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CAP (c-Cbl assoziiertes Protein) ist ein Adapterprotein, welches zusammen mit ArgBP2 und Vinexin die SoHo-Protein-Familie bildet. Es besitzt in seinem N-terminalen Bereich eine SoHo-Domäne und im C-Terminus drei SH3-Domänen, über welche es mit einer Vielzahl von Proteinen interagieren kann. CAP spielt bei verschiedenen Signaltransduktionsvorgängen und der Reorganisation des Aktinzytoskelettes eine Rolle. So wurde ihm eine Funktion im PI3-Kinase-unabhängigen Insulinsignalweg zugeschrieben. In Zell-Zell-Kontakten ist CAP zusammen mit Nectin und Afadin Bestandteil des NAPSystems, welches parallel zu Cadherin-Catenin-Adhäsionen existiert. In Fokalkontakten bindet CAP an FAK, Paxillin und Vinculin, welche wichtig für die Regulation der Zell-Matrix-Adhäsionen sind. In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion von CAP bei der Assoziation mit dem Aktinzytoskelett näher untersucht werden. Es wurde gezeigt, daß die Kolokalisation von CAP mit Vinculin und Aktin dynamisch und vom Ausbreitungsgrad der Zelle und dem Expressionsniveau des Proteins abhängig ist. Ohne funktionelle SH3-Domänen lokalisiert CAP nicht mehr in Fokalkontakten, kann aber bei Überexpression noch eine Ausbildung von Streßfasern induzieren. Die Funktionalität der zweiten und der dritten SH3-Domäne von CAP ist für die Zelladhäsion von Epithelzellen von Bedeutung, da Konstrukte, die in konservierten Aminosäuren der Domänen mutiert worden sind, eine verringerte Zellausbreitung aufweisen. CAP wurde zudem als ein Interaktionspartner und Substrat der Tyrosinkinasen c-Abl und c-Src charakterisiert. Die Assoziation mit den Kinasen wird dabei vor allem über den C-Terminus von CAP vermittelt, und CAP kann direkt mit der Src-Kinase interagieren. CAP wird von c-Abl überwiegend an Tyrosin 360, und von c-Src bevorzugt an Tyrosin 326 phosphoryliert. Diese Tyrosine liegen innerhalb bekannter Konsensus-Motive der Kinasen. Phosphorylierungsdefiziente CAP-Konstrukte sind noch dazu in der Lage, mit Vinculin und Aktin zu kolokalisieren. Tyrosin 326 hat jedoch einen Einfluß auf die Zellausbreitung auf Fibronektin, da ein in dieser Aminosäure mutiertes Konstrukt einen Defekt hierbei aufweist. Den genauen Mechanismus, über welchen CAP seinen Einfluß auf die Zell-Matrix-Adhäsion ausübt, ist noch ungeklärt. Durch die hier erstmals aufgezeigte Phosphorylierung des Adapterproteins erweitern sich dessen Interaktionsmöglichkeiten durch mögliche Bindungen an SH2-Domänen-enthaltende Proteine. CAP könnte als Bindeglied zwischen c-Abl und c-Src und weiteren zytoskelettalen Komponenten dazu beitragen, die Kinasen an Fokalkontakten zu verankern und ihnen neue Substrate zuzuführen. Die Interaktion mit CAP könnte dabei die Aktivität der Kinasen erhöhen. Weiterführende Studien werden die in diesem Signalweg nachgeschalteten Komponenten untersuchen und auch eine putative Rolle der Phosphorylierung von CAP in den bereits bekannten zellulären Zusammenhängen wie dem Insulinsignalweg näher beleuchten.
Die vorliegenden Arbeit analysiert 270 Traumapatienten, die durch das am Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt stationierte NEF in den Schockraum der Universitätsklinik eingeliefert wurden. Der Beobachtungszeitraum erstreckt sich von Anfang Januar 2004 bis einschließlich August 2007. Als Grundlage der Studie dient der Vergleich der präklinischen Daten des Notarzteinsatzprotokolls mit den klinischen Daten, die im Schockraum erhoben wurden. Ziel der Studie war es, den Stand der präklinischen Traumaversorgung darzustellen. Eine mögliche Überversorgung sowie eine Unterversorgung soll anhand präklinischer Maßnahmen, wie die Durchführung einer endotrachealen Intubation, die Anlage einer Thoraxdrainage und die prophylaktische Immobilisation der Halswirbelsäule erfasst werden. Insgesamt bestand für 28,1 % der Patienten eine präklinische Intubationsindikation. In internationalen Studien werden Indikationen von 16 % bis 29 % angegeben und somit bestätigt. Um eine präklinische Unterversorgung hinsichtlich der endotrachealen Intubation festzustellen, wurden notwendige Intubationen innerhalb der ersten 15 Minuten im Schockraum analysiert. Nach Einzelfallprüfung zeigt sich, dass 4,5 % der Patienten, die vom NEF in den Schockraum eingeliefert wurden, als unterversorgt bezeichnet werden können. Die rasche Indikation im Schockraum zur Sicherung des Atemwegs mittels endotrachaealer Intubation, ergab sich in mehr als der Hälfte der Fälle (55,6 %) durch eine stark eingeschränkte Vigilanz (GCS<9). Zur Detektion einer hinsichtlich der endotrachealen Intubation bestehenden präklinischen Überversorgung, wurden die am Unfallort zur Intubation führenden Indikationen analysiert. Hierbei zeigte sich, dass nur ein Patient (1,47 %) ohne anerkannte Indikation, nur aufgrund des Unfallmechanismus und der zu erwartenden Verletzungen ohne klinisches Korrelat endotracheal intubiert wurde. Ein Gruppenvergleich von Patienten mit und ohne Intubation zeigte signifikante Unterschiede in Bezug auf die anhand des Injury Severity Scores erhobenen Verletzungsschwere. Die Ergebnisse dieser Studie mit 4,5 % der Patienten, die präklinisch hinsichtlich der Atemwegssicherung unterversorgt und den 1,47 % der Patienten, die überversorgt waren, sind Ausdruck der eher zurückhaltenden Indikationsstellung einer endotrachealen Intubation unter präklinischen Bedingungen unter Berücksichtigung des engen präklinischen Zeitfensters. 12,2 % der Patienten benötigten nach dem Trauma eine Thoraxdrainage. Um eine präklinische Unterversorgung hinsichtlich der Anlage einer Thoraxdrainage zu ermitteln, wurde die Dringlichkeit und die Indikation der im Schockraum gelegten Drainagen beurteilt. Patienten, die innerhalb der ersten 15 Minuten nach Ankunft in der Klinik eine Drainage erhielten, wurden als unterversorgt eingestuft. Per Definition dieser Studie sind 33,3 % der Patienten, die eine Drainage benötigten, unterversorgt, das entspricht 4,1 % vom gesamten Patientenkollektiv. Von diesen Patienten hatten mehr als 90 % auffällige Atemmuster und 54,5 % waren endotracheal intubiert und beatmet. Trotz therapeutischer Maßnahmen, wie die Sauerstoffgabe oder die Intubation, war die periphere Sauerstoffsättigung bei den Unterversorgten in 45,5 % nicht zufriedenstellend (SpO2 < 90 %). In 45,5 % der Fälle war die Traumaursache mit der offensichtlichen Gefahr eines Pneumothorax eine Stichverletzung im Thoraxbereich. Als Ursachen für diese Mängel in der Patientenversorgung sind die eingeschränkten präklinischen diagnostischen Möglichkeiten, die Invasivität der Maßnahme mit den daraus resultierenden Komplikationen und die zeitlich aufwendige, auch für lange Jahre tätige Notärzte seltene Maßnahme der Thoraxdrainagenanlage zu nennen. Die Unsicherheit in Diagnostik und Therapie lassen das präklinische Konzept des „scoop and run“ mit dem sofortigen Transport in die Klinik vorteilhaft erscheinen. Die Ergebnisse der Immobilisation der Halswirbelsäule als prophylaktische Maßnahme, um Sekundärschäden durch Rettung und Transport abzuwenden, zeigen eklatante Mängel in der Patientenversorgung. Mehr als ein Drittel (35,9 %) der Patienten mit aufgrund des Unfallmechanismus klarer Indikation zur Durchführung der Protektion wurden ohne Immobilisation der Halswirbelsäule in die Klinik eingeliefert. Um diese Versäumnisse zu analysieren, erfolgte ein Vergleich der Gruppe mit und ohne HWS-Protektion. Patienten, die eine HWS-Protektion erhielten, hatten anhand des Injury Severity Scores erhoben signifikant schwerere und multiplere Verletzungen als Patienten ohne Protektion. Unter Berücksichtigung des Unfallmechanismus führten Stürze aus größer Höhe und Verkehrsunfälle häufiger zur Anwendung einer Zervikalstütze als Stürze aus geringer Höhe. Die Vigilanz hatte hingegen keinen Einfluss auf die Häufigkeit der HWS-Immobilisation, obwohl der bewusstlose Traumapatient eine relativ eindeutige Indikation darstellt. Von den 270 Patienten dieser Studie haben sich 2,9 % eine Verletzung der Halswirbelsäule zugezogen, davon 0,37 % mit einer instabilen Fraktur in diesem Bereich. Da Frakturen der Wirbelsäule sich häufig nicht aus der präklinischen eingeschränkten Diagnostik ergeben, ist es dringend erforderlich, unter Berücksichtigung des Unfallmechanismus und der Umstände am Unfallort, Sekundärschäden durch die Anlage eine Zervikalstütze abzuwenden. Um einen Vergleich mit anderen Kliniken zu ermöglichen, wurden Patientenkollektiv und Einsatzaufkommen analysiert. Hier zeigt sich eine Dominanz der männlichen Traumapatienten in der Altersgruppe der Berufstätigen, wie sie in anderen Traumazentren beschrieben wird. Auch der jahreszeitliche Verlauf mit einer Häufung der Traumapatienten in den Sommermonaten und ein typischer zirkadianer Rhythmus, die das Verkehrsaufkommen und das Freizeitverhalten der Bevölkerung wiederspiegeln, zeigt, dass von einem repräsentativen Patientenkollektiv ausgegangen werden kann. Der größte Anteil der Patienten hatte hinsichtlich der Traumaursache einen Unfall im Straßenverkehr (41,5 %), gefolgt von Stürzen aus unterschiedlichen Höhen (36,7 %). Gewalttaten mit einem Anteil von knapp 12 % als Traumaursache spiegeln das Patientenkollektiv einer Großstadt wie Frankfurt am Main wieder. Zur Objektivierung der Ergebnisqualität der präklinischen Patientenversorgung wurde der Mainz Emergency Evaluation Score (MEES) erhoben. Entsprechend ihrem Ausgangszustand konnten 87 % der Patienten stabil oder mit einem entsprechen dem MEES verbesserten Zustand der Vitalparameter in die Klinik transportiert werden. Maßnahmen wie die suffiziente Analgesie und Verbesserungen im Bereich der Atmung durch Sauerstoffgabe und endotracheale Intubation sind dafür wesentlich verantwortlich. Die präklinische Patientenversorung und die Struktur des Rettungswesens in Deutschland genießt international einen herausragenden Ruf. Dennoch konnten Defizite in der Erkennung und Behandlung von Traumapatienten festgestellt und in dieser Studie bestätigt werden. Um diese Defizite langfristig beheben zu können, sollte ein kontinuierliches Qualitätsmanagement implementiert werden. Auf eine Verbesserung der Dokumentationscompliance in der präklinischen Phase sollte geachtet werden, um eine Qualitätsbewertung regelhaft durchführen zu können. Kontinuierliche Schulungsmaßnahmen und regelmäßiges Training durch Simulation von Notfallsituationen sollten das notwendige Wissen praxisnah vermitteln und vertiefen. Simulationstraining, wie es im „Frankfurter Institut für Notfallmedizin und Simulation (FINeST)“ angeboten wird und Schulungsprogramme mit neuen Lernkonzepten müssen regelmäßig angeboten und ausgebaut werden, um die hohe Qualität des Rettungsdienstes in Deutschland zu sichern und weiter zu verbessern.
