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Von den in dieser Studie 163 untersuchten Patientinnen mit Carcinom der Cervix uteri wurden 56 mit entweder postoperativer oder alleiniger Radiochemotherapie und 107 mit entweder postoperativer oder alleiniger Radiotherapie behandelt. Die Radiotherapie bestand bei allen 163 Patientinnen aus perkutaner Hochvolttherapie, in 129 Fällen kombiniert mit intrakavitärer Kontaktbestrahlung. Die Chemotherapie bestand aus der wöchentlichen Gabe von Cisplatin. 62 Patientinnen wurden vor der Therapie operiert. Das mittlere Alter bei Diagnosestellung lag bei 55 Jahren mit eine Range von 21 bis 84 Jahren. Das Tumorstadium der untersuchten Patientinnen lag zwischen I und IVa, wobei die meisten Patientinnen Tumoren im Stadium II (36,8 %) oder III (27,6 %) aufwiesen. Allerdings wurde in vielen Fällen, in denen keine Operation erfolgte, das Tumorstadium nach FIGO und bei operierten Patientinnen das Tumorstadium nach TNM-Klassifikation erfasst. Bei 96,3 % der Tumoren handelte es sich histopathologisch um ein Plattenepithelcarcinom, in 3,7 % um ein Adenocarcinom. Obwohl 6 verschiedene Therapiemodalitäten eingesetzt wurden, war vor allem der Vergleich der Gruppe, die eine Radiochemotherapie erhalten hatten, mit jener, die eine alleinige Radiotherapie erhielt, von besonderem Interesse. Die akuten und chronischen Nebenwirkungen wurden nach den Richtlinien der RTOG-EORTC beurteilt. An 54 Patientinnen konnte über die Nachsorge hinaus ein Fragbogen zugesendet werden, der in Anlehnung an die Kriterien des LENT-SOMA Konzepts die subjektive Morbidität der Patientinnen abfragte. Die Gesamt 2-JÜR lag bei 70 %, die Gesamt 5-JÜR bei 58 % mit einer Rezidivrate für das Gesamtkollektiv von 14,1 %. Bei 17,4 % der Patientinnen traten Fernmetastasen sowie in 8 % der Fälle Lymphknotenmetastasen auf. Das Überleben bei Radiochemotherapie stellte sich gegenüber alleiniger Radiotherapie als verbessert (2-JÜR bei RCT von 82 % vs. 2-JÜR bei RT von 64% sowie 5-JÜR bei RCT von 69 % vs. 5-JÜR bei RT von 52 %) und die Rezidivrate (RCT 9 % vs. RT 14,1 %) als vermindert dar. Auch Fernmetastasen wurden in der RCT-Gruppe seltener verzeichnet (RCT 10,7 % vs. RT 18,3 %). Lediglich der Lymphknotenbefall war in beiden Gruppen nicht relevant unterschiedlich (RCT 7,1 % vs. RT 8,4 %). Postoperative Patientinnen wiesen zwar keine höhere Rezidivfreiheit jedoch längere Überlebensintervalle als nicht operierte Patientinnen auf. Die längsten Überlebensintervalle ließen sich für die postoperative RCT-Gruppe ermitteln. Im Vergleich wurden vor allem hämatogene Nebenwirkungen von Schweregrad 3 oder 4 in der Gruppe, die mit kombinierter Radiochemotherapie behandelt wurde, sehr viel häufiger festgestellt (RCT 35,7 % vs. RT 2,9 %). Allerdings wurde bei 32 Patientinnen der RT-Gruppe kein regelmäßiges Blutbild angefertigt. Die Therapie konnte in den meisten Fällen im geplanten Umfang erfolgen. Gastrointestinale Nebenwirkungen wurden in beiden Gruppen festgestellt, wobei keine großen Unterschiede zu beobachten waren. Akute Nebenwirkungen des Schweregrads 3 der Blase wurden in 2,5 % der Patientinnen ermittelt. An der Vagina war dies ebenfalls in 2,5 % der Fall. Urogynäkologische Nebenwirkungen des Schweregrads 4 wurden nicht verzeichnet. Es wurden ebenso wenig gastrointestinale Nebenwirkungen vom Grad 4 und insgesamt lediglich in 3 Fällen vom Grad 3 registriert, wobei diese alle in der RT-Gruppe (2,8 %) vorkamen. Die chronischen Nebenwirkungen waren insgesamt ebenfalls in der RCT-Gruppe etwas häufiger (RCT 17,9 % vs. RT 14 % für kumulative Häufigkeit aller chronischen Nebenwirkungen von Schweregrad 3 und 4), wobei die gastrointestinalen Nebenwirkungen in beiden Gruppen ähnlich waren (RCT 10,7 % vs. RT 10,3 % für kumulative Häufigkeit von Grad 3 und 4). Urologische Spätfolgen vom Grad 3 oder 4 wurden in der RCT-Gruppe jedoch weitaus häufiger ermittelt (kumulative Häufigkeit RCT 7,1 % vs. RT 1,9 %). Als weiterer Prognosefaktoren für Überleben wurde vor allem das Tumorstadium und ein Karnofsky-Index >70 identifiziert, wohingegen das Alter (ausgenommen die Gruppe der Patientinnen <80 Jahre) bei Therapiebeginn und vorhergehende operative Eingriffe keinen Einfluss auf die Prognose zu haben schienen. Vor allem für das Entstehen von chronischen Nebenwirkungen wurde eine Korrelation zwischen applizierter Gesamtdosis und Schwere sowie Häufigkeit von Spätfolgen der Schweregrade 3 oder 4 festgestellt (Für BED <110 Gy gastrointestinale chronische Nebenwirkungen Grad 3 und 4 in 4,5 % und der Blase in 3,4 % vs. BED >110 Gy gastrointestinale chronische Nebenwirkungen Grad 3 und 4 in 23,5 % und der Blase in 3,9 %). Patientinnen, die Grunderkrankungen wie Diabetes oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen in ihrer Anamnese hatten, litten etwas häufiger an gastrointestinalen Spätfolgen vom Schweregrad 4, während Spätfolgen vom Schweregrad 3 in der Gruppe ohne diese Grunderkrankungen häufiger ermittelt wurden. Bei der Befragung der Patientinnen wurden vor allem häufige Darmkrämpfe, Durchfälle und Schmerzen im Beckenknochen angegeben. 42,6% der Patientinnen gaben negative Auswirkungen der Therapie auf ihr Sexualleben an. Insgesamt deckt sich das Ergebnis aus dieser Arbeit mit den Ergebnissen der großen randomisierten Studien nach denen eine Radiochemotherapie eine Verbesserung der Prognose mit einer eher geringen Verstärkung von akuten und chronischen Nebenwirkungen für Patientinnen mit Carcinomen der Cervix uteri darstellt.
The growth of blood vessels is crucial for organ growth in the embryo and repair of wounded tissues in the adult. An imbalance in this process contributes to numerous malignant, inflammatory, ischemic, infectious and immune disorders (Ferrara et al., 2003). Postnatal neovascularization occurs through the recruitment of progenitor cells and angiogenesis. Integrins are heterodimeric cell surface molecules and are the main receptors for extracellular matrix proteins. Regulation of integrin activation is crucial during embryonic development and during adult life. Dysregulation of integrin activity leads to severe diseases. In this study, we have demonstrated that Rap1, a small GTPase regulating integrin activity, and its GEF Epac1 are expressed in both EPC and endothelial cells. Moreover, the pharmacological activator of Epac activates the small GTPase Rap1 in progenitor cells. In parallel the angiogenic growth factors VEGF and bFGF activate Rap1 in endothelial cells. In addition, the regulation of Rap1 activity in EPC and in endothelial cells plays an important role in the regulation of migration and adhesion to matrix proteins, by regulating the activity of different integrins, a mechanism known as integrin inside‐out signaling. Furthermore, regulation of Rap1 activity affects probably indirectly through outside‐in signaling of integrins the activity of several and crucial proteins such PKB/Akt and focal adhesion kinase in endothelial cells. In line with these results, we have demonstrated that Rap1 activity affect angiogenesis, homing of EPC to ischemic tissues and thereby postnatal neovascularization. The understanding how Rap1 regulates integrin activity in endothelial cells is still not completely clear, for example we have demonstrated that the known effectors of Rap1 mediating the increase of integrin activity in T and B cells, such as RAPL and RIAM are, respectively, either not increasing integrin activity or not expressed in endothelial cells. We aim to find the effector of Rap1 promoting integrin activity in endothelial cells and how RAPL regulates integrin functions and angiogenesis. Moreover data from us and others using genetic models and generation of Rap1a or Rap1b deficient mice or deficient for Rap1a and Rap1b led to embryonic lethality suggesting that Rap1 is a key node protein during embryonic development. The development of conditionnal Rap1a/b endothelial/pericytes restricted deficient mice will help us to decipher more precisely the role of Rap1 during vascular development and angiogenesis.
The research presented in this thesis characterizes U2AF homology motifs (UHM) and their interactions with UHM ligand motifs (ULM) in the context of splicing regulation. UHM domains are a subgroup of RNA recognition motifs (RRM) originally discovered in the proteins U2AF65 and U2AF35. Whereas canonical RRMs are usually involved in binding of RNA, UHM domains bind tryptophan containing linear protein motifs (ULM) instead. In the first article, we analyze the complex network of interactions between splicing factors and RNA that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´ splice site of an intron. The protein U2AF65 binds a pyrimidine-rich element in introns and recruits U2snRNP by binding its protein component SF3b155. My contribution was to define the binding site of the protein U2AF65 to the intrinsically unstructured N-terminus of the scaffolding protein SF3b155. I could show that the UHM domain of U2AF65 recognizes a ULM in SF3b155, and that this binding site is not overlapping with the binding sites of other splicing factors, like p14, to SF3b155. As the U2AF65-UHM:SF3b155-ULM interaction is mutually exclusive with an interaction between U2AF65-UHM and a ULM in the splicing factor SF1, which was reported to initially recognize the branch point sequence, my results provide the molecular details on how SF3b155 replaces SF1 during spliceosomal reorganizations. In the second article, we show that overexpression of the UHM domain of the splicing factor SPF45 induces exon 6 skipping in the pre-mRNA of Fas (CD95/APO-1). I provide evidence for in vitro binding of SPF45-UHM to ULM sequences in the splicing factors U2AF65, SF1, and SF3b155. I crystallized free and SF3b155-bound SPF45 UHM and solved both structures by X-ray crystallography. The analysis of the complex interface and sequence differences in the ULMs allowed me to design mutations of SPF45-UHM, which selectively inhibit binding to distinct ULMs. After assessing the ULM binding properties in vitro, we could show that the activity of SPF45-UHM in influencing the splicing pattern of Fas relies on interactions with SF3b155 and/or SF1, but that an interaction with U2AF65 is dispensable. A mechanism for the activity of SPF45-UHM could thus be engaging in ULM interactions and thus interfering with the network of interactions that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´splice site, as described above. In the third article, we describe an unusual flexible homodimerization mode of the UHM in the splicing factor Puf60, which enables simultaneous interactions with ULM sequences on other splicing factors. I could show that the NMR relaxation properties of Puf60-UHM are inconsistent with a model of a rigid dimer, but rather indicate a dimerization via a flexible linker. I identified a flexible loop in the peptide backbone of Puf60-UHM, and showed that mutiation of acidic residues in this loop impairs the dimerization. To analyze the dimerization interface in further detail, I solved the structure of Puf60-UHM by X-ray crystallography. The acidic residues in the flexible loop of one UHM dimer subunit mediate the dimerization by contacting basic residues on the β-sheet surface of the other dimer subunit. Differences in the four dimer interfaces observed for the eight molecules in the asymmetric unit of the crystal support the model of an undescribed, flexible mode of dimerization, and thus complement the NMR relaxation data. Furthermore, I could show that the Puf60-UHM dimer and U2AF65-UHM contact different ULM sequences on the SF3b155 N-terminus in vitro, thus providing a possible explanation for the mutual cooperative activation of Puf60 and U2AF65 in splicing assays described in the literature. The fourth article is a review about recent research on the recognition of DNA double strand breaks (DSB) by covalent histone modifications. The p53 binding protein 1 (53BP1) is a DSB sensor and a checkpoint protein for mitosis. Recent crystallographic evidence indicates that 53BP1 recognizes DSB sites by binding histone H4 dimetylated at lysine 20 (H4-K20). We provide a comprehensive overview of the atomic resolution structures that revealed how proteins can specifically recognize histone tail modifications, especially methylated lysines, to read the information stored in what is called the histone code.
