzsystemen hinaus ein vielversprechendes Werkzeug, um zum Beispiel elektrogene Membranproteine mit geringer Stromamplitude nachzuweisen oder in der giant-inside-out- Konfiguration elektrophysiologische Messungen durchzuführen. Lipophile Anionen können eingesetzt werden, um die elektrischen Eigenschaften der Membranen zu verändern und die Zellstabiliät während des Elektromanipulationsprozesses zu verbessern. Daher wurde für vier verschiedene lipophile Anionen die Spannungsabhängigkeit der Erhöhung der spezifischen Membrankapazität in Patch- Clamp-Experimenten mit HEK293-Zellen analysiert.
In den letzten 25 Jahren HIV-Forschung wurden einige Medikamente entwickelt, die in der Lage sind, den Ausbruch der Krankheit AIDS hinauszuzögern. Als Gemeinsamkeit dieser Arzneimittel ist die Interaktion mit regulatorischen Proteinen des HIV-Lebenscyclus zu erwähnen. In den letzten Jahren intensivierte sich jedoch auch die Forschung auf RNA als Angriffsort für Wirkstoffe, da sie in zahlreichen biochemischen Prozessen involviert ist. Aufgrund der vielfältigen Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA bietet sie Bindungsstellen für Proteine, Antibiotika und weitere kleine Moleküle. Die Affinität zwischen RNA und dem Liganden, z.B. einem Peptid, basiert auf Wasserstoffbrücken, Coulombschen Kräften und Stapelwechselwirkungen. Das Konzept dieser Arbeit bestand darin, peptidische RNA-Liganden zu entwickeln, die u.a. aufgrund von Stacking mit den Nucleobasen der RNA eine starke Bindung eingehen. In Anbetracht der Tatsache, dass lediglich vier unterschiedliche natürliche aromatische Aminosäuren existieren, wurden Synthesewege entwickelt, um eine Vielfalt nicht-natürlicher Bausteine zu gewährleisten. In diesem Projekt wurden (L)-Methionin bzw. (L)-Glutaminsäure als chirale Ausgangsverbindungen, in Abhängigkeit von der benötigten Seitenkettenlänge (C2 für Met, C3 für Glu), verwendet. Der Schlüsselschritt in beiden Syntheserouten ist mit der Heck- bzw. Negishi- Kupplung eine Übergangsmetall-katalysierte C-C-Knüpfungsreaktion. Auf beiden Wegen konnten in zehn Stufen Fmoc-geschützte -Aminosäuren dargestellt werden. Diese Bausteine wurden zusammen mit natürlichen Aminosäuren zu peptidischen Bibliotheken aufgebaut, die entweder über kombinatorische oder parallele Festphasensynthese hergestellt wurden. Über homogene Assays wurden die besten RNA-Binder identifiziert. In ersten Experimenten wurden ausgewählte Peptide auf ihre Affinität zum TAR-Element von HIV-1 untersucht. Ein Farbstoff-markiertes Tat-Peptid wurde in dieser Anwendung vom Test- Liganden verdrängt. Alternativ konnte über die Fluoreszenz der Pyren-Peptide eine direkte Bestimmung von Bindungskonstanten erfolgen. Mit dem Tripeptid 172 (IC50 = 900 nM, Kd = 50 nM) konnte eine vielversprechende Verbindung identifiziert werden. In Untersuchungen mit HIV-1-infizierten HeLa-P4- (IC50 = 125 microM) bzw. MT-4-Zellen (EC50 = 46 microM) wurde die antivirale Eigenschaft von 172 bewiesen. Des Weiteren wurden u.a. für das Peptid 172 antimikrobielle Tests gegen B. subtilis (MIC = 22 microM) und S. aureus (MIC = 31 microM) durchgeführt.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Mit den in dieser Arbeit entwickelten und getesteten Nachweismethoden konnte in verschiedenen Marktstudien gezeigt werden, dass sowohl molekularbiologische als auch immunologische Verfahren für den Nachweis von versteckten Allergenen in Lebensmitteln geeignet und auch miteinander vergleichbar sind. Dies wurde in zwei Studien deutlich, in denen beide Methoden sowohl für den Haselnuss- bzw. Erdnussnachweis miteinander verglichen wurden. In beiden Studien wurde eine sehr gute Übereinstimmung der beiden Verfahren gefunden. Nur in Einzelfällen gab zwischen beiden Methoden Abweichungen im Resultat, was aber fast ausschließlich Proben betraf, die einen sehr geringen Anteil (ca. 10 ppm Protein) Haselnuss bzw. Erdnuss enthielten. Damit konnte erstmals im direkten Vergleich gezeigt werden, dass PCR-basierte Methoden für den Allergennachweis in prozessierten Lebensmitteln genauso gut geeignet sind, wie antikörperbasierte Methoden. Allerdings besteht bis zum heutigen Zeitpunkt das Problem solche Anteile korrekt zu quantifizieren, da es an Referenzmaterialien mangelt, die es ermöglichen würden einen Mengenstandard für ein quantitatives Verfahren herzustellen. Momentan sind quantitative Messungen nur exakt möglich, wenn die zu untersuchende Lebensmittelmatrix genau bekannt ist und ein entsprechender Standard generiert werden kann. Trotzdem bieten beide Verfahren die Möglichkeit prozessierte Lebensmittel sehr empfindlich auf allergene Bestandteile zu untersuchen, um somit sicherzustellen dass die aktuellen gesetzlichen Regelungen und Richtlinien für die Etikettierung von Lebensmitteln, wie die EU-Richtlinie 2006/146/EU bzw. die Lebensmittelkennzeichnungsverordnung (LMKV), von den Lebensmittelherstellern eingehalten werden. Weiterhin bieten die etablierten Nachweismethoden den Herstellern die Möglichkeit, ihre Produktion im Hinblick auf potenzielle Kontaminationsrisiken mit allergenen Zutaten zu überprüfen bzw. die Effizienz der verwendeten Reinigungsmethoden einzuschätzen. Dies wurde erstmals im Rahmen an einer Modellstudie in Zusammenarbeit mit einem Aromenhersteller durchgeführt. In dieser Studie sollte die Effizienz von verschiedenen Reinigungsprozeduren hinsichtlich der Kontaminationsgefahr von allergenfreien Nachfolgeprodukten überprüft werden. Es konnte gezeigt werden, dass der verwendete Reinigungsprozess sehr effektiv abläuft und nicht mit Kontaminationen gerechnet werden muss. Diese Studie hat exemplarisch gezeigt, dass es möglich ist, allergenspezifische Nachweismethoden in einem Betrieb einzusetzen, um die Belastung der Produktionsanlage und der hergestellten Produkte mit potenziellen Allergenen zu überwachen. Prinzipiell sollte es also möglich sein allergenspezifische HAACCP Konzepte innerhalb eines Betriebes zu etablieren, um so die Produktsicherheit noch weiter zu verbessern. Abschließend kann man sagen, dass die Entwicklung von allergenspezifischen Nachweismethoden einen wichtigen Beitrag zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit darstellt. Nicht nur dass diese Methoden wichtig sind, um bestehendes Recht zu überwachen, sie sind auch für die Lebensmittelproduzenten ein wichtiges Werkzeug die Qualität ihrer Produkte zu erhöhen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Nanopartikeln