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Riboswitche – Vorbilder für die Konstruktion synthetischer RNA Schalter Riboswitche sind natürliche RNA Regulatorelemente. Sie sind in den nicht kodierenden Regionen von messenger RNAs (mRNAs) lokalisiert und beeinflussen die Expression nachfolgender Gene. Riboswitche bestehen aus zwei Domänen. Die Binde- oder Aptamerdomäne bildet eine Bindetasche, die einen Liganden ohne die Hilfe zusätzlicher Faktoren hoch spezifisch und affin binden kann. Die zweite Domäne, die sogenannte Expressionsplattform, interpretiert den Bindestatus der Aptamerdomäne und beeinflusst die Expression der nachfolgenden Gene. Liganden sind meist kleine, organische Moleküle wie Nukleotide, Aminosäuren oder Vitamine. Riboswitche regulieren Gene, die für die Synthese oder Verwertung ihres jeweiligen Liganden in der Zelle von Bedeutung sind. Kontrolliert wird die Genexpression meist durch Transkriptionstermination oder durch Maskierung der ribosomalen Bindestelle (SD = Shine Dalgarno Sequenz). Auch Eukaryoten nutzen das Prinzip der direkten RNA-Ligand-Interaktion zur Genregulation, wenn gleich in geringerem Ausmaß. In Pilzen und Pflanzen wird durch Ligandenbindung alternatives Spleißen von prä-mRNAs induziert, was entweder zur mRNA Degradation durch alternative Polyadenylierung oder der Repression der Translation durch alternative Leserahmen (uORFs) führt. Charakteristisch für eine Regulation über Riboswitche ist die direkte Wechselwirkung des niedermolekularen Liganden mit der RNA. In trans kodierte Proteinfaktoren sind aufgrund dieser direkten Bindung nicht notwendig. Dies macht natürliche Riboswitche zu geeigneten Vorbildern für die Entwicklung künstlicher RNA Schalter. Synthetische Riboswitche Aptamere sind kleine, synthetisch hergestellte, einzelsträngige RNA oder DNA Moleküle, die hochaffin und sehr spezifisch ein Zielmolekül binden können. Man kann Aptamere gegen nahezu jedes Molekül der Wahl über einen Prozess der in vitro Selektion gewinnen (SELEX = systematic evolution of ligands by exponential enrichment). Eine Eigenschaft der meisten Aptamere ist, dass sie ihre endgültige Struktur erst in Gegenwart des spezifischen Liganden ausbilden („induced fit“). Dies kann ausgenutzt werden, um RNA Aptamere als regulatorische Elemente einzusetzen. Hierzu inseriert man Aptamere in nicht translatierte Regionen einer mRNA. In Abwesenheit des Liganden bildet sich die Struktur nur teilweise aus und interferiert nicht mit zellulären Funktionen. Erst im Komplex mit einem Liganden kommt es zur effizienten Beeinflussung der Genexpression. Inseriert man ein regulatorisch aktives Aptamer in den 5’ nicht translatierten Bereich (5’UTR) einer eukaryotischen mRNA, erlaubt das Aptamer in der nicht ligandengebundenen Form die Translation nachfolgender Gene. Erst der Aptamer-Ligand-Komplex interferiert mit der Translationsinitiation. Ist das Aptamer nahe der cap-Struktur positioniert, behindert es die initiale Bindung des Ribosoms an die mRNA. Bei einer weiter stromabwärts gelegenen Insertion interferiert es mit dem Scannen der kleinen ribosomalen Untereinheit nach dem Startcodon. Die beste Regulationseffizienz wird hierbei bei einer Insertion direkt vor dem Startcodon erreicht. Es zeigte sich jedoch, dass nur eine sehr geringe Anzahl an Aptameren in der Lage ist, als RNA Schalter aktiv zu sein. Dies führte dazu, dass bis heute nahezu alle Systeme entweder auf dem Theophyllin oder dem Tetrazyklin Aptamer basieren. Ziele dieser Arbeit In dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum nur wenige Aptamere regulatorisch aktiv sind und was diese von inaktiven Varianten unterscheidet. Dafür wurden ein Tetrazyklin und ein Neomycin Aptamer detailliert charakterisiert. Desweiteren wurden neue RNA-basierte Regulationssysteme aufgebaut und ihr regulatorischer Mechanismus analysiert. Innerhalb dieser Arbeit wurde dabei ein System zur aptamerabhängigen Regulation des prä-mRNA Spleißens in Hefe etabliert. Außerdem konnte das bekannte Translationssystem für die Regulation essentieller Gene in Hefe weiter entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Arbeit erhalten: 1.Das Tetrazyklin Aptamer – In vitro Charakterisierung eines synthetischen Riboswitches. Das Tetrazyklin Aptamer ist 69 Nukleotide lang. Es besteht aus drei Stämmen (P1, P2 und P3) sowie drei einzelsträngigen Bereichen (J1/2, J2/3 und die Schleife L3; siehe Abbildung 1, links). Die Domäne oberhalb von P2 ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und kann ausgetauscht werden. Die Stämme P1-P3 sind bereits vor Ligandenbindung ausgebildet. Tetrazyklin wird über die drei einzelsträngigen Bereiche gebunden (siehe Abbildung 1, rechts). Durch fluorimetrische und kalorimetrische Methoden wurde eine Bindekonstante von Tetrazyklin an das Aptamer von 770 pM ermittelt. Diese Affinität ist außergewöhnlich hoch. Vergleichbare Aptamere und natürliche Riboswitche binden niedermolekulare Liganden 10- bis 1000-fach schlechter. Wir konnten zeigen, dass hohe Affinität eine Grundvoraussetzung für die regulatorische Aktivität ist, da Aptamermutanten mit verschlechterten Bindekonstanten keine in vivo Aktivität mehr aufweisen sind (Seiten 19-29). Durch Größenausschlußchromatographie konnte gezeigt werden, dass das Tetrazyklin Aptamer durch Ligandenbindung keine größeren globalen Konformationsänderungen erfährt. Dies weist auf eine weitgehende Vorformung der Bindetasche bereits ohne Tetrazyklin hin. Bei Ligandenbindung nimmt das Aptamer eine pseudoknotenähnliche Tertiärstruktur an, welche wahrscheinlich für die inhibitorische Wirkung auf das Ribosom verantwortlich ist (Seiten 19-29). Im Laufe dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur des Aptamers im Komplex mit Tetrazyklin in der Arbeitsgruppe von A. R. Ferré-D’Amaré gelöst. Die Struktur zeigt, dass die Stämme P1 und P3 aufeinander gestapelt sind (Abbildung 1, rechts). Stamm P2 bildet die Verlängerung einer irregulären Helix, die aus den einzelsträngigen Bereichen J1/2 und J2/3 gebildet wird. Nukleotide der Schleife L3 interagieren mit dieser irregulären Helix und bilden mit ihr zusammen die Bindetasche für Tetrazyklin. Diese hochauflösende Struktur diente uns in weiteren Arbeiten als Ausgangspunkt für die detaillierte Charakterisierung von ligandeninduzierten Änderungen (siehe 6.). 2. Das Tetrazyklin Aptamer ist in der Lage, prä-mRNA Spleißen in Hefe zu inhibieren. Der Aptamer-Tetrazyklin-Komplex kann nicht nur mit der Translationsinitiation, sondern auch mit dem Spleißen der prä-mRNA in Hefe interferieren (Seiten 31-37). Dazu wurde ein Hefe-Intron in den Leserahmen von GFP inseriert. Nur bei korrektem prä-mRNA Spleißen wird die reife mRNA aus dem Kern transportiert und GFP exprimiert. Für eine RNA-basierte Regulation des Spleißens wurde die Konsensussequenz der 5’ Spleißstelle in den Stamm P1 des Tetrazyklin Aptamers integriert. Dieser ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und seine Sequenz daher variabel. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von Tetrazyklin das Intron vom Spleißosom erkannt und entfernt wird. Die Expression des Gens ist dann möglich. Durch die Zugabe von Tetrazyklin wird das Spleißen inhibiert und GFP nicht länger exprimiert. Biochemische Strukturkartierungen der RNA in An- und Abwesenheit von Tetrazyklin zeigten, dass der Stamm P1 durch Ligandenbindung verfestigt wird. Die Ligandenbindung beeinflusst also nicht nur die Struktur der Bindetasche, sondern wird auch auf angrenzende Stammbereiche übermittelt. Durch Stabilisierung des Stammes P1 wird die 5’ Spleißstelle für das Spleißosom maskiert. Somit konnten wir den Mechanismus für die Aptamer basierte Regulation des prä-mRNA Spleißens aufklären. 3. Die Tetrazyklin Aptamer basierte Inhibition der Translationsinitiation ermöglicht die Regulation essentieller Gene in Hefe. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Insertion mehrerer Aptamerkopien in den 5’UTR zu einem effizienten Abschalten der Genexpression führt. Dies wurde genutzt, um ein neuartiges System für die konditionale Expression essentieller Gene in Hefe zu etablieren. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. K.-D. Entian wurden Insertionskassetten für eine PCR-basierte chromosomale Integration von Tetrazyklin Aptameren unter Kontrolle verschieden starker Promotoren konstruiert. Dafür wurden 1-3 Kopien des Tetrazyklin Aptamers unter Kontrolle des hoch exprimierenden TDH3-Promoters und des etwas schwächeren ADH1-Promoters gestellt. Außerdem wurde eines HA-tag angefügt, um die Genexpression mittels Westernblot verfolgen zu können. Zur Überprüfung der chromosomalen Insertion diente eine Kanamycin-Resistenz. Das neue System wurde erfolgreich an von fünf essentiellen Genen getestet. Es zeigte sich, dass die Zugabe von Tetrazyklin zu einem schnellen und effizienten Abschalten aller getesteten Gene führt. Die Vorteile dieses neuartigen konditionalen Genexpressionssystems in Hefe liegen in der einfachen Handhabung und der Unabhängigkeit vom verwendeten Stamm. Es müssen keine in transkodierten Proteinfaktoren coexprimiert werden. Durch dieses System konnte zum ersten Mal die Aptamer-basierte Regulation endogener, essentieller Gene gezeigt werden (Seiten 49-57). 4. Die Kombination von in vitro Selektion und in vivo Screening ermöglicht die Identifikation neuer regulatorisch aktiver Aptamere – ein Neomycin Riboswitch. Nur wenige in vitro selektierte Aptamere sind als synthetischer Riboswitch aktiv. In unserer Arbeitsgruppe wurde daher ein in vivo Screeningsystem zur Identifizierung neuer Aptamere in Hefe entwickelt. Eine Bibliothek in vitro selektierter Aptamere wurde hierzu in den 5’UTR des GFP Gens kloniert und die Aktivität einzelner Kandidaten durch Vergleich der Fluoreszenz in An- und Abwesenheit des Liganden überprüft. Wir verwendeten eine Bibliothek aus Neomycin-bindenden Aptameren und analysierten 5000 Hefeklone. Hierbei konnten zehn Sequenzen isoliert werden, die abhängig von Neomycin die Initiation der Translation inhibieren. Das 33 Nukleotid lange Aptamer N1 zeigt eine 7,5-fache Regulation und wurde näher charakterisiert. Es besteht aus einer internen asymmetrischen und einer terminalen Schleife, die durch zwei GC Basenpaare getrennt sind. Enzymatische Strukturkartierung und Mutationsanalyse zeigten, dass beide einzelsträngigen Bereiche für die Ligandenbindung wichtig sind. Der abschließende Stamm ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und hat geringen Einfluss auf die regulatorische Aktivität. N1 kann außerdem gegen andere Aminoglykosidantibiotika diskriminieren (Seiten 39-47). Interessanterweise sind die regulatorisch aktiven Aptamere in der in vitro selektierten Bibliothek stark unterrepräsentiert und konnten durch zufälliges Sequenzieren nicht identifiziert werden. Dieses Beispiel verdeutlicht eindrucksvoll die Notwendigkeit eines Screenings in vivo. 5. Regulatorisch aktive Neomycin Aptamere unterscheiden sich von inaktiven durch eine größere thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung. Durch weitere Mutationsanalysen von N1 konnte ein aktivitätsvermittelndes Element im Neomycin Riboswitch identifiziert werden. Dazu wurde entweder die terminale oder die interne asymmetrische Schleife mutiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequenz der terminalen Schleife nur einen modulierenden Einfluss auf die Aktivität hat, wobei die Asymmetrie der internen Schleife (aber nicht deren exakte Sequenz) ausschlaggebend für die regulatorische Aktivität ist. Für weitere Analysen wurde N1 mit fünf mutierten Varianten und dem inaktiven Neomycin bindenden Aptamer R23 verglichen. Alle sieben Aptamer haben eine ähnliche Sekundärstruktur und Ligandenaffinität, zeigen aber unterschiedliche Aktivität in vivo. Durch Bestimmung des Schmelzpunktes der verschiedenen Aptamere in An- und Abwesenheit von Neomycin zeigte sich, dass aktive Aptamere thermisch deutlich mehr durch Ligandenbindung stabilisiert werden als inaktive. Dabei ist die thermische Stabilität der Aptamer-Neomycin-Komplexe ähnlich. Jedoch ist die Stabilität ohne Ligand bei aktiven Aptameren gegenüber inaktiven Varianten deutlich erniedrigt. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in Zusammenarbeit mit Prof. J. Wöhnert konnte bestätigt werden, dass aktive Aptamere weniger stark vorgeformt sind als inaktive. Das in den Mutationsanalysen identifizierte Element nimmt nicht an der Ligandenbindung teil, sondern dient als Schalter, der den freien Zustand das Aptamers destabilisiert. Damit sorgt es für den großen Unterschied in der thermischen Stabilität des freien und des gebundenen Zustandes aktiver Aptamere. Dies zeigt, dass Unterschiede in der Stabilität die regulatorische Aktivität vermitteln (Seiten 73-102). Laufende Arbeiten sollen nun klären, ob thermische Stabilisierung durch Ligandenbindung ein allgemeingültiger Vermittler von regulatorischer Aktivität ist. Dazu werden weitere Aptamere überprüft, welche in Abwesenheit des Liganden unterschiedlich stark strukturiert sind und eventuell durch Ligandenbindung unterschiedlich stabilisiert werden. Außerdem werden wir testen, ob es die gewonnen Erkenntnisse erlauben, durch rationelles Design synthetische Riboswitche zu verbessern oder inaktive Aptamere in aktive zu verwandeln. 6. Was macht ein Aptamer zu einem regulatorisch aktiven Riboswitch? Für das Tetrazyklin Aptamer konnten wir zeigen, dass zum einen eine extrem hohe Bindekonstante und zum anderen eine hoch komplexe Bindetasche für die regulatorische Aktivität entscheidend sind. Dabei ist die Bindetasche in Abwesenheit des Liganden stark vorstrukturiert und erfährt keine globalen strukturellen Änderungen (Seiten 19-29). In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wachtveitl untersuchen wir den Einfluss von Bindekinetik und Lebensdauer des Aptamer-Tetrazyklin-Komplexes auf die regulatorische Aktivität. Dafür vergleichen wir das Tetrazyklin Aptamer mit drei regulatorisch inaktiven Mutanten. Für die Messungen nutzen wir die Eigenfluoreszenz des Tetrazyklins. Diese ist in wässriger Lösung geqenched und steigt bei Bindung an die RNA deutlich an. Erste Ergebnisse zeigen große Unterschiede zwischen den Aptameren in der Geschwindigkeit der Ligandenbindung. Außerdem zeigen sich geringe Unterschiede in der Lebensdauer der verschiedenen Komplexe. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert können die Veränderungen einzelner Basen bei Ligandenbindung untersucht werden. Hierbei zeigen erste Messungen am Tetrazyklin Aptamer, unterschiedliches Verhalten einzelner an der Bindung beteiligter Nukleotide. Eine detaillierte Aufklärung der ligandeninduzierten Veränderungen gewährt uns weitere Einblicke, warum das Tetrazyklin Aptamer als Riboswitch aktiv ist. Die regulatorische Aktivität Neomycin abhängiger Riboswitche wird durch thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung vermittelt. Dabei zeigte sich, dass durch Neomycin neue Basenpaare und Basenstapelungen entstehen. Durch weiterführende strukturelle Untersuchungen sollen nun ligandeninduzierte Veränderungen in N1 detailliert geklärt werden. Größere globale Änderungen konnten bereits durch EPR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. T. F. Prisner ausgeschlossen werden. Hierzu wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. J. W. Engels spinmarkierte Neomycin Aptamere hergestellt und die Abstände der Sonden in An- und Abwesenheit von Neomycin bestimmt. Es zeigte sich, dass sich der Abstand der Spinmarkierungen durch Zugabe von Neomycin (oder anderen Aminoglykosiden) nicht ändert (Seiten 59-72). Dies weist auf eher lokale Änderungen in der Bindetasche hin. Durch NMR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert werden im Moment die Strukturen verschiedener N1-Aminoglykosid-Komplexe gelöst. Dabei zeigt sich, dass in vivo aktive und inaktive Liganden eine ähnliche Struktur im Aptamer induzieren. Was die einzelnen Komplexe unterscheidet und damit die verschiedene Aktivität begründet ist Ziel der Analyse. Insgesamt konnte in dieser Arbeit ein Regulationssystem für die Aptamer-basierte Kontrolle des prä-mRNA Spleißens in Hefe entwickelt und das bestehende Translationssystem für die Applikation auf essentielle Gene angewendet werden. Außerdem wurden wichtige Punkte, warum Aptamere als Riboswitch funktionieren aufgeklärt. Damit legt diese Arbeit einen wertvollen Grundstein für die Weiterentwicklung RNA-basierter Genregulationselemente für die Anwendung in der synthetischen Biologie.