Die Coltrims-Methode hat sich seit den 1990er Jahren als gutes experimentelles Instrument in der Atomphysik und darüberhinaus etabliert. Sie beruht darauf, dass die bei einer Reaktion entstehenden Fragmente mit ortssensitiven Detektoren nachgewiesen werden. Die Signale der Detektoren wurden bisher mit einem analogen Vorverstärker verstärkt und dann mit Hilfe eines Constant Fraction Discriminators in digitale Signale umgewandelt. Die Zeitinformation der digitalen Signale wurden von Time to Digital Convertern aufgenommen und im Computer gespeichert. Mit dieser Form der Auslese und Analyse der von den Detektoren stammenden Signale können nur einige wenige Fragmente nachgewiesen werden. Die Lösung dieses Problems besteht also darin, eine neue Variante für die Auslese und Analyse der Signale zu finden. Diese wurde in der Verwendung eines Transientenrekorders gefunden. Anstatt nur die Zeitinformation zu speichern, nimmt dieser die gesamte Signalform der Detektoren auf. Die Aufgabe, die in dieser Arbeit bearbeitet werden sollte, bestand darin, eine Software zu entwickeln, mit deren Hilfe der Transientenrekorder gesteuert werden kann. Auch sollte ein Weg gefunden werden nur die für das Experiment notwendigen Informationen des aufgenommenen Zeitfensters zu speichern. Des Weiteren sollten Methoden aufgezeigt werden, wie die aufgenommen Signale untersucht und deren Parameter extrahiert werden können. Diese Methoden wurden dann an realen Signalen getestet. Nachdem im ersten Kapitel die Motivation zu dieser Arbeit und einige theoretische Hintergründe vorgestellt werden, wird im zweiten Kapitel auf verschiedene Methoden der Signalanalyse eingegangen. Der Augenmerk liegt dabei sowohl auf Einzel- sowie Doppelsignalanalyse. Die Güte der vorgestellten Algorithmen wird mit Hilfe von künstlichen Signalen ermittelt. Es zeigt sich, dass die beste Methode die zeitliche Position der Einzelsignale zu finden, der Pulsfit ist. Mit dieser Methode kann eine Auflösung von etwa 50 ps erzielt werden. Bei der Betrachtung der Doppelsignale stellt sich heraus, dass der minimale Abstand zwischen den Signalen 5 ns bis 7 ns betragen muss. Das dritte Kapitel zeigt eine Anwendung des neuen Aufnahmesystems. Dort werden die physikalischen Ergebnisse, die mit Hilfe des neuen Systems gewonnen werden konnten, mit einem herkömmlichen Aufnahmesystem verglichen. Aufgrund der geringeren Totzeit des neuen Aufnahmesystems konnte mehr Statistik gewonnen werden. Der dadurch gewonnene Vorteil zeigt sich deutlich in den Ergebnissen, bei denen eine vierfach Koinzidenz verlangt wird. Bei dem nächsten Kapitel beschriebenen Experiment mussten sehr viele Fragmente nachgewiesen werden. Hierzu wird ein weiteres Kriterium neben der Zeitsumme vorgestellt mit dem die Anodensignale einander zugewiesen werden können. Die in diesem Kapitel gezeigten physikalischen Ergebnisse zeigen die Impulsverteilungen für Neon und Helium für unterschiedliche Lichtintensitäten bzw. Ionisationsprozesse. Im darauf folgenden Kapitel wird beschrieben, wie die neue Aufnahmemethode dazu verwendet werden kann, die von den Detektoren kommenden Signale genauer zu analysieren. Die physikalische Reaktion führte dazu, dass von dem Detektor hauptsächlich Doppelsignale aufgenommen wurden. Dies erlaubt die Untersuchung der Doppelsignalalgorithmen an realen Signalen. Hierbei zeigte sich, dass die Totzeit bei realen Signalen vergleichbar mit der Totzeit bei künstlichen Signalen ist. Die Algorithmen können bei Abständen der Einzelsignale von weniger als 10 ns die Position der Signale nicht mehr genau bestimmen. Anhand der Pulshöhenverteilung kann gezeigt werden, dass der verwendete Detektor in der Mitte eine geringere Nachweiseffizienz hatte. Im letzten Kapitel wird die Güte der verschiedenen Methoden der Einzelsignalanalyse anhand von realen Signalen überprüft. Dabei wurden Signale desselben Detektors mit unterschiedlichen Vorverstärkern verstärkt. Die beiden Vorverstärker unterschieden sich in ihrer Bandbreitenbegrenzung. Die Daten wurden mit einem Transientenrekorder mit 2 GS aufgenommen. Es wird gezeigt wie diese Daten umgewandelt werden können, so dass sie einem System mit nur 1 GS entsprechen. Dies erlaubt es die Güte der Methoden für Signale eines Systems mit 2 GS mit denen eines Systems mit 1 GS zu vergleichen. Es zeigt sich in der Pulshöhenverteilung, dass die Signale des stärker bandbreitenbegrenzten Vorverstärkers vergleichbar mit den künstlichen Signalen sind. Die Signale des weniger stark bandbreitenbegrenzten Vorverstärkers weisen eine zu starke Abhängigkeit ihrer Breite von der Pulshöhe auf. Aus diesem Grund sind die Ergebnisse des letzt genannten Vorverstärkers abweichend von den Ergebnissen mit den künstlichen Signalen. Bei diesem Vorverstärker zeigte der einfache Constant Fraction Algorithmus die beste Auflösung.