als Trägersysteme für nukleosidische Arzneistoffe. Ihr Einsatz verhindert z.B. die Degradierung der Nukleoside und verbessert ihre Aufnahme in Zellen. Die Partikel wurden aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und mittels Glutaraldehyd stabilisiert. Durch die Kopplung von Trastuzumab an die Partikeloberfläche können HER2-überexprimierende Brustkrebszellen spezifisch erreicht werden. Bindet der Antikörper an den HER2-Rezeptor, kommt es zu einer Internalisierung des Ligand-ezeptorkomplexes und an den Liganden gebundene Partikel werden zusammen mit dem Komplex in die Zellen aufgenommen. Die Kopplung von Trastuzumab an die Oberfläche der HSA-Nanopartikel über eine Thioetherbindung war sehr effizient und stabil.Die Stabilität von Partikelsystemen über lange Lagerzeiten kann durch Gefriertrocknung erhöht werden. Zur Gefriertrocknung trastuzumabmodifizierter Partikel wurden Trehalose, Sucrose und Mannitol in Konzentrationen bis 5% als Hilfsstoffe eingesetzt. Trehalose und Sucrose waren bereits in einer Konzentration von 3% in der Lage, die physikochemischen Eigenschaften der Partikel direkt nach der Gefriertrocknung zu erhalten, die Partikel waren aber nicht lagerfähig. Mit Mannitol war dies direkt nach der Gefriertrocknung auch bei einer Konzentration von 5% nicht in gleichem Umfang möglich, die Partikel konnten aber am besten gelagert werden. Als nukleosidische Wirkstoffe wurden In die Matrix von HSA-Nanopartikeln unter anderem Antisenseoligonukleotide (ASOs) eingebettet. Das inkorporierte ASO P12 gehört zur Gruppe der Phosphorothioate (PTOs) und bewirkt eine Reduktion der Polo-like Kinase 1 (Plk1) auf mRNA- und Proteinebene. Plk1 ist wesentlich an der Zellteilung beteiligt und wird in vielen Tumoren überexprimiert, eine Hemmung von Plk1 führt zur Apoptose der Zellen. Damit das PTO eine Wirkung zeigen kann, muss es intrazellulär aus den Partikeln freigesetzt werden. Deshalb wurden die Partikel enzymatisch abgebaut. Die Wiederfindung der PTOs aus der abgebauten Partikelmatrix betrug maximal 30% und war von der Menge des zur Partikelstabilisierung verwendeten Glutaraldehyds abhängig. Je mehr Glutaraldehyd verwendet worden war, desto schlechter war die Wiederfindung. Eventuell werden die PTOs durch Glutaraldehyd inaktiviert, indem es zu einer Quervernetzung untereinander oder mit Albuminmolekülen kommt. Dennoch konnte in Brustkrebszelllinien eine biologische Wirkung der PTO-beladenen Partikelsysteme gezeigt werden. P12-beladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt HER2-überexprimierende Zellen aufgenommen. Die Partikel reduzierten die Menge der Plk1-mRNA signifikant. Dies ging mit einer ebenfalls signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge einher. Die Folge der Plk1-Reduktion war eine Aktivierung der Caspasen 3 und 7, die die Induktion der Apopotose zeigte. Plk1 kann nicht nur durch PTOs, sondern auch durch Plasmid-DNA, die small hairpin RNA (shRNA) gegen Plk1 exprimiert, gehemmt werden. Die Plasmide blieben bei der Einbettung in die Partikelmatrix intakt, allerdings trat eine Umformung von der supercoiled in die lineare und zirkuläre Form auf. Auch plasmidbeladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt in HER2-überexprimierende Zelllinien aufgenommen und führten dort zu einer signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge. Als weiterer nukleosidischer Wirkstoff wurde noch eine siRNA gegen Plk1 in die HSA-Partikel inkorporiert. Mit siRNA-beladenen Nanopartikeln konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge beobachtet werden. Partikel aus HSA können nicht nur durch den Einsatz von Glutaraldehyd stabilisiert werden, eine thermische Quervernetzung der Partikelmatrix ist ebenfalls möglich. Die besten physikochemischen Eigenschaften PTO-beladener Partikel wurden bei einer Quervernetzungstemperatur von 105°C über 10 min erzielt. Wurden diese Partikel enzymatisch abgebaut und das PTO aus der Partikelmatrix bestimmt, so konnten bis zu 80% des eingebetteten PTOs intakt detektiert werden. Allerdings waren die Partikel weniger stabil als chemisch quervernetzte Partikel. Bei einer Einlagerung über 6 Wochen stieg der Partikeldurchmesser an, 25% des eingebetteten P12s wurden aus der Matrix freigesetzt und bis zu 20% des Trastuzumabs wurden von der Oberfläche abgelöst. Dennoch war die Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge in der Zellkultur signifikant und mit der von chemisch stabilisierten Partikeln vergleichbar. Trastuzumabmodifizierte HSA-Nanopartikel stellen somit ein geeignetes Trägersystem für nukleosidische Arzneistoffe dar und führen zu einer spezifischen Wirkung in HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen.
Das Ziel des adaptiven Entwurfs von Substanzbibliotheken ist es, die vollständige biologische Testung einer molekularen Screeningbibliothek zu vermeiden. Stattdessen erfolgt, geleitet durch Optimierungsalgorithmen, eine "intelligente" Navigation durch den chemischen Raum, um so bevorzugt Substanzen mit gewünschten Eigenschaften auszuwählen. In einer retrospektiven Studie wurden die Optimierungsalgorithmen "Zufallssuche", "Simulated Annealing", "Evolutionsstrategie" und "Partikelschwarmoptimierung" im Hinblick auf den Entwurf von Bibliotheken von Serinproteaseinhibitoren systematischen verglichen. Die Gesamtzahl verfügbarer Substanztestungen wurde auf 300 beschränkt, um Laborbedingungen zu simulieren. Als Ergebnis zeigten sich besonders die Evolutionsstrategien für einen Einsatz in einer Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne geeignet, da diese effizient mit großen Populationen und wenigen Iterationen arbeiteten. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt den erfolgreichen Entwurf einer fokussierten Bibliothek von RNA-Liganden. In einer hybriden, prospektiven Optimierungsstudie wurden nach dem Vorbild einer iterativen Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne vom Computer vorgeschlagene Moleküle im Labor getestet. Die Substanzen wurden auf Inhibition einer spezifischen molekularen Wechselwirkung im Replikationszyklus von HIV getestet (Tat-TAR-Interaktion). In vier Generationen wurden 9 von 170 untersuchten Verbindungen positiv auf Inhibition der Tat-TAR-Interaktion getestet (Trefferquote: 5,3%), wobei lediglich 0,089% der Verbindungen der Screeningbibliothek untersucht wurden. Die zwei potentesten Kandidaten wiesen einen IC50 von 51 uM bzw. 116 uM auf.