In der vorliegenden retrospektiven Studie wurde der Zusammenhang zwischen Knochenstoffwechsel und Frakturrate von Nierentransplantierten Patienten untersucht. Aus einem Patientenkollektiv von 1600 Patienten des Kuratoriums für Dialyse und Nierentransplantation Frankfurt am Main wurden 122 Patienten ausgewählt, die nach Dialyse und anschließender Nierentransplantation sich einer Knochendichtemessung unterzogen haben. Stattgefundene pathologisch zu wertende Frakturen wurden in Zusammenhang mit epidemiologischen Faktoren, Medikamenteneinnahme und Blutparametern gesetzt. Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS 13, wobei ein p< 0,05 als statistisch signifikant gewertet wurde. Die Daten wurden auf bis zu fünfzehn Jahre nach Transplantation untersucht, als Untersuchungszeitpunkt möglicher Zusammenhänge verschiedener Parameter untereinander wurde der Zeitpunkt zwei Jahre post Tx gewählt, da hier die Datenlage am besten war. Betrachtet man das untersuchte Patientengut, so sind trotz teilweise langer Dialysezeit, Immunsuppression und eingeschränkter Lebensweise die meisten Blutparameter weniger pathologisch als erwartet bzw. im Rahmen der eingeschränkten Nierenleistung erklärlich. Beachtenswert ist das Parathormon: die signifikant positive Korrelation mit der Alkal. Phosphatase ist ein deutlicher Hinweis dafür, dass gerade in den ersten 24 Monaten nach Transplantation der Einfluß auf den Knochenstoffwechsel massiv zu sein scheint. Im Laufe der Zeit findet allerdings eine Entkoppelung statt, sodass ein weiterhin hoher Parathormonwert nicht mehr gleichbedeutend für einen starken Knochenkatabolismus ist. Die Knochendichte ist im Verhältnis zu gesunden Dreißigjährigen vermindert, aber im Vergleich zu Gleichaltrigen nur diskret reduziert. Eine Knochendichtemessung kann hinweisend auf eine Osteoporose sein, läßt aber nicht eine schlechte, frakturgefährdete Knochenqualität bei mäßiger bis guter Dichte erkennen. Zwischen Knochendichte und Frakturen fanden wir keine signifikante Korrelation, und somit gewinnt wieder die Klinik der Patienten an Gewicht: Knochenschmerzen, stattgefundene pathologische Frakturen ohne adäquates Trauma, Minderung der Körpergröße weit über die 97. Perzentile hinaus etc. scheinen weitaus bedeutungsvoller und folglich eine Indikation für eine medikamentöse knochenprotektive Therapie zu sein. Doch wie funktioniert eine solche Therapie? Calcium und Vitamin D3 verbessern bei geringen Nebenwirkungen, Medikamenten-Interaktionen und Kosten zwar nachweislich die Dichtewerte, allerdings nicht evident die Frakturrate. Die hier verabreichten Dosen könnten allerdings deutlich zu niedrig sein, neuere Studien zeigen jedenfalls Optimierungsmöglichkeiten im Sinne einer positiven Beziehung zwischen Dosis und sinkender Frakturrate auf. Anders sieht es mit den Bisphosphonaten aus, bei denen zukünftig nochmals das Wirkungs-Nebenwirkungs-Verhältnis in prospektiven Studien eruiert werden sollte. Es gilt als bewiesen, betrachtet man die BMD als quantitativen Erfolgsparameter, dass diese effizient bezüglich der Behandlung einer Steroid-induzierten Osteoporose sind, allerdings stehen die Nachfolger anderer Wirkungsgruppen schon parat, gekoppelt an ein anderes Nebenwirkungsspektrum. Eine rein protektive Dosis an Risikopatienten zum Zwecke einer niedrigen BMD, die allerdings nicht zwangsläufig ein damit verbundenes Frakturrisiko beinhaltet, ist fraglich. Die Glukokortikoide wirken interindividuell stark unterschiedlich, können allerdings bereits in sehr geringen Mengen knochenschädigend sein (tägliches Prednisolonäquivalent von 2,5mg). Hier scheint also die Dauer der Gabe im Verhältnis zur Gesamtdosis deutlich einflussreicher zu sein. Tatsache ist, dass wir keine Korrelation der Glukokortikoidgabe mit der BMD, der Frakturrate oder des PTH nachweisen konnten. Dennoch könnte ein Verzicht dieser und somit der Bisphosphonate bei entsprechender Alternative eine Gewinn-Situation für den Patienten darstellen. Die zur Einsparung verwendeten Immunsuppressiva gelten als ein weiterer Unsicherheitsfaktor, da kaum verwertbare Studien am Menschen bezüglich deren Auswirkungen auf den Knochenstoffwechsel existieren. Aus Gründen des häufigen Therapieregime-Wechsels ließen sich keine Daten erheben. Beachtlich ist die signifikante Korrelation des Serum-Eiweiß/Albumin-Spiegels bezüglich der Frakturen. Ein niedriger Wert hängt offensichtlich mit einer erhöhten Frakturzahl zusammen, was ernährungsphysiologische sowie endokrinologische Einflüsse stärker unterstreichen könnte. . Eine bessere Ernährung und die Vermeidung von Eiweißverlusten könnten langfristig hilfreich sein, ebenso wie die konsequente Therapie des Hyperparathyreoidismus v.a. in den ersten Monaten nach Transplantation mit (höheren) Vitamin-D- sowie gegebenenfalls Cinacalcet-Applikationen. Der Zeitpunkt einer medikamentösen knochenprotektiven Therapie scheint wichtiger als die Gesamtdauer zu sein, wobei Arzt und Patient stets die Multikausalität des bis heute noch nicht vollständig verstandenen Krankheitsbildes bedenken sollten.
Konuskronen verankerter Zahnersatz hat sich seit mehreren Jahrzehnten als hervorragende Therapieform zur Versorgung des reduzierten Restgebisses bewährt und verbindet zahlreiche Vorteile des festsitzenden mit denjenigen des herausnehmbaren Zahnersatzes. Vor dem Hintergrund einer steigenden Relevanz ästhetischer Versorgungen sowie einer größer werdenden Ablehnung der Patienten hinsichtlich der Verwendung metallischer Werkstoffe, gewann das Ziel, auch kombiniert festsitzend-herausnehmbaren Zahnersatz metallfrei zu fertigen, zunehmend an Bedeutung. Ziel der vorliegenden prospektiven klinischen Studie war die Evaluation des klinischen Langzeitverhaltens von keramischen Primärkronen aus IPS Empress 2® kombiniert mit Sekundärkronen und Prothesengerüsten aus faserverstärktem Kunststoff (Vectris®) sowie die Untersuchung der Patientenzufriedenheit. Als Kontrollgruppe dienten keramische Primärkronen mit Sekundärkronen aus Galvanogold und metallischen Gerüsten. Dazu wurden 29 Patienten mit insgesamt 37 Konusprothesen auf 165 keramischen Primärkronen versorgt, 27 (73%) Prothesen entfielen auf die Kontrollgruppe und 10 (27%) Prothesen auf die Testgruppe. Eingebunden in ein Recall-System, wurden die Patienten in halbjährigen Abständen über einen Zeitraum von 5 Jahren nachuntersucht. Zur Evaluation der Patientenzufriedenheit erhielten die Studienteilnehmer jeweils vor Therapiebeginn, nach Fertigstellung der Konusprothesen und im einjährigen Abstand einen Fragebogen. Die Zeit unter Risiko betrug durchschnittlich 59 ± 22 Monate (min. 16, max. 96 Monate), Befragungen hinsichtlich der Patientenzufriedenheit wurden über 46 ± 18 Monate durchgeführt (min. 15, max. 66 Monate). Beide Gruppen zeigten eine vergleichbar hohe Reparaturanfälligkeit. 88,9% der Restaurationen in der Kontrollgruppe, sowie 90% der Restaurationen in der Testgruppe mussten mindestens einmal instand gesetzt werden (Mann-Whitney-U-Test, p = 0,121). Auch das Schadensrisiko der vollkeramischen Primärkronen zeigte keine statistischen Unterschiede (Testgruppe: 10,81%; Kontrollgruppe: 10,16%; exakter Fisher-Test, p > 0,05). Die Häufigkeit einer Neuanfertigung der Konusprothese war bei der Test-Gruppe (40%) höher als bei der Kontroll-Gruppe (14,8%), ein statistisch signifikanter Unterschied war zwischen beiden Gruppen nicht nachzuweisen (exakter Fisher-Test, p = 0,16). Die Erfolgsrate zeigte in Abhängigkeit der Zeit unter Risiko jedoch ab 2,5 Jahren schlechtere Werte bei metallfreien Prothesen als bei der Kontrollgruppe, nach etwa 5 Jahren nahm dieser Unterschied deutlich zu (Kontrollgruppe: 86%, Testgruppe: 24%) und unterschied sich statistisch signifikant (Log-Rank-Test, p=0,041). Bei drei der 128 Galvano-Matrizen kam es zu einer Beschädigung an den Sekundärstrukturen, bei 9 von 37 Matrizen aus glasfaserverstärktem Kunststoff trat ein Schaden auf. Dieser Unterschied war statistisch hochsignifikant und belegt, dass Vectris®-Mesostrukturen eher zum Versagen neigen als Galvano-Sekundärkronen (exakter Fisher-Test, p = 0,00008). Im Gegensatz zu den durchaus unterschiedlichen klinischen Ergebnissen und den unbefriedigend hohen Reparaturzahlen war die Patientenzufriedenheit mit den jeweiligen Studienprothesen für beide Gruppen vergleichbar gut. Zu keinem Zeitpunkt zeigte sich eine relevante Personenzahl in einer der Gruppen mit dem erhaltenen Zahnersatz unzufrieden. So war in der Testgruppe initial lediglich eine Person unzufrieden, änderte diese Einstellung jedoch im Rahmen der weiteren Kontrollen. Eine weitere Person war anfangs zufrieden, dann vorübergehend unzufrieden, um im Weiteren erneut ihre Zufriedenheit zu äußern. Für die Metallgruppe ergab sich lediglich in der letzten Nachkontrolle eine Person, die unzufrieden mit dem Zahnersatz war. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen waren somit zu keinem Zeitpunkt nachzuweisen (exakter Fisher-Test, alle p > 0,05). Die vorliegende Untersuchung bestätigt, dass sich die Verwendung keramischer Primärkronen in Doppelkronenrestaurationen prinzipiell bewährt und die Anforderungen an die gestellten Parameter wie Haftkraftstabilität, Biokompatibilität und Ästhetik erfüllt. Jedoch weist die Lithiumdisilikat-Glaskeramik IPS Empress 2® eine unzureichende Stabilität auf, für diesen Indikationsbereich sind daher ausschließlich hochfeste Zirkoniumdioxid-Keramiken zu empfehlen. Mit diesem Material ist ein wesentlich geringeres Reparaturrisiko zu erwarten. Als Matrizenwerkstoff zeigten galvanogeformte Sekundärkappen sehr gute klinische Ergebnisse. Die hohe Passungspräzision, welches durch die intraorale Fügung erreicht wird, gewährleistet eine ideale Lagerung des Zahnersatzes und reduziert kinetikbedingte Schäden auf ein Minimum. Das Ziel der Untersuchung, die dauerhafte klinische Bewährung metallfreier Konusprothesen aus dem Glasfaserverbundmaterial Vectris® nachzuweisen, konnte nicht erreicht werden. Die Ergebnisse dieser prospektiven klinischen Studie belegen eine Überlegenheit der metallischen Konusprothese. Somit bedarf die Realisation einer klinisch verlässlichen metallfreien Konusprothese noch erheblichen Forschungs- und Entwicklungsbedarf. Insbesondere die Substitution von galvanogeformten Feingoldmatrizen stellt eine große Herausforderung dar.
Ein neues kombiniertes pulse-wave Doppler- und M-Mode Ultraschallgerät zur semiinvasiven Messung des arteriellen Blutflusses (ABF) in der thorakalen Aorta descendens bei koronaren Revaskularisationseingriffen ohne Einsatz des kardiopulmonalen Bypass (off-pump coronary artery bypass grafting (OPCAB)) wurde untersucht und mit der Thermodilutionsmethode zur Bestimmung des cardiac output (CO) verglichen. Bei 45 Patienten, die sich einem OPCAB-Eingriff unterzogen, wurden ABF und CO gleichzeitig mittels des kombinierten Ultraschall-Dopplergerätes und der Thermodilutionsmethode bestimmt zu den folgenden fünf Messzeitpunkten: nach Anästhesieeinleitung (1), nach Sternotomie (2), nach Eröffnung des Perikards (3), nach Luxation des Herzens mittels eines speziellen Sperrersystems (4), nach Entfernen des Thoraxsperrers (5). Die Teilnehmer der Studie wurden in zwei Subgruppen unterteilt, entsprechend dem Typ des Thoraxsperrers, der eingesetzt wurde. Infolge einer Änderung des Operationsverfahrens wurden 15 Teilnehmer mittels des Octopus-Sperrers, 30 mittels des CTS-Sperrers revaskularisiert. Wir führten insgesamt 225 Messungen durch. Die Korrelationskoeffizienten und die linearen Regressionsgleichungen wurden berechnet. Alle Messungen und die Messwerte der Subgruppen getrennt wurden im Bland-Altman-Diagramm dargestellt. Der Korrelationskoeffizient für alleMesswerte war r = 0,66 (CO = 0,6508xABF+2,386) bzw. r = 0,66 (CO= 0,7499xABF+2,386) für dieOctopus-Sperrer Subgruppe und r = 0,65 (CO = 0,5583xABF+2,5281) für die CTS-Sperrer Subgruppe. Der Bias (Mittelwert der Differenzen) aller Messwerte betrug 0,8l/min (0,88l/min in der Octopus-Sperrer Subgruppe und 0,75l/min in der CTS-Sperrer Subgruppe) und die „limits of agreement“ (Mittelwert der Differenzen +-2SD)+-2,38l/min (2,07l/min in der Octopus-Sperrer Subgruppe und 2,52l/ min in der CTS-Sperrer Subgruppe). Demzufolge misst das Ultraschall-Dopplergerät den ABF während eines OPCAB-Eingriffes nicht mit ausreichender Genauigkeit. Weitere Untersuchungen in anderen klinischen Situationen sollten durchgeführt werden.
Mycophenolat-Mofetil (MMF) hemmt die Aktivität von Mikrogliazellen und verringert den exzitotoxischen neuronalen Schaden in organotypischen hippocampalen Schnittkulturen (OHSC). Der Tractus perforans ist die wichtigste neuronale afferente Verbindung zwischen entorhinalem Kortex (EC) und Gyrus dentatus (GD) im Hippocampus. Er besteht aus Axonen, deren Ursprungsneurone im EC liegen und die im GD terminieren. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von MMF auf den Erhalt dieser Projektion zu untersuchen. Methodisch wurde zu diesem Zweck die Fluoreszenzmarkierung des Tractus perforans in der organotypischen hippokampalen Schnittkultur (OHSC) etabliert. Die von uns angestrebte retrograde Färbemethode sollte entorhinale Neurone unter der Voraussetzung markieren, dass deren Axone (Tractus perforans) intakt waren. Ein guter neuronaler Erhalt sollte sich in einem entsprechend erhaltenen Tractus perforans und retrograd markierten entorhinalen Neuronen wiederspiegeln. OHSC aus 8 Tage alten Wistar Ratten wurden für 9 div (days in vitro) mit oder ohne MMF (100 mikro g/ml) kultiviert. Zunächst wurde methodisch die retrograde Markierung des Tractus perforans mit dem lipophilen Farbstoff DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindo-carbocyaninperchlorat) in der OHSC etabliert und mit dem hydrophilen Dextranamin Mini Ruby versucht. Die retrograde Markierung entorhinaler Neurone und die durchgängige Darstellung des Tractus perforans in der OHSC mit Mini Ruby gelang in unseren Versuchen nicht, während die Markierung mit DiI erfolgreich war. Nach der Fixierung wurde die retrograde Markierung des Tractus perforans durch das Platzieren eines DiI-Kristalles im GD eingeleitet. Die auf diese Weise mit DiI markierten entorhinalen Neurone wurden mit neuronenspezifischen Antikörpern gegen NeuN gegengefärbt und somit zweifelsfrei als Neurone identifiziert. An diesem Modell wurde der Einfluß von MMF auf die Zahl DiI/NeuN doppelmarkierter entorhinaler Neurone quantitativ ausgewertet. Die quantitative Analyse erfolgte an Bildern, die mit einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop gewonnen wurden. Die quantitative Auswertung retrograd mit DiI markierter OHSC zeigte, dass die Anzahl der DiI-NeuN doppelmarkierten entorhinalen Neurone in den MMF behandelten OHSC 19fach höher war als in den unbehandelten OHSC (p<0,05). Unsere Ergebnisse zeigen, dass MMF den Erhalt ganzer neuronaler Fasertrakte und Projektionen in der OHSC verbessert. Vor dem Hintergrund vorhandener Arbeiten, die auf neuroprotektive Effekte der MMF deuten, scheint MMF ein aussichtsreicher Kandidat für die Reduzierung des Sekundärschadens im Rahmen von Verletzungen des zentralen Nervensystems zu sein.