Die Identifikation neuer Hits und Leitstrukturen sind die ersten Schritte bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe. Dieser Herausforderung wird derzeit primär mittels High-Throughput-Screening oder der gezielten Modifikationen bekannter Liganden begegnet. Eine weitere Option ist das computerbasierte virtuelle Screening, das es kostengünstig ermöglicht, in kurzer Zeit sehr viele Moleküle auf ihre potentielle biologische Aktivität hin zu untersuchen. Der in dieser Arbeit verwendete Ansatz zur Identifikation neuer Inhibitoren der 5-Lipoxygenase und der Cyclooxygenase-2 beruht auf dem Verfahren des ligandenbasierten virtuellen Screenings. Unter der Voraussetzung der Kenntnis mindestens eines Referenzliganden können so mittels einer Ähnlichkeitsanalyse potentielle neue strukturelle Grundgerüste identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde ein auf atomaren Partialladungen und der dreidimensionalen Struktur der Moleküle basierender Deskriptor (Charge3D/TripleCharge3D) entwickelt. In retrospektiven Studien mit Cyclooxygenase-2 Inhibitoren wurde die Effektivität der neuen Deskriptoren überprüft und mittel eines evolutionären Algorithmus optimiert. Der Charge3D Deskriptor erreicht Anreicherungsfaktoren bis zu 16,1 im ersten Perzentil der durchsuchten Datenbank, wohingegen der TripleCharge3D Deskriptor mit seiner detailierteren Ladungsauftrennung Werte von bis zu 24,8 erreichte. Ein ebensolches retrospektives Screening wurde für 5-Lipoxygenase Inhibitoren durchgeführt. Den maximalen Anreicherungsfaktor von 6,1 im ersten Prozent der Datenbank erreichte hier der Charge3D Deskriptor, der TripleCharge3D Deskriptor erreichte 5,3. Diese wesentlich geringeren Werte sind auf die Diversität der 5-LO Inhibitoren (54 Inhibitoren mit 39 verschiedenen Grundgerüsten) und deren unterschiedliche Inhibitortypen (Redox, nicht Redox und Eisen-bindende Inhibitoren) mit ihren jeweiligen Bindemodi zurückzuführen. In Screenings nach 5-LO Inhibitoren in der Naturstoffdatenbank der Firma AnalytiCon Discovery und COX-25-LO Dualinhibitoren in Datenbanken der Firma Asinex konnten unter Verwendung der beiden Deskriptoren Inhibitoren, mit für diese Targets bislang unbekannten Scaffolds identifiziert werden. Unter Verwendung des 2D Pharmakophor Deskriptors CATS wurden zuerst zwei neue Scaffolds für Inhibitoren der 5-LO identifiziert. Struktur 1 ist den in vitro Assaydaten zufolge ein direkter Inhibitor der 5-LO. Struktur 2 hingegen erreicht seine Wirkung nicht nur über die direkte Interaktion mit der 5-LO. Eine Erklärung dafür wäre die Wechselwirkung mit dem 5-LO aktivierenden Protein FLAP, der Hemmung der Translokation der 5-LO zur Kernmembran, oder die Inhibition 5-LO aktivierender bzw. inaktivierender Kinasen. In nachfolgenden Screenings mit den Strukturen 1 und 2 als Referenzstrukturen konnten mittels der Charge Deskriptoren Substanzderivate (17 Moleküle) mit 5-LO inhibitorischer Wirkung (5 Moleküle mit IC50 Werte ≤ 1 μM an partiell aufgereinigter 5-LO), identifiziert werden. Für das Screening nach COX-2/5-LO Dualinhibitoren wurden 11 Strukturen mit 7 unterschiedlichen Scaffolds unter Verwendung der Charge Deskriptoren aus gewählt. Drei Moleküle zeigten keine 5-LO Aktivität, und jeweils eines nur in intakten PMNLs bzw. im S100 Zellüberstand. Die restlichen 6 Moleküle waren in beiden 5-LO Assays aktiv (intakte PMNLs IC50 zwischen 2 und 15 μM, S100 Zellüberstand 5-LO zwischen 0.5 μM und 25 μM). Somit zeigten 7 Moleküle im S100 Assay Aktivität und konnten als direkte Inhibitoren der 5-LO identifiziert werden. Im Cyclooxygenase-2 Aktivitätsassay mit intakten MonoMac6 Zellen zeigte eine der 11 Strukturen zudem eine geringe (IC50 = 70 μM) inhibierende Aktivität. Modifikationen zur Verbesserung der COX-2 Hemmung könnten in einem potenten COX-2/5-LO Dualinhibitor resultieren, der beispielsweise in der Schmerzbehandlung eingesetzt werden könnte. Ein weiteres Projekt war die Erstellung eines Homologiemodells der 5-LO basierend auf der 15-Lipoxygenase Struktur des Kaninchens (PDB-Struktur: 1LOX). Die Sequenzidentität der beiden Strukturen (1LOX / humane 5-LO) lag bei 37 %. Das Modell wurde zum einen zur Vorhersage von zugänglichen Caspase-6 Schnittstellen an der 5-LO angewandt, und zum anderen wurden Dockingexperimente in Aktiven Zentrum und in Bereichen der C2-like Domäne der 5-LO durchgeführt. Hyperforin, ein bekannter Inhibitor d er 5-Lipoxygenase, wurde an verschiedenen Stellen des Modells für Dockingexperiment eingebracht. Die im Aktiven Zentrum erreichten Scorewerte (Chemscore = -9±1) deuteten hier auf eine unfavorisierte Bindungsstelle hin. BWA4C (ein bekannter Eisenbinder) und ZM230487 (ein nicht-redox Inhibitor) erhielten im Aktiven Zentrum Scorewerte von 27±0,1 und 22±2,5, wodurch eine Bindung als wahrscheinlich angenommen werden kann. Weitere Dockingexperimente an der C2-like Domäne, und speziell am Interface zwischen der C2-like und der katalytischen Domäne, ergaben ähnlich hohe Chemscorewerte für Hyperforin, BWA4C und ZM230487. Aus diesen Resultaten ließ sich kein eindeutiger Bindemodus für Hyperforin ableiten. Eine Positionierung im Aktiven Zentrum ist nach diesen Experimenten unwahrscheinlich, so dass die Existenz einer weiteren, experimentell noch nicht identifizierten Bindestelle vermutet werden kann. Eine solche Interaktionsfläche könnte als Ansatzpunkt für die Entwicklung weiterer 5-Lipoxygenaseinhibitoren eine zentrale Rolle einnehmen.
Antiproliferative und proapoptotische Mechanismen des Morphins - Konsequenzen für die Krebstherapie
(2008)
Im Rahmen dieser Arbeit sollte geprüft werden, ob Morphin in der Prostatakarzinomtherapie eingesetzt werden kann. Prostatakrebs ist bei Menschen eine der vier häufigsten aber kaum therapierbare Krebserkrankung. Nach dem Wiederauftreten des Karzinoms weist diese eine extrem hohe Mortalitätsrate auf. Morphin hemmt in MCF7-Zellen, die wie Prostatakarzinome zu den Adenokarzinomen gehören, das Tumorwachstum bei klinisch relevanten Plasmakonzentrationen und weist einen scheinbar μ-Opioid-Rezeptor unabhängigen antiproliferativen Effekt auf. In Kombination mit Naloxon kann dieser Effekt noch gesteigert werden. Somit könnte in Patienten das Tumorwachstum gehemmt werden, ohne die klassischen Nebenwirkungen hervorzurufen. Für den antiproliferativen Effekt ist die Stabilisierung von p53 notwendig. Prostatakarzinome schienen für eine Therapie mit Morphin prädestiniert, da p53 nur sehr selten in diesen Karzinomen mutiert ist. Für die Experimente wurde die LNCAP Prostatakarzinomzelllinie eingesetzt. Da Morphin weder das Tumorwachstum, noch die Zellproliferation in LNCAP-Zellen hemmte, scheint Morphin für die Behandlung von Prostatakarzinomen nicht geeignet zu sein. Durch Untersuchung der Angiogenese in LNCAP Tumoren konnte gezeigt werden, dass eine geringere Vaskularisierung keine verminderte Tumormasse zur Folge hat. Für eine erfolgreiche Krebstherapie scheint es im Gegenteil wichtig zu sein, eine normale Vaskularisierung in Tumoren wiederherzustellen. Die unterschiedlichen Morphinsensitivitäten der beiden Adenokarzinomzelllinien führte zu der Hypothese, dass der μ-Opioid-Rezeptor - zumindest partiell - doch an der Vermittlung des antiproliferativen Effekts des Morphins beteiligt sein könnte. Morphin induziert verschiedene Effekte in MCF7-Zellen, während LNCAP-Zellen kaum auf Morphin reagierten. Es sollte daher untersucht werden, warum MCF7-Zellen sensitiver auf Morphin ansprechen. Durch Überlebenstests mit MCF7-Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung der Zellen mit Morphin in Kombination mit exogenem Glutathion das Überleben der MCF7-Zellen im Vergleich zu morphinbehandelten Zellen signifikant steigern konnte. Dies war ein Hinweis, dass Morphin erstens die Bildung von ROS induziert und dies zweitens in einem Ausmaß geschieht, dass die Überlebensrate der MCF7-Zellen konzentrationsabhängig gehemmt wurde. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass die Inkubation der MCF7-Zellen mit Morphin weder die endogene Glutathionkonzentration noch die Expressionsraten der detoxifizierenden Enzyme SOD1 und P5 moduliert. Morphin induziert bei Konzentrationen von 100 μM und 1000 μM in MCF7-Zellen eine signifikant gesteigerte Superoxidanionenbildung. Wie bei den MCF7 Überlebenstests konnte exogen gegebenes Glutathion die durch 100 μM Morphin induzierte Superoxidanionenbildung unterdrücken. Die verstärkte Bildung der Superoxidanionen ist auf Morphin beschränkt, da sie nicht durch die Gabe von Fentanyl, Levomethadon oder Oxycodon induziert werden konnte. Die Bildung der Superoxidanionen könnte Morphin durch die Modulation einer plasmamembranständigen NADH Oxidase hervorrufen. Weiterhin wurden die Folgen einer chronischen Morphingabe im Rückenmark untersucht. Es wird vermutet, dass Morphin im Rahmen einer chronischen Behandlung Apoptose in GABAergen Neuronen auslöst. Für die neuronenspezifische Apoptose nach chronischer Morphingabe konnten durch FACS-Analysen ebenfalls Hinweise gefunden werden. Mittels vergleichender Proteomanalyse konnte festgestellt werden, dass VDAC1 im Rückenmärkgewebe von Tieren, die eine beginnende Morphintoleranz aufweisen, verstärkt exprimiert wurde. Neue Untersuchungen zeigen, dass VDAC1 in der Plasmamembran als Redoxenzym fungieren kann. Dort ist es mit einer NADH Oxidase in den PMOR Komplex eingebunden, der eine wichtige Rolle in der Regeneration von NAD+ aus NADH spielt und so Überleben und Zellwachstum ermöglicht. Eine Störung des PMOR Komplexes hat die Bildung von Radikalen zur Folge. In dieser Arbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass Morphin durch Modulation der plasmamembranstädnigen NADH Oxidase in MCF7-Zellen die Bildung von Superoxidanionen induziert. Als Konsequenz könnte VDAC1 verstärkt phosphoryliert werden, um die NAD+/NADH Homöostase aufrecht zu erhalten. Im Laufe der chronischen Morphingabe wird postuliert, dass sich derart viele Superoxidanionen akkumulieren, dass schwerwiegende Schäden an den Makromolekülen vorliegen und die Zelle daher in die Apoptose geht.