Eine weltweite Veränderung der Lebensweise hat eine Zunahme der Anzahl adipöser Menschen und damit ein verstärktes Auftreten von Typ 2 Diabetes mellitus zur Folge. Eine häufig auftretende Komplikation dieser Erkrankung ist das diabetische Fußulkus, dessen molekularen und zellbiologischen Grundlagen weitestgehend unbekannt sind. Für einen normalen Wundheilungsverlauf ist ein Zusammenspiel vieler Wachstumsfaktoren und Zytokine essentiell. Auch die Insulinsensitivität der Haut scheint von großer Bedeutung zu sein. Die Funktionen von Insulin im Wundheilungsprozess und in der Haut sind weitestgehend unerforscht. Um ein besseres Verständnis für die Bedeutung von Insulin in der Wundheilung zu erhalten, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Analyse eines Insulin-regulierten Enzyms in der Haut, der HMG-CoA-Reduktase, während des Heilungsprozesses normaler sowie diabetisch chronischer Wunden. Die HMG-CoA-Reduktase katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Mevalonat-Stoffwechselweg und ist somit indirekt an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Die Verletzung von murinem Hautgewebe führte zu einem Anstieg der HMG-CoA-Reduktase-mRNA-Expression an Tag 3 und an Tag 13 nach Verletzung. Die Lokalisation der HMG-CoA-Reduktase im Wundgewebe zeigte, dass insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten durch eine besonders starke mRNA-Expression des Enzyms charakterisiert waren. Im Gegensatz dazu konnte im diabetischen, chronischen Wundgewebe keine Regulation der mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase detektiert werden. Wundheilungsrelevante Faktoren, wie Insulin und EGF, induzierten die mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase in HaCaT-Keratinozyten (in vitro). Für die Insulin-vermittelte mRNA-Induktion konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor SREBP2 für die Transkription des Gens essentiell war. Neben einer erhöhten Transkription der HMG-CoA-Reduktase wurde ebenfalls eine gesteigerte Enzymaktivität nach Insulin- oder EGF-Stimulation detektiert. Die Induktion der Insulin-vermittelten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität stand in einem funktionellen Zusammenhang zur Biosynthese des angiogenen Faktors VEGF. Der Einfluss der HMG-CoA-Reduktase auf die VEGF-Biosynthese war posttranskriptionell über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1 vermittelt. Auch im tierexperimentellen Modell (in vivo) konnte durch eine Statin-Behandlung bei Mäusen gezeigt werden, dass die Enzymaktivität der HMG-CoA-Reduktase in Keratinozyten für eine normale VEGF-Expression essentiell war. Die VEGF-Synthese wurde von der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in vivo, wie in vitro nach Insulin-Stimulation, posttranskriptionell beeinflusst. Die Analyse weiterer wundheilungsrelevanter Vorgänge ergab, dass eine Inhibierung der HMG-CoA-Reduktase in vivo wie in vitro eine Verringerung der Keratinozytenproliferation zur Folge hatte. Die Keratinozytenproliferation ist ein wichtiger Vorgang bei der Reepithelisierung einer Wunde. Ist das Wundareal durch Keratinozyten geschlossen, beginnt die Differenzierung der Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass der Differenzierungsprozess von Keratinozyten in vitro mit einer Induktion der HMG-CoA Redukase Aktivität assoziiert war. Eine Hemmung der Enzymaktivität hatte eine Inhibierung der mRNA-Expression von Keratinozyten-Differenzierungsmarkern, wie Involucrin, Filaggrin und Keratin 1 zur Folge. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die HMG-CoA-Reduktase wichtige Prozesse, wie Wundangiogenese und Keratinozytenproliferation, im kutanen Wundheilungsverlauf beeinflusst.
Mannheimia haemolytica und Pasteurella multocida gehören zu den Verursachern der unter Rindern weltweit verbreiteten Enzootischen Bronchopneumonie. Derzeitige Impfstoffe und Antibiotika gegen diese Bakterien können die Verbreitung der Krankheit nicht maßgeblich einschränken, weshalb Bedarf an neuen Medikamenten besteht. Bei der Besiedelung der Lunge treffen M. haemolytica und P. multocida auf Eisenmangel. Die Aufnahme von Eisen ist ein wesentlicher Faktor bei der Kolonisierung und Persistenz pathogener Bakterien im Wirt, da Eisen essentiell ist. Medikamente, die an Proteinen der Eisenversorgung angreifen, können deshalb zur Eindämmung der Bronchopneumonie beitragen. Um einen Überblick über die Gene von M. haemolytica und P. multocida zu erhalten, die bei der Adaptation an Eisenmangel beteiligt sind, wurden die Bakterien in der vorliegenden Arbeit in vitro unter Eisenmangel kultiviert, denn die meisten bakteriellen Gene, die an der Eisenaufnahme beteiligt sind, werden erst bei Eisenmangel transkribiert. Mittels Mikroarray-Analyse der Transkriptome wurden erstmals die in vitro eisenregulierten Gene von M. haemolytica und erstmals auch die eisenregulierten Gene eines Rinder-Isolats von P. multocida identifiziert. Der in dieser Arbeit verwendete Mikroarray war ein Multigenom-Mikroarray und stellt die offenen Leserahmen beider Bakterien dar. Mit der Mikroarray-Analyse wurden 129 Gene von M. haemolytica identifiziert, die bei Wachstum unter Eisenmangel eine veränderte Transkription aufwiesen. Die größte Gruppe der Gene mit verstärkter Transkription bildeten die Gene, die für Rezeptoren und Transporter kodieren. Von diesen kodieren etwa drei Viertel für Proteine, die an der Aufnahme von Eisen aus verschiedenen Quellen beteiligt sind. Die größte Gruppe der Gene mit verminderter Transkription wurde von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Damit wurde auch für M. haemolytica das Prinzip bestätigt, dass Bakterien bei Eisenmangel verstärkt Gene transkribieren, deren Proteine an der Eisenaufnahme beteiligt sind, während Gene für eisenhaltige Proteine des Energie-Stoffwechsels vermindert transkribiert werden. Bei der Analyse des Transkriptoms von P. multocida wurden 173 Gene mit veränderter Transkription identifiziert. Auch bei P. multocida konnte mit der funktionellen Klassifizierung der kodierten Proteine die größte Gruppe an Genen mit verstärkter Transkription den Transport- und Bindungsproteinen zugeordnet werden. Die größte Gruppe an Genen mit verminderter Transkription wurde auch bei P. multocida von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Beim Vergleich des Transkriptoms von M. haemolytica mit dem von P. multocida wurden mehr Unterschiede als Gemeinsamkeiten festgestellt. Nur 40 der 1424 homologen Gene zeigten die gleiche Richtung in der Änderung in der Transkription. Unter den 15 homologen Genen mit verstärkter Transkription waren die Gene, die für einen Hämoglobin-Rezeptor, die ABC-Transportsysteme FbpABC und YfeABCD sowie das Energie liefernde System TonB-ExbBD kodieren. In den 25 homologen Genen mit verminderter Transkription waren 15 Gene enthalten, deren kodierte Proteine am Energie-Stoffwechsel beteiligt sind. Dies waren die Proteine NapABCDFGH des Nitrat-Reduktase-Komplexes, die Proteine NrfABCD des Nitrit-Reduktase-Komplexes und die Proteine FrdABCD des Komplexes der Fumarat-Reduktase. Ein auffälliger Unterscheid war, dass bei M. haemolytica die gesamten Gene verstärkt transkribiert wurden, deren Proteine an der Aufnahme von Eisen aus Transferrin beteiligt sind. Bei P. multocida dagegen konnte das Gen für den Transferrin-Rezeptor nicht nachgewiesen werden. Somit gehört das in dieser Arbeit verwendete Isolat von P. multocida vermutlich zu den 30% der Rinder-Isolate von P. multocida, die keinen Transferrin-Rezeptor besitzen, aber die Rinderlunge besiedeln können (Ewers et al., 2006). Im Vergleich zu M. haemolytica fielen bei P. multocida die vielen verstärkt transkribierten Gene auf, die an der Aufnahme von Eisen aus dem Blut beteiligt sind. Die Transkription dieser verschiedenen Transporter deutet auf eine gute Adaptation von P. multocida für die Verwendung von Eisen aus dem Blut des Wirts hin, die bei M. haemolytica in diesem Maß nicht gegeben scheint. Für M. haemolytica wurde die in vivo-Relevanz einiger eisenregulierter Gene überprüft, die in der Mikroarray-Analyse eine erhöhte Transkription zeigten. Dazu wurde die RNA untersucht, die aus dem Lungengewebe von infizierten Rindern isoliert worden war. In diesem Gewebe wurde die Transkription von 11 Genen mittels RT-PCR nachgewiesen. Für die Gene, die für die Hämoglobin-Rezeptoren von M. haemolytica kodieren, wurde mittels quantitativer real time PCR auch eine Verstärkung der Transkription im Lungengewebe nachgewiesen. Die Verstärkung der Transkription in vivo war der transkriptionellen Verstärkung in vitro vergleichbar, was auf eine Funktion der Hämoglobin-Rezeptoren bei der Infektion in vivo hindeutet. Zur Untersuchung der Regulation des Eisenhaushalts von M. haemolytica wurde versucht, das Gen fur zu deletieren, das für den Hauptregulator des Eisenhaushalts kodiert, was jedoch nicht gelungen ist. In einem antisense-Ansatz konnte jedoch gezeigt werden, dass der Stamm mit dem fur-antisense-Plasmid ein signifikant verzögertes Wachstum hatte, was auf die essentielle Funktion des Gens fur in M. haemolytica hinweist. Ein antisense-Ansatz ist noch kein Beweis für die essentielle Funktion eines Gens. Doch die mit Gioia et al. (2007) übereinstimmenden Schwierigkeiten bei der Herstellung einer ∆-fur-Mutante von M. haemolytica sowie das verringerte Wachstum in Gegenwart der fur-antisense-mRNA deuten stark auf eine essentielle Funktion dieses Gens hin.