Ziel dieser anthropometrischen Studie war es, an einem Kollektiv von 1176 Probanden im Alter von 7-25 Jahren die Kollmann´schen Proportionen zu bestimmen und den Einfluss von Alter, Geschlecht und fazialem Wachstumstyp auf die Verteilung der Gesichtsdrittel zu analysieren. Weiterhin sollte die Übereinstimmung von anthropometrischer und kephalometrischer Messung der vertikalen Gesichtsproportionen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde bei 29 Probanden aus dem vorliegenden Untersuchungskollektiv die Länge von Mittel- und Untergesicht sowohl direkt im Gesicht des Probanden als auch röntgenkephalometrisch bestimmt, wobei die Zeitdifferenz zwischen den beiden Messungen durchschnittlich 3,6 1,7 Monate (1-6 Monate) betrug. Obwohl sich im Mittelgesicht wie auch im Untergesicht mit Korrelationskoeffizienten von R = 0,69 und R = 0,73 eine hohe und statistisch signifikante Übereinstimmung der anthropometrischen und kephalometrischen Messergebnisse zeigte, kann nicht von einer exakten Übereinstimmung ausgegangen werden. Der Mittelwertvergleich ergab, dass die anthropometrischen Messwerte niedriger ausfielen als die kephalometrischen. Aus diesem Grund ist in Übereinstimmung mit der Literatur der Anthropometrie bei Messungen zu Fragen der fazialen Ästhetik gegenüber der Kephalometrie der Vorzug zu geben. Die vorliegende Erhebung anthropometrischer Daten zur vertikalen Gesichtsproportionierung ergab, dass eine ideale Gesichtsdrittelung mit einer Übereinstimmung aller drei Gesichtsdrittel nur bei einem der 1176 Probanden (0,1%) zu beobachten war. Oberes und mittleres Gesichtsdrittel stimmten in 16 Fällen (1,4%) überein, mittleres und unteres Gesichtsdrittel in 8 Fällen (0,7%) und oberes und unteres Gesichtsdrittel in 73 Fällen (6,2%). Die Ermittlung von Durchschnittswerten zeigte, dass das obere und untere Gesichtsdrittel mit einem Anteil von median je 35,9% der Gesichtshöhe gleich groß waren und 28,2% auf das mittlere Gesichtsdrittel entfielen. Die erwartete altersabhängige Proportionsverschiebung vom Hirn- zum Gesichtsschädel konnte im vorliegenden Untersuchungskollektiv im Widerspruch zu den Ergebnissen anderer Studien nicht beobachtet werden. Dennoch ist für die klinische Anwendung der Kollmann´schen Proportionen festzuhalten, dass bei Kindern und Jugendlichen vor Abschluss der Pubertät eine Veränderung der Gesichtsproportionen möglich und ein Rückschluss auf das Vorliegen einer Dysgnathie daher zu diesem Zeitpunkt nicht zulässig ist. Der Einfluss des Geschlechts erwies sich für das obere Gesichtsdrittel als statistisch signifikant, wobei der Anteil bei den männlichen Probanden mit 35,6% niedriger war als bei den weiblichen Probanden mit 36,0%. Im Mittelgesicht war kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Jungen und Mädchen nachweisbar (28,2% vs. 28,4%). Der Anteil des Untergesichts war bei männlichen Probanden statistisch signifikant größer als bei weiblichen (36,5% vs. 36,0%). Die vorliegenden Ergebnisse lassen in Übereinstimmung mit der Literatur den Schluss zu, dass beim männlichen Geschlecht eine geringfügige Dominanz des Untergesichts auf Kosten des Stirndrittels vorliegt. Hinsichtlich des Einflusses des zugrundeliegenden Wachstumsmusters zeigte sich, dass die Werte für das obere Gesichtsdrittel beim brachyfazialen Typ statistisch signifikant höher waren (brachyfazial vs. dolichofazial: 36,3% vs. 35,4%; brachyfazial vs. doliochofazial/normofazial: 36,3% vs. 35,6%). Ein signifikanter Einfluss des fazialen Typs auf den Anteil des Mittelgesichts konnte nicht nachgewiesen werden. Der Anteil des unteren Gesichtsdrittels fiel beim brachyfazialen Wachstumstypus statistisch signifikant kleiner aus als beim dolichofazialen Wachstumstypus (brachyfazial vs. dolichofazial/ normofazial: 35,6% vs. 36,1%; brachyfazial vs. dolichofazial: 35,6% vs. 36,7%; brachyfazial/normofazial vs. dolichofazial: 36,0% vs. 36,7%). Zusammenfassend lassen die erzielten Resultate in Übereinstimmung mit der Literatur den Schluss zu, dass eine ideale Gesichtsdrittelung (Kollmann´sche Proportionen) bei der Mehrheit der Bevölkerung nicht nachweisbar ist und die vertikalen Gesichtsproportionen dem Einfluss von Alter, Geschlecht und Wachstumstyp unterliegen, was bei deren Bewertung berücksichtigt werden muss.
Crohn´s disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are idiopathic inflammatory disorders. Environmental factors, infectious microbes, ethnic origin, genetic susceptibility, and a dysregulated immune system can result in mucosal inflammation. However, the etiology of both CD and UC still remains largely unclear. Inflammatory bowel diseaserelated animal models suggest that a combination of genetic susceptibility factors and altered immune response driven by microbial factors in the enteric environment may contribute to the initiation and chronification of the disease. The intestinal immune system represents a complex network of different lymphoid and non-lymphoid cell populations as well as humoral factors. In inflammatory bowel disease, the controlled balance of the intestinal immune system is disturbed at all levels. In CD, naïve T cells preferably differentiate into Th1 or Th17 producing cells, while in UC, these cells differentiate into aberrant Th2 cells. Overall, in active inflammatory bowel disease effector T cell activity (Th1, Th17, Th2) predominates over regulatory T cells. Animal models of intestinal inflammation are indispensable for our understanding of the pathogenesis of CD and UC. When chosen appropriately, these models proved to be a helpful tool to investigate pathophysiological mechanisms, as well as to test emerging therapeutic options in the preclinical phase. 2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) and oxazolone are the two major chemicals applied to induce Th1- and Th2-skewed intestinal inflammation, respectively. Colitis can be induced in susceptible strains of mice by intrarectal instillation of the haptenating substances TNBS or oxazolone in ethanol, which is necessary for an initial desintegration of the epithelial barrier. TNBS or oxazolone are believed to haptenize colonic autologous or microbiotic proteins rendering them immunogenic to the host immune system. While TNBS administration in the presence of ethanol results in a transmural infiltrative disease in the entire colon based on an IL-12/IL-23 driven, Th1-or Th17 mediated response, oxazolone instillation finally leads to a colitis caused by a polarized Th2 IL-13-dominated lymphocyte response. Rectal oxazolone instillation in ethanol produces a more superficial inflammation that affects the distal half of the colon rather than the whole colon. Therapeutic modulation of the disturbed immune response in patients with inflammatory bowel disease still represents a complex challenge in the clinic. Currently, none of the therapeutic measure are disease specific and they generally target the pathophysiology downstream of the driving immunpathology. So, there is still the need to develop a tailored approach to prevention of the initiation and perpetuation of the inflammatory cascade before tissue injury occurs. One important aspect of this approach might involve the induction or re-establishment of immunological tolerance. FTY720 following rapid phosphorylation to FTY-P by endogenous sphingosine kinases acts as a sphingosine-1-phosphate (S1P) receptor agonist and represents the prototype of a new generation of S1P receptor modulators. While changing currently its proposed mode of action still focus on the fact, that FTY720 effectively inhibits the egress of T-cells from lymph nodes, thereby reducing the number of antigen-primed/restimulated cells that re-circulate to peripheral inflammatory tissues. However, recent studies indicate, that its immunomodulatory properties might be more complex and exerted not only via interactions with other S1P receptor subtypes but also via a direct modulation of the inflammatory capacity of dendritic cells (DC) resulting in a modified regulation of T cell effector functions as well as in an induction of regulatory T cells and function. 1,25(OH)2D3, the active form of vitamin D, is a secosteroid hormone that has in addition to its central function in calcium and bone metabolism pronounced immune regulatory properties. The biological effects of calcitriol are mediated by the vitamin D receptor (VDR), a member of the superfamily of nuclear hormone receptors. A number of studies identified calcitriol/VDR as prominent negative regulators of Th1-type immune responses, whereas Th2 responses are not affected or even augmented. These effects have been mainly explained by direct activities on lymphocytes, subsequent studies clearly supported a role of calcitriol in modulating monocyte differentiation or DC maturation. However, to translate the immunosuppressive capacities of calcitriol into an effective immunointervention, a great challenge was the design of structural analogs of calcitriol that are devoid of adverse effects related to hypercalcemic activity. The intense study of the 25-oxa series generated a large number of calcitriol analogs exhibiting substantial dissociation between possible immunomodulatory capacities and undesired hypercalcemia. Especially, the combination of the 22-ene modification with the 25-oxa element as realized in ZK156979 yielded a very promising set of new analogs for further characterization in animal models resembling human autoimmune diseases. So, the overall aim of the studies presented here was to evaluate strategies of enhancing regulatory immunity in mouse models of Th1- and Th2-mediated colitis as a new therapeutic approach. To this end we used FTY720, 22-ene-25-oxa vitamin D (ZK156979), as well as the combination of calcitriol and dexamethasone to evaluate the respective pro-tolerogenic potential in intestinal inflammation models in mice. First, to induce Th1-mediated colitis a rectal enema of TNBS was given to Balb/c mice. FTY720 was administered i.p. from day 0-3 or 3-5. FTY720 substantially reduced all clinical, histopathologic, macroscopic, and microscopic parameters of colitis analyzed. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a down-regulation of IL-12p70 and subsequent Th1 cytokines. Importantly, FTY720 treatment resulted in a prominent up-regulation of FoxP3, IL-10, TGFβ and CTLA4. Moreover, we observed a significant increase of CD25 and FoxP3 expression in isolated lamina propria CD4+ T cells of FTY720-treated mice. The impact of FTY720 on regulatory T cell induction was further confirmed by concomitant in vivo blockade of CTLA4 or IL-10R which significantly abrogated its therapeutic activity. Thus, our data provide new and strong evidence that besides its well-established migratory properties FTY720 down-regulates proinflammatory signals while simultaneously inducing the functional activity of CD4+CD25+ regulatory T cells. In a second approach, the rectal instillation of oxazolone yielded a Th2-mediated colitis. Treatment with FTY720 prominently reduced the clinical and histopathologic severity of oxazolone-induced colitis, abrogating body weight loss, diarrhea, and macroscopic and microscopic intestinal inflammation. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a prominent reduction of the key Th2 effector cytokines IL-13, IL-4 and IL-5. Moreover, FTY720 inhibited GATA3 and T1/ST2 expression, which represent distinct markers for Th2 differentiation and Th2 effector function. Thus, our data are supportive for the view that FTY720 exhibits beneficial prophylactic as well as therapeutic effects in Th2-mediated experimental colitis by directly affecting Th2 cytokine profiles, probably by reducing GATA3 and T1/ST2. Recently, we described 22-ene-25-oxa-vitamin D (ZK156979) as a representative of a novel class of low calcemic vitamin D analogs showing prominent immunomodulative capacities. Here, we used the Th1-mediated TNBS colitis to test its anti-inflammatory properties in vivo. We found that treatment with ZK156979 clearly inhibited the severity of TNBS-induced colitis without exhibiting calcemic effects. Both early and late treatment abrogated all the clinical macroscopic and microscopic parameters of colitis severity; in addition we observed a clear down-regulation of the relevant Th1 cytokine pattern including the T-box transcription factor, T-bet. On the other hand, application of ZK156979 increased local tissue IL-10 and IL-4. Finally, as a new approach we evaluated the pro-tolerogenic potential of calcitriol and dexamethasone in acute Th1-mediated colitis. Calcitriol and/or dexamethasone were administered i.p. from day 0-3 or from day 3-5 following the instillation of the haptenating agent. The combination of these steroids most effectively reduced the clinical and histopathologic severity of TNBS colitis. Th1-related parameters were down- while Th2 markers like IL-4 and GATA3 were up-regulated. Clearly distinguishable from known steroid effects calcitriol in particular promoted regulatory T cell profiles as indicated by a marked increase of IL-10, TGFß, FoxP3 and CTLA4. Furthermore, analysis of DC mediators responsible for a pro-inflammatory differentiation of T cells revealed a clear reduction of IL-12p70, and IL23p19 as well as IL-6 and IL-17. Thus, our data suggest the concept of a steroid-sparing application of calcitriol derivatives in inflammatory bowel disease. Furthermore, the data presented suggest that early markers of inflammatory DC and Th17 differentiation might qualify as new target molecules for both calcitriol as well as for selective immune modulating vitamin D analogs. In conclusion the data of these published investigations added to the substantial progress in understanding the biology of tolerogenic DC and regulatory T cells with respect to their roles in health and disease achieved in the past years. This has led to an increasing interest in the possibility of using DC and regulatory T cells as biological therapeutics to preserve and restore tolerance to self antigens and alloantigens. Especially DC may be helpful to exert their important roles in directing tolerance and immunity by modulation of subpopulations of effector T cells and regulatory T cells. The data demonstrated in the present studies may assist to define the divergent implications of new therapeutic concepts for the treatment of inflammatory bowel disease, especially with regard to a possible auspicious impact on pro-tolerogenic DC and regulatory T cell functions. However, further studies are needed to fulfil our understanding of the complex immunomodulatory profiles of FTY720 as well as of calcitriol and its low calcemic analog ZK156979, thus accelerating their entry into the clinic as new therapeutic options for the cure of inflammatory bowel disease.
1.1 Hintergrund Diese Studie vergleicht in drei Teilen die konservative Behandlung nichtverschobener, nichtdislozierter Unterkiefergelenkfortsatzfrakturen mit der offenen Reposition und Fixierung verschobener und dislozierter Unterkiefergelenkfortsatzfrakturen bei I. Erwachsenen und II. bei Kindern. In einem speziellen III. Teil der Arbeit wird die geschlossene, konservative gegenüber der offenen, operativen Behandlung von nichtdislozierten hohen (Klasse VI nach Spiessl und Schroll1) Gelenkwalzenfrakturen verglichen. 1.2 Patienten und Methodik 1.2.1 Erwachsene 129 Patienten mit 158 Frakturen wurden von 2000 bis 2005 in die Studie aufgenommen. Klassen II bis V, d.h. verschobene und dislozierte Frakturen wurden operiert, also offen reponiert und intern fixiert, fortan als ORIF bezeichnet. Klasse I und VI (nichtverschobene, nichtdislozierte Frakturen) wurden konservativ therapiert und erhielten die geschlossene Therapie, fortan als GT bezeichnet. Nach einem Jahr wurden Gesichtssymmetrie, Schmerz, Fazialisfunktion, Narbenbildung, Reossifikation auf Röntgenkontrollen, Fragmentposition horizontal und vertikal beurteilt sowie inzisale Maximalbewegungen und die Kondylentranslation vermessen. 1.2.2 Kinder 22 Patienten jünger als 14 Jahre wurden von 2000 bis 2005 in die Studie einbezogen. Klasse II bis V nach Spiessl und Schroll, was verschobenen bzw. dislozierten Frakturen entspricht, wurden operiert; Klasse I und VI, entsprechend nicht disloziert und verschoben, konservativ behandelt. In einem Intervall von 1, 2 und 5 Jahren wurde dieses Kollektiv auf dieselbe Art und Weise nachuntersucht wie das Erwachsenenkollektiv. 1.2.3 Klasse VI Es nahmen 22 Patienten zwischen 2001 und 2005 mit 26 Klasse VI Frakturen (4 doppelt) an dieser Studie teil; in randomisiert ausgelegter Weise hatten 9 (41%) ORIF und 13 (59%) GT. Die Nachsorge erfolgte nach einem Jahr auf die bereits beschriebene Art. 1.3 Ergebnisse 1.3.1 Erwachsene Klasse I umfasste 29 Patienten, 37 Frakturen, mit einer relativen Inzidenz von 23%, Klasse II: 23/28/18%, Klasse III: 16/20/13%, Klasse IV: 30/35/22%, Klasse V: 18/23/15%, Klasse VI: 13/15/9%. Klinische Verläufe waren in Klasse I unkompliziert; Klasse II, III und IV erreichten operativ horizontale und vertikale Fragmentreposition mit geringem Knochenumbau. Einzelfälle zeigten persistierenden Schmerz, Dysokklusion und Osteosynthesefrakturen. Die Ergebnisse waren in Klasse V und VI weniger erfolgreich. Obgleich ORIF in Klasse V gute Reposition erreichte, kam es zu ausgeprägtem vertikalen Knochenabbau, Einzelfälle zeigten persistierenden Schmerz, Dysokklusion und Osteosynthesefrakturen. Klasse-VI-Fälle zeigten die schlechteste Translation, ebenfalls ausgeprägten Knochenumbau und gehäuft Dysokklusion. 1.3.2 Kinder 19 (79%) Patienten stellten sich zur Nachsorge vor: Klasse I=8, II=3, III=0, IV=2, V=5, VI=1; 11 Patienten (58%) nach 1 Jahr; 4 (21%) nach 2 Jahren und 4 (21%) nach 5 Jahren. Völlige Symptomfreiheit oder fehlende Motivation war nach telefonischer Aussage der Eltern der Grund für das Nichterscheinen zur Nachsorge. Alle Untersuchten zeigten eine suffiziente Mundöffnung. Ein Klasse-VI-Patient zeigte insuffiziente Kondylentranslation sowie drei Patienten Deflexionen; zwei Patienten partielle Fazialisparesen, die jedoch nach einem Jahr abgeklungen waren; in zwei Fällen wurden gebrochene Osteosynthesematerialien entfernt. Die vertikale und horizontale Kondylenabstützung wurde erfolgreich wiederhergestellt. Nennenswerte Kondylenresorptionen wurden in Klasse V verzeichnet; insgesamt 4 (17%) Misserfolge waren zu verzeichnen, wovon 3 auf Klasse V entfielen. 1.3.3 Klasse VI Insgesamt stellten sich 17 (77%) Patienten zur Nachuntersuchung vor; 8 (47%) wurden geschlossen und 9 (53%) offen therapiert. Alle Patienten zeigten eine normale Mundöffnung. Insuffiziente kondyläre Translation (definiert durch <6mm Translation bei Mundöffnung, Protrusion und Mediotrusion <3mm) trat jeweils bei zwei der ORIF- und GT- Patienten auf. Anhaltender Schmerz bei 2 mit ORIF, Deflexion größer als 4mm ebenfalls bei 2 mit ORIF. Bleibende Nervenparesen wurden nicht verzeichnet. Im Falle eines ORIF- Patienten wurde gebrochenes Osteosynthesematerial entfernt und im Falle eines GT- Patienten war eine starke Dysokklusion erkennbar. Die vertikale Position des medialen Fragments wurde mit ORIF erfolgreich wiederhergestellt, wenn dies auch mit einem beträchtlichen Umbauprozess verbunden war (der laterale Kondylenpol ist bei Klasse VI unverändert). Die geschlossene Therapie versagte in der vertikalen Wiederherstellung des medianen Kondylenpols, zeigte aber weniger Umbauprozesse. Die Winkelabweichung war bei ORIF erfolgreich reduziert, bei der GT konnte eine leichte Winkelvergrößerung verzeichnet werden. 1.4 Schlussfolgerung Klasse V und VI stellen im großen Kollektiv der Erwachsenen nach wie vor die komplexesten Anforderungen, während die übrigen Klassen nach den Richtlinien dieser Studie gut therapiert werden können. Beim kleineren Kollektiv der Kinder ist das Behandlungsprinzip zu 83% erfolgreich, wobei auch hier die größten Probleme bei Klasse V liegen. Innerhalb der Klasse-VI-Studie ergab die GT 2/8 (25%) und ORIF 2/9 (22%) inakzeptable Ergebnisse und postoperativen Kondylenumbau. Insgesamt erreichte hier die Erfolgsrate 75 zu 78%. Wenn hier also nicht die GT zukünftig vorzuziehen ist, könnten hochfeste resorbierbare Osteosynthesen mit intraossärer Lokalisation ein besseres Ergebnis liefern als die Mikroplatten und Schrauben an der dorsalen Kondylenzirkumferenz, die in dieser Studie verwendet wurden. Insgesamt könnte der Gelenkumbau in Klasse V und VI und die Translation in Klasse VI durch noch vorsichtigere Mobilisation und verbesserte Osteosynthese sowie von einem minimalisierten Operationstrauma profitieren.