Die Einführung von Imatinib hat die Behandlung der CML revolutioniert, leider wird die Wirksamkeit dieses Medikaments überschattet durch das Vorkommen von primären und sekundären Resistenzen, welches Gegenstand vieler laufender Studien ist. Wir haben untersucht ob ein Mangel an einer aktiven Tyrosinphosphatase, der PTP-1B, Ursache einer solchen Resistenz gegen Imatinib in bcr-abl positiven Zellen sein kann. Zu diesem Zweck konstruierten wir eine Substratfalle, die einerseits in der Lage ist PTP-1B zu binden, allerdings keine/ kaum katalytische Aktivität besitzt. Eine solche dominant-negative Mutante wurde in K562 Zellen kloniert und mit einem überexprimierendem Klon hinsichtlich CML-prägenden Veränderungen (Differenzierungsverhalten mittels FACS-Analysen, veränderte Signaltransduktion mittels Western Blot und Wachstumsverhalten mittels Zellzahlbestimmung, etc...) untersucht. Hiernach konnten wir zeigen, dass ein Mangel an aktiver PTP-1B zu einer Resistenz gegen Imatinib in bcr-abl positiven Zellen führt.
The crude oil constituents benzene, toluene, ethylbenzene, and the three xylene isomers (BTEX) are the dominating groundwater contaminants originating from surface spill accidents by oil production facilities and with gasoline and jet fuel. Thereby BTEX posing a threat to the world´s scarce drinking water resources due to their water solubility and toxicity. An active remediation cleanup involving a BTEX event proves not only to be very expensive but almost impossible when it comes to the complete removal of contaminants from the subsurface. A favoured and common practice is combining an active remediation process focussing on the source of contamination coupled together with the monitoring of the residual contamination in the subsurface (monitored natural attenuation; MNA). MNA include all naturally occuring biological, chemical and physical processes in the subsurface. The general goal of this work was to improve the knowledge of biodegradation of aromatic hydrocarbons under anaerobic conditions in groundwater. For this groundwater and soil at the former military underground storage tank (UST) site Schäferhof – Süd near Nienburg/Weser (Niedersachsen, Germany) were sampled and analysed. The investigations were done in collaboration of the Umweltbundesamt, the universitys of Frankfurt and Bremen and the alphacon GmbH Ganderkesee. To investigate the extent of groundwater contamination, the terminal electron acceptor processes (TEAPs) and the metabolites of BTEX degradation in groundwater, six observation wells were sampled at regular intervals between January 2002 and September 2004. The wells were positioned in order to cover the upstream, the source area and the downstream of the presumed contamination source. Additionally, vertical sediment profiles were sampled and investigated with respect to spreading and concentration of BTEX in the subsurface. A large residual contamination involving BTEX is present in soil and groundwater at the studied locality. Maximum BTEX concentration values of 17 mg/kg were recorded in analysing sediment in the unsaturated zone. In the capillary fringe, values of 450 mg/kg were recorded (October 2004) and in the saturated zone maximum values of 6.7 mg/kg BTEX were detected. The groundwater samples indicate increasing BTEX concentrations in the groundwater flow direction (from 532 µg/l up to 3300 µg/l (mean values)). Biodegradation of aromatic hydrocarbons under anaerobic conditions in the sub surface at contaminated sites is characterised by generation of metabolites. From the monoaromatic hydrocarbons BTEX metabolites such as benzoic acid (BA) and the methylated homologs and C1-and C2-benzyl-succinic acids (BSA) are generated as intermediates. A solid-phase extraction method based on octadecyl-bonded silica sorbent has been developed to concentrate such metabolite compounds from water samples followed by derivatization and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) of the extracts. The recovery rate range between 75 and 97%. The method detection limit was 0.8 µg/l. Organic acids were identified as metabolic by-products of biodegradation. Benzoic acid, C1-, C2- and C3-benzoic acid were determined in all contaminated wells with considerable concentrations. Furthermore, the depletion of the dominant terminal electron acceptors (TEAs) oxygen, nitrate, and sulphate and the production of dissolved ferrous iron and methane in groundwater indicate biological mediated processes in the plume evidently proving the occurrence of NA. A large overlap of different redox zones at the studied part of the plume has been observed. A important finding in this study is the strong influence of groundwater level fluctuations on the BTEX concentration in groundwater. A very dry summer in 2003 was recorded during the monitoring period, resulting on site in a drop of the groundwater level to 1.7 m and a concomitant increase of BTEX concentrations from 240 µg/l to 1300 µg/l. The groundwater level fluctuations, natural degradation and retention processes essentially influence BTEX concentrations in the groundwater. Groundwater level fluctuations have by far a stronger influence than the influence of biological degradation. Increasing BTEX concentrations are hence not a consequence of limited biological degradation. Another part of the study was to observe the isotopic fractionation of the electron acceptor Fe(III), due to biologically mediated reduction of Fe(III) to the watersoluble Fe(II) at the site and first field data are presented. Both groundwater and sediment samples were analysed with respect to their Fe isotopic compositions using high mass resolution Multi Collector-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry (MC-ICP-MS). The delta56Fe -values of groundwater samples taken from observation wells located downstream of the source area were isotopically lighter than delta56Fe -values obtained from groundwater in the uncontaminated well. The Fe isotopic composition of most parts of the sediment profile was similar to the Fe isotopic composition of uncontaminated groundwater. Thus, a significant iron isotope fractionation can be observed between sediment and groundwater downstream of the BTEX contamination.
Obwohl zur Diagnostik kognitiver Funktionen bei Patienten mit psychischen Störungen computerisierte neuropsychologische Leistungstests inzwischen das Mittel der Wahl sind, gibt es kaum Untersuchungen, ob es eine besondere Patient-Computer-Interaktion gibt, und ob diese Interaktion Einfluss auf die Ergebnisse neuropsychologischer Leistungstests hat. Aufgrund der spezifischen Psychopathologie depressiver Erkrankungen ist diese Fragestellung hierzu besonders relevant. In der vorliegenden Studie wurde deshalb die Patient-Computer-Interaktion zunächst mit den Variablen Computererfahrung, Computereinstellung und Wahrnehmung der Testsituation operationalisiert. Anschließend wurde geprüft, ob sich depressive Patienten in diesen Variablen von Kontrollpersonen unterscheiden, ob die Computererfahrung und die Computereinstellung jeweils einen Einfluss auf die Ergebnisse von neuropsychologischen Leistungstests haben und ob diese Einflüsse besonders stark bei depressiven Patienten zum Tragen kommen. Es wurden 73 Patienten mit rezidivierend depressiver Störung mit 73 Alters und Geschlecht gematchten Kontrollpersonen verglichen. Die Diagnose erfolgte anhand der Internationalen Diagnose Checklisten nach DSM IV. Zur Erfassung der Patient-Computer-Interaktion wurden der Demographische Fragebogen zu Umgang mit Computern, die Groningen Computer Attitude Scale sowie ein neu entwickelter Fragebogen zur Wahrnehmung der Testsituation eingesetzt. Die umfangreiche neuropsychologische Untersuchung erfolgte mit den Testbatterien NEUROBAT und CANTAB sowie einer Visuomotorischen Tracking-Aufgabe. Depressive Patienten zeigten kognitive Leistungsdefizite gegenüber Kontrollpersonen in einer Gedächtnis Wiedererkennen-, einer Visuomotorischen Tracking- und in einer Arbeitsgedächtnisaufgabe. Die Patienten hatten weniger Computererfahrung, eine weniger positive Computereinstellung und nahmen die Testsituation weniger positiv wahr als Kontrollpersonen, obwohl die Computereinstellung und die Wahrnehmung der Testsituation auch bei den Patienten überwiegend positiv war. Sowohl Patienten als auch Kontrollpersonen mit geringer Computererfahrung oder negativerer Computereinstellung zeigten in einigen neuropsychologischen Tests schlechtere Ergebnisse trotz der statistischen Kontrolle möglicher konfundierender Variablen wie Alter, Geschlecht und Bildung. Die Computererfahrung fungierte dabei von allen Variablen als häufigster Prädiktor zu Erklärung eines Testergebnisses. Depressive Patienten mit negativerer Computereinstellung reagierten langsamer bei den Tests der NEUROBAT-Testbatterie. Ansonsten ergaben sich keine weiteren Interaktionen Gruppe x Computererfahrung bzw. Gruppe x Computereinstellung. Computerisierte neuropsychologische Leistungstests werden von Patienten mit rezidivierend depressiver Störung überwiegend positiv wahrgenommen. Sowohl bei den Patienten als auch bei den Kontrollpersonen haben die Computererfahrung und Computereinstellung stellenweise einen Einfluss auf die Testergebnisse. Die Nichtberücksichtigung dieser Variablen kann somit zur Benachteiligung von Personen führen, die über geringe Computererfahrung oder eine negativere Computereinstellung verfügen. Rezidivierend depressive Patienten sind bei Nichtberücksichtigung dieser Variablen nicht aufgrund ihrer spezifischen Psychopathologie benachteiligt, sondern wegen ihrer geringeren Computererfahrung und negativeren Computereinstellung. Bei der Untersuchung kognitiver Funktionen mit computerisierten neuropsychologischen Leistungstests sollten deshalb zukünftig sowohl bei wissenschaftlichen als auch bei klinischen Fragestellungen immer die Computererfahrung und die Computereinstellung mitberücksichtigt werden.