IL-18 ist ein proinflammatorisches Zytokin mit tumorsuppressiven Eigenschaften. Daher befindet es sich derzeit in klinischen Studien der Phase II zur Behandlung immunsensitiver Tumore. Erste Ergebnisse dieser Studien sind vielversprechend, zumal IL-18 im Vergleich zu beispielsweise IL-1Beta und IL-12 eine hohe Verträglichkeit im Menschen aufweist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-18 nicht nur in soliden Tumoren, sondern auch in leukämischen Zellen wie AML-Zellen zur Expression eines Genmusters führt, welches hohes antileukämisches Potential aufweist. Diese Erkenntnis wurde mittels einer Microarray-Analyse gewonnen und in unabhängigen Versuchen überprüft. Zu den hochregulierten Genen gehören neben IFNY und Fas-Ligand die in der vorliegenden Arbeit untersuchten angiostatischen Chemokine IP10 und I-TAC sowie EBI3, die Beta-Kette des heterodimeren Zytokins IL-27. Da die Regulation des humanen EBI3-Gens bislang schlecht charakterisiert war, schloss sich eine Promotoranalyse des humanen EBI3-Promotors an. Diese brachte hervor, dass zwei NFKB-Bindungsstellen des Promotors für die Expression von EBI3 unter dem Einfluß von proinflammatorischen Zytokinen unabdingbar sind. Der humane Promotor wurde dabei in dieser Arbeit zum ersten Mal im humanen Kontext betrachtet. Weiterhin konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass IL-27 die Fähigkeit besitzt, humane myeloisch-leukämische Zellen zu aktivieren und Signale in Form von STAT1 und STAT3-Phosphorylierung sowie Hochregulation von SOCS3- Expression zu induzieren. Interessanterweise lassen sich die potentiell tumorsuppressiven Eigenschaften von IL-18 in Bezug auf KG1 Zellen durch eine Zugabe von Zink verstärken. So kommt es unter dem Einfluß von Zink zu einer Verstärkung der Expression von IFNY und EBI3. Dieser synergistische Effekt besitzt allgemeinere Gültigkeit, da die hier durchgeführten Experimente an humanen PBMC zeigten, dass eine Erhöhung des extrazellulären Zinkgehalts um den Faktor 2 im Vergleich zu dem physiologisch zugänglichen Zinkgehalt im Blutplasma zu einer Potenzierung der Freisetzung von IFNY durch die proinflammatorischen Zytokine IL-1Beta, IL-18 und IL-12 führt. Diese Ergebnisse waren besonders in Bezug auf IL-1Beta unerwartet und tragen ihren Anteil zum Verständnis der erhöhten Sensibilität von Leukozyten unter zinksupplementierten Bedingungen bei. Weitere Studien werden zeigen, ob eine Therapie mit IL-18 und möglicherweise auch in Kombination mit Zink eine alternative Option bei AML Patienten bietet, die besonders responsiv auf dieses Zytokin reagieren.
Das Ziel dieser Arbeit war es, RNA-Strukturen als potentielle Zielstrukturen für die Medikamentenentwicklung zu untersuchen. Hierbei ging es im Speziellen um die Anwendung Virtueller Screening Verfahren für die RNA-Liganden-Vorhersage. Hierzu wurde die als TAR-Motiv (transactivating response element) bekannte RNA-Struktur der mRNAs des HI-Virus ausgewählt. Diese Struktur wurde gewählt, da mit den vier PDB-Einträgen 1ANR, 1ARJ, 1LVJ und 1QD3 bereits experimentell motivierte Strukturmodelle zum Beginn der Untersuchung vorlagen. Ausschlaggebend war hierbei auch das Vorhandensein eines Tat-TAR-FRET-Assays im Rahmen des SFB 579, in welchem diese Arbeit angefertigt wurde. Die Aufmerksamkeit, welche dem HI-Virus im Rahmen der Bekämpfung der Immunschwächekrankheit bereits zukam, führte bei dem gewählten Testmodell ebenfalls zu einem, wenn auch immer noch überschaubaren Datensatz bereits getesteter Substanzen, der als Grundlage für einen Liganden-basierten Ansatz als erste Basis dienen konnte. Basierend auf diesen Voruntersuchungen ergaben sich die weiteren Schritte dieser Arbeit. Die Arbeit lässt sich zusammenfassend in vier zum Teil parallel verlaufende Phasen einteilen: Phase 1:Bestandsaufnahme bekannter Informationen über die Zielstruktur · experimentell bestimmte Zielstrukturen · experimentell bestimmte Liganden/Nichtliganden der Zielstruktur Phase 2: Ableiten eines ligandenbasierten Ansatzes zur Vorhersage von potentiellen Bindern der Zielstruktur aus Substanzbibliotheken, der nicht auf Strukturdaten der Zielstruktur beruht. Phase 3: Analyse der bekannten Konformere der Zielstruktur auf konstante Angriffspunkte für ein spezielles Liganden-Design. Phase 4: Einbinden der bekannten Strukturinformationen der Zielstruktur zur weiteren Verfeinerung der Auswahlverfahren neuer Kandidaten für die weitere experimentelle Bestimmung des Bindeverhaltens. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels der Anwendung von künstlichen neuronalen Netzen in einem ligandenbasierten Ansatz durch virtuelles Screening der Chemikalien-Datenbanken verschiedener Lieferanten fünf neue potentielle TAR-RNA-Liganden identifiziert werden (drei davon mit einem Methylenaminoguanidyl-Substrukturmotiv), sowie als „Spin-Off“ durch die Anwendung der ursprünglich nur für den Tat-TAR-FRET-Assay vorgesehenen Testsubstanzen in einem Kooperationsprojekt (mittels CFivTT-Assay) zwei neue potentiell antibakterielle Verbindungen identifiziert werden. Die Beschäftigung mit der offensichtlichen Flexibilität der TAR-RNA und damit einer nicht eindeutig zu definierenden Referenz-Zielstruktur für das Liganden-Docking führte zur Erstellung eines Software-Pakets, mit dem flexible Zielstrukturen – basierend auf den Konformer-Datensätzen von MD-Simulationen – auf konstante Angriffspunkte untersucht werden können. Hierbei wurde ausgehend von der Integration eines Taschenvorhersage-Programms (PocketPicker) eine Reihe von Filtern implementiert, die auf den hierzu in einer MySQL-Datenbank abgelegten Strukturinformationen eine Einschränkung des möglichen Taschenraums für das zukünftige Liganden-Design automatisiert vornehmen können. Des Weiteren ermöglicht dieser Ansatz einen einfachen Zugriff auf die einzelnen Konformere und die Möglichkeit Annotationen zu den Konformeren und den daraus abgeleiteten Tascheninformationen hinzuzufügen, so dass diese Informationen für die Erstellung von Liganden-Docking-Versuchen verwendet werden können. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Deskriptor für die Beschreibung von Taschenoberflächen eingeführt: der auf der „Skalierungs-Index-Methode“ basierende molekulare SIMPrint. Die Beschäftigung mit der Verteilung der potentiellen Bindetaschen auf der Oberfläche der Konformerensemble führte ferner zur Definition der Taschenoberflächenbildungswahrscheinlichkeit (Pocket Surface Generation Probability – PSGP) für einzelne Atome einer Zielstruktur, die tendenziell für die Einschätzung der Ausbildung einer potentiell langlebigen Interaktion eines Liganden mit der Zielstruktur herangezogen werden kann, um beispielsweise Docking-Posen zu bewerten.
Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Komplexen mittels organischer Synthese und NMR-Spektroskopie
(2008)
Viele biologische Prozesse basieren auf der spezifischen Bindung eines Liganden an einen Rezeptor. Die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und seinem Ligand kann im Wesentlichen durch zwei verschiedene Modelle beschrieben werden: zum einen das vom E. Fischer eingeführte Schlüssel-Schloss-Prinzip und zum anderen das von Koshland beschriebene "induced-fit-model". Bei dem Schlüssel-Schloss-Prinzip liegt der Ligand in der Bindetasche des Rezeptors wie ein Schlüssel im Schloss. Ganz anders hierzu setzt die induzierte Anpassung ("induced-fit-model") eine konformationelle Änderung des Proteins durch den Liganden für die Bindung voraus. Ändern sich jedoch die Konformationen von Substrat und Rezeptor in einer gegenseitigen Beeinflussung, dann spricht man von "double-induced-fitmodel". Die Untersuchung dieser Erkennung auf molekularer Ebene ist von großer Wichtigkeit, denn sie dient zum besseren Verständnis und damit auch zur gezielten Beeinflussung solcher Prozesse. Wie wird der Ligand von einem Rezeptor selektiv erkannt und gebunden? Für die Erkennung und Bindung spielen spezifische nichtkovalente Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Zum Repertoire der nichtkovalenten Wechselwirkungen gehören die elektrostatische Wechselwirkungen, die Wasserstoffbrückenbindung und der hydrophobe Effekt.
In der vorliegenden Arbeit werden anhand von drei ausgewählten Beispielen solche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Liganden mit ihrem Rezeptor untersucht. In den ersten beiden Kapiteln werden Proteine und im letzten Kapitel RNA als Rezeptor untersucht. Die einzelnen Kapitel beginnen jeweils mit einer kurzen Einführung der Rezeptoren und der dazugehörenden Liganden, schließlich wird dann die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung beschrieben. Als Rezeptor wurden in der vorliegenden Arbeit Proteine (Kinasen und Membranproteine) und strukturierten Elemente der RNA (Aptamerdomäne der purinbindenden Riboswitche und der SELEX-RNA) gewählt. Membranproteine der Atmungskette, Kinasen und Riboswitches stellen zusätzlich attraktive Rezeptoren für das Wirkstoffdesign dar. Die damit interferierenden Liganden umfassen Substrate, Cofaktoren, Metabolite und Inhibitoren. Die Untersuchung der Wechselwirkung erfolgte mittels NMR-Spektroskopie und organischer Synthese.
Poly(pyrazol-1-yl)borate, die sogenannten Skorpionate, repräsentieren eine der etabliertesten Ligandenklassen in der Koordinationschemie und finden aufgrund ihrer Vielseitigkeit zahlreiche Anwendungen. In den letzten Jahren hat sich ein besonderes Interesse an Bis- und Tris(pyrazol-1-yl)boratliganden entwickelt, die mehrere Skorpionateinheiten im selben Molekül vereinen und dadurch kooperative Effekte zwischen den Metallionen fördern. Diese Liganden können sowohl Einsatz in der homogenen Katalyse als auch in den Materialwissenschaften finden. Die bisher in unserer Arbeitsgruppe entwickelten ditopen Bis(pyrazol-1-yl)borate des Typs L (Abb. 3.1) weisen allerdings eine recht hohe Hydrolyseempfindlichkeit auf, deren Ursache wahrscheinlich im elektronenschiebenden Charakter und der Raumerfüllung der Alkylsubstituenten begründet liegt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher zunächst die ditopen Skorpionatliganden M2[3] und M2[6] mit Phenyl- und Pentafluorphenylsubstituenten dargestellt, die in darauf folgenden Hydrolysestudien eine im Vergleich zu L erheblich höhere Beständigkeit gegenüber Feuchtigkeit zeigten. Die Umsetzungen der Liganden Li2[Lpara] (Dissertation Dr. Susanne Bieller; Frankfurt 2005) und Li2[6] mit MnII-chlorid verdeutlichten, dass sich das C6F5-substituierte Heteroskorpionat auch in Bezug auf sein koordinationschemisches Verhalten vom tertButyl-substituierten Liganden unterscheidet. Während Li2[Lpara] mit MnCl2 zu einem chlorid-überbrückten, makrozyklischen, dinuklearen Mangankomplex reagiert, wird mit Li2[6] das in Abb. 3.2 dargestellte Koordinationspolymer {(MnCl2)2(Li(THF)3)2[6]}∞ erhalten. Die Ladung der anionischen Polymerkette wird durch Lithium-Gegenionen ausgeglichen. Um die Bildung von diskreten Komplexen einerseits bzw. von Koordinationspolymeren andererseits gezielt steuern zu können, wurden die mit sterisch anspruchsvollen Pyrazolylsubstituenten versehenen Liganden M2[4], M2[5] und M2[7] (Abb. 3.1) dargestellt. Im Zuge der Kristallisation von Li2[4] zeigte sich, dass diese Verbindung eine hohe Affinität für Chloridionen besitzt. Auch in Anwesenheit eines Überschusses Kronenether führen Spuren des Halogenids zur Ausbildung des in Abb 3.3 gezeigten dinuklearen, chloridverbrückten Lithiumkomplexes Li2Cl[4]. Die ausgeprägte Komplexbildungstendenz lässt Li2Cl[4] im Hinblick auf die Entwicklung von Anionenrezeptoren interessant erscheinen. Komplexe, in denen zwei Metallionen durch zwei Heteroskorpionatliganden in eine makrozyklische Struktur eingebunden werden (Tmeta/para in Abb. 3.4), konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht isoliert werden. Ein Hinweis, warum dieses Strukturmotiv ungünstig sein könnte, wurde durch die Charakterisierung des auf einem partiell hydrolysierten Derivat von Li2[Lpara] beruhenden CoII-Makrozyklus Co2[23]2 erhalten. Die Analyse der Strukturparameter dieser Verbindung deutet an, dass die Bildung eines Makrozyklus im Fallder unhydrolysierten Heteroskorpionate aufgrund sterischer Wechselwirkungen zwischen den Pyrazolylringen und der Phenylenbrücke benachteiligt sein sollte. Obwohl zwischen Aryl- und Alkyl-basierte n Heteroskorpionaten erhebliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Neigung zur hydrolytischen Zersetzung erkennbar sind, zeigen beide Ligandentypen ähnliche Labilitäten gegenüber der stark Lewis-aziden Verbindung Brommanganpentacarbonyl. Die Reaktionen von Li2[Lpara], Li2[3] und Li2[6] mit Mn(CO)5Br führten zur Spaltung von B-N-Bindungen, die in allen drei Fällen durch Kristallisation des in Abb. 3.5 gezeigten, pyrazolid-verbrückten MnI-Carbonylkomplexes 21 dokumentiert werden konnte. Im Gegensatz zu den Heteroskorpionatliganden zeigen oligotope phenylenverknüpfte Homoskorpionate keine Tendenz, sich unter dem Einfluss von Mn(CO)5Br zu zersetzen. Reaktionen der di- und tritopen Tris(pyrazol-1-yl)borate Li2[15], Li2[16] und Li3[18] lieferten die in Abb. 3.6 dargestellten Mangantricarbonylkomplexe (Mn(CO)3)2[15], (Mn(CO)3)2[16] und (Mn(CO)3)3[18] in guten Ausbeuten. Neben der Darstellung dieser, für materialwissenschaftliche Fragestellungen (Koordinationspolymere, Metallorganische Netzwerke) interessanten Liganden, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob die Verknüpfung zweier Heteroskorpionateinheiten Auswirkungen auf die katalytische Aktivität entsprechender Rhodium-Cyclooctadien-Komplexe in der Polymerisation von Phenylacetylen