Die vorliegende Studie führte einen Vergleich zwischen Lokalanästhesie (LA) und Allgemeinanäthesie (GA) hinsichtlich der Entwicklung früher postoperativer kognitiver Dysfunktion (POCD) nach Carotis-Thrombendarterektomie (Carotis- TEA) durch. Es handelt sich hierbei um eine prospektive, extern randomisierte Studie, die als Teil einer Subgruppenanalyse der europaweiten GALA-Studie (General Anaesthesia versus Local Anaesthesia) durchgeführt wurde. Es wurden insgesamt 40 Patienten in die Studie eingeschlossen (GA n = 23, LA n = 17). Die kognitive Leistungsgeschwindigkeit wurde mittels Zahlen-Verbindungs-Tests (ZVT) und die Befindlichkeit wurde durch die Befindnisskalierung durch Kategorie und Eigenschaftswörter (BSKE(EWL)) zu jeweils vier Messzeitpunkten (MZP) (am Vorabend der Operation, 5, 29 und 77 Stunden postoperativ) bestimmt. Das Ausmaß der neuronalen Schädigung wurde mittels des biochemischen Markers Protein S-100b zu drei MZPs bestimmt (präoperativ, vor Unclamping der A. carotis interna und am Ende der Operation). Die Geschwindigkeit im ZVT nahm in der GA-Gruppe postoperativ signifikant ab (p = 0,0001). Sowohl fünf (p = 0,023) als auch 29 Stunden (p = 0,043) postoperativ zeigten sich signifikante Gruppenunterschiede. Die S-100b-Konzentration zeigte in der GA-Gruppe am zweiten MZP einen signifikanten (p < 0,001) Anstieg von 0,086 ± 0,038 mikro g/l, im Vergleich zum Ausgangswert von 0,061 ± 0,024 mikro g/l. Signifikante Gruppenunterschiede konnten wir hier am Ende der Operation messen (p = 0,006). Bei der Befindlichkeitsskalierung waren keine signifikanten Gruppenunterschiede messbar. Anhand unserer Ergebnisse können wir eindeutig die Thesen widerlegen, dass das verwendete Anästhesieverfahren keinen Einfluss auf die Entwicklung früher POCD hat und dass es nicht das Ausmaß der neuronalen Schädigung beeinflusst. Wir schließen daraus, dass die Lokalanästhesie einen positiven Effekt auf die Entwicklung früher POCD und das Ausmaß der neuronalen Schädigung hat. Eingeschränkt wird die Aussagekraft dieser Ergebnisse durch eine kleine Fallzahl, ein kurzes Follow-up und ein nicht standardisiertes Neuromonitoring und Shunting unter Allgemeinanästhesie.
Ziel dieser Nachuntersuchung war es zu zeigen, ob Patienten mit einer rheumatischentzündlichen Grunderkrankung und rein degenerativ veränderten Hüftgelenken im Langzeitverlauf von einer Hüft-Totalendoprothese über den dorsalen Zugang profitieren. Zugrunde lag ein Kollektiv von 109 degenerativ veränderten Patienten- Hüften (108 Patienten) und 22 rheumatische Patientenhüften (21 Patienten), die in den Jahren 1995 bis 1998 in der orthopädischen Universitätsklinik von einem einzigen Operateur eine Hüft-Totalendoprothese über den dorsalen Zugang erhielten. Der Untersuchungszeitraum beläuft sich auf durchschnittlich 9,2 Jahre. Neben der klinischen Untersuchung mittels des Harris-Hip-Scores wertete die Arbeitsgruppe radiologische Beckenübersichtsaufnahmen und Lauensteinaufnahmen der endoprothetisch versorgten Hüftgelenke aus. Hierfür eignete sich der Mayo-Hip- Score mit dem das Ablöseverhalten der Prothese vom Knochen in Form einer Saumbildung ermittelt wurde. Es wurden 42 rein degenerativ veränderte Patienten-Hüften klinisch nachuntersucht, von denen 23 radiologische Bilder ausgewertet werden konnten. Bei Patienten aus dem rheumatischen Formenkreis lagen von zehn klinisch nachuntersuchten Patienten sechs radiologische Bilder vor. Ein gutes Ergebnis (84%) wird für die Gruppe der Patienten mit einer rein degenerativen Hüftgelenkserkrankung (Arthrose) und ein mittleres Ergebnis (78%) für Patienten aus dem rheumatischen Formenkreis evaluiert. Der Zusammenhang zwischen einer besseren Funktionsfähigkeit und geringeren Schmerzen nach 10 Jahren post operationem bei einem minimalinvasiven dorsalen Zugang kann nicht nachgewiesen werden. Dennoch erscheint es früh-postoperativ einige Vorteile für das Verwenden des minimal-invasiven Zugangs zum Hüftgelenk zu geben: Laut o. a. Studien liegt der intraoperative Blutverlust unter den Mengen von konventionellen Schnitten und die mögliche frühere Rehabilitationsfähigkeit bei kleineren Zugängen spricht ebenfalls für das Verwenden eines minimal-invasiven Zugangs. Insgesamt sind 92% der Patienten mit dem heutigen postoperativen Ergebnis zufrieden. Eine kleine Operationsnarbe, die weit dorsal liegt, könnte laut Patientinnen-Angaben sehr gut durch die Badebekleidung verdeckt werden, was bei antero-lateralen Zugängen nicht der Fall zu sein scheint. Dies erhöht eindeutig die Lebensqualität von Patientinnen, insbesondere von jungen Rheumatikerinnen. In Folge einer Nachbeobachtungszeit von durchschnittlich 9,2 Jahren lässt sich sagen, dass die Implantation einer Hüft-Totalendoprothese über den dorsalen Zugang sowohl bei degenerativ veränderten als auch bei rheumatisch-entzündlichen Hüftgelenken eine gute Alternative zu den Operationstechniken über den anterioren oder antero-lateralen Zugang darstellt. Die anfänglich beschriebene Ablehnung den dorsalen Zugang zu nutzen - weil über einen dorsaler Zugang das stützende Gewebe traumatisiert und damit die dorsale Luxationstendenz auf lange Sicht begünstigt werden und zu einer chronischen Instabilität des Hüftgelenkes führen könnte – konnte in unserer Studie nicht nachgewiesen werden. Zwar traten Luxationen auf, die dann teilweise operativ korrigiert werden mussten, aber es kam in keinem Fall während der Nachbeobachtungszeit zu einer Revision aufgrund einer Luxation und folgender Instabilität. Aufgrund dieser Daten- und Informationslage kann der dorsale Zugang zur Implantation einer Hüft-Totalendoprothese bei Patienten mit Arthrose und Patienten des rheumatischen Formenkreises als gute und sichere Alternative betrachtet werden.
In der vorliegenden Untersuchung wurden die im Zeitraum von 1984 bis 2006 an der Universitätsklinik Frankfurt am Main aufgrund von nicht-kolorektalen Lebermetastasen durchgeführten Leberteilresektionen untersucht. Ziele dieser Arbeit sind die Darstellung des Patientenkollektivs einschließlich der operativen Faktoren der Lebermetastasenresektion, die Ermittlung von Langzeitergebnissen nach der Resektion und die Feststellung von Prognosefaktoren im Hinblick auf das postoperative Überleben dieser Patienten. Das untersuchte Patientenkollektiv (n = 69) umfasste 31 Männer und 38 Frauen mit einem medianen Alter von 52 Jahren zum Zeitpunkt der Leberresektion. Am häufigsten waren folgende Primärtumore vertreten: Magenkarzinom, Mammakarzinom, Malignes Melanom, Neuroendokriner Tumor und Nierenzellkarzinom. Der größte Anteil der Primärtumore wurde als mäßig differenziert (G2) eingestuft. 55,1 % der Patienten zeigten eine solitäre Lebermetastasierung. Der mediane Tumordurchmesser betrug 5 cm. Bei 14,5 % der Patienten wurden bilobäre und bei 85,5 % unilobäre Lebermetastasen festgestellt. 20,3 % der Patienten präsentierten sich mit einer synchronen und 73,9 % mit einer metachronen Metastasierung (unbekannt: 5,8 %). Zur Resektion der Metastasen wurden atypische Segmentektomien (n = 25), typische Segmentektomien (n = 22) und (erweiterte) Hemihepatektomien (n = 22) durchgeführt. Bei einer medianen Operationsdauer von 195 min erfolgte bei 69,6 % der Patienten ein zusätzlicher Eingriff. Der mediane Sicherheitsabstand zum Resektionsrand lag bei 10 mm. Die Liegedauer auf der Intensivstation betrug im Median einen Tag. Bei 39 Patienten traten postoperative Komplikationen auf. Ein Fortschreiten der Tumorerkrankung war bei 30 Patienten dokumentiert. Das mediane tumorspezifische Überleben nach Resektion nicht-kolorektaler Lebermetastasen lag bei 4,3 Jahren. Die dazugehörigen 1-, 5- und 10-JahresÜberlebensraten betrugen 80,1 %, 47,9 % und 35,5 %. Die mediane tumorspezifische Überlebenszeit nach Resektion nicht-kolorektaler, nicht-neuroendokriner Metastasen stellte sich mit 2,0 Jahren und folgenden 1-, 5- und 10-Jahres-Überlebensraten dar: 76,8 %, 43,1 % und 27,9 %. Nach der Leberresektion aufgrund von Metastasen eines Magenkarzinoms ergaben sich tumorspezifische 1-, 5- und 10-Jahres-Überlebensraten von 80,8 %, 23,1 % und 11,5 % (mediane ÜLZ: 18 Monate). Die 1-, 5- und 10-Jahres-Überlebensraten nach der Resektion von Filiae eines Mammakarzinoms betrugen 74,6 %, 51,1 % und erneut 51,1 %. Die mediane Überlebenszeit nach Operation von Metastasen eines Malignen Melanoms lag bei 22 Monaten: 1-JÜR: 66,7 %, 5-JÜR: 33,3 %, 10-JÜR: 0,0 %. Nach der Resektion von Filiae eines Neuroendokrinen Tumors betrug die 1- 5- und 10-Jahres-Überlebensrate 100,0 %, 80,0 % und erneut 80,0 %. Bei Patienten mit primärem Nierenzellkarzinom ergab sich nach der Resektion eine mediane Überlebenszeit von 44 Monaten und die dazugehörige 1-Jahres-Überlebensrate lag bei 75,0 %. Die folgenden Faktoren zeigten sich in den Resultaten der univariaten Analyse als signifikante Prädiktoren für das tumorspezifische Überleben der Patienten: Primärtumorgruppe8, Grading des Primärtumors, zusätzliche Eingriffe neben der Leberresektion und Sicherheitsabstand zum Resektionsrand. In der multivariaten, tumorspezifischen Analyse wurden zwei Determinanten als unabhängige Prognosefaktoren für das Überleben nach der Leberresektion identifiziert: Der kleinste Sicherheitsabstand der Leberfiliae zum Resektionsrand und die Durchführung eines zusätzlichen Eingriffs neben der Leberresektion. Bei Durchführung eines solchen Eingriffs war das Risiko für die Patienten, an der Tumorerkrankung zu versterben, 3,5mal so groß im Vergleich zu Patienten, bei denen kein zusätzlicher Eingriff erfolgt ist. Bei Annahme eines Sicherheitsabstandes von mindestens 10 mm als Referenz, errechnete sich im Vergleich dazu für Patienten, bei denen kein Sicherheitsabstand eingehalten werden konnte, ein 6,3mal so großes Risiko an der Tumorerkrankung zu versterben. Bei Einhaltung eines kleinen Abstandes zum Resektionsrand (0,1 mm - 9,9 mm) war das entsprechende Risiko für die Patienten 4,9mal so groß. Die Resektion nicht-kolorektaler Lebermetastasen erscheint in ausgewählten Fällen sinnvoll. Um die Prognose der operierten Patienten zu verbessern, sollte entsprechend den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ein Sicherheitsabstand von mindestens einem Zentimeter angestrebt werden.
Humane endogene Retroviren (HERVs) sind Relikte von Infektionen der Keimzellen von Primatenvorläufern mit exogenen Retroviren vor 40 Millionen Jahren. Die meisten HERV Elemente sind defekt durch die Akkumulation von Mutationen, Deletionen und Rearrangements. Lediglich einige Proviren der HERV-K/HML-2 Familie enthalte noch offenen Leserahmen für alle retroviralen Proteine. Die Expression repetitiver endogener Elemente wird in somatischen Zellen unterdrückt. Transkription und Translation von HERV-K Genprodukten tritt in Keimzelltumoren, Melanomen und Eierstockkrebs auf. In der vorliegenden Arbeit wurde die HERV-K exprimierende Melanomlinie UKRV Mel 2-C9 etabliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die HERV-K Expressionen durch die dominante Aktivität des Provirus 108 bedingt ist. Die Expression und korrekte Prozessierung der viralen Proteine konnte nachgewiesen werden. Durch Elektronenmikroskopie wurde bestätigt, dass HERV-K 108 virale Partikel mit charakteristischen Strukturen der Hüllproteine produziert. Diese Partikel enthalten virale Volllängen RNA-Genome. Da HERV-K 108 in der Linie UKRV Mel 2-C9 eine Mutation im aktiven Zentrum der Reversen Transkriptase zeigt, sind die Partikel nicht infektiös. Um Einblicke in die der HERV-K Expression in Keimzelltumoren und Melanomen zu Grunde liegenden transkriptionellen Regulationsmechanismen zu erhalten, wurden mittels 5’ und 3’ RACE (rapid amplification of cDNA ends) der Transkriptionsstart und die Terminationsstelle bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass der HERV-K Promotor in den untersuchten Zelllinien TATA-unabhängig agiert obwohl die HERV-K LTR (long terminal repeat) ein TATA-Motiv aufweist. Die transkriptionelle Aktivität des HERV-K Promotors ist abhängig von einer GC-Box in unmittelbarer Nähe zu einem Initiatorelement am Startpunkt der Transkription. Das GC-Sequenzmotiv ist die Bindestelle für die Transkriptionsfaktoren SP1 (specific protein) und SP3. Mutationen des Bindemotivs führten zu einem drastischen Abfall der Promotoraktivität im Luziferaseassay. Durch Proteinknockdown mittels spezifischer siRNA gegen SP1 und SP3 konnte die Promotoraktivität ebenso deutlich reduziert werden. Elektrophoretic mobility shift assays und Chromatinimmunopräzipitationen bestätigten eine Bindung von SP1 und SP3 an die HERV-K LTR. Die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 sind an der Initiation der basalen Transkription von HERV-K maßgeblich beteiligt.