Diese Untersuchung beschreibt den peri- und postinterventionellen Verlauf von Patienten, die wegen eines Lebertumors einer chirurgischen oder radiologischen Intervention unterzogen wurden. Das Untersuchungsregime war prospektiv, je 12 Patienten wurden einer operativen, einer TACE oder einer LITT unterzogen und insgesamt mindestens über 9 Monate postinterventionem nachuntersucht. Das Hauptaugenmerk lag auf der Analyse des Lebervolumens das computertomographisch erfasst wurde und der Serumverläufe des Hepatocyte Growth Factor (HGF). Bei den 36 Patienten, die über mindestens 9 Monate nachbeobachtet werden konnten, wurden insgesamt 302 computertomographische Volumendaten erhoben und 314 Laboruntersuchungen vorgenommen. Von diesen 36 Patienten verstarben 14 (je 5 in der chirurgischen und der TACE-, 4 in der LITTGruppe) während des Nachuntersuchungszeitraumes, bei 14 Patienten war ein Tumorrezidiv nachweisbar (6 in der chirurgischen, 5 in der TACE- und 3 in der LITT-Gruppe). Zusammenfassend lassen sich folgende Ergebnisse formulieren: 1. Es findet sich eine tendenzielle Lebervolumenabnahme bei LITT-Patienten. Die chirurgischen Patienten erzielen im Schnitt am Ende des Untersuchungszeitraums in etwa das präoperative Ausgangsvolumen. Das Volumen der TACE-Patienten zeigt keine ausgeprägten Volumenänderungen. 2. Das maximale Lebervolumen korreliert mit der Körperoberfläche mit einem Lebervolumen- Körperoberflächenverhältnis von etwa 0,865 l/m². 3. Patienten, die radiologisch-interventionell behandelt wurden, wiesen niedrigere HGFSerumkonzentrationen auf als die chirurgische Kontrollgruppe. 4. Patienten mit HCC wiesen deutlich höhere Serumkonzentrationen von HGF auf als Patienten mit Metastasen, Patienten mit Metastasen eines Mammakarzinoms niedrigere als Patienten mit anderen Metastasen. Im Unterschied zu der Vergleichsgruppe in der einige Rezidive beobachtet werden konnten, entwickelte keine der Mammatumorpatienten ein Rezidiv. 5. Bei Patienten, die im Verlauf ein Rezidiv entwickelten, zeigten sich deutlich höhere HGFKonzentrationen als bei Patienten ohne Rezidiv. 6. Patienten mit erhöhten Serumtransaminasen wiesen postinterventionell höhere HGFAntworten auf als Patienten mit niedrigeren Serumtransaminasenkonzentrationen. Diese Ergebnisse decken sich mit denen anderer Arbeitsgruppen.
The Na+,K+-ATPase was discovered more than 50 years ago, but even today the pumpcycle and its partial reactions are still not completely understood. In this thesis, Voltage Clamp Fluorometry was used to monitor the conformational changes that are associated with several electrogenic partial reactions of the Na+,K+-ATPase. The conformational dynamics of the ion pump were analyzed at different concentrations of internal Na+ or of external K+ and the influences on the conformational equilibrium were determined. To probe the effect of the internal Na+ concentration on the Na+ branch of the ion pump, oocytes were first depleted of internal Na+ and then loaded with Na+ using the epithelial sodium channel which can be blocked by amiloride. The conformational dynamics of the K+ branch were studied using different external K+ concentrations in the presence and in the absence of external Na+ to yield additional information on the apparent affinity of K+. The results of our Voltage Clamp Fluorometry experiments demonstrate that lowering the intracellular concentration of Na+ has a comparable effect on the conformational equilibrium as increasing the amount of K+ in the external solution. Both of these changes shift the equilibrium towards the E1/E1(P) conformation. Furthermore, it can be shown that the ratio between external Na+ and K+ ions is also a determinant for the position of the conformational equilibrium: in the absence of external Na+, the K+ dependent shift of the equilibrium towards E1 was observed at a much lower K+ concentration than in the presence of Na+. In addition, indications were found that both external K+ and internal Na+ bind within an ion well. Finally, the crucial role of negatively charged glutamate residues in the 2nd extracellular loop for the control of ion-access to the binding sites could be verified.
Typ 1 Diabetes mellitus ist eine Glucoseverwertungsstörung, die durch die utoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen des Pankreas bedingt wird. Es wird davon ausgegangen, dass zu 40 - 50 Prozent exogene Faktoren und zu 50 - 60 Prozent genetische Faktoren an der Pathogenese beteiligt sind. Die Gene der HLA-Region sind dabei etwa zu einem Drittel an der genetischen Disposition beteiligt. HERV K18, ein HERV der im ersten Intron des CD 48 Gens auf Chromosom 1q21.2-q22 lokalisiert ist, verfügt über einen Bereich der für ein Superantigen (SAg) codiert. In Studien wurde eine Vβ7-T-Zellen-Expansion in Pankreata bei neumanifestiertem Typ 1 Diabetes mellitus nachgewiesen, die auf die SAg Wirkung des env Gens des HERV K18 zurückzuführen war. Es wurde anschliessend postuliert, dass SAg Autoimmunerkrankungen hervorrufen indem sie T-Zellen, genauer autoreaktiver CD4+ Vb17-T-Lymphozyten, aktivieren, die spezifisch für Autoantigene sind. Humane endogene Retroviren (HERV) machen 8 % des menschlichen Genoms aus und werden mit der Entstehung von verschiedenen Autoimmunprozessen in Verbindung gebracht, wie Rheumatoide Arthritis oder Multipler Sklerose. Unterschiede in der DNA-Sequenz des HERV K18 könnten eine prädisponierende Wirkung von Untergruppen des endogenen Retrovirus für eine Typ 1 Diabetesmanifestation erklären. 20 kb stromaufwärts des 5 LTREndes findet sich ein hochpolymorpher Mikrosatellitenmarker dessen Polymorphismen ebenfalls von Bedeutung sein könnten für die Entstehung von Typ 1 Diabetes mellitus. Nicht nur die mittels SAg getriggerte polyklonale Aktivierung autoreaktiver CD4+ Vb17-T-Lymphozyten könnte zu Typ 1 Diabetes mellitus führen, auch über eine Veränderung der CD48-Expression könnte es einen kausalen Zusammenhang mit der Pathogenese des Typ 1 Diabetes geben. In der Untersuchung der HERV K18-Polymorphismen fand sich bei beiden, also HERV 8594 und HERV 8914, weder in der Genotypenverteilung noch in der Transmissionsanalyse ein Hinweis für eine Kopplung mit Typ 1 Diabetes mellitus. Ebenso zeigte die Analyse des Mikrosatelliten zeigte keine signifikanten Unterschiede. Unsere Ergebnisse zeigen somit weder eine Assoziation des HERV K18, noch der ihm benachbarten Genregion mit Typ 1 Diabetes mellitus. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit einem Polymorphismus im Areal 2q33, welches immunologisch betrachtet von essentieller Bedeutung ist. Es beherbergt Gene, deren Moleküle an der Zelloberfläche exprimiert werden und die als regulierende Signale in der T-Zell- Aktivierung fungieren. Zu den wichtigsten zählen CD28, CTLA 4 sowie ICOS. CTLA 4 ist bei der Entstehung des Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Basedow, Hashimoto Thyreoiditis sowie Myasthenia gravis involviert. Durch die gengeographische Nähe des ICOS zum CTLA 4 besteht die Möglichkeit, dass auch ICOS mit Typ 1 Diabetes gekoppelt ist. Innerhalb des Intron 4 des ICOS befindet sich ein alter, hochkonservierter und hochpolymorpher Mikrosatellit, genannt SARA 47. In der Transmissionsanalyse fiel auf, dass das Allel 93 ausschliesslich transmittiert wurde und das Allel 95 hingegen eher retiniert wurde. Besonders deutlich wird dieser Effekt in der isolierten Betrachtung der maternalen Transmission. Hier wird vor allem die protektive Wirkung des Allels 95 deutlich. In der Kopplungsanalyse des SARA 47 mit CTLA 4 wird der Haplotyp 93-A ausschliesslich transmittiert und ist somit ein prädisponierender Faktor in der Entstehung des Typ 1 Diabetes mellitus. Die gekoppelten Haplotypen 95-G sowie 99-A hingegen wirken eher protektiv. Durch den in dieser Arbeit untersuchten Mikrosatelliten wird die Bedeutung der Region 2q33 in der Pathogenese von Typ 1 Diabetes mellitus untermauert.