Situierte Kritik: Modelle kritischer Praxis in Hermeneutik, Poststrukturalismus und Neopragmatismus
(2008)
Wie ist Kritik an sozialen Verhältnissen möglich? Welches sind ihre Bedingungen, ihre Verfahren und ihre Grenzen? Diese Studie konturiert den Spielraum kritischer Praxis, indem sie die Aspekte der Analyse, Evaluation und Transformation gesellschaftlicher Wirklichkeit mit Blick auf Ansätze hermeneutischer, poststrukturalistischer und neopragmatistischer Philosophie (insbesondere von Gadamer, Butler und Rorty) expliziert. Aufgrund der sozialen Konstitution von Subjektivität, Rationalität und Normativität kann Kritik dabei nicht mit Bezug auf universelle überzeitliche Maßstäbe erläutert werden, sondern als ‚situierte Kritik‘, die ihre Ausgangs- und Orientierungspunkte in den herrschenden Verhältnissen selbst findet.
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist charakterisiert durch einen Differenzierungsblock sowie aberrante Selbsterneuerung („self-renewal“) hämatopoetischer Vorläuferzellen im Knochenmark (Grignani, 1993). Bei Patienten mit akuter Promyelozyten-Leukämie (APL), einem Subtyp der AML, bezeichnet als M3 gemäß FAB(„French-American-British“)-Klassifikation, ist dieser Phänotyp induziert durch die spezifischen Leukämie-assoziierten chromosomalen Translokationen t(15;17) sowie t(11/17). Beide involvieren einen identischen Anteil des Retinsäure-Rezeptors Alpha (RAR-Alpha) und jeweils entweder Gene der Promyelozyten-Leukämie (PML) oder promyelozytäre Zinkfinger (PLZF). Durch homologe Oligomerisierung, vermittelt durch die PCC(“coiled-coil”)-Domäne beim PML (Grignani, 1999) und die BTB/POZDomäne beim PLZF (Benedetti, 1997), formieren die Fusionsproteine PML/RAR und PLZF/RAR-Alpha in vivo HMW(“high molecular weight“)-Komplexe (Melnick, 1999). Im Vergleich zum RAR-Alpha von Wildtyp-Zellen zeigen diese erhöhte Affinität zu “Histone-Deacetylase-Recruiting-Nuclear- Corepressor”-Komplexen, was über aberrante Rekrutierung der Histon- Deazetylase zu konstitutiver Hypoazetylierung der Histone und schließlich zur Blockade der Transkription von Genen, die für eine Ausdifferenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen bedeutsam sind, führt. Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist das molekulare Targeting der Oligomerisierungsdomänen von PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha in vitro. Hierfür werden retrovirale Vektoren mit artifiziellen Fusionsgenen kloniert. Diese bestehen aus jeweils PCC-ABL oder POZ-ABL, welche sich aus der ABLKinase des Philadelphia-Chromosoms BCR/ABL und den spezifischen Oligomerisierungsdomänen von PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha zusammensetzen sowie den Peptiden PCC und POZ mit analogen Strukturen zu diesen Domänen. Fusionen der ABL-Kinase mit den Oligomerisierungsdomänen von PML und PLZF führen wie bei BCR (Beissert, 2003) zur konstitutiven ABLAktivität und vermitteln IL-3-unabhängiges Wachstum von Ba/F3-Zellen (murine Pro-B-Zelllinie). Die jeweils koexprimierten Peptide lagern sich an die analogen Proteinstrukturen von PCC-ABL und POZ-ABL an und stören deren homologe Oligomerisierung, was die IL-3-Unabhängigkeit gänzlich aufhebt. Dies wird über Wachstumskurven, Durchflusszytometrie (FACS) und Westernblot gezeigt. Folgend werden Vektoren zur Koexpression der kompletten APLcharakterisierenden Fusionsgene PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha zusammen mit identischen Peptiden kloniert, um mit diesen Sca1+/lin--selektionierte, murine, hämatopoetische Stammzellen zu infizieren. Deren Differenzierungsgrad wird über Zählung der Kolonien-formenden Einheiten (“Colony Forming Units” - CFUs), über deren Kolonie-Morphologie, deren Zytologie sowie Stammzell- und Differenzierungsoberflächenmarker bestimmt. Die Kontrollen mit alleiniger Expression der Fusionsproteine sowie zusammen mit vertauschten Peptiden zeigen die bekannte Morphologie von Promyelozyten, während die Koexpression der interferierenden Peptide zu deutlich akzelerierter Ausdifferenzierung führt. Eine erhöhte Replating-Effizienz durch die aberrante Fähigkeit zur Selbsterneuerung, eine typische Eigenschaften leukämischer Blasten, wird unter Einfluss interferierender Peptide nicht beobachtet. Hierfür wird ursächlich eine Störung der HMW-Komplex-Bildung beschrieben. Die Fusionsproteine PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha werden durch dieses Targeting über Westernblot nicht mehr nachgewiesen und somit als proteasomal degradiert angenommen. Das Vorliegen der Fusionsgene von PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha in den bei diesen Experimenten verwendeten Zellen kann auf RNA-Ebene über RT-PCR gezeigt werden. Zusammenfassend beschreibt die Koexpression von spezifischen Peptiden, die mit Oligomerisierungsdomänen von Fusionsproteinen, wie hier PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha, interferieren, einen neuen, vielversprechenden Ansatz bei der Therapie von Leukämien.
Talentierte Nachwuchsspieler fördern, dieser Aufgabe nehmen sich sowohl Fußballverbände als auch Fußballvereine an. Vereine kommen dieser Aufgabe in ihren Vereinsjugendmannschaften nach; der DFB - als Dachverband des organisierten Fußballs in Deutschland - widmet sich seit 2002 im Rahmen seines Talentförderprogramms verstärkt diesem Aufgabenfeld. Wesentliche Schwerpunkte des DFB-Talentförderprogramms stellen das Erlernen und Festigen von technischen und individualtaktischen Elementen dar. Konzeptionell untermauert werden derartige Fördermaßnahmen durch die Ausbildungskonzeption des DFB. Diese beschäftigt sich neben dem systematischen technisch-taktischen und konditionellen Leistungsaufbau auch mit der Persönlichkeitsförderung talentierter Nachwuchsspieler. Ziel dieser Arbeit ist es, aufbauend auf bisherigen Untersuchungsergebnissen der Unterrichtswissenschaft diesbezügliche Möglichkeiten kooperativer Vermittlungsformen im Fußball-Juniorentraining zu beleuchten. So werden Zusammenhänge bzw. Perspektiven diskutiert und Effekte kooperativer Trainingsformen veranschaulicht. Im Rahmen der theoretischen Auseinandersetzung wird deutlich, dass die Fußballtechnik mit ihren charakteristischen Merkmalen auf der Schnittstelle zwischen rein fertigkeitsbezogenen und typisch taktischen Anforderungen liegt: Technik und Taktik verschmelzen demnach in der Spielsituation. Ein Techniktraining mit einer Zentrierung auf Bewegungsabläufe wird dieser Komplexität nicht gerecht. Entscheidend für die erfolgreiche Bewältigung einer Spielsituation sind neben verlaufsbezogenen Bewegungsmerkmalen auch Wahrnehmungs- und Entscheidungskomponenten sowie die Bewältigung von Druckkomponenten. In diesem Zusammenhang erscheint es lohnend, Fähigkeiten aufzubauen, die eine erfolgreiche Lösung des übergeordneten Problems – die Einsicht in Sinnzusammenhänge – ermöglichen (vgl. SINNING 2003; RIEPE 2000; SCHERER 1995). Die Einsicht in die Struktur (Zusammengehörigkeit) von Informationen, die vorher so nicht vorhanden war, stellt somit - neben der Förderung der Eigeninitiative und der Verantwortung für das eigene Lernen - die Intention kooperativer Trainingsformen im Fußball-Juniorentraining dar. Hierbei erscheinen insbesondere die Entwicklung eigener Ideen und Lösungen im Training und die daraus resultierende erfolgreiche Handlungsfähigkeit in Spielsituationen von Bedeutung. So werden im empirischen Arbeitsteil Auswirkungen kooperativer Trainingsformen auf das „Entscheidungsverhalten“ talentierter Nachwuchsspieler bzw. das „Effektverhalten individualtaktischer Aktionen“ analysiert. Gleichermaßen werden Effekte kooperativer Trainingsformen im Bereich der „Teamkompetenz“ überprüft. Es bleibt festzuhalten, dass es bei den kooperativ Trainierenden im Entscheidungsverhalten zu einer nachhaltigen (Intervall AT - RT) signifikanten Verbesserung kommt - bei traditionell trainierten Probanden ist ein diesbezüglicher Fortschritt im Rahmen dieser Untersuchung nicht zu beobachten. Gleichermaßen signifikant verbessert sich die Teamkompetenz (Solidaritätsfähigkeit) der kooperativ trainierenden Probanden unmittelbar im Anschluss an den Trainingszeitraum (Intervall ET - AT). Im Intervall zum RT tritt zudem keine signifikante Verschlechterung in der späten Phase des Lernprozesses auf. Diese Untersuchungsergebnisse stehen im Einklang mit bisherigen unterrichts- bzw. sportwissenschaftlichen Befunden (GRÖBEN und KRAUSS 2004; BÄHR et al. 2007) und unterstützen den im Theorieteil dieser Arbeit entwickelten Ansatz einer Implementierung kooperativer Trainingsformen in das Fußball-Juniorentraining. Hingegen erfährt das Effektverhalten individualtaktischer Aktionen - sprich die erfolgreiche Umsetzung eines Passes, Dribblings oder Torschusses - durch ein traditionelles Training unmittelbar (Intervall ET - AT) eine signifikante Verbesserung. Kooperative Trainingsformen erzielen in diesem Zusammenhang keinen vergleichbaren Effekt. Darüber hinaus lassen sich im Rahmen dieser Untersuchung - aufgrund des vorliegenden Stichprobeneffektes - keine validen Aussagen hinsichtlich der intergruppenspezifischen Entwicklung der Variablen „Entscheidungsverhalten“ und „Effektverhalten individualtaktischer Aktionen“ treffen. An dieser Stelle sei nochmals angemerkt, dass der vorliegende Stichprobeneffekt trotz eines umfassenden Parallelisierungsverfahrens (vgl. 3.4.1) zum Tragen kommt. Daher erscheint es bei weiterführenden Untersuchungen sinnvoll, sich im Rahmen des Parallelisierungsverfahren verstärkt mit der Qualität von Beobachtungs-/ Einteilungskriterien zu beschäftigen bzw. die Beobachtungen der Experten hinsichtlich ihrer Validität zu prüfen. Abschließend betrachtet, sollte es in Anbetracht der Ziele und Schwerpunkte, die im Rahmen der Talentförderung im Juniorenfußball eine Rolle spielen (vgl. DFB-Ausbildungskonzeption), weiterhin ein wissenschaftliches Anliegen sein, aufbauend auf den vorliegenden Befunden und Erhebungsinstrumenten (Bewertungsbogen zum Entscheidungsverhalten und Effektverhalten individualtaktischer Aktionen), Möglichkeiten kooperativer Trainingsformen im Fußball-Juniorentraining zu analysieren. Eine verstärkte Differenzierung zwischen „lernen“, „üben“ und „trainieren“, sollte in diesem Zusammenhang bei zukünftigen Forschungsarbeiten Berücksichtigung finden. Theoretische Begründungszusammenhänge sowie erste positive empirische Ergebnisse kooperativer Trainingsformen konnten mit Hilfe dieser Arbeit aufgezeigt werden.