Typ 1 Diabetes mellitus (T1D), Hashimoto-Thyreoiditis (HT) und Morbus Addison (AD) sind autoimmunvermittelte Erkrankungen mit multifaktorieller und polygener Ätiologie. Die gemeinsamen prädisponierenden genetischen Merkmale (HLA Klasse II-Moleküle und CTLA-4) bedingen eine Störungen in der T-Zell-Aktivierung und Homöostase. Es mehren sich Hinweise, dass PTPN22 ein weiterer genereller Risikofaktor für Autoimmunität ist. PTPN22 kodiert für eine intrazelluläre Tyrosin-Phosphatase, die als Suppressor der T-Zell- Aktivierung wirk. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verteilung des PTPN22 1858 C/T Polymorphismus in deutschen Patienten mit T1D (n = 220), AD (n = 121) und HT (n = 116) sowie gesunden Kontrollen (n = 239) untersucht. Hierbei konnte eine signifikante Assoziation der Genvariation und den Erkrankungen T1D und HT bestätigt werden. PTPN22 1858 T wurde häufiger bei Patienten mit T1D (19,3% vs. 11,3%; p = 0,001; OR für Allel T = 1,88, 95% CI [1,30-2,72]) und HT (18,1% vs. 11,3%; p = 0,0129; OR für Allel T = 1,74, 95% CI [1,12-2,69]) beobachtet. Erstmals konnte eine exklusive Assoziation zum weiblichen Geschlecht bei Patientinnen mit T1D beobachtet werden (p = 0,0001). Ein signifikanter Unterschied zwischen männlichen Typ 1 Diabetikern und Kontrollen war nicht nachweisbar. Für eine Assoziation von PTPN22 1858 C/T und AD fanden sich keine Hinweise. Zusammenfassend ist der Polymorphismus PTPN22 1858 C/T in der Pathogenese von HT und T1D in der deutschen Bevölkerung involviert, beim T1D durch einen geschlechtsspezifischen Mechanismus, der zu einer Risikoerhöhung im weiblichen Geschlecht führt. Diese Ergebnisse werden durch aktuelle Studien bestätigt. Der Vitamin D-Stoffwechsel ist ein weiteres System mit einem klar belegten Einfluss auf das Immunsystem. Die Gabe von aktivem Vitamin D zeigte im Tiermodell eine Protektion vor T1D. Der modulierende Einfluss auf T-Zell-Differenzierung und Aktivität von dendritischen Zellen mittels Zytokinausschüttung bewirkt ein Verschiebung des Gleichgewichts von T-Helferzellen in Richtung Th2-Zellen und regulatorischen T-Zellen. Zusätzlich belegen epidemiologische Daten eine Verbindung von Vitamin D Ernährungsstatus in der frühen Kindheit und der Prävalenz von T1D. Ein genetisches Risiko für T1D konnte für die folgenden Komponenten des Vitamin D-Systems identifiziert werden: Vitamin D bindendes Protein (DBP), CYP2R1, CYP27B1 und CYP24 sowie Vitamin D-Rezeptor (VDR). Ein weiteres Makromolekül mit essentieller Bedeutung für die Aufrechterhaltung des Vitamin D-Metabolismus ist Megalin. Der endozytotische Multiliganden-Rezeptor gehört zur Familie der low-density Lipoprotein (LDL)-Rezeptoren und wird hauptsächlich in den Zellen des proximalen Tubulus der Niere exprimiert, zusätzlich aber auch in anderen resorptiven Epithelien. Megalin liefert den größten Beitrag zur Protein-Aufnahme aus dem glomerulären Filtrat in die Zellen des proximalen Tubulus. Neben einer relativ unspezifischen Bindung vieler Proteine (z.B.: Albumin, ベ1- und ベ2-Mikroglobulin) bindet Megalin einige Liganden mit hoher Affinität. Hierzu zählen Hormone, Vitamin-bindende Proteine und Lipoproteine. Megalin gewinnt durch die zelluläre Aufnahme von Vitamin D im Komplex mit seinem Transportprotein DBP eine große Bedeutung im Vitamin D-Stoffwechsel. Die Endozytose ist notwendig um 25 OH D3 zu konservieren und um Zellen mit der Vorstufe zur Generierung von 1,25 (OH)2 D3, der biologisch aktiven Form von Vitamin D, zu versorgen. Weiterhin ist die Aufnahme möglicherweise direkt mit der Aktivierung des nukleären VDR verbunden, als Vorbereitung auf kommende Liganden In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Bedeutung von genetischen Polymorphismen des Megalingens bei Patienten mit T1D und gesunden Kontrollen der deutschen Bevölkerung untersucht. Die Analyse von neun SNPs erbrachten interessante Erkenntnisse: Genvariationen von Megalin sind mit T1D assoziiert, wobei MegE36 A, ein SNP auf Exon 36, das Risiko einer Erkrankungsmanifestation erhöht. Allel »A« wurde häufiger bei Patienten mit T1D beobachtet (95,6% vs. 92,2%; OR für Allel A = 1,85, 95% CI [1,18-2,91]). In der geschlechtsgetrennten Analyse beschränkten sich die gefundenen Differenzen der Allelfrequenzen lediglich auf das männliche Geschlecht (p = 0,0014; OR für Allel A = 2,67, 95% CI [1,43 – 4,98]). Bei Frauen war kein signifikanter Unterschied nachweisbar. Da dieser exonische SNP still ist, d.h. durch einen synonymen Aminosäurenaustausch keinen Einfluss auf die Rezeptorfunktionalität hat, treten mögliche Effekte auf RNA-Ebene auf. Denkbar ist auch eine Kopplung mit einem benachbarten Marker. Drei weitere nicht synonyme exonische SNPs (MegE03 A/G, MegE66 A/G and MegE69 A/C) weisen eine grenzwertige Assoziation zu T1D auf und haben zugleich einen funktionellen Einfluss auf die Proteinstruktur. Bemerkenswerterweise zeigt MegE66, wie auch MegE36 A, lediglich bei Männern ein genetisches Risiko für T1D. Diese Geschlechtsspezifität wird möglicherweise durch eine Interaktion von Megalin mit Androgenen und Östrogenen in Verbindung mit dem Transportprotein (SHBG) begründet. Die Aufklärung des molekularen Mechanismus wird Gegenstand künftiger Studien sein.
Die Magnetresonanzspektroskopie (MRS) ist eine nicht-invasive Methode zur Quantifizierung metabolischer Änderungen des Gehirnstoffwechsels. Einige dieser Metaboliten wie N-Acetyl-Aspartat (tNAA), Myo-Insoitol (mI), Kreatin (tCr) und Cholin (Cho) können auch als Marker für neurodegenerative Erkrankungen (z.B. Morbus Alzheimer) dienen. Bislang haben nur wenige Studien MR-spektroskopische Veränderungen bei Patienten mit der Diagnose einer „leichten kognitiven Beeinträchtigung“ (Mild Cognitive Impairment = MCI) untersucht. Entsprechend sollten in dieser Untersuchung MR-spektroskopische Veränderungen bei MCI-Patienten erfasst und in Abhängigkeit vom klinischen Verlauf in einer Längsschnittstudie analysiert werden. Fünfzehn MCI-Probanden und zwölf gesunde ältere Kontrollpersonen wurden jeweils zweimal innerhalb eines Zeitraumes von ca. 40 Monaten klinisch, neuropsychologisch sowie MR-spektroskopisch untersucht. Die MR-Spektroskopie wurde als Einzelvolumenspektroskopie (SVS) mit kurzer Echozeit (TE = 30 ms) durchgeführt. Als VOI wurde ein Bereich im Parietallappen ausgewählt, der den Gyrus cinguli mit einschloss. Der Anteil an CSF wurde aus der Dekonvolution der T2-Dephasierung des Wassersignals ermittelt. Die Auswertung der Spektren erfolgte mit dem Programm LCModel, das eine Analyse des Spektrums mittels einer Linearkombination von Modellspektren durchführt. Die ermittelten Werte für die Signalintensitäten wurden in absolute Metabolitenkonzentrationen (mmol/l) unter Berücksichtigung entsprechender Korrekturen umgerechnet. Der Mittelwert des MMSE-Scores der MCI-Patienten lag zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung bei 26,4 (Bereich 20 - 30) und fiel im Verlauf auf 23,3 (Bereich 14 - 28) ab. Sechs der MCI-Patienten entwickelten im zeitlichen Intervall ein dementielles Syndrom (MCIKonverter). Alle Kontrollpersonen hatten einen MMSE-Score von mehr als 29 in beiden Untersuchungen. Bei den MRS-Untersuchungen wurde bei Erstuntersuchung ein signifikanter Unterschied für den CSF-Anteil des Messvolumens im Vergleich der Patientengruppe und der Probanden festgestellt. Für die MR-spektroskopisch erhobenen Metabolitenkonzentrationen ergaben sich bei der Erstuntersuchung keine signifikanten Unterschiede. Bei der zweiten Untersuchung zeigte sich dagegen eine signifikante Erniedrigung der Konzentrationen von tCr und tNAA der Gruppe der MCIKonverter im Vergleich zu den entsprechenden Konzentrationen der anderen Gruppen. In der MCI-Gruppe war eine Abnahme der tNAA-Konzentgration signifikant mit einer Abnahme der kognitiven Leistung korreliert. Dieser Effekt war im Wesentlichen auf metabolische Änderungen in der Gruppe der MCIKonverter zurückzuführen. Für die Metaboliten Cho und mI konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Diese Pilotstudie zeigt, dass MR-spektroskopisch gemessene Metaboliten (insbesondere tNAA) bei der MCI als Surrogatmarker eines (in Richtung Demenz) fortschreitenden neurodegenerativen Krankheitsprozesses eingesetzt werden können. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie sind mit anderen Publikationen (Ackl et al., 2005; Adalsteinsson et al, 2000; Chao et al, 2005; Kantarci et al., 2000) in Einklang zu bringen. Da auch die tCr-Konzentration im Verlauf Schwankungen unterliegt, wird klar, dass eine Quantifizierung in absoluten Konzentrationen einem relativen Vergleich von tNAA zu tCr vorzuziehen ist.
Im Forschungsgebiet des Wissensmanagements ist der Teilbereich des Wissenstransfers von großer Bedeutung, jedoch gleichzeitig auch mit vielen Problemen verbunden, die es auf dem Weg zu einem erfolgreichen Wissenstransfer zu identifizieren und zu lösen gilt. Die vorliegende Arbeit stellt einen Ordnungsrahmen vor, mit dessen Hilfe ein detailliertes Gesamtbild des Wissenstransfers innerhalb einer beliebigen Organisation erstellt werden kann. Der Ordnungsrahmen bildet Rollen, Objekte und Handlungen des Wissenstransfers ab und setzt diese miteinander in Beziehung. Diesen Konstrukten des Ordnungsrahmens sind potentielle Probleme zugeordnet, die im Rahmen einer Literaturrecherche identifiziert werden und die einen reibungslosen Ablauf des Wissenstransfers innerhalb von Organisationen behindern können. Eine für den Ordnungsrahmen entwickelte Handlungsanleitung beschreibt, wie dieser als Basis für die konkrete Untersuchung der aktuellen Situation des Wissenstransfers in Organisationen eingesetzt werden kann. Im Rahmen der Forschungsarbeit wird anhand von mehreren Praxisfällen gezeigt, dass der Ordnungsrahmen mit Hilfe der Handlungsanleitung dazu eingesetzt werden kann, den Ist-Zustand des Wissenstransfers in Organisationen zu erheben sowie vorhandene Probleme im Wissenstransfer aufzudecken. Das Vorgehen der Forschung ist an den Grundsätzen des Design Science ausgerichtet. Der Beitrag zur Forschung als Ergebnis des Design Science-Prozesses ist der Ordnungsrahmen, dessen Validität und Relevanz anhand mehrerer Kriterien gezeigt wird.
Gibt es zwischen Rauchern und Nichtrauchern einen Unterschied in der Husteninzidenz nach Fentanyl?
(2009)
Fragestellung: Die Inzidenz von fentanylinduziertem Husten soll von Injektionsgeschwindigkeit und Raucherstatus des Patienten abhängen und bis zu 18% betragen. Wir konnten vorher bei Nichtrauchern zeigen, dass die Inzidenz an fentanylinduziertem Husten lediglich 3% beträgt und unabhängig von der Injektionsgeschwindigkeit ist. In der vorliegenden Untersuchung haben wir die Inzidenz von fentanylinduziertem Husten bei Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern und bei unterschiedlichen Injektionsgeschwindigkeiten geprüft. Material und Methoden: Mit Zustimmung der Ethikkommission erhielten 530 konsekutive ASA l-lll Patienten (Raucheranteil unseres regionalen Patientenkollektivs 25%) randomisiert, einfach blind entweder 0,15 μg.kgKG Fentanyl über 2, 5 oder 10 Sekunden oder Kochsalz intravenös injiziert. Patienten mit akuten Infekten der Luftwege wurden ausgeschlossen. Primärer Endpunkt: Husten innerhalb von 5 Minuten nach Fentanyl-lnjektion. Null-Hypothese: kein signifikanter Unterschied zwischen Rauchern und Nichtrauchern und zwischen Fentanyl und Placebo. Statistik: Faktorielle ANOVA und chi- Quadrat-Test, p < 0,001. Ergebnisse: Unter der Annahme einer Hustenlnzidenz von 5% nach Fentanyl und 0% nach Plazebo errechneten sich 340 Patienten / Gruppe, also 1360 Patienten. Die geplante Zwischenauswertung nach 530 Patienten ergab eine Husteninzidenz von 2% sowohl in der Raucher- (n=176) als auch in der Nicht-Rauchergruppe (n= 356, p= 0,970 Raucher vs. Nichraucher). Die Husteninzidenz wurde weder in der Raucher- noch in der Nichtrauchergruppe durch die Injektionsgeschwindigkeit beeinflusst, betrug zwischen 1 und 3 % (p= 0,999 und 0,848 für Husteninzidenz vs. Injektionsgeschwindigkeit in der Raucher- bzw. Nichrauchergruppe) und unterschied sich nicht von Placebo. Die Rekalkulation der notwendigen Gruppengröße auf der Basis dieser Ergebnisse ergab 10449 Patienten / Gruppe, also 41794 Patienten für einen möglicherweise signifikanten aber klinisch irrelevanten Unterschied, so dass die Untersuchung beendet wurde. Schlussfolgerungen: Im Gegensatz zu den bisherigen Daten bei asiatischen oder chinesischen Patienten konnten wir in unserer Untersuchung keinen Einfluss des Raucherstatus auf die Inzidenz an fentanylinduziertem Husten feststellen. Die Husteninzidenz war bei Rauchern und bei Nichtrauchern unabhängig von der Injektionsgeschwindigkeit und nicht verschieden von Placebo.
Mechanismus der Inhibition APOBEC3-vermittelter Restriktion durch das Bet Protein der Foamyviren
(2009)
Der Selektionsdruck seitens der Pathogene führte im Laufe der Evolution zur Entwicklung verschiedener Abwehrmechanismen. Neben der angeborenen und adaptiven Immunabwehr rückte in den letzten Jahren ein neuer Immunitätszweig in den Fokus der Wissenschaft, die sogenannte intrinsische Immunität. Dieser Begriff geht einher mit der Entdeckung zellulärer, antiviral wirkender Deaminasen aus der Familie der APOBEC3 Proteine (A3A, -B, -C, -DE, -F, -G und -H). Diese Proteine übten einen starken Selektionsdruck aus, so dass nur die Viren überleben konnten, die einen Weg gefunden haben diesen zellulären Replikationsblock zu umgehen. Die komplexen Retroviren, wie Lenti- und Foamyviren, haben dazu Proteine entwickelt, welche in der Lage sind die A3 vermittelte, zelluläre Abwehr auszuhebeln. Während das Vif Protein des HI-Virus, das den proteasomalen Abbau des Zielproteins induziert, intensiv erforscht wurde, ist die Wirkungsweise des foamyviralen Bet noch unbekannt und Gegenstand dieser Arbeit. Die Aufklärung der Wirkungsweise des Bet Proteins erforderte zunächst die Etablierung eines experimentellen Systems, das die Messung antiviraler Aktivität verschiedener A3 Proteine, sowie deren Neutralisation durch Bet erlaubt. Bet zeigt sich aktiv gegen die meisten Deaminasen der Primaten, nicht aber gegen die Deaminasen der Katze und der Maus. Da die Aktivität sowohl im homologen (PFV), als auch heterologen (SIV) System bestimmt wurde, wird eine Beteiligung anderer viraler Komponenten ausgeschlossen. Aus dem breiten Spektrum sensitiver A3 Proteine wurden das humane A3B, -C und –G für weitere Untersuchungen verwendet. Durch Titrationsexperimente mit huA3C und –G zeigte sich, dass Bet dosisabhängig agiert und unterschiedliche A3 Proteine unterschiedlich empfänglich sind. Die mittels Immunopräzipitation untersuchte Bindung zwischen Bet und den empfänglichen A3 Proteinen korreliert mit deren Neutralisierung. Die Bindungsstudie mit in vitro hergestelltem huA3C deutet auf eine direkte, RNase unabhängige Interaktion hin. Die Bet-bedingte Inhibition der Dimerisierung von huA3C und -G konnte mittels Immunopräzipitation und chemischer Quervernetzung gezeigt, sowie die Bet-Bindestelle mithilfe eines Rekombinationsansatzes innerhalb der Dimerisierungsfläche von huA3C lokalisiert werden. Fraktionierungen der Proteine nach Löslichkeit bzw. Dichte, sowie Immunofluoreszenzstudien und FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) zeigten Bet-abhängige Änderungen der Lokalisierung, Komplexbildung und zytoplasmatischen Beweglichkeit von huA3B, -C und –G. Als Resultat dieser veränderten Eigenschaften Bet-sensitiver A3 Proteine wird ihre Inkorporation in Virionen verhindert, was zum Verlust der antiviralen Aktivität führt. Damit beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit einen neuen Weg, den Viren beschreiten um die A3 vermittelte Immunität auszuschalten.