hat. Sterisch anspruchsvolle Pyrazolylsubstituenten tragende monotope Rhodium-Cyclooctadien- Skorpionatkomplexe konnten in dieser Reaktion bereits erfolgreich als Katalysatoren eingesetzt werden und lieferten regioselektiv cis-transoid-verknüpftes Poly(phenylacetylen). Zunächst wurden die in Abb. 3.7 dargestellten Rhodiumkomplexe (Rh(cod))2[3] und (Rh(cod))2[6] von Bis(pyrazol-1-yl)boraten, die keine sterisch anspruchsvollen Pyrazolylsubstituenten tragen, synthetisiert. Ähnlich wie der analoge einkernige Komplex Rh(cod)[H2Bpz2 ] zeigten (Rh(cod))2[3] und (Rh(cod))2[6] keinerlei katalytische Aktivität. Daher sollten im Anschluss die mit Phenylpyrazolylgruppen ausgestatteten Derivate (Rh(cod))2[5] und (Rh(cod))2[7] synthetisiert und im katalytischen Prozess eingesetzt werden. Im Verlauf dieser Experimente stellte sich heraus, dass die Reaktionen der Alkalimetallskorpionate Li2[5] und K2[7] mit (Rh(Cl)(cod))2 nicht zu den Zielverbindungen, sondern zur Zersetzung der Ligandgerüste führen. In beiden Fällen konnte das Abbauprodukt 22 isoliert werden (Abb. 3.8). Weitere Untersuchungen ergaben, dass 22 in der Lage ist, Phenylacetylen in guten Ausbeuten und regioselektiv (cis-transoid-verknüpftes Poly(phenylacetylen)) zu polymerisieren. 22 stellt somit ein gut zugängliches und leicht zu modifizierendes Katalysatorsystem dar, dessen Optimierung Thema zukünftiger Untersuchungen sein wird.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym bei der zellulären Leukotriensynthese. Sie katalysiert zunächst die Umwandlung von AA zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HPETE) und als zweiten Schritt die Dehydratisierung der 5-HPETE zum instabilen Epoxid Leukotrien A4 (LTA4). Leukotriene sind wichtige Mediatoren bei Entzündungsprozessen und allergischen Reaktionen. Die 5-LO besteht aus zwei Domänen, einer N-terminalen regulatorischen Domäne (AS 1-121) und einer C-terminalen katalytischen Domäne (AS 120-673). Die katalytische Domäne besteht hauptsächlich aus a-Helices, die regulatorische hingegen hat fast ausschließlich b-Faltblätter als Sekundärstrukturelemente. Mit ihrem aus acht Faltblättern bestehenden antiparallelen b-Sandwich hat sie Ähnlichkeit mit einer C2- Domäne. Sie besitzt eine Ca2+-Bindungsstelle und ist maßgeblich bei der Bindung des Enzyms an Membranen beteiligt. Für einige Inhibitoren und zelluläre Faktoren existieren Hinweise, dass sie an die C2-ähnliche Domäne der 5-LO binden, die direkten Beweise fehlen jedoch. Die katalytische Domäne enthält das aktive Zentrum mit einem prosthetischen Eisen und drei Phosphorylierungsstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal erfolgreich eine Methode zur Überexpression und Aufreinigung der regulatorischen Domäne in E. coli entwickelt, die eine große Ausbeute des Zielproteins erbringt. In einer einfachen one-step Aufreinigung können bis zu 80 mg Fusionsprotein aus MBP und der regulatorischen Domäne der 5-LO (MBP-5LO1-128) pro Liter Expressionskultur gewonnen werden. Ein Verdau mit TEV-Protease führt zur effizienten Abspaltung des MBP. Die weitere Aufreinigung mit hydrophober Interaktionschromatogragphie ergibt eine Ausbeute von 3,4 mg reiner regulatorischer Domäne. Dabei weisen sowohl das Fusionsprotein, als auch die abgespaltene regulatorische Domäne eine Reinheit von über 95% auf. Leider ist die momentan erreichbare Konzentration der reinen regulatorischen Domäne noch nicht ausreichend, um damit NMR-Messungen zur Strukturaufklärung durchführen zu können. Es konnte bestätigt werden, dass die katalytische Domäne der 5-LO alleine nicht zu einer Umsetzung von Arachidonsäure in der Lage ist. Der Verlust der enzymatischen Aktivität ist vermutlich nicht auf eine Fehlfaltung der Proteindomäne zurückzuführen. Die korrekte Faltung der katalytischen Domäne konnte durch eine - wenn auch schwache - Bindung der Domäne an ATP gezeigt werden konnte. Die Zugabe von regulatorischer Domäne zu rekombinanter, aufgereinigter WT 5-LO hat unter gewissen Bedingungen (Abwesenheit von PC) einen stimulierenden Effekt auf die Aktivität des Gesamtenzyms. Dieser Effekt könnte durch eine „Dimerisierung“ der regulatorischen Domäne mit WT 5-LO hervorgerufen werden. In Gegenwart von PC ruft die regulatorische Domäne eine Hemmung der 5-LO-Aktivität hervor. Außerdem ist MBP-5LO1-128 (im Gegensatz zu MBP alleine) in der Lage, das Zwischenprodukt der 5-LO, 5-HPETE, in einer 1:1 Reaktion zu reduzieren. Diese Fähigkeit könnte zur Unterdrückung einer Selbstaktivierung der 5-LO physiologisch bedeutend sein. Interessant ist, dass die Reduktion in Anwesenheit von Ca2+, PC oder PC und Ca2+ deutlich verringert war. Ca2+ führte vor allem in Abwesenheit von PC zu einer deutlichen Verminderung der 5-HPETE-Reduktion. In Gegenwart von PC zeigt Ca2+ nur einen minimalen Einfluss auf die 5-HPETE-Reduktion. Es existieren deutliche Hinweise für eine Konformationsänderung von C2-Domänen durch Ca2+-Bindung [105; 106]. Geht man davon aus, dass dies auch für die C2-ähnliche Domäne der 5-LO zutrifft, erklärt sich damit die Verminderung der 5-HPETE-Menge in Gegenwart von Ca2+. Es ist gut vorstellbar, dass eine Ca2+-induzierte Konformationsänderung zu einer schlechteren Zugänglichkeit der für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten führt. Die Anwesenheit von PC führte zu einer noch stärkeren Hemmung der 5-HPETEReduktion, als die Zugabe von Ca2+. Die Beobachtung, dass 5-HPETE in Anwesenheit von PC teilweise vor einer Reduktion geschützt wird, ist in Übereinstimmung mit Ergebnissen von Rakonjac [62]. Vermutlich werden die, für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten bei Bindung der Domäne an die PC-Micellen teilweise verdeckt. Cystein 99 könnte eine Rolle bei dieser Reaktion spielen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass es bei der Reduktion von 5-HPETE nicht zu einer maßgeblichen Ausbildung von Disulfidbrücken kommt. Vorstellbar wäre die Ausbildung einer Hydroxysulfonylgruppe am Cystein. Eine Beteiligung von Cystein 99 wird durch die Ergebnisse des Dockings von 5-HPETE an das Homologiemodell der 5-LO und experimentelle Daten aus anderen Arbeiten (M. Hörnig, O. Rådmark) unterstützt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und die physiologische Relevanz zu zeigen sind weitere umfassende Untersuchungen nötig. Um eine Bindung von Hyperforin, LP 121, C06 und B02 an die regulatorische Domäne zu untersuchen wurde ein Kompetitionsassay entwickelt. Dabei wurde rekombinante, aufgereinigte 5-LO mit dem entsprechenden Inhibitor versetzt und dann versucht, die Hemmung mit Hilfe der regulatorischen Domäne aufzuheben. Greift der Inhibitor an der regulatorischen Domäne an, so sollte die Zugabe von MBP-5LO1-128 bewirken, dass ein Teil des Inhibitors an die regulatorische Domäne bindet, er sich somit nicht mehr an der 5-LO befindet und seine Wirkung vermindert wird. Um sicher zu gehen, dass die beobachteten