Die Maus hat wie die meisten Säugetiere zwei Zapfenopsine, das S-Opsin (UV-empfindlich) und das M-Opsin (grün-empfindlich). Die Zapfen werden nach dem jeweils exprimierten Opsin S-Zapfen oder M-Zapfen genannt. Bei der Maus wird die Zapfenzahl embryonal festgelegt, aber das Opsin-Expressionsmuster entwickelt sich erst postnatal (Szel et al. 1998). In der ersten Postnatalwoche (PWo 1) exprimieren alle Zapfen über die gesamte Retina das S-Opsin. Ab PWo 2 kann das M-Opsin immunzytochemisch nachgewiesen werden. Eine Besonderheit der adulten Maus ist die Koexpression beider Opsine in vielen Zapfen (Dualpigmentzapfen; Lukats et al. 2005). Außer einer geringen Zahl "echter" S-Zapfen exprimieren alle Zapfen das M-Opsin entweder allein oder zusammen mit dem S-Opsin (Szel 1993, Applebury 2000, Haverkamp et al. 2005). Das adulte wildtypische Zapfenmuster besteht aus gegenläufigen dorso-ventralen Gradienten der S- und M-Zapfen (Szel 1993, Applebury 2000). Das M-Opsin wird stärker in der dorsalen Retina exprimiert und die Expression nimmt zur ventralen Retina ab. In der ventralen Retina exprimieren alle Zapfen das S-Opsin, in der dorsalen Retina ist die Zahl der S-Zapfen sehr gering. Das adulte Zapfenmuster entsteht durch einen Wechsel von S- zu M-Opsinexpression in vielen Zapfen. Die Expression der Opsine wird während der postnatalen Entwicklung durch den Schilddrüsenhormonrezeptor beta 2 (TRbeta2) reguliert. Ein Fehlen des TRbeta2 (TRbeta2 -/-) führt zum Verlust des M-Opsins und zur Expression des S-Opsins in allen Zapfen (Ng et al. 2001). Auch das Schilddrüsenhormon und der Retinsäurerezeptor gamma (RXRgamma) sind Regulatoren in der postnatalen Entwicklung der Opsinexpression (Roberts et al. 2005, 2006). Die Pax8 -/- Maus hat durch den Verlust des Pax8-Gens eine mißgebildete Schilddrüse, die kein Schilddrüsenhormon produzieren kann (Mansouri et al. 1998). In der vorliegenden Studie wurde die Auswirkung der postnatalen Hypothyreose von Pax8 -/- auf die Entwicklung des Auges und der Retina im Alter von PWo 3 untersucht. Die Ergebnisse von Pax8 -/- wurden mit Pax8 +/- und +/+ Wurfgeschwistern verglichen. Die Hypothyreose von Pax8 -/- wurde durch Messung der Schilddrüsenhormonwerte im Blut bestätigt. Die Augenparameter unterscheiden sich nicht zwischen Pax8 -/- und den Kontrolltieren. Auch die Entwicklung der Retina ist bei allen drei Pax8-Genotypen gleich. Pax8 -/- zeigt keine Veränderungen in der Schichtung der Retina sowie der Morphologie untersuchter Zelltypen. In allen drei Pax8-Genotypen konnten die Transkripte der S- und M-Opsine und des Stäbchenopsins nachgewiesen werden. Auch die Transkripte des TRbeta2, der Deiodinase 2 und der Deiodinase 3 wurden ermittelt. Anhand dieser Ergebnisse kann die Aussage gemacht werden, daß die Hypothyreose von Pax8 -/- keinen Einfluß auf die generelle postnatale Entwicklung des Auges und der Retina zeigt. Im Gegensatz dazu ist die Auswirkung der Hypothyreose auf die Ausprägung des S- und M-Zapfenmusters gravierend. Sie wurde durch Dichtezählungen der S- und M-Zapfen analysiert. Zunächst wurde das Zapfenmuster der wildtypischen Maus-Stämme C57, Sv129 und Pax8 +/+ untersucht. Alle drei Wildtypen zeigen im Alter von PWo 3 und PWo 22 (adult) ein vergleichbares Zapfenmuster mit gegenläufigem dorso-ventralem Gradienten der S- und M- Zapfen. Auch die heterozygote Pax8 +/- Maus zeigt das wildtypische Zapfenmuster. Pax8 -/- hingegen hat ein verändertes Zapfenmuster. Die S-Zapfendichten sind bei PWo 3 und PWo 22 über die gesamte Retina gleich, so daß kein Gradient ausgebildet ist. Die Veränderung im M-Zapfenmuster von Pax8 -/- ist bei PWo 3 deutlich zu sehen, während das adulte M-Zapfenmuster wieder wildtypisch erscheint, hier scheint also eine verzögerte normale Entwicklung vorzuliegen. Durch eine Substitution mit Thyroxin (T4) ab P2 kann bei Pax8 -/- das wildtypische Zapfenmuster erzeugt werden, somit ist das Schilddrüsenhormon für die Ausprägung des Zapfenmusters während der postnatalen Entwicklung verantwortlich. Weitere Versuche zeigen, daß die Opsinexpression während des ganzen Lebens plastisch und Schilddrüsenhormon-abhängig ist. Eine Unterbrechung der T4-Substitution ab PWo 4 führt bei Pax8 -/- zum Rückgang auf das hypothyreote Zapfenmuster. Auch wenn Pax8 -/- erst im adultem Alter mit T4 substituiert wird, ist eine Veränderung des Zapfenmusters sichtbar. Eine künstlich durch Methimazol erzeugte Hypothyreose in adulten C57-Mäuse führt ebenfalls zu einer Veränderung des Zapfenmusters, das dann mit dem Zapfenmuster von Pax8 -/- identisch ist. Zusammenfassend erlauben die Ergebnisse den Schluß, daß das Schilddrüsenhormon über die Expression der Opsine die Ausprägung des Zapfenmusters sowohl während der Entwicklung reguliert, als auch für eine Aufrechterhaltung des Zapfenmusters während des ganzen Lebens benötigt wird. Dieser Befund hat auch klinische Relevanz. Die nicht seltene Neugeborenen-Hypothyreose beim Menschen wird heute durch eine direkt nach der Geburt beginnende lebenslange Thyroxin-Substitution therapiert. Nach unseren Befunden bei der Maus könnte dies auch für die Aufrechterhaltung einer normalen Zapfenopsin-Expression und damit eines normalen Sehvermögens notwendig sein.