Funktionelle Charakterisierung von Peptidliganden für das komplexe HIV-1-RNA-Verpackungssignal PSI
(2008)
Im Laufe der vergangenen Jahre hat die Identifizierung von Peptidleitstrukturen in der Wirkstoffentwicklung zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Phage Display Technologie ist eine Methode, welche zur Selektion von inhibitorischen Peptiden weit verbreitet ist. Prinzipiell eignet sich dieser Ansatz auch für die Suche nach neuen Leitstrukturen für die Therapie der HIV-Infektion, welche in hochspezifische und -regulierte Schritte im HIV-Replikationszyklus eingreifen sollen. Bei der Verpackung viraler RNA in neu entstehende Virionen handelt es sich um einen Prozess, welcher auf der gezielten Erkennung der dreidimensionalen Struktur der PSI-Region am 5'-Ende ungespleißter, viraler RNA durch die NCp7-Domäne des Gagp55-Vorläuferproteins basiert. Darüber hinaus partizipiert das NCp7-Protein noch an der Reversen Transkription der HIV-RNA sowie an der Integration proviraler DNA und spielt somit eine zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus. In vorangegangenen Arbeiten konnten wir mittels der Phage Display Technologie Peptidliganden für die HIV-1 PSI-RNA selektieren, welche die PSI-RNA-NCp7-Interaktion hemmten und in Folge dessen die Verpackung viraler RNA verhindern sollten. Die Bindung der identifizierten tryptophanreichen Peptide an die PSI-RNA konnte zwar zum Teil in vitro mit NCp7 kompetitiert werden, jedoch wiesen die Peptide eine relativ geringe Affinität für die PSI-RNA auf. Im Vordergrund der vorliegenden Arbeit stand nach Optimierung der Affinität eine umfassende funktionelle Charakterisierung der Peptide hinsichtlich ihrer antiviralen Aktivität in vitro. Zunächst gelang es mittels Spot-Synthese-Membranen die Affinität der PSI-RNA-bindenden Peptide um etwa das 30-fache zu verbessern. Der KD-Wert des optimierten HKWPWW-Peptids lag bei 1,1 µM für ein Teilelement der PSI-RNA, das allein über Verpackungsaktivitäten verfügt. Die folgende Analyse der Bindungseigenschaften des HKWPWW-Peptids an die PSI-RNA über NMR und Fluoreszenz-Spektroskopie offenbarte, dass das Peptid über die hydrophoben Aminosäuren an eine charakteristische Schleifenregion in der Sekundärstruktur der PSI-RNA bindet, ähnlich wie der natürliche Ligand NCp7. Gestützt auf diese Ergebnisse, wurde im Hauptteil des Projekts untersucht, ob das HKWPWW-Peptid in der Lage ist, die Verpackung viraler RNA in HI-Virionen zu hemmen. Hierfür erfolgte die Etablierung diverser Testsysteme, welche die intrazelluläre Expression des Peptids ermöglichten. Die Expression von HKWPWW in Fusion mit RFP in Pseudoviren-produzierenden Zellen über transiente Transfektion führte in der höchsten getesteten DNA-Konzentration (2,5 µg) zu einer 95%igen Reduktion des infektiösen Titers. Dieser inhibitorische Effekt war spezifisch für lentivirale Pseudoviren, da die Produktion gammaretroviraler Pseudoviren nicht durch die Anwesenheit des Peptids beeinflusst wurde. Mittels einer stabilen HKWPWW-exprimierenden T-Zelllinie gelang es nachzuweisen, dass das Peptid sogar in der Lage ist, replikationskompetentes HIV über einen Zeitraum von fünf Tagen zu hemmen. Die Synthese des HKWPWW-Peptids in Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne ermöglichte die direkte Behandlung von HIV-infizierten Zellen und führte zu einer verminderten Freisetzung infektiöser HI-Viren in die Zellkulturüberstände. Dabei lagen die IC50- und IC90-Werte des HKWPWW-Peptids nach zweimaliger Peptidzugabe bei 5, 7 bzw. 28,6 µM. Eine in der Literatur oftmals beschriebene Beobachtung ist, dass bei einer reinen Hemmung der HIV-Verpackung Viren entstehen, welche keine virale RNA enthalten. Das Phänomen war in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids wenig ausgeprägt wie Korrelationen von p24-Antigen-ELISA und die Quantifizierung viraler RNA in Viruspartikeln zeigten. Diese Gegebenheit sowie das Wissen über die mannigfaltigen Funktionen des NCp7-Proteins im HIV-Replikationszyklus ließen vermuten, dass HKWPWW noch zusätzlich andere Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen könnte. Unterstützt wurde diese Annahme dadurch, dass HKWPWW Ähnlichkeiten zu der hydrophoben Plattform von NCp7 aufweist, welche essentiell für die Verpackung viraler RNA sowie die Reverse Transkription ist. Damit in Einklang steht, das neben einer Bindung an die PSI-RNA auch eine schwächere Interaktion des HKWPWW-Peptids mit den viralen TAR- und PBS-Strukturen nachgewiesen werden konnte. Die auch beobachtete Hemmung der frühen HIV-Replikationsschritte durch HKWPWW könnte somit mit einer möglichen Hemmung der Transkription viraler Gene, der Reversen Transkription oder Integration erklärt werden. Jedoch zeigte die elektronenmikroskopische Analyse, dass nicht nur weniger Viren in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids entstehen, sondern dass diese zum Teil einen weniger kondensierten Kern aufweisen. Dies kann als ein Anhaltspunkt angesehen werden, dass HKWPWW tatsächlich auch auf der Ebene der RNA-Verpackung bzw. der viralen Partikelentstehung einen hemmenden Effekt ausübt. Somit resultiert die beobachtete antivirale Aktivität des HKWPWW-Peptids vermutlich aus kombinierten inhibitorischen Effekten auf mehreren Ebenen der HIV-Replikation.
Der menschliche Körper ist permanent verschiedenen Mikroorganismen aus der Umwelt ausgesetzt. Dringen diese in den Körper ein, werden sie oder ihre Produkte vom Körper als „fremd“ erkannt und abgewehrt. Dies geschieht über zwei unterschiedliche immunologische Systeme, dem schnell und zuerst reagierenden angeborenen und einem langsamer reagierenden erworbenen Immunsystem. Vom angeborenen Immunsystem erkannt werden so genannte pathogen associated molecular pattern, zu denen auch die CpG-DNA zählt, welche als Ligand des TLR9 identifiziert wurde. CpG- und Non-CpG-ODN sind bislang hauptsächlich an Zellen des Immunsystems erforscht und bewirken dort eine Immunaktivierung und einen pro-inflammatorischen Effekt, der mit dem Ausschütten inflammatorischer Zytokine einhergeht. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass sowohl CpG- als auch Non-CpGPTO-ODN an humanen Keratinozyten eine IL-8-Suppression bewirken. Diese IL-8-supprimierende Wirkung wird nicht über den beschriebenen Rezeptor für CpG-DNA TLR9 entfaltet, sondern vermutlich mittels direkter physikalischer Interaktion mit IL-8 selbst. Durch diese Maskierung des IL-8 kann das Chemokin im ELISA nicht mehr detektiert werden. Des Weiteren gelang im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit der funktionelle Nachweis, dass auch in vivo (im Kontaktdermatitis-Mausmodell) bei topischer Applikation eine anti-inflammatorische Wirkung durch eine Non-CpG-ODN-haltige Salbe erzielt werden kann. Auf intakter Haut, welche permanent mit einer eigenen Mikroflora besiedelt und somit auch permanent mit bakterieller DNA konfrontiert ist, lösen CpG- und Non-CpG-ODN eine Immunsuppression aus, vermutlich als Schutz vor überschießenden Entzündungen der Haut. Außerdem konnte anhand konfokaler Laser-Scan Mikroskopie gezeigt werden, dass die verwendeten ODN längen- und sequenzspezifisch in Keratinozyten aufgenommen und innerhalb der Zellen transportiert werden. Hier zeigte sich, dass Sequenzen, welche bei der IL-8-Suppression nur geringe oder keine Effekte zeigen, direkt in den Nukleus oder die Nukleoli transportiert werden, wo sie vermutlich an nukleare Bestandteile gebunden oder abgebaut werden. Untersuchungen zum Penetrationsverhalten der ODN an Multilayern zeigten, dass die ODN auch hier längenabhängig in tiefere viable Schichten gelangen. Die Untersuchungen zum Penetrations- und Aufnahme-Verhalten der ODN ist für einen möglichen therapeutischen Einsatz der ODN von hohem Interesse. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit gelang zudem erstmals der Nachweis, dass PTO-ODN in der Lage sind, die zum angeborenen Immunsystem zählenden anti-mikrobiell wirksamen Substanzen HbD2, HbD3 und Psoriasin zu induzieren. Diese werden in der Haut synthetisiert und schützen gegen eine ganze Reihe von Mikroorganismen. Anhand Promoter-Aktivitätsstudien konnte demonstriert werden, dass die verwendeten ODN eine Aktivierung von NF K B vermitteln, welche in direktem Zusammenhang mit einer HbD2-Induktion steht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CpG- und Non-CpG-ODN zwar als "fremd" und potentiell gefährlich in intakter Haut erkannt werden, wodurch eine Induktion von anti-mikrobiell wirksamen Substanzen ausgelöst wird. Gleichzeitig findet jedoch eine IL-8-Suppression (in vitro), beziehungsweise eine anti-inflammatorische Wirkung (in vivo) statt, welche vermutlich vor überschießenden Immunreaktionen der Haut schützen sollen.