Effekte nicht artifiziell sind, wurde ein Inhibitor, der an der katalytischen Domäne der 5-LO angreift als Negativkontrolle für den Assay benutzt. Für diesen Zweck wurde der Eisenligandinhibitor Zileuton ausgewählt. Es ist bekannt, dass Zileuton das Eisen im aktiven Zentrum der 5-LO chelatiert und nicht an die regulatorische Domäne bindet. Die Hemmung von Zileuton konnte erwartungsgemäß durch Zugabe der regulatorischen Domäne nicht aufgehoben werden. Hyperforin und B02 zeigten eine deutlich verminderte 5-LOHemmung bei steigender Menge an MBP-5LO1-128. Die Hemmung durch LP 121 und C06 wurde nicht von der regulatorischen Domäne beeinflusst. Es konnte also ein effektives und einfaches Screeningverfahren zur Untersuchung der Bindung von 5-LO-Inhibitoren an die regulatorische Domäne entwickelt werden, mit der Einschränkung, dass der Assay nur für den Nachweis einer reversiblen Bindung von Inhibitoren an die regulatorische Domäne tauglich ist. Dieser Assay wird sich in Zukunft als wichtiges Tool bei der Suche nach neuen 5-LO-Inhibitoren erweisen, da die Substanzen mit einem direkten Angriff des aktiven Zentrums bisher nicht zu effektiven und nebenwirkungsarmen Arzneimitteln geführt haben.
Untersuchung möglicher Wege zur Präparation von Nioboxynitriden mittels thermischer Kurzzeitprozesse
(2008)
In dieser Arbeit wurden mögliche Wege zur Präparation von Nioboxynitriden mittels thermischer Kurzzeitprozesse (Rapid Thermal Processing (RTP)) in dünnen Metallfilmen untersucht. Die dafür verwendeten Nb-Filme wurden mittels Magnetronsputtern auf ein thermisch oxidiertes Siliziumsubstrat (SiO2/Si-Substrat) aufgebracht. Die SiO2-Schicht hatte eine Dicke von 100 nm und soll die unerwünschte Reaktion zwischen Si und Nb vermeiden, welche zur Bildung von Niobsiliziden bei der RTP-Temperung führen kann. Um Nioboxynitride zu präparieren wurden Nb-Filme in mehreren Schritten mittels RTP behandelt. Durch die Variation der Ansatzreihenfolge (Oxidation und Nitridierung), der Reaktionsgase (O2, N2, NH3), der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit sowie der Schichtdicke der Proben wurde die Möglichkeit der Bildung von Nioboxynitriden untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Bildung von Nioboxynitriden bei der Nitridierung der Nb2O5-Filme in Ammoniak erfolgt. Die Nb2O5-Filme wurden durch die Oxidation der as-deposited Nb-Filme im molekularem Sauerstoff bei 450 °C (nach 5 min Oxidation) bzw. bei 500 °C (nach 1 min Oxidation) hergestellt. Die gebildete Nb2O5-Phase wurde dem orthorhombischen beta-Nb2O5 zugeordnet. Die Oberfläche der Nb2O5-Filme zeigte Rissbildung sowie sichtbare Delamination bzw. Ablösung der Nb-Filme vom Substrat. Dies wird durch das Stressaufkommen im Film bei der direkten Oxidation des as-deposited Films im O2-Strom erklärt. Das Stressaufkommen wird durch eine starke Ausdehnung des Kristallgitters von Niob bei der Bildung des Nb2O5 sowie durch eine hohe Oxidationsrate des as-deposited Nb-Films in O2 hervorgerufen. Das Herabsetzen der Oxidationsgeschwindigkeit verringerte den Stress zwischen dem Metall und Niobpentoxid und verbesserte die Oberflächenqualität des Films nach der Temperung. Eine Herabsetzung der Reaktionsgeschwindigkeit wurde durch die Änderung der Ansatzreihenfolge erreicht. Die Oxidation der vorher nitridierten Nb-Filme führte zu einer langsameren Bildung des Nb2O5 im Vergleich zu den Filmen, die einer direkten Oxidation im O2-Strom ausgesetzt wurden. Dies wurde durch die Barrierefunktion der bei der Nitridierung gebildeten Niobnitride gegen den eindiffundierenden Sauerstoff hervorgerufen. Bei der Oxidation wurde die Diffusion des Sauerstoffes im nitridierten Film durch den Stickstoff gehemmt, was zu einer Abnahme der Oxidationsgeschwindigkeit und somit zu einer langsameren Bildung des Nb2O5 führte. Die Oxidation der zuvor nitridierten Filme führte zu wesentlich niedrigerem Stress zwischen dem Niob und den gebildeten Oxidphasen als zwischen dem Niob und dem Niobpentoxid bei der direkten Oxidation des Niobs in molekularem Sauerstoff. Die weitere Nitridierung der Filme, bei denen bei der Oxidation der bereits nitridierten Filme die Bildung nur einer Nb2O5-Phase erfolgte, führte zur Bildung von zwei Phasen: Nb4N3 und NbxNyOz. Die Zusammensetzung des gebildeten Nioboxynitrides entspricht am wahrscheinlichsten einer Zusammensetzung von NbN0.6O0.2. Sowohl die 200 als auch 500 nm-Filme zeigten nach der dreifachen Temperung eine hohe Porosität. Die hohe Porosität der Probe wurde durch Gasbildung und -diffusion (H2, H2O) im Innern des Films bei der Temperung des Nb2O5-Films in NH3 verursacht. Die EFTEM/EELS-Untersuchungen zeigten, dass sich beim dünnen 200 nm-Film zwei ausgeprägte Zonen (an der Oberfläche – Nb4N3, im Bulk bzw. am Interface – NbxNyOz) gebildet haben. Beim 500 nm-Film zeigte sich, dass die stickstoffhaltigen sowie stickstoff- und sauerstoffhaltigen Zonen, welche entsprechend Nb4N3 und NbxNyOz zugeordnet wurden, im ganzen Film ziemlich gleichmäßig verteilt sind. Ein Hinweis auf die Bildung eines Nioboxynitrides durch die Nitridierung der unvollständig oxidierten Nb-Filme im molekularen Stickstoff wurde nicht gefunden. Bei diesen Temperungen erfolgte die Bildung von unterschiedlichen Oxid- und Nitridphasen. Es wurde festgestellt, dass die Oxidation sowie die Nitridierung der Nb-Filme zu einem texturierten Wachstum der gebildeten Phasen führten. Die SiO2-Schicht auf dem (100)-orientierten Silizium wirkte sich auf das Schichtwachstum des auf das Silizium aufgebrachten Niobs aus und beeinflusste die Kristallstruktur der entstandenen Nb-Schicht und der bei den RTP-Temperungen gebildeten Phasen. Bei dünnen Schichten, wirkt sich dieser Effekt stärker aus, da der Einfluss des Substrates mit wachsender Schichtdicke abnimmt. Die bei der Oxidation gebildeten Nioboxide stellten eine starke Diffusionsbarriere für den bei der Nitridierung eindiffundierenden Stickstoff dar, was zur Aufstauung von Stickstoff in den an der Oberfläche liegenden Filmschichten führte. Die Analyse der erhaltenen SIMS-Daten zeigte, dass bei der Nitridierung der bereits oxidierten Filme die Diffusion des Stickstoffes zwei gleichzeitig ablaufende Prozesse verursacht. Von einer Seite verdrängt der eindiffundierende Stickstoff den Sauerstoff aus dem Film. Andererseits führt die Diffusion des Stickstoffes aufgrund des Schneepflug-Effekts zur Aufstauung des Sauerstoffes in den tiefliegenden Bereichen des Films. Gleichartige Diffusionsprozesse wurden bei der Oxidation der bereits nitridierten Filme beobachtet. Die Nioboxide, welche am Interfacebereich detektiert wurden, bildeten sich durch die Reaktion zwischen Niob und dem aus der SiO2-Schicht ausdiffundierenden Sauerstoff. Die Gegenwart der schon vorhandenen Nioboxide hemmte allerdings die Ausdiffusion des Sauerstoffes aus der SiO2-Schicht des Substrates im Vergleich zu den unoxidierten Filmen.