Der tägliche und jahreszeitliche Wechsel in den Lichtverhältnissen bedeutet für alle Lebewesen eine regelmäßige und fundamentale Veränderung ihrer Lebensbedingungen. Mit Hilfe einer inneren Uhr können Lebewesen regelmäßige Veränderungen ihrer Umwelt im Tagesgang und während des Jahres antizipieren. Diese Innere Uhr sitzt bei Säugetieren im hypothalamischen Nucleus suprachiasmaticus (SCN) und generiert einen zirkadianen Rhythmus, der durch Signale des retinohypothalamischen Traktes mit den Umweltbeleuchtungsbedingungen synchronisiert wird. Bei Wirbeltieren werden die Elemente, die an der Genierung von zirkadianen Zeitsignalen beteiligt sind zu einem spezifischen neuronalen Schaltkreis im Gehirn, dem photoneuroendokrinen System (PNS), zusammengefasst. Im PNS werden im Pinealorgan photoperiodische Signale in die zirkadian rhythmische Synthese des Neurohormons Melatonin umgesetzt. Dabei ist die vom zentralen Oszillator im SCN gesteuerte Freisetzung von Noradrenalin (NA) aus sympathischen postganglionären Nervenfasern in das Pinealorgan der entscheidende Reiz zur nächtlichen Ankurbelung der Melatoninbiosynthese. Melatonin wird ausschließlich in der Nacht gebildet und fungiert daher als ein Zeithormon. Unmittelbar nach der Synthese wird Melatonin in die Blutbahn abgegeben und liefert allen Zellen, die mit spezifischen Melatoninrezeptoren ausgestattet sind, die aktuelle Licht- und Zeitinformationen. NA bewirkt in allen untersuchten Säugetieren die Aktivierung des Schlüsselenzyms der Melatoninsynthese, der Arylalkylamin N-Acetyltransferase (AANAT). Die Transkription der Aanat wird durch eine cAMP-abhängige Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors CREB (cyclicAMP response element binding protein) eingeleitet. Der inhibitorische Transkriptionsfaktor ICER (inducible cAMP early repressor) ist in die Abschaltung der erhöhten Melatoninsyntese am Ende der Nacht involviert. Die Transkription von Icer erfolgt ebenfalls durch die NA-induzierte Aktivierung der cAMP-Signalkaskade. In Säugetieren, persistiert der Rhythmus der Melatoninausschüttung, wenn das Tier unter konstanter Dunkelheit gehalten wird, wird aber durch eine akute Lichtexposition während der Nacht unterdrückt. Beim Syrischen Hamster ist die photoperiodische Abhängigkeit der Melatoninsynthese für die Hemmung der hypothalamohypophysären-gonadalen Achse mit Beginn des Herbstes notwendig und sichert den optimalen Zeitpunkt z.B. für die saisonale Reproduktion, den Winterschlaf, die Migration oder den täglichen Schlaf. Allerdings kann im Unterschied zu Ratte und Maus beim Syrischen Hamster kein Anstieg der Melatoninkonzentration im Pinealorgan während des Tages induziert werden. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die fehlende Induzierbarkeit der Melatoninsynthese während des Tages beim Syrischen Hamster besser zu verstehen, und zu untersuchen, ob auch im Pinealorgan des Syrischen Hamsters, wie bei Ratte und Maus, der inhibitorische Transkriptionsfaktor ICER vorkommt und reguliert ist. Um die Nicht-Induzierbarkeit der Melatoninsynthese zu erklären wurde eine eventuelle Abhängigkeit der ICER Menge im Pinealorgan von der Photoperiode untersucht. Die Unterdrückung der Funktion der hypothalomo-hypophysären-gonadalen Achse unter Kurztag Photoperiode wurde durch die Gewichtsabnahme der Gonadengewichte bestätigt. Die immunhistochemische Analyse bestätigte das Vorkommen des ICER Proteins im Pinealorgan des Syrischen Hamsters und es konnte eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Dauer der Lichtperiode und der Expression des ICER Proteins gezeigt werden. Bei einer Langtag Photoperiode von 16 h Licht wurde ein schnellerer Anstieg und insgesamt höhere ICER Protein Werte als bei der Kurztag Photoperiode beobachtet. Unabhängig von der Photoperiode, waren die ICER Werte niedrig zum Beginn der Nacht und stiegen zum Ende der Nacht an. ICER Minimalwerte wurden in beiden Photoperioden 5 und 6 h nach Beginn der Dunkelperiode beobachtet und lassen sich durch einen aktiven Abbau erklären, der zeitgleich mit der NA-Ausschüttung aus den sympathischen Nervenendigungen stattfindet. Während der gesamten Lichtphase zeigte sich unabhängig von der Photoperiode ein erhöhter ICER Proteinspiegel im Pinealorgan des Syrischen Hamsters, der möglicherweise die Stimulation der Melatoninsynthese während des Tages im Unterschied zur Ratte und der Maus nicht ermöglicht. Die hier präsentierten Daten lassen sich gut in bereits erarbeitete Modelle der transkriptionellen Regulation des Aanat Gens und der posttranslationellen Mechanismen in der Regulation der Melatoninsynthese beim Nager einfügen. Sie zeigen, dass auch beim Syrischen Hamster die transkriptionelle Regulation der Melatoninbiosynthese eine wichtige Rolle zu spielen scheint und das darin offensichtlich der inhibitorische Transkriptionsfaktor des cAMP Signaltransduktionsweges, ICER, ähnlich wie bei Maus und Ratte, involviert ist. Weiterhin könnte die erhöhte Präsenz von ICER während des Tages erklären, warum zu dieser Zeit eine Aktivierung des cAMP-Signaltransduktionsweges nicht zu einem Anstieg der Melatoninbiosynthese führt.
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin (IL)-18 scheint an einer Vielzahl von Entstehungsprozessen pathologischer Erkrankungen, darunter rheumatoide Arthrits und Artherosklerose, sowie Tumorwachstum und Metastasierungsfähigkeit von Tumoren, beteiligt zu sein. Da die biologische Aktivität der Matrix-Metallo-Proteinase-9 (MMP-9) ebenfalls entscheidenden Einfluss auf die Pathologie dieser Erkrankungen hat, wurden die Auswirkungen von IL-18 auf die MMP-9-Produktion in peripheren Blutmonozyten (PBMC) untersucht. Darüber hinaus richtete sich unser Augenmerk auf die Möglichkeiten einer immunopharmakologischen Intervention mittels anti-Tumor-Nekrose-Faktorα (anti-TNFα) oder IL-10. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß die MMP-9-Produktion in PBMC durch IL-18 gesteigert wird. Dabei ist die Potenz von IL-18 bei der Freisetzung von MMP-9 vergleichbar mit derjenigen von TNFα. Durch die Verwendung neutralisierender monoklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung von MMP-9 von einer endogenen TNFα-Produktion abhängig ist. Während IL-18 und TNFα die Protease induzieren, ergibt eine Inkubation mit IFNγ keine Effekte auf die Freisetzung von MMP-9 in den PBMC. Die hier beschriebene Induktion von MMP-9 durch IL-18 ließ sich ebenfalls in humanen Vollblutkulturen nachweisen. Das antientzündliche Zytokin IL-10 ist in der Lage, die Sekretion von MMP-9 sowohl aus unstimulierten als auch aus PBMC, die zuvor mit IL-18 inkubiert wurden, konsequent zu unterdrücken. Die Produktion des tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) bleibt von einer Stimulation mit IL-18 unberührt, wohingegen eine Zugabe von IL-10 die Sekretion von TIMP-1 aus PBMC steigert. Die vorliegende Arbeit erweitert somit die proentzündlichen Wirkungsweisen von IL-18 auf PBMC, betont die herausragende Rolle einer intermediären TNFα-Produktion und stellt einen Zusammenhang her zwischen den biologischen Funktionen von IL-18 und der pathologischen Potenz von MMP-9.
I. Untersuchung der Transformationsmaschinerie in Acinetobacter baylyi ADP1 durch Analyse der subzellulären Lokalisation von Kompetenzproteinen, Mutantenstudien und In-vivo-Detektion des DNA-Translokators in der lebenden Zelle. 1. Durch Komplementationsstudien konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertionen in den Mutanten T843 (comM::nptII) und T840 (comL::nptII) keine polaren Effekte auf stromabwärts gelegene Gene des comM-Q Clusters haben. Hieraus kann geschlossen werden, dass ComM und ComL essentiell sind für die natürliche Transformation. 2. Mit Hilfe der sacB-nptII Selektionskassette wurde eine markerlose und somit nichtpolare Mutation in comN erzeugt. Diese Mutante war nicht mehr transformierbar, woraus eindeutig geschlossen werden kann, dass ComN ebenfalls essentiell ist für die natürliche Transformation. 3. Western-Blot-Analysen subzellulärer Fraktionen von A. baylyi ergaben, dass die Kompetenzproteine ComL und ComN in der inneren Membran lokalisiert sind. 4. Mutantenstudien führten zu dem Schluss, dass ComL in der comM-, der comN- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen ist. Auch ComN ist in der comM- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen. Daraus lässt sich folgern, dass die Proteine entweder die Expression der entsprechende Gene beeinflussen oder dass durch Interaktionen von ComM, ComN, ComL und ComO die Stabilität der Proteine erhöht wird. 5. Die Kompetenzproteine ComEA und ComP wurden translational mit GFPuv fusioniert (C-terminale Fusion). Die Expression der Gene comEA-gfp und comP-gfp, die auf dem Plasmid pRK415 unter der Kontrolle eines lac-Promotors vorlagen, führte nach Induktion mit IPTG zur Detektion der Fusionsproteine in A. baylyi. Über Komplementationsstudien konnte nachgewiesen werden, dass die ComEA-GFP- und ComP-GFP-Fusionsproteine funktionsfähig sind. 6. Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Verteilung von ComEA und ComP in der Zellmembran von A. baylyi abhängig ist von der Wachstumsphase und der Kompetenz: Während die Kompetenzproteine in der lag-Phase (zum Zeitpunkt maximaler Kompetenzinduktion) gleichmäßig über die gesamte Membran verteilt sind, finden sie sich im Laufe der exponentiellen Phase (mit abnehmender Kompetenz) in einer abnehmenden Zahl von separaten Foci, bis sie schließlich in der späten stationären Phase (zum Zeitpunkt minimaler Kompetenz) nur noch in 1 - 2 distinkten Foci lokalisiert sind. II. DNA-Transfer in marinen Bakterien 1. Vor der Auswahl geeigneter Selektionsmarker für DNA-Transferstudien in marinen Bakterien wurde eine Analyse der spontanen Resistenzen mariner Bakterien durchgeführt. Diese Analysen ergaben, dass 72 % von 116 marinen Isolaten sensitiv gegenüber einer Kombination von je 100 μg Kanamycin und 100 μg Streptomycin pro ml Medium sind. 2. Es wurde ein Transformationsprotokoll für das Screening mariner Bakterien auf die Fähigkeit zur DNA-Aufnahme durch natürliche Transformation etabliert. Es wurden drei Vektoren pM1, pM2 und pM3 konstruiert, die eine Übertragung und stabile Insertion von Antibiotikaresistenz-Markergenen und dem zur Detektion eingesetzten gfp-Gen durch homologe Rekombination flankierender rDNA-Bereiche mit dem rDNA-Operon des Rezipienten ermöglichten. 3. Unter Einsatz dieser Vektoren wurde die Transformierbarkeit von 83 marinen Isolaten überprüft. Diese Analysen führten zur Identifizierung von vier transformierbaren Isolaten. Bei diesen Isolaten handelt es sich um Marinobacter sp., K. rosea, P. phosphoreum und P. marincola Stämme.