Das medulläre Schilddrüsencarcinom ist ein maligner Tumor der parafollikulären calcitoninbildenden C-Zellen der Schilddrüse. In der Nachsorge der Patienten mit MTC stellt die Bestimmung des Calcitonin und CEA-Wertes im Serum zurzeit den Gold-Standard dar. In den letzten Jahren hat die Einführung der in hohem Maße sensitiven RT-PCR-Technik die Diagnose und den frühen Nachweis von Metastasen bei einigen Krebsformen verbessert. Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Methode, mit welcher der molekulare Nachweis der Calcitonin-mRNA und carcinoembryonale Antigen-mRNA im peripheren Blut von Patienten mit medullärem Schilddrüsencarcinom und nachgewiesenen Fernmetastasen durchgeführt wurde. Bei keinem der untersuchten Patienten konnte CT-mRNA im peripheren Blut nachwiesen werden, obwohl die CT-Werte im Serum bei allen MTC Patienten erhöht waren. CEA mRNA wurde häufiger bei Patienten mit MTC (54 %) als in der Kontrollgruppe (34,4%) nachgewiesen. Der Grund für den hohen Anteil falsch positiver CEA-mRNA Nachweise bei Kontrollpatienten ist unbekannt. Vermutet wird eine „illegitime Transkription“. Die Ergebnisse zeigen, daß Calcitonin mRNA kein geeigneter Parameter für den Nachweis zirkulierender Tumorzellen bei Patienten mit medullärem Schilddrüsencarcinom ist. Im Gegensatz dazu könnte der Nachweis der CEA mRNA eine Verbesserung der frühen Diagnose des metastasierten medullären Schilddrüsencarcinoms darstellen.
Es ist bekannt, dass Curcumin in einer Vielzahl verschiedener Zellarten die Proliferation hemmt und Apoptose induziert. In der Literatur werden Konzentrationen von 10 bis 150 µM (3.7-55 µg/ml) als dafür notwendig beschrieben. Da Curcumin nach oraler Aufnahme, aufgrund seiner schlechten Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt, eine geringe Bioverfügbarkeit im Organismus aufweist, sind therapeutische Lösungen erforderlich um Curcumin besser nutzen zu können. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Wirkung von geringen Mengen Curcumin, die allein keine Effekte zur Folge haben, in Zusammenwirkung mit Licht untersucht. Es wurde gezeigt, dass bereits Konzentrationen von 0,2-1 µg/ml in Keratinozyten die Proliferation hemmen, wenn sie mit UVA- oder sichtbarer Licht-Bestrahlung kombiniert werden. Desweiteren wurde belegt, dass diese Behandlung Apoptose in HaCaT-Zellen induziert, wobei der mitochondriale Apoptoseapparat aktiviert wird. Dies belegen die Freisetzung von Cytochrom c und die frühe Spaltung der Caspase-9 wohingegen Caspase-8 zeitverzögert aktiviert wurde. Weiterhin wurde dargelegt, dass Erk1/2, PKB/Akt und PKC durch Curcumin/Licht gehemmt werden, wohingegen p38 durch diese Behandlung eine Aktivierung erfährt. Zusätzlich ergab sich ein inhibierender Einfluss auf den EGF-Rezeptor, einem “upstream”-Regulator all dieser Kinasen, und den Transkriptionsfaktor NF-kappaB. Bei in vivo-Studien an immundefizienten Mäusen mit A431-Xenografts hatte eine Behandlung mit i.p. verabreichtem Curcumin und anschließender Bestrahlung mit sichtbarem Licht einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf das Tumorwachstum zur Folge. In diesen Tumoren fand eine Reduktion der Ki-67-Expression sowie eine Induktion von „apoptotic bodies“ statt. Western Blot-Analysen bestätigten die Apoptoseinduktion durch eine verstärkte Aktivierung der Caspase-9. Zusätzlich zeigte sich auch eine Hemmung von Erk1/2 sowie EGF-R nach beschriebener Behandlung in den Tumoren. Die Wirkungsweise des Curcumins in Kombination mit Licht in vitro wie auch in vivo weisen auf einen neuen therapeutischen Ansatz einer photodynamischen Therapie hin. Dabei kann durch die Verwendung von sichtbarem Licht auf den Einsatz der karzinogenen UV-Bestrahlung, wie sie in üblichen Phototherapien angewandt wird, verzichtet werden.
Struktur, Funktion und Dynamik von Na(+)-, H(+)-Antiportern : eine infrarotspektroskopische Studie
(2008)
Die Funktion von Membranproteinen ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Um diese verstehen zu können, ist das Verständnis der Beziehungen zwischen der Struktur, der Dynamik und der Wechselwirkung mit der Umgebung der Membranproteine notwendig. Spektroskopische Methoden, wie beispielsweise FTIR- und CD-Spektroskopie sind in der Lage, diese Informationen zu geben. In der vorliegenden Dissertation haben sie bedeutende Beiträge zum Verständnis der durch die Aktivierung induzierten Konformationsänderungen der Na+/H+ Antiporter geleistet. Die hohe Empfindlichkeit einer selbstkonstruierten FTIR-ATR-Perfusionszelle ermöglichte es, über eine Proteinprobe verschiedene Wirkstoffmoleküle perfundieren zu lassen und die dadurch verursachten strukturellen Änderungen spektroskopisch zu charakterisieren. Die Konformationsänderungen, die den Aktivierungsprozess begleiten, wurden bei zwei verschiedenen Na+/H+ Antiportern, NhaA und MjNhaP1, untersucht. Sie werden bei unterschiedlichen pH-Bereichen aktiviert bzw. deaktiviert. Der Na+/H+ Antiporter NhaA aus E. coli hat seine maximale Transportaktivität bei pH 8,5 und ist bei pH < 6,5 vollständig inaktiv. Trotz bekannter 3D-Struktur dieses Proteins für die inaktive Konformation bei pH 4 bleiben die Konformationsänderungen, die mit der Aktivierung des Proteins einhergehen, immer noch ungeklärt. Die Analyse der FTIR- und CD-Spektren von NhaA ergab in beiden Zuständen Anteile an beta-Faltblatt, an Schleifen und ungeordneten Strukturen, wobei die alpha-helikale Struktur dominiert. Die FTIR Spektren des inaktiven und aktiven Zustands zeigen zwei Komponenten, die auf die Präsenz zweier alpha-Helices mit unterschiedlichen Eigenschaften abhängig vom Aktivitätszustand hindeuteten. Die temperaturinduzierten strukturellen Änderungen und die Reorganisation des Proteins während des Entfaltungsprozesses bestätigten, dass die Aktivierung des Proteins eine Änderung in den Eigenschaften der alpha-Helices zur Folge hat. Aktivierung führt zu einer thermischen Destabilisierung dieser Struktur. Auch für die beta-Faltblattstruktur, welche den Hauptkontakt zwischen den Monomeren bildet, wurde ein unterschiedliches thermisches Verhalten zwischen dem inaktiven und aktiven Zustand beobachtet. Daraus konnte gefolgert werden, dass Aktivität nur dann möglich ist, wenn NhaA als Dimer vorliegt. Die Ergebnisse des (1)H/(2)H Austauschs zeigen, dass die Lösungsmittelzugänglichkeit des Proteins sich mit der Aktivierung ändert. Die Aktivierung des Proteins induziert eine offene, für die Lösung zugänglichere Konformation, in welcher die Aminosäureseitenketten in der hydrophilen Region des Proteins schneller Wasserstoff durch Deuterium austauschen, und in welcher zusätzliche Aminosäureseitenketten, die sich im inaktiven Zustand in der hydrophoben Region des Proteins befinden, mit der Aktivierung der Lösung exponiert werden. Die Aufnahme reaktionsinduzierter Differenzspektren ergab eindeutige spektroskopische Signaturen für die Zustände „inaktiv“ und „aktiv“. Die Differenzspektren der pH-Titration zeigten, dass der pH-Wert einen dramatischen Effekt sowohl auf die Sekundärstruktur als auch auf den Protonierungszustand der Aminosäureseitenketten hat. Die pH- und Na+-induzierte Aktivierung des Proteins führt zur Umwandlung der transmembranen alpha-helikalen Struktur bezüglich Länge, Ordnungsgrad und/oder Anordnung und zur einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Glutaminsäure oder Asparaginsäure. Die pD induzierten Sekundärstrukturänderungen lieferten zusätzlich Informationen über die Umgebungsänderung der Aminosäureseitenkette des Tyrosins mit der Aktivierung. Der Vergleich der durch die Bindung des Natriums und des Inhibitors induzierten Differenzspektren zeigte, dass die Bindungsstellen des Natriums und des Inhibitors unterschiedlich sind. Die FTIR- und CD-Ergebnisse für den Na+/H+ Antiporter MjNhaP1 aus M. jannaschii, der im Gegensatz zu NhaA bei pH 6 aktiv und bei pH Werten > 8 inaktiv ist, zeigten, dass ähnlich wie NhaA das Protein im aktiven Zustand bei pH 6 hauptsächlich aus alpha-Helices aufgebaut ist. Es bestand die Möglichkeit, zwei verschiedene Probenpräparationen (Protein in Detergenz bzw. in 2D-Kristallen) zu untersuchen und miteinander zu vergleichen. Die Erhöhung des pH-Werts bei der in Detergenz solubilisierten Probe führte zu einer Abnahme der alpha-helikalen und einer Zunahme der ungeordneten Strukturen. Das äußerte sich auch in den Untersuchungen zur thermischen Stabilität und im (1)H/(2)H Austauschexperiment. Die thermische Stabilität der alpha-Helices nahm mit der Inaktivierung dramatisch ab. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass bei der Aktivierung von MjNhaP1 die beta-Faltblattstruktur nicht involviert ist, aber diese von fundamentaler Bedeutung für die Gesamtstabilität des Proteins und wahrscheinlich für den Hauptkontakt zwischen den Monomeren verantwortlich ist. Im Gegensatz zu NhaA ist die Monomer Monomer Wechselwirkung nicht für die Aktivität von MjNhaP1 notwendig. Aufgrund des höheren Anteils von ungeordneter Struktur im inaktiven Zustand der in Detergenz solubilisierten Probe beobachtet man in diesem Zustand einen höheren (1)H/(2)H Austausch. Der Vergleich mit den Ergebnissen des (1)H/(2)H Austausches von 2D-Kristallen ermöglichte die Lokalisation der ungeordneten Struktur an der Außenseite des Proteinmoleküls im inaktiven Zustand. Die pH-induzierten Differenzspektren zeigten, dass die Aktivierung zu einer Helikalisierung des Proteins und einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Asparaginsäure und/oder Glutaminsäure unabhängig von der Probenpräparation führt. Der Vergleich von NhaA und MjNhaP1 zeigt, dass die Aktivierung in beiden Fällen mit einer Konformationsänderung und Änderung der Protonierung oder der Umgebung von einer oder mehreren Seitenketten von Asparaginsäure oder Glutaminsäure verbunden ist. Dabei sind die Strukturänderungen der beiden Proteine während der Aktivierung ähnlich, bei Inaktivierung jedoch deutlich unterscheidbar. Die pH-induzierten Strukturänderungen wurden bei NhaA und MjNhaP1 durch die Mutanten G338S und R347A, die keine pH-Abhängigkeit der Aktivität zeigen, bestätigt.