Auswirkungen einer Mutation des Adhäsionrezeptors PSGL-1 bei humanen neutrophilen Granulozyten
(2009)
Der VNTR Polymorphismus des PSGL-1 ist schon seit längerer Zeit Gegenstand wissenschaftlicher Untersuchungen. Der Rezeptor weist je nach Genotyp eine unterschiedliche Länge auf. Dabei ist der Rezeptor mit dem Allel A der längste, das C-Allel weist phänotypisch den kürzesten Rezeptor auf. Der Rezeptor mit dem B-Allel liegt mit der Länge in der Mitte der drei Rezeptoren. In dieser Studie wurde das Roll- und das Adhäsionsverhalten von Leukozyten mit den Genotypen AA bzw. BB mit Hilfe eines Flusskammermodells untersucht. Dieses Verhalten kommt im Rahmen der Bindung zustande, welche P-Selektin und PSGL-1 miteinander eingehen. Das Blut von acht Probanden wurde untersucht, vier Probanden wiesen den Genotyp AA, die anderen vier den Genotyp BB auf. Die Leukozyten wurden aus dem Vollblut isoliert, verdünnt und in das Flusskammermodell eingespeist. Die verdünnte Zellsuspension wurde mittels einer Pumpe über ein Schlauchsystem durch eine Messkammer befördert, welche im Vorfeld mit P-Selektin beschichtet wurde. Dort konnten die Zellen mikroskopisch untersucht und videotechnisch dokumentiert werden. Anschließend konnte die Rollgeschwindigkeit der neutrophilen Granulozyten und die Anzahl der adhärenten Zellen an der Oberfläche durch Computerprogramme ermittelt werden. Als Resultat ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen der Rollgeschwindigkeit der Zellen des Genotyps AA und der Zellen des Genotyps BB. Dabei wiesen die Zellen mit dem B-Allel wegen der geringeren Länge des PSGL-1 eine höhere Rollgeschwindigkeit auf, als die Zellen mit dem AAllel, deren PSGL-1 länger ist. Zudem blieben signifikant weniger Leukozyten mit dem BAllel an der Oberfläche haften als die Leukozyten der anderen Gruppe. Daraus lässt sich schließen, dass die Bindungskraft zwischen PSGL-1 und PSelektin von der Länge des PSGL-1 abhängig ist. Der kürzere Rezeptor (B-Allel des PSGL-1) weist also eine geringere Bindungskraft auf als der längere Rezeptor (A-Allel des PSGL-1). Die Bindung zwischen PSGL-1 und PSelektin lässt sich wahrscheinlich pharmakologisch beeinflussen. Es wurden Antikörper entwickelt, die in klinischen Studien Erfolg versprechende Ansätze bei der Entzündungshemmung gezeigt haben. Die aktuelle Literatur zu klinisch pharmakologischen Behandlungsansätzen wurde in dieser Arbeit diskutiert.
Tumoren epithelialen Ursprungs weisen häufig eine vermehrte Expression und/oder Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) auf. Durch die übermäßig starke bzw. permanente Vermittlung von Überlebens- und Proliferationssignalen an die betroffene Zelle trägt dies direkt zum Voranschreiten der Tumorerkrankung bei. Für eine Reihe von Tumorentitäten ist bekannt, dass eine abnorme Expression von EGFR mit einer schlechteren Prognose für den Krankheitsverlauf und die mittlere Überlebenszeit betroffener Krebspatienten korreliert. Begleitend zur systemischen Chemotherapie solcher Tumoren wird eine gerichtete Therapie zur Eindämmung der EGFR-vermittelten Signaltransduktion durch den Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) oder EGFR-spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) erzielt. Bei der therapeutischen Anwendung monoklonaler anti-EGFR Antikörper wurden in einigen Fällen lediglich milde Nebenwirkungen wie z.B. Hautausschläge beobachtet, wobei das Auftreten dieser Effekte mit dem Therapieerfolg korrelierte. Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern, die gegen ErbB Rezeptor-Tyrosinkinasen gerichtet sind, sind mittlerweile zur Tumortherapie zugelassen, darunter der chimäre anti-EGFR Antikörper Cetuximab (Erbitux®, ImClone/BMS/Merck) zur Behandlung von metastasierenden Kolonkarzinomen sowie Karzinomen des Kopf- und Halsbereichs, der humane anti-EGFR Antikörper Panitumumab (Vectibix®, Amgen) bei metastasierenden Kolonkarzinomen, und der humanisierte anti-ErbB2 Antikörper Trastuzumab (Herceptin®, Genentech/Roche) bei Brustkrebs. Weitere Antikörper befinden sich derzeit in fortgeschrittenen Phasen der klinischen Entwicklung, darunter der humanisierte anti-EGFR Antikörper Matuzumab (Merck/Takeda). Klinische Daten zeigen, dass Patienten mit EGFR positiven Tumoren, die gegenüber etablierter Chemotherapie resistent sind, von der Behandlung mit anti-EGFR Antikörpern profitieren. Durch aktivierte EGF-Rezeptoren induzierte mitogene Signale werden vermindert bzw. blockiert, indem die Antikörper mit hoher Affinität an ErbB Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden und die Ligandenbindung bzw. die Dimerisierung verhindern, die zur Bildung aktivierter Rezeptor Dimere nötig ist. Auf diese Weise wird die mitogene Signalübertragung aktivierter ErbB-Rezeptor Dimere verhindert und die Proliferation der Tumorzelle wird verlangsamt oder kommt zum Stillstand. Es gibt Hinweise, dass darüber hinaus sekundäre Effektormechanismen des Immunsystems wie die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) oder die komplementabhängige Zytotoxizität (CDC) gegen Antikörper-markierte Tumorzellen die anti-tumorale Wirksamkeit dieser Antikörper noch verstärken. Die lebensverlängernde Wirkung der Behandlung mit diesen Antikörpern ist ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung einer zielgerichteten Krebstherapie durch passive Immuntherapie. Zu Beginn dieser Arbeit waren die genauen Bindungsstellen der therapeutischen anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab noch unbekannt. Die Kenntnis der Lage der Epitope auf dem EGFR Molekül könnte wichtige Hinweise zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieser Antikörper liefern und Ansätze zur weiteren Optimierung dieser Therapeutika aufzeigen. Aus vorangegangenen Experimenten war bekannt, dass Cetuximab und Matuzumab Epitope auf dem EGFR erkennen, die eine intakte Raumstruktur des Rezeptors voraussetzen. Diese Beobachtungen konnten in dieser Arbeit bestätigt werden, ferner konnte die Lage der Epitope auf die EGFR Ektodomäne III/L2 eingegrenzt werden. Da sowohl Cetuximab als auch Matuzumab nicht-lineare, konformationelle Epitope erkennen, wurde eine Variante der Phage Display Methode zur Identifizierung von Peptiden gewählt, die mit den hypervariablen Regionen (CDR) dieser Antikörper interagieren, welche die Bindungsspezifität der Antikörper vermitteln. Ziel dieser Experimente war die Identifizierung von Peptiden, welche die konformationellen Epitope von Cetuximab bzw. Matuzumab in linearer bzw. zyklisch restringierter Form nachbilden. Die Aminosäuresequenzen solcher sogenannter Mimotope könnten zur Identifizierung entsprechender Oberflächenstrukturen am EGFR Molekül herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden aus kommerziell erhältlichen Bibliotheken genetisch modifizierter M13 Bakteriophagen, die randomisierte lineare bzw. zyklische Peptide als N-terminale Fusion am Oberflächenprotein pIII exponieren (M13KE), unter Anwendung der „Delayed Infectivity Panning“ (DIP) Methode Peptide angereichert, die von Cetuximab bzw. Maztuzumab erkannt werden. Zur Anreicherung von M13KE Bakteriophagen mit CDR-spezifischen Fusionspeptiden mittels DIP wurde zunächst ein „single-chain“ Antikörperfragment aus der cDNA von Matuzumab konstruiert und in den bakteriellen Expressionsvektor pIB-Tx kloniert. Mit dem resultierenden Konstrukt pIB-Tx-scFv(E72K) bzw. dem bereits vorhandenen analogen Konstrukt pIB-Tx-scFv(225), welches das „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab enthält, wurden E. coli HB101 Bakterien transformiert, um die bakterielle Oberflächenexpression dieser Antikörperfragmente zum Einsatz in DIP Experimenten zu erreichen. In alternierenden positiven und negativen Selektionsrunden wurden unter Einsatz dieser scFv-exprimierenden E. coli HB101 Bakterien in Biopanning Experimenten Phagen mit solchen Fusionspeptiden angereichert, die selektiv an die „single-chain“ Antikörperfragmente von Cetuximab bzw. Matuzumab binden. Phagen ELISA Experimente mit M13KE Einzelklonen zeigten, dass aus allen eingesetzten Bibliotheken Phagen mit Fusionspeptiden isoliert werden konnten, die an den jeweiligen parentalen Antikörper des zur Selektion eingesetzten „single-chain“ Antikörperfragmentes binden. Ein Teil der Phagenklone wies eine zumindest partielle Kreuzreaktivität zu dem entsprechenden anderen anti-EGFR Antikörper auf, obwohl sie auf Bindung an diesen nicht selektioniert worden waren. Die Sequenzanalyse der Fusionspeptide lieferte keine gemeinsame Consensus Sequenz, es konnten jedoch kurze, gemeinsame Sequenzmotive identifiziert werden. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurden diese Klone als mögliche Kompetitoren der Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA in MTT-Zytotoxizitätsassays eingesetzt. Ein Teil der selektionierten Fusionspeptide war in der Lage, die Bindung der aus dem „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab scFv(225) bestehenden Zellbindungsdomäne des Immuntoxins scFv(225)-ETA an EGFR exprimierende Zellen zu kompetieren. Auch für einige Fusionspeptide, die zunächst nur auf Bindung an Matuzumab selektioniert worden waren, wurde dies beobachtet. Peptide, welche die Bindung des Immuntoxins an EGFR kompetieren, weisen in ihren pIII-Fusionspeptiden laut Sequenzanalyse die gemeinsamen Sequenzmotive KTL bzw. YPLG auf. Nach einem Abgleich der Sequenzen der kompetierenden, kreuzreaktiven Peptide mit KTL bzw. YPLG Motiven wurden zwei Peptide ausgewählt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurde zunächst bestätigt, dass die synthetischen Peptide in der Lage sind, durch Kompetition spezifisch die Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA und dessen zytotoxische Wirkung auf EGFR exprimierende Zellen zu verhindern. Kaninchenseren und aus diesen affinitätsgereinigte anti-Peptid Antikörper zeigten in ELISA Experimenten konzentrationsabhängige Bindung an die immobilisierten synthetischen Peptide. Die Bindung der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab an die synthetischen Peptide konnte ebenfalls bestätigt werden. In einer Reihe von Experimenten wurde untersucht, ob die Immunisierung mit potentiellen Mimotopen der anti-EGFR Antikörper eine endogene humorale Immunantwort gegen den humanen EGFR bewirkt hatte. Die Bindung der affinitätsgereinigten anti-Peptid Antikörper an den Rezeptor auf der Oberfläche EGFR-exprimierender Tumorzellen wurde zunächst in Durchflusszytometrie (FACS) Experimenten analysiert. Für die gereinigten anti-Peptid Antikörper wurde spezifische Bindung an murine Renca-lacZ/EGFR Zellen sowie an humane A431 Vulvakarzinomzellen detektiert, die den humanen EGFR auf der Oberfläche exprimieren. Die Bindung an A431 konnte durch Vorinkubation der Antikörper mit einem Überschuss der entsprechenden synthetischen Peptide vollständig verhindert werden. In einer weiteren Serie von FACS Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Bindung der Antikörper Cetuximab und Matuzumab an EGFR durch eine Vorinkubation von Renca-lacZ/EGFR Zellen mit den gereinigten anti-Peptid Antikörpern deutlich reduziert werden konnte. Dies ist ein Beweis für die Fähigkeit der in Immunisierungsexperimenten generierten anti-Peptid Antikörper, die Bindungsstellen von Cetuximab und Matuzumab am EGFR zumindest teilweise zu besetzen. Diese Beobachtungen zeigen, dass durch Immunisierung mit den hier ausgewählten synthetischen Peptiden in Versuchstieren die Bildung von Antikörpern mit ähnlichen Eigenschaften wie Cetuximab bzw. Matuzumab und somit eine endogene Immunantwort gegen den humanen EGFR ausgelöst werden konnte. In Immunfluoreszenz Experimenten wurde die Bindung der anti-Peptid Antikörper an Renca-lacZ/EGFR Zellen erneut überprüft und mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) visualisiert. In diesen Experimenten wurde für gereinigte anti-Peptid Antikörper (KTL Motiv bzw. YPLG Motiv) Bindung an die Zelloberfläche bzw. membrannahe intrazelluläre Strukturen beobachtet, die der Lokalisierung der Bindungssignale der parallel getesteten anti-EGFR Antikörper Cetuximab, Matuzumab und dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 entsprach. Die Bindung der anti-Peptid Antikörper konnte durch Zugabe eines Überschusses der jeweiligen synthetischen Peptide verhindet werden. In einer weiteren Serie von Immunfluoreszenz Experimenten wurde der humane EGFR auf Renca-lacZ/EGFR Zellen gleichzeitig mit anti-KTL bzw. anti-YPLG Peptid Antikörpern aus Kaninchen sowie dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 detektiert. Durch eine Überlagerung der Signale konnte eindeutig eine Kolokalisation nachgewiesen werden. Dies ist ein Beweis dafür, dass es sich bei der Bindung der anti-Peptid Antikörper an die Oberfläche von Renca-lacZ/EGFR um Bindung an den humanen EGFR handelt. In Lysaten von EGFR exprimierenden Zelllinien konnte mit gereinigten anti-Peptid Antikörpern ein Protein detektiert werden, dessen Größe dem humanen EGFR entspricht. Die durch Stimulation des humanen EGFR mit dem natürlichen Peptidliganden EGF hervorgerufene Autophosphorylierung des Rezeptors in A431 Zellen konnte durch Zugabe von anti-Peptid Antikörpern teilweise inhibiert werden, allerdings nicht in dem gleichen Ausmaß, wie dies für die als Positivkontrollen eingesetzten anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab beobachtet wurde. In MTT-Zytotoxizitätsassays konnte darüber hinaus eine teilweise Kompetition der Bindung des rekombinanten Toxins TGF!-ETA an EGFR-exprimierende A431 Zellen, und somit eine teilweise Kompetition des natürlichen Peptidliganden TGF! an EGFR durch Vorinkubation mit anti-Peptid Antikörpern nachgewiesen werden. Zur näherungsweisen Quantifizierung der Affinitäten der anti-Peptid Antikörper und der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab für die synthetischen Peptide (KTL Motiv und YPLG Motiv) bzw. für die gereinigte extrazelluläre Domäne des humanen EGFR (sEGFR) wurden ELISA Bindungstests durchgeführt. Die aus den Bindungskurven berechneten Affinitätswerte zeigen, dass die anti-Peptid Antikörper an sEGFR im nanomolaren Bereich binden und damit ca. 200-fach niedrigere Affinitäten für den Rezeptor besitzen als die affinitätsoptimierten anti-EGFR Antikörper Cetuximab bzw. Matuzumab. Die Affinitäten der anti- Peptid Antikörper für die synthetischen Peptide liegen ebenfalls im nanomolaren Bereich, während Cetuximab und Matuzumab lediglich mikromolare Affinitäten für die Peptide besitzen. Durch „Epitope Mapping“ in silico vorhergesagte mögliche Oberflächenstrukturen auf EGFR, welche die Peptidmimotope mit KTL bzw. YPLG Motiven nachbilden, sind direkt benachbart zu den mittlerweile publizierten Bindungsstellen von Matuzumab und Cetuximab bzw. EGF in der Ektodomäne III/L2 von EGFR (Li et al., 2005; Schmiedel et al., 2008) und zeigten im Falle des Peptides mit KTL Motiv Übereinstimungen mit Teilen beider Epitope. Möglicherweise ist dieses Peptid in der Lage, alternative Strukturen mit KTL bzw. KTI Motiven an der Oberfläche von EGFR nachzubilden, die Gemeinsamkeiten mit beiden Epitopen von Cetuximab bzw. Matuzumab besitzen und daher von beiden Antikörpern erkannt werden können. Eine endgültige Klärung der Bindung der hier identifizierten Peptide an Cetuximab bzw. Matuzumab bzw. der Bindung der anti-Peptid Antikörper an EGFR könnte in nachfolgenden Untersuchungen mittels Röntgenkristallographie bzw. NMR strukturell aufgeklärt werden – die hierzu nötigen Peptide bzw. Proteine liegen bereits in gereinigter Form vor. Eine Optimierung der hier identifizierten Mimotope zur Steigerung der Affinitäten der induzierten anti-Peptid Antikörper für EGFR könnte zur Entwickung von Vakzinen führen, die eine Alternative zur wiederholten, kostenintensiven passiven Immunisierung von Patienten mit EGFR-exprimierenden Tumoren mit monoklonalen Antikörpern darstellen könnte.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Eindimensionale Gelelektrophoresen Die Analyse mitochondrialer Proteine aus juvenilen und seneszenten P. anserina-Wildstämmen mit Hilfe von eindimensionalen SDS- und eindimensionalen Blau-Nativen-Gelelektrophoresen zeigt keine deutlichen, seneszenzspezifischen Unterschiede. Im Gegensatz dazu werden in initialen Versuchen der nicht-radioaktiven 2D-PAGE differentiell gebildete Proteine visualisiert. 2. 2D-PAGE mit radioaktiv-markierten, mitochondrialen Proteinen aus jungen und alten P. anserina-Wildstämmen In der ungerichteten Proteomanalyse wurden 29 differentiell-gebildete Proteine identifiziert und zusätzlich zahlreiche Isoformen einiger Proteine gezeigt. Von der ß-ATPase wurden modifizierte Isoformen gefunden. Außerdem wurde eine seneszenspezifisch verringerte Bildung von ROS-Abwehr-Proteinen in den Mitochondrien detektiert. Im Gegensatz dazu wurde eine größere Menge eines Chaperons gefunden, das bei der Proteinsynthese eine Rolle spielt: eine Protein-Disulfid-Isomerase, die die Umlagerung und Neubildung von Di-Sulfid-Brücken bei der Faltung von Proteinen katalysiert. Zusätzlich wurde eine erhöhte Menge des Proteins SSC1 identifiziert. Dieses gehört zur Hsp70-Hitzeschock-Proteinfamilie. Es wurde ebenfalls eine erhöhte Menge des Apoptosefaktors Cyclophilin D in den mitochondrialen Proben aus den seneszenten Wildstämmen identifiziert. Die Identifizierung dieses Proteins in Mitochondrien von P. anserina stellt neben der Charakterisierung der Metacaspasen (Hamann et al., 2007) einen weiteren Ansatzpunkt für die Apoptoseforschung in P. anserina dar. Die molekularbiologische Analyse dieses Proteins wurde aufgrund dieser Proteomanalyse im Arbeitskreis aufgenommen (Dissertation D. Brust). Ein weiteres Protein, das in stark erhöhter Menge in den Proteinisolaten identifiziert wurde, ist PaMTH1. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und die Funktion dieser neu identifizierten differentiell-gebildeten Methyltransferase während der Alterung in P. anserina mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und physiologischen Analysen untersucht. 3. Charakterisierung von PaMTH1 Im Rahmen von Northernblot-Analysen wurde gezeigt, dass die PaMth1-Transkriptmenge in drei unabhängigen alten Wildstämmen im Vergleich zu den entsprechenden jungen Wildtsämmen deutlich erhöht ist. In einer Westernblot-Analyse von Gesamtproteinen und Mitochondrien aus jungen und seneszenten Wildstämmen wird der seneszenzspezifische Anstieg der Proteinmenge verifiziert. Die genauere Einordnung von PaMTH1 in die Klasse I der Methyltransferasen und die Ergebnisse der Analyse der Substratspezifizität geben einen Hinweis auf eine Schutzfunktion durch die Verhinderung einer ROS-Entstehung unter der Beteiligung von Substanzen mit einer Catecholgruppe. Die Ergebnisse der Analyse der Modulation der PaMth1-Expression in P. anserina deuten ebenfalls auf eine Schutzwirkung von PaMTH1 hin: PaMth1-Überexpressionsstämme zeigen eine verbesserte Wuchsrate auf stress-induzierenden Medien, weniger carbonylierte Proteine und vor allem eine verlängerte Lebensspanne ohne physiologische Nachteile im Vergleich zum Wildstamm. Dagegen lebt die PaMth1-Deletionsmutante kürzer und wächst schlechter auf ROS-induzierenden Medien, sie zeigt allerdings keine erhöhte Menge von carbonylierten Proteinen im eindimensionalen „Oxyblot“. Die beobachtete Lebensspannenverkürzung der PaMth1-Deletionsmutante wird jedoch durch die Reversion dieser Stämme wieder aufgehoben, sodass die Hypothese des Schutzes vor der ROS-Generierung durch die Methylierung von Dihydroxylgruppen anhand der erhaltenen Daten unterstützt wird.