Die trimeren P2X–Rezeptoren sind nicht–selektive Kationenkanäle, die durch Adenosintriphosphat (ATP) aktiviert werden. Es gibt sieben Untereinheiten (P2X1–7). P2X–Rezeptoren sind in nahezu jedem Gewebe exprimiert und dort an den verschiedensten physiologischen Vorgängen beteiligt. Neben den „Cys–Loop“–Rezeptoren und den ionotropen Glutamat–Rezeptoren stellen die P2X–Rezeptoren eine eigenständige Familie von Neurotransmitter–gesteuerten Rezeptoren dar. Eine Untereinheit der trimeren P2X–Rezeptoren besteht aus den intrazellulären N– und C–Termini und zwei Transmembrandomänen, die über eine große extrazelluläre Domäne verbunden sind. Da weder ein P2X–homologes lösliches Protein für Kristallisationsstudien noch ein Gewebe zur Aufreinigung großer Mengen von P2X–Rezeptorprotein zur Verfügung steht, stützen sich Struktur–Funktions–Studien auf einzelpunktmutierte Rezeptoren in heterologen Expressionsystemen. Einige Aminosäuren, die bei Austausch gegen Alanin eine deutliche Verschiebung der Dosis–Wirkungs–Kurve von ATP bewirken und von denen daher vermutet wird, dass sie an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Ob sich die Agonisten–Bindungstasche der P2X–Rezeptoren zwischen zwei Untereinheiten, wie bei den nikotinischen Acetylcholin–Rezeptoren, oder innerhalb einer Untereinheit, vergleichbar mit den ionotropen Glutamat–Rezeptoren, befindet, ist weitgehend ungeklärt. Um die Lokalisation der ATP–Bindungstasche zu bestimmen, wurden, basierend auf vorhandener Literatur, potenziell an der ATP–Bindung beteiligte Aminosäuren des P2X1–Rezeptors durch zielgerichtete Mutagenese gegen Cysteine ausgetauscht und die P2X–Rezeptormutanen in Xenopus laevis–Oozyten exprimiert. Das Ziel dabei war, quervernetzte Cystein–Mutanten durch Disulfidbrückenbildung zwischen den substituierten Cysteinen zu identifizieren und so die Distanz von Aminosäure–Seitenketten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, zu bestimmen. Für die biochemischen Untersuchungen wurden entweder alle neu gebildeten Proteine der Oozyten metabolisch durch Inkubation mit radioaktivem [35S]–Methionin oder selektiv die Plasmamembran– ständigen Proteine mit Sulfo–NHS–Fluoreszenz–Farbstoffen markiert. Die Rezeptormutanten wurden affinitätschromatographisch über ein N–terminales Hexahystidyl–Motiv unter nicht–denaturierenden Bedingungen aufgereinigt und mit nicht–reduzierender SDS–Polyacrylamid–Gelelektrophorese (PAGE) auf Expression sowie mit Blauer–Nativer–PAGE auf korrekte Trimerisierung überprüft. Darüber hinaus wurden homologe Cystein–Substitutionen einer P2X2–1–Chimäre, welche dieselben Bindungseigenschaften des P2X1–Rezeptors besitzt, mittels der Zwei–Elektroden–Spannungsklemme charakterisiert (TEVC). Die Koexpression der verschiedenen P2X–Mutanten ergab eine spontane Quervernetzung über Disulfidbrücken zwischen den P2X1 K68C– und F291C–Mutanten, die in nicht–reduzierenden SDS–PAGE–Gelen über eine Dimerbildung nachgewiesen werden konnte. Dies deutet auf eine geringe Distanz zwischen diesen Cystein–substituierten Aminosäuren hin. Die Ausbildung der Disulfidbrücke konnte nach Reduktion der Quervernetzung während der Aufreinigung und durch Zugabe von ATP verhindert werden. In funktionellen Studien der P2X2–1 K68C/F291C–Doppelmutante war es entsprechend möglich die Disulfidbrücke reversibel zu reduzierenden. In den Mutantenkanäle exprimierenden Xenopus–Oozyten wurde der geringe Rezeptorstrom durch Reduktion mit DTT ca. 60fach potenziert und dadurch überhaupt messbar gemacht. Die Reoxidation durch H2O2 wurde wie in den biochemischen Experimenten in Anwesenheit von ATP ebenfalls verhindert. Da die Aminosäuren K68 und F291 des P2X1–Rezeptors möglicherweise an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, sind diese Ergebnisse die ersten direkten experimentellen Hinweise auf die Aposition von Domänen benachbarter Untereinheiten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind. Demnach befindet sich die ATP–Bindungstasche an der Grenzfläche zwischen zwei Untereinheiten der P2X–Rezeptoren. Die Koexpression homologer Cystein–substituierter P2X2–, P2X3– und P2X4–Rezeptoren zeigte analog zu den P2X1–Experimenten eine spontane Dimerisierung der P2X2 K69C– und F289C–Mutanten. Eine mäßige Quervernetzung von zwei Untereinheiten der P2X3 K63C– und F280C– sowie der P2X4 K67C– und F294C–Mutanten konnte nach Anwendung einer ca. 0,5 nm langen Cystein–spezifischen quervernetzenden Substanz erreicht werden. Die paarweise Kombination der P2X1–, P2X2–, P2X3–und P2X4–Cystein–Mutanten zeigte selbst nach Anwendung quervernetzender Substanzen nur in der Kombination von P2X1–K68C und P2X2–F289C eine Quervernetzung von zwei unterschiedlichen Untereinheiten eines heteromeren P2X1/2–Rezeptors. Diese Kombination konnte in elektrophysiologischen Messungen durch Reduktion der Disulfidbrücke spezifisch messbar gemacht und somit die Heteromerisierung dieser Untereinheiten eindeutig aufgezeigt werden. Zusammenfassend deutet die geringe Distanz der an der Quervernetzung beteiligten Cystein–Mutationen der P2X1–, P2X2– und homomeren P2X1/2–Rezeptoren auf ein konserviertes strukturelles Motiv dieser P2X–Subtypen hin, welches in P2X3– und P2X4–Rezeptoren nicht konserviert zu sein scheint. Diese Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf die generelle Struktur der P2X–Rezeptoren und werden maßgeblich zur Interpretation einer zukünftigen Kristallstruktur beitragen.