Methodik: Die Daten von 1553 Patienten mit Knotenstrumen, die in den Jahren 2004 und 2005 im Bürgerhospital Frankfurt am Main operiert worden sind, wurden analysiert. Patienten mit einem bereits klinisch manifestem C-Zell-Karzinom, mit einem Rezidiv oder mit einem durch ein genetisches Familienscreening (MEN 2a, MEN 2b, fCZK) entdeckten C-Zell-Karzinom wurden aus der weiteren Analyse vorerst herausgenommen und in einer gesonderten Gruppe zusammengefasst. Im weiteren Verlauf erfolgte die Aufteilung der 1553 Patienten in einen Teil, der bereits mit vorbestimmten basalen Calcitoninwerten in das Bürgerhospital überwiesen wurde und in einen anderen Teil, bei dem diese Bestimmung erstmalig im Rahmen des im Bürgerhospital routinemäßig durchgeführten Calcitoninscreenings bei Strumapatienten erfolgte. Bei beiden Gruppen wurden dann diejenigen Patienten näher betrachtet, die einen pathologischen, präoperativen, basalen Calcitoninwerte hatten. Die Grenzwerte für ein pathologisches Ergebnis wurden hierbei nach Geschlecht differenziert: für Männer galt basal 10 [ng/l], für Frauen hingegen 5 [ng/l]. Auf einen pathologisch hohen basalen Calcitoninwert folgte in der Regel bei jedem Patienten ein Calcitoninstimulationstest mit Pentagastrin (i.v. Injektion von 0,5 [mikro-g/kg Körpergewicht], Bestimmung des CT bei Minute 0, 2, 5 10, höchster gemessener CT-Wert galt als stimuliertes CT (sCT)). Hier lagen die Grenzwerte auch nach Geschlecht differenziert bei 100 [ng/l] für Männer und 50 [ng/l] für Frauen. Nach dem Ergebnis des Stimulationswertes richtete sich die Wahl der Operationsmethode: Fiel der Stimulationstest pathologisch aus, so wurde eine Thyreoidektomie (TTX) oder isthmuserhaltende Thyreoidektomie (IPTB) durchgeführt. War der Stimulationstest dagegen negativ, so wurde eine subtotale Entfernung der Schilddrüse angestrebt. Bei allen Patienten erfolgte postoperativ neben der histologischen auch eine immunhistologische Untersuchung des entfernten Schilddrüsengewebes, sowie eine erneute Bestimmung der basalen und stimulierten Serumcalcitoninwerte. Stellte sich in der Immunhistologie eine C-Zell-Pathologie heraus, so wurde bei dem betroffenen Patienten weiterhin noch eine genetische Analyse auf das Vorliegen eines MEN 2a, 2b oder familiären C-Zell-Karzinoms durchgeführt. Die statistische Analyse der Daten erfolgte rein deskriptiv. Dabei wurden das arithmetische Mittel, der Median, die Range und der Quartilabstand verwendet. Die Bestimmung einer Signifikanz war zur Beantwortung der Fragestellung nicht nötig. Ergebnisse: Von den 1553 Patienten hatten insgesamt 120 ein präoperativ erhöhtes Calcitonin. Von diesen 120 Patienten hatten 14 ein C-Zell-Karzinom, 40 eine C-Zell-Hyperplasie und 66 keine C-Zell- Pathologie. Trennt man diese Gruppe der 120 Patienten in diejenigen, die schon von extern mit einem gemessenen Calcitoninwert kamen (Gruppe A) und diejenigen bei, denen intern im Bürgerhospital im Rahmen des routinemäßigen Calcitoninscreenings erstmals der basale Calcitoninwert bestimmt wurde (Gruppe B), so entfallen auf die Externen 37 und auf die Internen 83 Patienten. Bei den externen Patienten gab es 11 C-Zell-Karzinome (30 %), 22 CZell-Hyperplasien (60 %) und vier Patienten hatten keine C-Zell-Pathologie (10 %). Bei den intern bestimmten Patienten gab es drei C-Zell-Karzinome (4 %), 18 C-Zell-Hyperplasien (22 %) und 62 Patienten hatte keine C-Zell-Pathologie (74 %). Im präoperativ erfolgten Calcitoninstimulationstest waren in der Gruppe A 27 der 36 getesteten Patienten pathologisch stimulierbar. Von den neun nicht stimulierbaren Patienten hatten 6 eine CZH und drei keine CZP. In der Gruppe B waren 14 der 57 getesteten Patienten pathologisch stimulierbar. Von den 43 nicht stimulierbaren Patienten hatten 9 eine CZH und 33 keine CZP. Bei den extern überwiesenen Patientinnen fand sich kein Fall mit einem basalen Calcitoninwert über 5 [ng/l] und unter 10 [ng/l]. Die Zahl derjenigen Patientinnen, die intern bestimmt worden sind und diese Kriterien erfüllten lag bei 39. Von diesen 39 Patientinnen hatte eine Patientin ein C-Zell-Karzinom, drei eine C-Zell-Hyperplasie und 35 hatten keine C-Zell-Pathologie. Die Kosten für die Stimulationstests, die bei diesen 39 Patientinnen mit einem niedrig pathologischen Calcitoninwert von über 5 [ng/l] aber unter 10 [ng/l] in den Jahren 2004 und 2005 angefallen sind, beliefen sich auf 2.073,60 €. Schlussfolgerung: Die Berücksichtigung der verschiedenen Normalbereiche bei der Calcitoninbestimmung von Männern und Frauen und der daraus resultierenden verschieden hohen Grenzwerte führte zu der präoperativen Diagnose von einem C-Zell-Karzinome und drei C-Zell-Hyperplasien (davon ein Indexfall) in der Gruppe der intern bestimmten Patienten, die bei den bisherigen Grenzwerten von 10 [ng/l] basal nicht aufgefallen wären. Nachteilig war eine hohe Anzahl an falsch positiven Ergebnissen bei Patienten die keine C-Zell-Pathologie aufwiesen. Die durch die differenzierten Grenzwerte entstehende finanzielle Mehrbelastung ist zwar deutlich, aber in Anbetracht der Ergebnisse vertretbar, so dass weiterhin eine Differenzierung angestrebt werden sollte.
In dieser Arbeit wurden potentielle Mitglieder des Proteinnetzwerks um Ataxin-2 untersucht, um Rückschlüsse auf die bisher unbekannte Funktion von Ataxin-2 machen zu können. Ataxin-2 ist das Krankheitsprotein der Spinozerebellären Ataxie Typ 2, einer Polyglutaminerkrankung, bei der die Expansion eines Polyglutamintraktes zur Degeneration von Purkinje-Neuronen führt. Da die Funktion von Ataxin-2 bisher nicht ermittelt werden konnte, sollte die Charakterisierung seiner Protein-Interaktoren es ermöglichen, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Dazu wurden die drei Kandidaten „Similar to golgin-like“, TRAP und alpha-Actinin-1 untersucht, die alle drei mit Hilfe von Hefe-2-Hybrid Screens identifiziert worden waren. Im Fall von „Similar to golgin-like“, einem aus Genom und cDNA-Fragmenten hervorgesagten Protein unbewiesener Existenz, konnte eine mutationsabhängige Modulation der Bindungsstärke an Ataxin-2 im Hefe-2-Hybrid-System gezeigt werden, die sich allerdings mit rekombinanten Proteinen in Koimmunpräzipitationen in Säuger-Zellen nicht reproduzieren ließ. Beide Proteine kolokalisierten am ER, unabhängig von der Länge des pathogenen Polyglutamintraktes-2 in Ataxin. Gegen ein SIM-Peptid hergestellte Antikörper zeigten eine exklusive Expression im menschlichen Gehirn und wurden erfolgreich zum Nachweis eines endogenen Komplexes aus Ataxin-2 und SIM-IR im krankheitsrelevanten Gewebe eingesetzt. Allerdings war es nicht möglich, mittels 5’-RACE und 2D-Gel Massenspektrometrie die potentiellen Isoformen von SIM näher zu charakterisieren. Zur funktionellen Analyse von SIM wurden intrazelluläre Transportvorgänge am Golgi-Apparat untersucht, aber ein Einfluss von SIM / Ataxin-2 ließ sich nicht belegen. Im Fall des Interaktions-Kandidaten TRAP wurden Antikörper hergestellt und mit einem bereits publizierten polyklonalen Antikörper, der TRAP in rattus norvegicus erkennt, verglichen. Die Expressionsmuster zeigten eine identische Expression im Hirn und der Testis. Eine Kolokalisations-Studie wies sowohl TRAP als auch Ataxin-2 am ER nach. Allerdings erwiesen sich alle verwendeten Antikörper als ungeeignet für Immunpräzipitationen, so dass die physiologische Existenz des endogenen TRAP-Ataxin-2 Komplexes nicht bewiesen werden kann. Im Fall des Interaktor-Kandidaten alpha-Actinin-1 ließ sich die Interaktion mit Ataxin-2 sowohl für die endogenen Proteine in der zytosolischen Fraktion von Mausgehirnen als auch für die rekombinanten Proteine in Säuger-Zellen belegen. Beide Proteine konnten im Zytosol und zu kleineren Anteilen an der Plasmamembran kolokalisiert werden. Als verantwortliche Subdomänen im Fall von Ataxin-2 wurde der N-terminale Bereich des Proteins in der Nähe der pathogenen Expansion, im Fall von alpha-Actinin-1 die Aktin-bindende Domäne durch GST-pulldown Analysen identifiziert. Darauf aufbauend wurde in Patienten-Fibroblasten das Aktinzytoskelett und die Dynamik von alpha-Actinin-1 in Anwesenheit der Ataxin-2-Polyglutamin-Expansion untersucht, wobei allerdings kein Unterschied zu erkennen war. Anschließend an die Analyse des Zytoskeletts wurde ein möglicher Einfluss von Ataxin-2 und seiner Polyglutamin-Expansion auf die EGF-Rezeptorinternalisierung studiert, da eine Rolle von Ataxin-2 auf die Endozytose in parallelen Analysen der Arbeitsgruppe wahrscheinlich wurde. Hierzu wurden Säuger-Zellen mit alpha-Actinin-1 transfiziert und die Internalisierung mikroskopisch und mittels Analyse der ERK1/2 Aktivierung verfolgt. Ergänzt wurden die Experimente durch Analysen zur ERK1/2 Aktivierung in Patienten- und Kontroll-Fibroblasten. Entgegen den Erwartungen hatte die Überexpression von alpha-Actinin-1 keinen Einfluss auf die Internalisierung, und bei keinem der Ansätze zeigte sich eine signifikante Veränderung der ERK1/2 Aktivierung. Auch Transkriptombefunde aus SCA2-KO Gewebe, nach denen einzelne Gene des Zytoskeletts oder der Rezeptor-Endozytose ihre Expression ändern, ließen sich nicht mit Konsistenz validieren. Abschließend wurden Experimente zur subzellulären Lokalisation von Ataxin-2 durchgeführt, die eine Lokalisation am ER und nicht wie bisher berichtet am Golgi-Apparat sicherten und Ergebnisse zur Assoziation mit Polyribosomen bekräftigten. Obwohl somit bei allen drei Proteininteraktor-Kandidaten glaubwürdige Befunde für eine Ataxin-2 Bindung sprechen, ist derzeit eine funktionelle Analyse der Assoziationen nicht möglich und eine klare Definition der physiologischen Rolle von Ataxin-2 lässt sich aus diesen Daten nicht ableiten, wenn auch die prominente Lokalisation von Ataxin-2 am rauen endoplasmatischen Retikulum mit einem Einfluss von Ataxin-2 auf die ribosomale Translation und die Sekretion in Cisternen kompatibel ist.