Veränderungen in der akustischen Umwelt sind häufig mit Ereignissen verbunden. Diese wiederum können für ein Tier eine besondere Verhaltensrelevanz haben, im Gegensatz zu einem gleichbleibenden akustischen Hintergrund, der mit keinem positiven oder negativen Ereignis verbunden ist. Es ist also naheliegend zu spekulieren, dass Veränderungen oder neue akustische Reize im zentralen Nervensystem anders repräsentiert werden als der kontinuierliche Hintergrund und dass diese Repräsentation sowohl von der Häufigkeit der Stimuli als auch vom Unterschied zum akustischen Hintergrund abhängt. In Elektroenzaphalografie-Messungen (EEG) am Menschen wurde eine besondere Aktivitätsänderung bei auditorischen Abweichungen erstmals 1978 nachgewiesen. Dabei wurde ein akustischer Reiz über einen längeren Zeitraum regelmäßig wiederholt (Standard) und in einigen, seltenen Fällen durch einen anderen Reiz (Deviant) ersetzt. Dieser Deviant löste eine zusätzliche negative Komponente im EEG aus (Mismatch negativity), die bei den Standard-Stimuli nicht vorhanden war. Eine Voraussetzung, um MMN auszulösen, ist die Präsentation von einigen Standard-Stimuli, sodass eine neuronale Repräsentation des Stimulus aufgebaut werden kann, gegen die jeder weitere Reiz abgeglichen wird. Die zelluläre Basis von MMN und des zugrunde liegenden Mechanismus zur Detektion von auditorischen Veränderungen ist nur wenig erforscht. Als möglicher zellulärer Detektionsmechanismus akustischer Veränderungen wurde die Stimulus-spezifische Adaptation (SSA) vorgeschlagen, die zugleich der Ursprung von MMN im primären auditorischen Kortex sein könnte. SSA beschreibt die Eigenschaft von Neuronen der Hörbahn, auf die Wiederholung von identischen Reizen mit abnehmender Aktivität zu antworten und zugleich die Fähigkeit beizubehalten, andere Stimuli weiterhin mit hoher Aktivität zu repräsentieren. Die veränderte neuronale Repräsentation von Tönen mit niedriger Auftrittswahrscheinlichkeit, im Vergleich zu Tönen mit hoher Auftrittswahrscheinlichkeit, wurde bereits sehr eindrücklich im auditorischen Kortex der anästhesierten Katzen demonstriert. Die vorliegende Arbeit hat es sich zum Ziel gesetzt, bei der Repräsentation von auditorischen Abweichungen die Lücke zwischen der Ebene aufsummierter Potenziale (EEG beim Menschen) und der Ebene einzelner kortikaler Neurone zu schließen. Gleichzeitig sollte dabei erstmalig SSA im auditorischen Kortex des wachen Tieres nachgewiesen und so eine pharmakologische Interaktion der normalerweise eingesetzten Anästhetika mit SSA ausgeschlossen werden. Der experimentelle Ansatz basierte auf elektrophysiologischen Messungen mit chronisch implantierten Mikroelektroden im wachen Tier. Die Elektroden waren im auditorischen Kortex positioniert und ermöglichten eine gleichzeitige Messung der lokalen aufsummierten Potenziale (lokale Feldpotenziale, LFP) und der Aktionspotenziale einzelner Neurone als extrazelluläre Potenzialveränderungen. Das Stimulationsparadigma bestand aus Folgen zweier Reintöne, die mit unterschiedlicher Auftrittwahrscheinlichkeit präsentiert wurden. Der Ton mit hoher Auftrittwahrscheinlichkeit bildete den akustischen Hintergrund, der Ton mit niedriger Auftrittswahrscheinlichkeit (Deviant) die akustische Abweichung. In dieser Arbeit konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass Neurone im auditorischen Kortex der wachen Ratte akustische Abweichungen mit einer höheren Aktivität repräsentieren als den auditorischen Hintergrund (bis zu 19,5% Aktivitätsunterschied). Stimulusspezifische Adaptation ist somit auch im wachen Tier Teil der neuronalen Codierung der akustischen Umwelt. Mithilfe der Signalentdeckungstheorie konnte des Weiteren gezeigt werden, dass die unterschiedliche neuronale Repräsentation von häufigen und seltenen Stimuli auch zu einer erhöhten neuronalen Unterscheidbarkeit zwischen beiden Stimuli führte. Auf der Ebene der ereigniskorrelierten LFPs konnte SSA in zwei Komponenten nachgewiesen werden: der ersten, negativen Auslenkung und der folgenden, positiven Auslenkung. Besonders in der ersten, negativen Komponente war SSA systematisch nachzuweisen und sie war zusätzlich starkmit der Aktivität der einzelnen Neuronen korreliert, während die positive Komponente der LFPs keine Korrelation mit den Messungen der einzelnen Nervenzellen zeigte. Der Grad der SSA hing von der Auftrittwahrscheinlichkeit und dem Frequenzabstand der beiden Töne ab. Keine der Messungen hatte die besondere Charakteristik von MMN. Zusammenfassend lässt sich die Aussage treffen, dass SSA auch im wachen Tier nachgewiesen wurde, sowohl auf der Ebene einzelner Neurone als auch in der aufsummierten Aktivität, wenn auch in einer schwächeren Ausprägung als in den bisher veröffentlichten Ergebnissen in anästhesierten Tieren. Ein direkter Beitrag der kortikalen Neurone zu MMN konnte nicht gezeigt werden, es gab aber einen starken Zusammenhang zwischen den einzelnen Neuronen und den LFPs.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Auswirkungen von Feldenkrais-Bewegungsübungen auf ein Klientel, dass aus freien Stücken an Feldenkraiskursen eines niedergelassenen Feldenkraislehrers teilnimmt, wobei insbesondere gesundheitliche und psychosomatische Aspekte betrachtet werden. Feldenkrais formulierte die theoretischen Grundlagen der Methodik auf einem breiten wissenschaftlichen Fundament verschiedener Fachrichtungen, wie Medizin, Neurobiologie, Psychologie, Physik, Systemtheorie und Anthropologie und lieferte damit eine Erklärung, wie die von ihm entwickelte Bewegungsmethodik Ein uss auf die Entwicklung und die Lernfähigkeit eines jeden Individuums nehmen kann. Der Mensch wird dabei, im Gegensatz zur dualistischen Sichtweise, die in der klassischen Schulmedizin vorherrscht, als ein Ganzes gesehen, in dem die Bereiche Körper und Seele nicht zu trennen sind. Die moderne Neurobiologie bestätigt mit der Anwendung neuer Messmethoden, wie dem funktionellen Magnetresonanztomogramm bedeutende Aussagen der Theorie von Feldenkrais. Systemtheorie und Konstruktivismus sind dabei grundlegend für den feldenkrais'schen Denkansatz und für die heutige Psychosomatik, wie sie unter anderem von von Uexküll beschrieben wird. Der Mensch wird hier als autopoietisches System betrachtet, welches sich selbst ständig reguliert. Somit kann er sich wechselnden Umweltein flüssen anpassen und ist zur Selbstheilung fähig, worin Feldenkraislehrer, respektive Psychotherapeuten ihn unterstützen können. Zunehmend suchen Menschen zur Förderung der persönlichen Weiterentwicklung, wie gleichzeitig zur Bewältigung gesundheitlicher und insbesondere psychosomatischer Probleme Feldenkraiskurse auf. Vor diesem Hintergrund wurden in der Praxis eines niedergelassenen Feldenkraislehrers die Kursteilnehmer vor- und direkt nach der Teilnahme an zehn Feldenkraisstunden, sowie im Langzeitverlauf zu den Auswirkungen befragt. Die 82 erwachsenen Probanden der Studie waren zu 2/3 weiblich, bei einem Durchschnittsalter von 46 Jahren. Die Stichprobe glich in ihrem psychosomatischen Beschwerdestatus der durchschnittlichen Allgemeinbevölkerung, wohingegen ein überdurchschnittlich hohes Schulbildungs- und Berufsausbildungsniveau vorlag. Die Motivation der Kursteilnehmer lag gleichermaßen im Wunsch, die Fähigkeit der Körperwahrnehmung und die Beweglichkeit zu steigern, wie verschiedene Beschwerden und Erkrankungen zu verbessern. Anhand zweier standardisierter psychometrischer Fragebögen, dem Giessener Beschwerdebogen und der Symptom-Checkliste SCL-90-R konnte eine signifikante Verbesserung psychosomatischer und somit gesundheitlicher Beschwerden direkt nach dem Kurs, wie auch im Langzeitverlauf ein halbes Jahr nach Kursende beschrieben werden. Dazu zählen im Einzelnen Gliederschmerzen, Herzbeschwerden, Somatisierungstendenz, Zwanghaftigkeit, Depressivität, Aggressivität und die grundsätzliche psychische Belastung. Mithilfe des neu entwickelten Selbsteinschätzungsfragebogens des Verfassers ergaben sich weitere Hinweise auf die positiven Langzeitauswirkungen nicht nur im seelischen Bereich, sondern in weiteren zentralen Bereichen menschlichen Handelns, namentlich dem Wahrnehmungsbereich, dem kognitiven Bereich und der Beweglichkeit. Die Verbesserungen betrafen mehrere Lebensbereiche, den privaten, wie auch den beruflichen Bereich. Die Sicherheit der Feldenkraismethode gegenüber dem Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen wurde ebenfalls dokumentiert. Anhand kontrollierter randomisierter Folgestudien sollten die Ergebnisse abgesichert werden. Der kreative Wissensaustausch von Neurobiologen mit moderner Messtechnik und wissenschaftlich arbeitenden Feldenkraislehrern, die zur Entwicklung spezieller Messmethodik einen Beitrag leisten können, kann zu neuen Erkenntnissen auf den Gebieten des Lernverhaltens, der Reifung und der Gesundheit des Menschen führen.
Diese Arbeit untersuchte die Epidemiologie und den Einfluss verschiedener Faktoren (Grunderkrankung, empirische Therapie, Schweregrad der Sepsis und Erreger mit Resistenz) auf das Überleben von Patienten mit Septikämien. Die häufigsten Grunderkrankungen dieses Kollektivs waren Leukämien (33%), solide Neoplasien (14%) sowie kardiale Vorerkrankungen (14%). Knapp die Hälfte der Patienten erwarb die Septikämie im Krankenhaus (47%). ...
Streptomyces coelicolor ist der Modellorganismus der GC reichen, Gram+ Actinomyceten, die mehr als zwei Drittel aller bekannten Antibiotika produzieren. Phänotypisch zeichnet er sich durch die Bildung eines Substrat- und eines Luftmyzels aus, welches im Laufe der weiteren Differenzierung Sporen bildet. Streptomyceten produzieren neben Antibiotika noch eine Vielzahl biotechnologisch interessanter Metaboliten. Der komplexe Lebenszyklus und Stoffwechsel erfordern eine genaue Regulation der Genexpression. Die letzten Jahre haben gezeigt, dass neben Proteinen auch die RNA eine regulatorische Funktion hat. Verschiedene regulatorisch aktive RNA Elemente wie Riboswitche, RNA-Thermometer und kleine nicht kodierende RNAs (small noncoding RNAs – sRNAs) wurden identifiziert. sRNAs wirken meist als antisense Riboregulatoren, indem sie ihre Ziel-mRNA binden und dadurch die Translation hemmen oder fördern. In dieser Arbeit wurden verschiedene bioinformatische Methoden verwendet, um sRNAs im Genom von S. coelicolor vorherzusagen. Es wurden Terminatorstrukturen und konservierte Sekundärstrukturen in den intergenen Regionen vorhergesagt, die keinem Gen zuzuordnen waren. In einem weiteren Ansatz wurden Bindestellen des Regulatorproteins DasR vorhergesagt, um DasR kontrollierte sRNAs zu identifizieren. Zusätzlich wurde mittels 454 Sequenzierung erstmalig das Transkriptom von S. coeliocolor analysiert. Auf diese Weise konnten etwa 500 sRNAs vorhergesagt werden. Eine der beiden charakterisierten sRNAs, sc32, ist 139 nt lang. Ihr Promoter liegt im kodierenden Bereich des Gens bldC und sie wird spezifisch durch Kälteschock induziert. Die zweite charakterisierte sRNA, sc1, ist 159 nt lang und in allen sequenzierten Streptomyceten konserviert. Ihre Expression wird nur bei Stickstoffmangel in der Stationärphase reprimiert. Durch molekularbiologische Analysen konnte ein Zielgen von sc1 identifiziert werden, die extrazelluläre Agarase DagA. Es konnte gezeigt werden, dass sc1 an die dagA-mRNA bindet und dadurch die Translation inhibiert. Als zweites mögliches Ziel von sc1 konnte die Histidinkinase SCO5239 identifiziert werden. Hier wurde gezeigt, dass Koexpression von sc1 die Expression einer SCO5239 Reportergenfusion um den Faktor acht steigert. Durch Analyse des Proteoms von sc1 Mutanten, konnte die differenzierte Expression von elf weiteren Proteinen gezeigt werden. Sc1 scheint als Regulator zu agieren, indem es auf die Stickstoffversorgung der Zelle reagiert und den Sekundärmetabolismus deaktiviert.