In this thesis I have investigated the regulation of eicosanoid synthesizing-enzymes by cannabinoid receptor agonists. Rat renal mesangial cells were used as a model system. I could show that all three (CB1, CB2, and GPR55) cannabinoid receptors are expressed on the mRNA level in rat renal mesangial cells – but with differing expression profiles. The CB1 and GPR55 receptors are expressed in comparable amounts, whereas the CB2 receptor is considerably less expressed than the CB1 and the GPR55 receptors. Furthermore I could show that stimulation of renal mesangial cells with CB1 receptor agonists, such as R(+)MA or ACEA, increased IL-1β-induced cPLA2, sPLA2-IIa, and COX2 protein and mRNA expression which subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Additionally, the IL-1β- induced sPLA2-IIa promoter activity was also increased by CB1 receptor stimulation. Besides the modulated expression of the eicosanoid synthesizing enzymes, I could show that CB1 agonists also led to an increase of IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation. In contrast, stimulation with CB2 selective agonists led to a decrease in IL-1β- induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. Accordingly, the IL-1β-induced sPLA2-IIa promoter activity was also reduced by CB2 receptor agonists. IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation were not influenced by CB2 recptor activation. Matching the results I obtained with CB1 receptor agonists on IL-1β-induced PGE2 formation, I could observe an increased cPLA2 protein and mRNA expression with a subsequent increase in IL-1β-induced PGE2 formation by GPR55 stimulation. Stimulation with THC, an unselective CB agonist, increased the IL-1β-induced sPLA2-IIa protein expression and subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Subjecting the cells to higher THC concentrations surprisingly led to a reduction of the IL-1b-induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. A possible explanation may be the differential expression of the three CB receptors. At low concentrations THC may predominantly activate CB1 and GPR55 and with increasing concentration CB2 receptors may also be activated, slightly reversing the enhancing effect. Moreover, I could show that the CB1 receptor stimulation mediated phosphorylation and hence the activation of ERK1/2 MAPK. Additionally to ERK1/2, there was also a phosphorylation and activation of NFkB observed by CB1 receptor stimulation. In my thesis I could show for the first time that PPARα was activated by IL-1β in rMC. The IL-1β-induced PPARα promoter activity was completely inhibited by addition of the CB2 receptor agonist, JWH015. These findings were confirmed by inhibition of the IL-1β-induced PGE2 formation by a PPARα antagonist (MK-886). In summary, I could show that activation of CB1 receptors in our system led to a worsening of an inflammatory condition, whereas activation of the CB2 receptors led to the complete opposite; namely a reduction of the inflammatory response by reducing the sPLA2-IIa expression and PGE2 formation. GPR55 activation did not display any alteration of inflammatory conditions, since the classical inflammatory pathway was not influenced.
Ideale universelle Nucleosid-Analoga könnten im Hinblick auf therapeutische Oligonucleotide einen Fortschritt in der Entwicklung darstellen. Zudem bieten solche Nucleosidanaloga auch aus synthetischer Sicht Vorteile: Durch ihre Struktur sind chemische Modifikationen – wie beispielsweise Modifizierungen an der Zuckereinheit – leichter zugänglich, als bei den natürlichen Nucleosiden. Ein Ziel der vorliegenden Doktorarbeit bestand darin, bereits bekannte universelle Nucleosidbausteine solchermaßen zu modifizieren, das bei ihrer Anwendung in Oligonucleotiden ihre Vorteile besser zum Tragen kommen. Vor diesem Hintergrund besaßen vor allem protonierbare 2´-O-Modifikationsmotive eine besondere Relevanz. Im Vergleich zur bereits bekannten 2´-O-Aminoethyl-Modifikation des 4,6-Difluorbenzimidazol-Nucleosidbausteins konnte eine um eine Methyleneinheit längere 2´-O-Aminopropylfunktion des Nucleosids hergestellt werden. Dabei wurde eine Syntheseroute eingeschlagen, mit der diese Modifikation in hohen Ausbeuten und hoher Reinheit aus dem 3´-,5´-Markiewicz-geschützten Nucleosid eingeführt werden konnte. Grundlage dieser Modifizierungsmethode ist eine Michael-Addition von Acrylnitril an die 2´-OH-Funktion unter basischen Bedingungen. Damit konnte ein 2´-O-Cyanoethylrest an das Nucleosid geknüpft werden; dieser wurde als Modifikationsmotiv beibehalten und es konnte das entsprechende 3´-Phosphoramidit hergestellt werden. Außerdem lässt sich ein 2´-O-Cyanoethylrest mittels Raney-Nickel-katalysierter Hydrierung in das primäre Amin überführen. Durch diese Michael-Addition-Reduktionssequenz konnte die erwähnte 2´-O-Aminopropylmodifikation in nur zwei Stufen mit einer Gesamtausbeute von über 80 % an das Difluorbenzimidazolnucleosid geknüpft werden. Die 2´-O-Aminopropylfunktion wurde zudem als Ausgangspunkt zur Kupplung weiterer erfolgsversprechender Modifikationsmotiven verwendet: In diesem Ansatz wurden mittels standardisierter Peptidkupplungschemie Carbonsäurederivate an die freie Aminofunktion gekuppelt. Hierdurch waren neuartige 2´-O-Modifizierungen, wie z.B. Lysin- oder auch Laurinsäurekonjugate zugänglich; diese waren über den Propylamidlinker mit dem Nucleosid verbunden. Im Hinblick einer polykationischen Modifizierung konnte auch ein Sperminderivat an die Aminopropylfunktion gekuppelt werden. Sämtliche dieser Konjugate konnten ebenfalls nach mehrstufigen Synthesen in das 3´-Phosphoramidit überführt werden und wurden schließlich erfolgreich in RNA-Oligonucleotide eingebaut. Für den Einbau der 2´-modifizierten universellen Nucleosidanaloga in RNA-Oligonucleotide wurden zunächst kurze 12mer-Sequenzen gewählt, die sich bereits als gute Testsysteme für spektroskopische Untersuchungen herausgestellt haben. Hernach konnten mit diesen Duplexen spektroskopische Untersuchungen wie UV-Schmelzkurvenanalysen und CD-Spektroskopie durchgeführt werden. Zudem stand die biologische Testung dieser Modifikationen in synthetisch zugänglichen siRNA-Oligonucleotiden im Fokus dieser Arbeit. Um die Flexibilität der Konjugationsmethode zu erhöhen konnte auch eine postsynthetische Kupplung an das festphasengebundene RNA-Oligomer etabliert werden. Dies wurde durch den Einbau des geeignet geschützten 2´-Aminopropyl-Nucleosidbausteins in ein RNA-Oligomer erreicht: Durch einfache Zugabe von Bocanhydrid in den Reduktionsansatzes gelang eine simultane Boc-Schützung des 2´-O-Aminopropylderivats in quantitativer Ausbeute. Diese Prozedur konnte auch auf ein 7N-Purinnucleosidanalogon übertragen werden, welches im Hinblick auf die thermodynamische Stabilisierung eines RNA-Duplexes einem 4,6-Difluorbenzimidazolbaustein gegenüber überlegen zu sein scheint. Die Boc-geschützen Derivate wurden als Phosphoramidite in die automatisierte Festphasensynthese von Oligonucleotiden eingesetzt. Der große synthetische Vorteil dieser Methode besteht einerseits in ihrer einfachen Durchführbarkeit, andererseits in ihrer effizienteren und ökonomischeren Vorbereitung: Es muss nur jeweils ein Phosphoramiditbaustein (mit Boc-geschützter 2´-O-Aminopropylfunktion) synthetisiert und in ein Oligonucleotid eingebaut werden. Sowohl mit dem 4,6-Difluorbenzimidazolnucleosid, als auch mit seinem 7N-Purin-Pendant konnten erfolgreiche Festphasenkupplungen durchgeführt werden. Im Hinblick auf die thermodynamischen Eigenschaften konnten vor allem für das 7N-Purinnucleosid interessante Resultate erzielt werden: Das via Festphasenkupplung erhaltene RNA-12mer, welches eine Argininmodifikation am 2´-O-Aminopropyl-7N-Purinnucleosid trägt, zeigt eine im Vergleich zum unmodifizierten A-U-Basenpaar ähnliche Stabilität bei leicht erhöhtem Tm-Wert. Um den Ursprung dieses Effekts genauer zu ergründen wären weitere thermo-dynamische Untersuchungen anhand des 7N-Purinbausteines z.B. mit anderen Modifikations-motiven oder auch an unterschiedlichen Positionen im Oligomer sinnvoll.
Synchronized neural activity in the visual cortex is associated with small time delays (up to ~10 ms). The magnitude and direction of these delays depend on stimulus properties. Thus, synchronized neurons produce fast sequences of action potentials, and the order in which units tend to fire within these sequences is stimulusdependent, but not stimulus-locked. In the present thesis, I investigated whether such preferred firing sequences repeat with sufficient accuracy to serve as a neuronal code. To this end, I developed a method for extracting the preferred sequence of firing in a group of neurons from their pair-wise preferred delays, as measured by the offsets of the centre peaks in their cross-correlation histograms. This analysis method was then applied to highly parallel recordings of neuronal spiking activity made in area 17 of anaesthetized cats in response to simple visual stimuli, like drifting gratings and moving bars. Using a measure of effect size, I then analyzed the accuracy with which preferred firing sequences reflected stimulus properties, and found that in the presence of gamma oscillations, the time at which a unit fired in the firing sequence conveyed stimulus information almost as precisely as the firing rate of the same unit. Moreover, the stimulus-dependent changes in firing rates and firing times were largely unrelated, suggesting that the information they carry is not redundant. Thus, despite operating at a time scale of only a few milliseconds, firing sequences have the strong potential to provide a precise neural code that can complement firing rates in the cortical processing of stimulus information.