Flexibility and constraints in migration and breeding of the barnacle goose Maximising fitness means, to a large extent, optimising management of time and energy. This thesis investigates aspects of timing and resource acquisition and utilisation in the barnacle goose Branta leucopsis during spring migration and reproduction. The barnacle goose population wintering along the Wadden Sea coast, and traditionally migrating via a stopover in the Baltic to its breeding sites in northern Russia, has shown some remarkable developments, among them, a geometric growth rate since the 1950s and a notable change in the timing of departure from the wintering grounds. Furthermore, long being regarded as an obligate Arctic breeder, within the past three decades this species has successfully colonised a wide variety of habitats at temperate latitudes, thereby shortening the migratory distances considerably or refraining from migration altogether. These remarkable changes raise questions about the flexibility of migratory and reproductive schedules. What are the costs and benefits of different migration strategies? And, given the context of global change, to what extent are animals capable of adapting to rapidly changing environments? In order to answer these questions we tracked migratory geese by satellite and with the help of data loggers and, furthermore, explored possible relationships of migratory behaviour and breeding performance. Another central thesis topic represents a within-species comparison of major life-history traits in populations breeding along a large ecological gradient from arctic to temperate environments. Fieldwork was conducted in arctic Russia, Sweden and The Netherlands.
Untersuchungen zum Target und Wirkmechanismus der eNOS-Transkriptionsverstärker AVE9488 und AVE3085
(2008)
Die Substanzen AVE9488 und AVE3085 der neuen chemischen Klasse der eNOS-Transkriptionsverstärker führen zu einer signifikanten Aktivierung des eNOSPromotors, die in vitro und in vivo in einer Erhöhung der eNOS-Expression auf mRNAund Proteinebene resultiert. Als Folge davon kommt es zu einer signifikant gesteigerten Synthese von bioverfügbarem Stickstoffmonoxid (NO). Dieser Effekt führt in Kombination mit einer ebenfalls beobachteten Normalisierung der eNOS-Entkopplung zu einer deutlichen antiatherosklerotischen Wirkung in ApoE-Knockout-Mäusen. AVE9488 und AVE3085 wurden initial durch eine phänotypische Reihentestung chemischer Bibliotheken in einer stabilen eNOS-Promotor-Reporter-Endothelzelllinie identifiziert. Daher waren bis zum heutigen Zeitpunkt molekulare Targets und ihre Wirkweise unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, Targetproteine der eNOS-Transkriptionsverstärker zu identifizieren, zu validieren und Hinweise auf den zugehörigen Wirkmechanismus zu sammeln. Zur Identifizierung potenzieller Zielproteine wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. In einem genomischen Ansatz sollten einzelne, für die Aktivierung des eNOSPromotors durch AVE9488 und AVE3085 essentielle Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Eine in silico-Analyse des für die Substanzwirkung notwendigen 300bp-Promotorbereichs vor Transkriptionsstart auf konservierte Transkriptionsfaktor-Bindemotive ergab potenzielle Bindungsstellen für insgesamt 105 Transkriptionsfaktoren. In Gel-Retardierungsexperimenten mit Oligonukleotiden, die aufbauend auf der bioinformatischen Analyse die konservierten cis-Elemente in diesem Sequenzbereich abdeckten, und Kernextrakten aus Endothelzellen, die mit AVE9488 behandelt worden waren, konnte eine Abschwächung der DNA-Protein-Komplexbildung beobachtet werden. Diese Effekte konnten jedoch mit dieser Technologie aufgrund der hohen Anzahl möglicher bindender Transkriptionsfaktoren nicht auf einzelne eingeengt werden. Im Folgenden wurden daher einzelne Transkriptionsfaktoren ausgewählt, die eine nachgewiesene Rolle bei der Regulation der eNOS-Transkription besitzen, und auf ihre Bedeutung bei der Substanz- ermittelten eNOS-Promotoraktivierung untersucht. Nach Ausschaltung durch siRNA von Sp1, GATA-2, Ets-1, MAZ und PATZ1 im eNOS-Transkriptionstest konnten bei Sp1, GATA-2 und MAZ lediglich eine Erniedrigung der basalen eNOS-Promotoraktivitätfestgestellt werden. Da die Substanz-induzierte eNOS-Transkriptionserhöhung bei keinem der untersuchten Transkriptionsfaktoren beeinflusst wurde, scheinen diese Proteine bei diesem Prozess keine Rolle zu spielen. Als zweite Strategie kamen Proteomik-Techniken zur Identifizierung möglicher Targetprot eine durch ihre direkte biochemische Affinität zum Pharmakophor der eNOS-Transkriptionsverstärker zum Einsatz. Durch die chromatographische Anreicherung bindender Proteine aus Endothelzelllysaten an spezifischen Affinitätsmaterialien und der Markierung rekombinanter, humaner Proteine auf Protein-Mikroarrays mit Biotinmarkierten eNOS-Transkriptionsverstärkern konnte eine Gesamtliste mit insgesamt 18 potenziellen Targetkandidaten ermittelt werden. Die weitere zelluläre Validierung dieser Kandidaten erfolgte durch ihre siRNA-vermittelte Ausschaltung im eNOS-Transkriptionstest. Innerhalb aller potenziellen Targets konnte nur nach Ausschalten von Häm-bindenden Protein 1 (HEBP1) der eNOS-Promotor durch AVE3085 nur noch signifikant abgeschwächt gegenüber der Kontrolle aktiviert werden. Dieses Protein stellte somit den einzigen Targetkandidaten dar, der bei der Aktivierung des eNOS-Promotors eine Rolle zu spielen scheint. Nach rekombinanter Expression des humanen HEBP1 konnte die Bindung der eNOS-Transkriptionsverstärker an dieses Protein durch zwei unabhängige biochemische Methoden konfirmiert werden. Bei Messungen der Tryptophanfluoreszenz des HEBP1 konnte der eNOS-Transkriptionsverstärker 9257 den Liganden Hämin, der eine Quenchung der Fluoreszenz bewirkt, aus der Bindung verdrängen. Weiterhin konnte mit Hilfe einer Fluoreszenz-markierten eNOS-Substanz ihre direkte Bindung an das HEBP1 durch Messung der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen und ein KD-Wert von 11,7μM ermittelt werden. Abschließend konnte in ersten Untersuchungen der Hebp1-Expression in einem Herz-Kreislauf-relevanten Tiermodell für chronische Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt die differentielle Hochregulation des Hebp1-Gens um den Faktor 2,5 unter pathologischen Bedingungen nachgewiesen werden, die jedoch nicht durch die Behandlung mit AVE3085 beeinflusst wurde.
Deformation quantization on symplectic stacks and applications to the moduli of flat connections
(2008)
It is a common problem in mathematical physics to describe and quantize the Poisson algebra on a symplectic quotient [...] given in terms of some moment map [...] on a symplectic manifold [...] with a hamiltonian action by a Lie group G. Among others, problems may arise in two parts of the process: c might be a singular value of the moment map and the quotient might not be well-behaving; in the interesting cases the quotient often is singular. By the famous result of Sjamaar and Lerman ([102]) X is a symplectic stratified space. We are interested in cases for which we can give a deformation quantization of the possibly singular Poisson algebra of X. To that purpose we introduce a Poisson algebra on the associated stack [...] for special cases and consider its deformations and their classification. We dedicate ourselves to use the rather geometric methods introduced by Fedosov for symplectic manifolds in [37]. That leads to the question how to perform differential geometry on a smooth stack. The Lie groupoid atlas of a smooth stack is a nice model for the same space (Tu, Xu and Laurent-Gengoux in [107] and Behrend and Xu in [16]), but both have different topoi. We give a morphism (P,R) that compares the topologies of a smooth stack and its atlas. This yields a method to transport sheaves and their sections between a smooth stack and its Lie groupoid atlas. A symplectic stack is a smooth separated Deligne-Mumford stack with a 2-form which is closed and non-degenerate in an atlas. Via (P,R) a deformation quantization on a symplectic stack can be performed in terms of an atlas. We also give a classification functor for the quantizations in the spirit of Deligne ([35]) based on the geometric interpretation given by Gutt and Rawnsely in [49]. As an application we give a deformation quantization for the moduli stack of flat connections in particular configurations. We use Darboux charts provided by Huebschmann (e.g. in [54]) to construct the corresponding Lie groupoid. This captures the symplectic form arising in the reduction process and differs from other approaches using gerbes of bundles (e.g. Teleman [105]).