Das Ziel dieser Studie war die Etablierung von Grenzwerten für die bronchiale Methacholinprovokation durch Vergleich des Aerosol Provokation Systems (APS-SC) mit einem ATS Standard (five-breath dosimeter method, SDM). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die APS-SC Methode unter Verwendung eines Kurzprotokolls und des Systems der Firma Cardinal Health eine sichere, schnelle und verlässliche Methode der bronchialen MCP darstellt. Im Schnitt erspart dieses Verfahren acht Minuten gegenüber der klassischen SDM gemäß dem von der ATS empfohlenen „short five breath dosimeter protocol“. Zudem entfallen in der Vorbereitung das Herstellen und die Lagerung mehrerer unterschiedlich konzentrierter Methacholinlösungen; während der Untersuchung existiert daher auch kein Verwechslungsrisiko. Der Test selbst ist für Untersucher und Patient weniger belastend. Die Verwendung einer Konzentration von 16,00 mg/ml für die Methacholin-Testlösung stellt einen guten Mittelweg zwischen akzeptablen Inhalationszeiten innerhalb der Stufen und einer nicht zu aggressiven Konzentration dar, mit der vom Anfang eines Tests bis zu seinem Ende gearbeitet werden kann. Zwischen den Kategorien der BHR für die SDM- und die APS-SC Methode besteht ein enger Zusammenhang. Als Grenzwert für die Annahme einer BHR – definiert als diejenige Methacholindosis bzw. -konzentration, die zu einem Abfall der FEV1 um 20 % vom Ausgangswert führt – stimmt der bestehende und von der ATS publizierte Grenzwert von 8,00 mg/ml am besten mit einer Dosis von 1,00 mg Methacholin in der APS-SC Methode überein.
Akute Hochrisiko-Leukämien oder deren Rezidive, chronische Leukämien, Myelodysplastische Syndrome und Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphome sind Indikationen für hämatopoetische Stammzelltransplantationen. Das Verfahren ist mit einer hohen Therapie-assoziierten Morbidität und Mortalität (TRM), die bei 5-40% liegt, assoziiert. Hauptprobleme sind dabei neben Infektionen die akute und chronische Transplantatreaktion (Graft-versus-Host-Erkrankung, GvHD). Die TRM variiert je nach Grunderkrankung, Spender und Allgemeinzustand des Patienten. Um Risikofaktoren für die TRM zu identifizieren, analysierten wir in einer retrospektiven Studie 205 allogene pädiatrische SZT in 4 Kliniken, von denen jeweils 2 Kliniken ein hohes bzw. niedriges Risikoprofil hinsichtlich der TRM hatten. Wir überprüften die Anwendbarkeit und Validität des von Matthes-Martin et al. entwickelten Risikoscores (TRMScore), der aus drei Risiko-Punkten Patienten-spezifische (Alter, Grunderkrankung) und Therapie-spezifische (Spender) Charakteristika miteinander kombiniert. Dieser Score teilt die Patienten in 4 TRM–Risikogruppen ein mit einem Score von 0 Punkten (Patient unter 10 Jahren mit HLA-identischen Geschwister als Donor) bis zu 3 Punkten (Patient über 10 Jahren, CR3 und HLA-nicht passenden Spender). Wir modifizierten den TRM-Score von Matthes-Martin et al., indem wir die Patienten mit einem TRM-Score von 0 und 1 in eine erste Gruppe (TRM-Score I) und die Patienten mit dem TRM-Score von 2 und 3 in eine zweite Gruppe zusammen (TRM-Score II) zusammenfassten, und entwickelten den mTRM-Score (modifizierter TRM-Score). Die Indikationen zur SZT waren ALL, AML, CML, Non-Hodgkin-Lymphome, Hodgkin-Lymphome und MDS. Es gab 88 KMT und 115 PBSZT und in 2 Fällen war die Stammzellquelle eine Kombination aus Knochenmark und peripherem Blut. Das Patientenalter lag zwischen 0 und 23 Jahren. Spender waren MSD (26,8%), MRD (1%), MUD (53,2), MMUD (10,2%) und MMRD (8,8). Am LFU lebten 61% der Patienten. Von den 39% der verstorbenen Patienten sind 40% aufgrund eines Rezidivs verstorben und 60% transplantationsassoziiert. Die Gesamt-TRM lag bei 22,4%. Wir teilten transplantationsassoziierte Faktoren in folgende Gruppen ein: Patienten-assoziierte Variablen, Spender-assoziierte, Krankheits-assoziierte, Therapie-assoziierte Variablen und sonstige Variablen. Die logistische Regression zeigte signifikant prognostische Faktoren, die die TRM beeinflussen. Das waren die Klinik (P=0,0045), in der die SZT durchgeführt wurde, das Jahr der SZT (P=0,0457, ab 2001) und der Spendertyp (P=0,0083, kein MSD). Die Diagnose, der Remissionsstatus bei SZT und der TRM-Score waren keine prognostischen Risikofaktoren für die TRM. Bei Anwendung des mTRM-Scores kristallisierte sich dieser als ein Prädiktor für die TRM (P=0,0447) heraus. Ein TRM-Score von I ging mit einer niedrigen TRM-Rate einher. Der mTRM-Score kann aufgrund der Ergebnisse zur Therapieentscheidung herangezogen werden, da er eine Einschätzung der tatsächlichen Überlebenswahrscheinlichkeit für die Patienten möglich macht. Die Klinik als Risikofaktor für die TRM ist nicht alleine durch das Patientenkollektiv und durch die Auswahl des Spendertyps zu erklären. Anhand der 1-Jahres-TRM (23%) von Matthes-Martin et al. errechneten wir die zu erwartende TRM-Rate für unsere Kliniken. Die erwartete TRM wich in Klinik C und Klinik D stark von der beobachteten TRM ab, in Klinik A und Klinik B waren sie annähernd gleich. Ein signifikanter Unterschied bestand nur bei Klinik C mit einem p-Wert von 0,05 bei dem TRM-Score und 0,02 bei dem mTRM-Score. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das Outcome der SZT von den Kliniken an sich bzw. deren Therapiemodalitäten beeinflusst wurde.
Nahrungsmittelallergikern steht aufgrund inakzeptabler Nebenwirkungen bei der spezifischen Immuntherapie zurzeit noch keine kausale Therapie dieser Erkrankung zur Verfügung. Demzufolge bleibt die Vermeidung der entsprechenden Lebensmittel für Nahrungsmittelallergiker der einzige Weg möglicherweise lebensbedrohlichen allergischen Reaktionen zu entgehen. Ziel dieser Arbeit war es, das Potential eines viralen Vektors für die Verwendung bei der spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie zu untersuchen. Die Überlegung dahinter war, das Risiko eines anaphylaktischen Schocks, der bei Injektion eines Allergens immer gegeben ist, durch intrazelluläre Expression des Proteins über das rekombinante Virus zu verringern. Zusätzlich dazu bringt das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ideale Voraussetzungen für eine Allergievakzine mit: Die Infektion mit MVA führt zu einer stark Th1-gerichteten Immunantwort gegen die viral exprimierte Proteine, die möglicherweise die allergische Th2-gerichtete Immunantwort modulieren kann. Die prophylaktische Immunisierung mit MVA-OVA im Mausmodell der systemischen Sensibilisierung gegen Ovalbumin (OVA) führte dosisabhängig zur Suppression der spezifischen IgE-Antwort und somit zum Schutz vor allergischer Sensibilisierung. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Vakzinierung mit MVA-OVA eine dauerhafte spezifische IgG-Antwort induziert. Diese Daten unterstützen das Konzept einer Modulation der Sensibilisierung durch MVA-Vakzine. Weiterhin wurden zwei rekombinante Vakzinen generiert, mittels derer entweder das Tropomyosin aus Garnelen (Pen a 1) oder das Lipid-Transfer-Protein aus Haselnuss (Cor a 8) intrazellulär exprimiert werden konnte. Dass die Sensibilisierung gegen diese Allergene häufig mit schweren allergischen Reaktionen korreliert, unterstreicht die Notwendigkeit einer verbesserten Immuntherapie in diesem Bereich. Während MVA-Pen a 1 in ausreichender Menge und Qualität für die Verwendung im Mausmodell hergestellt werden konnte, gelang es nicht, eine homogene Population von MVA-Cor a 8 zu gewinnen, in der das Selektionsgen K1L nicht mehr vorhanden war. Parallel zur Virusherstellung wurden Mausmodelle der Sensibilisierung gegen Cor a 8 und Pen a 1 entwickelt. Vergleiche unterschiedlicher Mausstämme ergaben, dass sich Mäuse des Stammes CBA/J am empfänglichsten für eine systemische Sensibilisierung mit Cor a 8 sind. Aufgrund von Erfahrungen zur Sensibilisierung gegen Pen a 1 wurden Mäuse des Stammes C3H/HeJ bei der Etablierung eines Garnelenallergiemodells verwendet. Es zeigte sich, dass durch die intragastrale Applikation von 0,1 mg Pen a 1 sowie Choleratoxin als Adjuvanz (drei Gaben in dreiwöchigem Abstand), gefolgt von einer systemischen Gabe des Allergens mit Aluminiumhydroxid eine spezifische Sensibilisierung hervorgerufen werden konnte, die nach Exposition mit Pen a 1 zu allergischen Symptomen führte. Auch in diesem Modell bot die prophylaktische Immunisierung mit MVA-Pen a 1 Schutz vor Pen a 1spezifischer Sensibilisierung. Um die therapeutische Effektivität der Vakzine ermitteln zu können, muss die begonnene Etablierung eines Allergiemodells mit symptomauslösenden Provokationen und immunologischen Analysen weitergeführt werden. Der in dieser Studie beobachtete starke schützende Effekt einer Vakzinierung mit MVA vor allergischer Sensibilisierung und das sehr gute Sicherheitsprofil dieses Vektors in klinischen Studien zu anderen Erkrankungen belegt die Möglichkeit einer Verwendung von MVA zur erfolgreichen spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie.
Das Modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) entstand nach mehr als 500 Passagen des Chorioallantois Vacciniavirus Ankara (CVA) auf Hühnerembryofibroblasten. Mit der Passagierung ging u.a. der Verlust zahlreicher Vacciniavirus Virulenzfaktoren einher, wodurch MVA einen hochattenuierten Phänotyp aufweist. Bei mangelnder Pathogenität für humane Organismen verfügt das MVA jedoch über eine vollständig erhaltene Genexpression inklusive integrierter Fremdgene. Hierdurch bedingt ist MVA ein vielversprechender Kandidat nicht nur als Pockenimpfstoff der dritten Generation, sondern auch als Vektorvakzine gegen zahlreiche Infektionskrankheiten sowie in der Tumor-assoziierten Immunotherapie. Ein wesentliches Charakteristikum der Attenuierung von MVA ist seine fehlende Replikationsfähigkeit in humanen Zellen. Bislang ist es jedoch noch nicht möglich gewesen, die hierfür verantwortlichen genetischen Veränderungen eindeutig zuzuordnen. Vorangegangene Arbeiten wiesen darauf hin, dass sich der beschriebene Effekt zumindest teilweise auf die Zeitspanne zwischen zwei Vorläufern des MVA eingrenzen lässt. So zeigten sich humane HeLa Zellen für das CVA 152 permissiv, während gegenüber dem CVA 386 nur noch eine Semipermissivität bestand. Mit Hilfe einer vergleichenden Sequenzanalyse von CVA 152 und CVA 386 konnten verschiedene Deletionen identifiziert werden, deren Auftreten potentiell verantwortlich für den veränderten Phänotyp von CVA 386 ist. In diesem Zusammenhang wurden im Rahmen dieser Arbeit die Gene C12L, C14L, C15L und C16L der Deletion I und die Gene M1L, M2L und der OLR 037 der Deletion II charakterisiert. Durch Transfektion von Expressionsplasmiden wurden die entsprechenden Proteine bezüglich ihrer Expression und posttranslationalen Modifikation, sowie ihrer subzellulären Verteilung untersucht. So ließ sich für das Protein M2 eine posttranslationale N-Glykosylierung und die Lokalisation innerhalb des trans-medialen Golgiapparats nachweisen. Zusätzlich konnte eine Sekretion des M2 Proteins im Zellüberstand transfizierter 293T-Zellen gezeigt, sowie die bereits publizierte Inhibition der NF-:B-Aktivierung durch extrazellulär zugegebenes M2 Protein eingeleitet werden. Die Proteine C14 und C15 zeigten sich in der Laserscanmikroskopie mitochondrial lokalisiert; C16 dagegen kolokalisierte neben einer hauptsächlich intranukleären Verteilung zusätzlich mit F-Aktin. Ferner ergaben sich für die Proteine C14 und C15 erste Hinweise auf eine inhibitorische Funktion gegenüber Staurosporin-induzierter Apoptose.
In der Arbeit wird Fuzzy-Regression als mögliche ökonometrische Analysemethode bei fehlerbehafteten Daten modelliert und erprobt. Dazu ist die interpretatorische Lücke zu schließen, die einerseits zwischen den Datenproblemen in empirischen Datensätzen und ihrer Modellierung als Fuzzy-Daten und andererseits zwischen der Modellierung der Fehlereinflüsse in den Fuzzy-Daten und den Aussagen und Analysen besteht, die auf der Basis einer Fuzzy-Regression über die vorliegenden Daten getroffen werden können. Da bereits eine Vielzahl von Ansätzen zur Fuzzy-Regression entwickelt wurden, wird als das Hauptproblem nicht die Modellierung der Fuzzy-Methoden als solcher gesehen, sondern vielmehr die fehlende Vorstellung über die mögliche Bedeutung der Fuzzy-Modellierungen im konkreten Anwendungsfall. Die Arbeit vollzieht deshalb im Sinne einer Machbarkeitsstudie die verschiedenen Schritte von den Fehlereinflüssen in wirtschaftsbezogenen Datensätzen und deren Modellierung als Fuzzy-Daten bis hin zur explorativen Analyse mit Fuzzy-Regression nach. Dabei werden für jeden der Schritte exemplarische Beispiele ausgewählt, um die Denkweise der Fuzzy-Modellierung auszuarbeiten und die Möglichkeiten und Grenzen der Methoden aufzuzeigen. Die Untersuchungen zeigen, dass vor allem die Fuzzy-Modellierung von Fehlereinflüssen in den Merkmalsdaten und die Beschreibung von gleichförmigen Strukturen in den Fehlereinflüssen durch Fehlerszenarien als Analyseinstrumente geeignet sind, da sie eine Grundlage für eine weitergehende Untersuchung der Fehlereinflüsse bilden. Als Ausblick auf ein Schätzmodell für Fuzzy-Regression bei Fehlern in den Daten werden abschließend einige Ansätze für die Einbettung des Regressionsproblems für Fuzzy-Merkmalsvariablen in die Verteilungsmodelle für Fuzzy-Zufallsvariablen vorgestellt, die auf der Konstruktion der Fehlerszenarien basieren.
Ziel dieser Arbeit war es, zwei Atemtestverfahren in der Diagnostik der bakteriellen Fehlbesiedelung im Dünndarm bei Kindern mit Zystischer Fibrose miteinander zu vergleichen. Der moderne 13C-Xylose-Atemtest wurde dem bisher etablierten H2-Glukose-Atemtest gegenübergestellt. Dabei sollte zusätzlich die Suszeptibilität der CF-Patienten für eine IBF eruiert werden. Die Probanden absolvierten einen kombinierten 13C-Xylose-/H2-Glukose-Atemtest. Retrospektiv wurden zunächst die H2-Ergebnisse der einzelnen Probandengruppen analysiert und dann den maximalen PDR-, cPDR- und den DOB-Werten gegenübergestellt. Die Ergebnisse der aktuellen Studie sprechen für die Prädisposition der CF-Patienten, eine IBF zu entwickeln. Kliniker sollten aber bei der Interpretation der Atemtestergebnisse stets die beeinflussenden Faktoren, die vor allem die Erkrankung der Mukoviszidose mit sich bringt, berücksichtigen und therapeutische Konsequenzen vorsichtig umsetzen. So können die erhöhten Wasserstoffkonzentrationen im H2-Glukose-Atemtest bei CF-Kindern nicht ausschließlich einer IBF zugeschrieben werden. Die hohen Nüchternwerte sind auch Ausdruck der allgemeinen Maldigestion, Malabsorption und der intestinalen Motilitätsstörung, die bei diesen Patienten vorherrschen. Der 13C-Xylose-Atemtest lieferte in den Gruppen der Erwachsenen und Kinder ohne Zystische Fibrose repräsentative Ergebnisse, was für zukünftige Nutzung im Rahmen der Diagnostik einer IBF spricht. Bei heranwachsenden Kindern ist lediglich die altersabhängige endogene CO2-Produktion und orozökale Transitzeit zu berücksichtigen. Für die Diagnostik einer IBF speziell bei Patienten mit Mukoviszidose erscheint uns der 13C-Xylose-Atemtest nicht geeignet, was wir hauptsächlich der krankheitsspezifischen generellen Malassimilation, der Malabsorption und der intestinalen Motilitätsstörung zuschreiben. Wir beführworten daher aktuell weiterhin unter Berücksichtigung der ihn beeinflussenden Faktoren die Anwendung des H2-Glukose-Atemtests in der gastroenterologischen Diagnostik einer IBF wegen der einfachen, preiswerten und nichtinvasiven Anwendbarkeit. Weitere Studien sollen in Zukunft klären, ob der 13C-Xylose-Atemest trotz seiner hohen Kosten regelmäßig mit Nutzen im klinischen Alltag anzuwenden ist. Im Vergleich mit dem Goldstandard des Jejunalaspirates müssen Sensitivität und Spezifität des Isotopen-Atemtests in zukünftigen Studien erarbeitet werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Erkenntnisse über die Beeinflussung der Überlebensraten von Patienten mit Nierenzellkarzinom durch verschiedene Faktoren wie Tumorstadium und Tumorgröße, Differenzierungsgrad, Metastasierung und histologischer Subtyp zu gewinnen. Insbesondere soll die Frage geklärt werden, inwiefern die Prognose der Patienten von der Art der Diagnosestellung, also inzidentell oder symptomatisch, abhängt. Zu diesem Zweck wurden die Daten aller Patienten, die zwischen dem 01.01.1997 und dem 31.12.2005 in der urologischen Universitätsklinik in Frankfurt am Main mit der Verdachtsdiagnose eines Nierenzellkarzinoms radikal nephrektomiert bzw. teilreseziert worden sind, retrospektiv erhoben und analysiert. Die Patienten wurden entweder der asymptomatischen Gruppe zugeteilt, bei denen der Nierentumor zufällig diagnostiziert werden konnte oder der Gruppe bei der die Diagnose erst aufgrund einer auf den Nierentumor oder seine Metastasen hinweisenden Symptomatik gefunden werden konnte. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 50 Monate (1 bis 112 Monate). Insgesamt konnte die Diagnose Nierenzellkarzinom bei 246 (68,72 %) Patienten zufällig gestellt, nur 112 (31,28 %) präsentierten sich mit darauf hinweisender Symptomatik. Inzidentelle Tumoren waren signifikant kleiner als Symptomatische (4,8cm versus 6,8cm) und wiesen signifikant häufiger ein niedriges Tumorstadium (p<0,001) und eine günstigere Differenzierung auf (p<0,001). Zusätzlich kam es seltener zu Fernmetastasen sowie zum Befall regionaler Lymphknoten. Hinsichtlich der Verteilung von Alter und Geschlecht ergaben sich keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Therapeutisch ergaben sich in bezug auf die durchführbare Operationsart signifikante Unterschiede. Während bei immerhin 36,18% aller Patienten mit inzidentellen Tumoren eine Teilresektion durchgeführt werden konnte, war solch ein nierenerhaltendes Vorgehen nur bei 6,25% aller Patienten mit symptomatischen Tumoren möglich. Die Überlebenswahrscheinlichkeit erwies sich als signifikant besser für Patienten mit inzidentell diagnostizierten Tumoren (p<0,001), genauso wie für Tumoren mit besserem Differenzierungsgrad (p<0,001), günstigerem Staging (p<0,001) sowie geringerer Größe (p<0,001). In multivariater Analyse bestätigten sich nur Diagnoseart, Differenzierungsgrad und das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein von Metastasen als unabhängige prognostische Variablen. Patienten, bei denen der Tumor zufällig anhand einer Routineuntersuchung in völlig asymptomatischem Stadium gefunden werden kann, haben demnach eine signifikant bessere Überlebenswahrscheinlichkeit. Aus diesem Grund sowie aus der Tatsache heraus, dass bisherige Ergebnisse systemischer Therapien die Langzeitüberlebensrate der Patienten mit fortgeschrittenen Nierenzellkarzinomen meist nicht verbessern können, bleibt die Frage der Notwendigkeit einer Screeninguntersuchung weiter bestehen. Jede Möglichkeit einer frühzeitigen Diagnose sollte genutzt werden. Hier bietet sich insbesondere die Sonographie als kostengünstigstes und nicht invasives Verfahren an. Inwieweit die Empfehlung einer generellen und flächendeckenden Screeningmaßnahme sinnvoll ist, wird allerdings weiterhin anhand ihrer Kosteneffizienz beurteilt und kann deshalb beim Nierenzellkarzinom aufgrund der doch vergleichsweise geringen Prävalenz nicht ausgesprochen werden. Doch erscheint die Forderung sinnvoll, die Nieren im Rahmen abdominaler Sonographien aus nichturologischen Gründen immer mit zu untersuchen. Die kurze Zeit, die dies für den geübten Untersucher in Anspruch nimmt, ist tolerierbar; vor allem im Hinblick auf den Benefit, den diese Untersuchung für den Patienten haben kann. Ebenso sinnvoll und realistisch erscheint, dass jeder Urologe zumindest bei seinen Patienten in regelmäßigen Abständen die Nieren schallt oder es Ihnen zumindest als entgeltliche IGeL Leistung anbietet. Die Entdeckung eines Nierentumors in einem frühen asymptomatischen Stadium erscheint sowohl hinsichtlich der Therapie als auch ihrer Prognose am günstigsten zu sein.
Nach einer erfolgten Stammzelltransplantion im Rahmen einer Leukämie sollte in regelmäßigen Abständen der hämatopoetische Chimärismus untersucht werden, da ansteigende autologe Anteile einem Rezidiv häufig voran gehen. [33, 35-37] Es wurde in den letzten Jahren beschrieben [50, 52, 54, 55, 81], dass Sequenzpolymorphismen (SPs) als hochempfindliche Marker für die Chimärismusanalyse fungieren können. Durch sie würde eine deutlich höhere Sensitivität erzielt werden, als mit der bisher verwendeten Methode, die Short Tandem Repeats als Marker zur Diskriminierung von Spender und Empfänger benutzt. Ziel dieser Arbeit war es, die Proben von Kindern, die nach einer ALL eine Stammzelltransplantation erhalten hatten, und die bereits mit der STR-Methode untersucht worden waren, mit der RT-PCR-Methode in Hinblick auf die in der Einleitung gestellten Fragen, erneut zu analysieren. Es ist in 96 % der Empfänger-/Spenderpaare möglich unter den 29 ausgewähltenten SPs mindestens einen geeigneten Marker zu finden und sicherlich wäre es möglich noch weitere Sequenz-Polymorphismen hinzu zu nehmen, falls die Informativität der 29 verwendeten nicht ausreichend ist. Es konnte in fast allen Experimenten eine Sensitivität von 0,1 % erreicht werden, mit zunehmender experimenteller Erfahrung immer zuverlässiger, so dass man inzwischen ein Experiment, bei dem diese Sensitivität nicht erreicht wird, wiederholen würde. Durch eine Vereinfachung der Methode mit einem optimierten Primerscreening, universellen Standardreihen und dem Einsatz von einer definierten Menge DNA-Lösung, die zumindest über einen weiten Bereich unabhängig ist von der enthaltenen Konzentration, lässt sich eine Laborroutine entwickeln, die ähnlich zeitaufwändig ist, wie der jetzige Goldstandard, die STR-Methode. Allerdings ist die RT-PCR-Methode derzeit noch deutlich teurer. In dieser Arbeit zeigt sich, dass die Real-Time PCR mit Sequenz Polymorphismen als genetische Marker eine sehr sensitive Methode zur Erfassung autologer Anteile darstellt und in der praktischen Anwendbarkeit mit der bisherigen PCR-Methode mit Short Tandem Repeats zur Differenzierung vergleichbar ist. Häufig lassen sich autologe Signale früher detektieren. Dadurch werden auch mehr Patienten als gefährdet eingestuft. Vor allem Patienten, die zweimal oder öfter in Folge einen gemischten Chimärismus von größer als 0,5 % aufweisen (und sich nicht in der Phase eines abnehmenden Chimärismus befinden) müssen genau beobachtet und engmaschig kontrolliert werden. Bei einer ansteigenden Dynamik ist es häufig sinnvoll, eine Immuntherapie einzuleiten. Nur bei zwei unserer Patienten verschwanden die autologen Signale von alleine wieder. Bei 50 % der Rezidivpatienten und bei 2 der 3 Patienten, die abgestoßen haben, sieht man mit der RT-PCR-Methode früher autologe Signale. Es wäre jetzt in einem nächsten Schritt nötig, bei einem ausreichend großen Patientenkollektiv beide Methoden parallel in einer prospektiven Studie miteinander zu vergleichen.
Hintergrund: Die häufigsten infektiösen Ursachen für Durchfallerkrankungen sowohl im Kindes- als auch im Erwachsenenalter sind viraler Genese. Dabei werden Rota-, Noro-, Adeno- und Astroviren in absteigender Reihenfolge benannt. Die Diagnose der oft nosokomialen Infektionen erfolgt durch Virusnachweis in Stuhlproben. Material und Methodik: In dieser retrospektiven epidemiologischen Auswertung wurden anhand der Stuhlproben von Gastroenteritispatienten im Zeitraum 2000 – 2008 die Häufigkeitsverteilung der einzelnen Viren sowie saisonale Aspekte untersucht. Bestimmt wurden des Weiteren die Geschlechts- und die Altersverteilung der Patienten. Der überwiegende Anteil der eingesandten Proben entstammte der Universitätsklinik Frankfurt/Main; hinzu kamen Proben von einigen in näherer Umgebung liegenden Gesundheitsämtern, Krankenhäuser und Laborarztpraxen. Ergebnisse: Die laborchemische Effizienz beträgt ca. 10 – 20 %. In Deutschland ist die winterliche Rotavirusinfektion bei Kleinkindern die häufigste Ursache des Brechdurchfalls. An zweiter Stelle stehen im Wechsel Adeno- und Norovirusinfektionen, während Astrovirusinfektionen in den letzten Jahren selten geworden sind. Schlussfolgerung: In Übereinstimmung mit neuen Studien aus anderen Regionen wird belegt, dass Noroviren des Typ 2 heute einen wesentlichen Anteil bei der infektiösen Gastroenteritis stellen und – im Unterschied zu Rotaviren – vor allem ältere Menschen betroffen sind.
Die vorliegende Arbeit analysierte die Behandlung von Patienten mit Infektionserkrankungen am Zentrum der Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde des Klinikums der Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt am Main (Carolinum). Dabei wurde vor allem untersucht, welche Auswirkungen die Reduzierung von Personalressourcen speziell für die Behandlung dieser Patienten ab dem Jahr 2000 hinsichtlich der Betreuung und Versorgung hatte. Die Studie war retrospektiv angelegt und wertete Daten aus den Jahren 1998 bis 2002 aus. Hierfür wurden alle im Archiv lagernden Karteikarten herangezogen und die Daten in eine dafür entwickelte FilemakerPro©-Datenbank übertragen. Im Untersuchungszeitraum nahmen 940 Patienten mit Infektionskrankheiten etwa 3700 Besuche wahr. Regelmäßig erschienen 25% der Patienten, auf sie entfielen 60% aller Besuche. Diese Gruppe wurde einer näheren Betrachtung unterzogen: Die Auswertung der erhobenen Daten zeigte, dass das Ziel der Absenkung der Patientenzahlen und die Anzahl der Behandlungstermine erreicht werden konnte, die systematische Betreuung der Patienten sich jedoch verschlechterte. Der Anteil der sanierten Patienten sank von 34% auf 18% ab, die Zahl der unsystematisch behandelten Patienten verdreifachte sich dagegen von 1999 auf 2000 und blieb bei diesem hohen Wert. Vorsorgebehandlungen nahmen maximal ein fünftel aller Behandlungen ein, mit abnehmender Systematik sank dieser Anteil gegen null. Begünstigender Faktor für eine Sanierung waren ein erstelltes OPG (ersatzweise ein Zahnfilmstatus) und die Erstellung einer Behandlungsplanung. Das Vorhandensein eines OPGs erhöhte aber nicht die Wahrscheinlichkeit für eine folgende Behandlungsplanung. Patienten die an das Carolinum von außerhalb überwiesen wurden, hatten eine größere Chance auf eine Sanierung. Letztlich wurden nur 4% aller regelmäßig erschienenen Patienten systematisch mit Recall betreut, zahnärztlich saniert wurden insgesamt jedoch 30% der behandelten Patienten. Entgegen allgemeiner Annahmen waren kurzfristig abgesagte oder nicht eingehaltene Termine die Ausnahme.
Der katheterinterventionelle Verschluss des persistierenden Foramen ovale ist heutzutage ein sicher durchzuführender Eingriff zur Sekundärprophylaxe einer paradoxen Embolie. Mit den derzeit zur Verfügung stehenden Verschlusssystemen werden komplette Verschlussraten von 86 % – 96 % erreicht. Mehrere Studien konnten zeigen, dass das Vorliegen eines Restshunts das Auftreten von erneuten paradoxen Embolien begünstigt. Mehrere Therapieoptionen für Patienten mit Restshunt stehen zur Verfügung: eine Operation mit Entfernung des PFO-Okkluders und Naht- oder Patchverschluss des PFO, eine medikamentöse Prophylaxe mit Thrombozytenaggregationshemmern oder oralen Antikoagulanzien sowie die Implantation eines zweiten Okkluders. Ziel dieser Arbeit war die Beurteilung der Wirksamkeit und Sicherheit der perkutanen Implantation eines zweiten Verschlusssystems bei Patienten mit mittlerem oder großem Restshunt. Zwischen Oktober 1997 und April 2008 wurde in unserem Zentrum bei 40 Patienten mit einem durchschnittlichen Alter von 51 ± 13 Jahren der katheterinterventionelle Verschluss eines Restshunts mit verschiedenen Verschlusssystemen versucht. Von den Patienten waren 22 weiblich und 18 männlich. Die Implantation eines zweiten Okkluder war bei 39 Patienten erfolgreich (98%). Nur bei einem Patienten war es nicht möglich den Restdefekt mit einem Katheter zu sondieren. Folgende Schirme wurden als Zweitokkluder implantiert: ein Premere-Okkluder bei 20 Patienten (51%), ein Amplatzer-Okkluder bei 13 Patienten (33%), ein STARFlex-Okkluder bei vier Patienten (10%), ein Helex-Okkluder bei einem Patienten (2,5%) und ein Angelwings-Okkluder bei einem Patienten (2,5%). Die mittlere Durchleuchtungszeit aller Eingriffe betrug 8,6 ± 8,6 Minuten. Während der Eingriffe und innerhalb von 30 Tagen nach Implantation eines zweiten Okkluders traten keine Komplikationen auf. Die Patienten wurden im Mittel 36 ± 29 Monate nachbeobachtet. In dieser Zeit wurde bei allen Patienten mindestens sechs Monate nach dem Eingriff eine transösophageale Echokardiographie mit Shuntdiagnostik durchgeführt. Hierbei zeigte sich bei 27 von 39 Patienten (69%) ein kompletter Verschluss des PFO. Bei neun Patienten verblieb nur noch ein kleiner Restshunt, bei einem Patienten ein mittlerer Restshunt und bei weiteren zwei Patienten ein großer Restshunt. Der Patient mit mittlerem Restshunt und ein Patient mit einem großen Restshunt erhielten einen dritten Okkluder. Letzterer verstarb 21 Tage nach Implantation des dritten Okkluders an einer akuten Perikardtamponade. Eine Patientin mit großem Restshunt entschied sich für eine Operation. Neben dem oben beschriebenen Todesfall nach Implantation eines dritten Okkluders traten während des ganzen Nachbeobachtungszeitraums keine weiteren Komplikationen auf. Diese Arbeit zeigt, dass die perkutane Implantation eines zweiten PFO-Okkluders sicher und technisch problemlos möglich ist. Ein kompletter Verschluss konnte in der Mehrzahl der Patienten erreicht werden. Außer einem Todesfall durch eine akute Perikardtamponade nach Implantation eines dritten Okkluders traten sowohl während den Eingriffen als auch im weiteren Verlauf keine Komplikationen auf.
Methylphenidat ist ein Dopaminreuptakehemmer, der in seiner chemischen Struktur dem Amphetamin ähnlich ist. Klinisch wird es in der Behandlung des juvenilen Aufmerksamkeitsdefizit-Syndroms (ADHS) eingesetzt. Aber auch eine steigende Anzahl Erwachsener, die am ADHS leiden, profitiert von dessen therapeutischen Wirkungen. Bei gleichzeitiger Einnahme von Methylphenidat und Ethanol wird aus beiden der aktive Metabolit Ethylphenidat gebildet. Zur Charakterisierung der pharmakokinetischen Eigenschaften von Methylphenidat bei gleichzeitiger Ethanolaufnahme, wurden Untersuchungen zum in-vitro Metabolismus in humanem Leberhomogenat und ein von der Ethikkommission und der Bundesbehörde genehmigter Probandenversuch nach AMG durchgeführt. Dabei wurden drei verschiedene Konditionen mit variierter Einnahmereihenfolge der Prüfsubstanzen bei 9 gesunden männlichen Probanden untersucht, die die alleinige Aufnahme von Methylphenidat (20 mg), die Aufnahme von Methylphenidat (20 mg) 30 Minuten nach Ethanolaufnahme (Wein bis zu einer BAK von ca. 0,8 ‰) und die Einnahme von Methylphenidat (20 mg) 30 Minuten vor Ethanolaufnahme (Wein bis zu einer BAK von ca. 0,8 ‰) beinhalteten. Blutproben wurden über einen Messzeitraum bis zu 7 h entnommen und durch eine neu entwickelte validierte Methode mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Flugzeitmassenspektrometrie (LC-TOF) analysiert. Die in-vitro Versuche zeigten, dass nur in Gegenwart von Leberenzymen Ethylphenidat gebildet wurde, bei alleiniger Inkubation von Methylphenidat und Ethanol in Puffer konnte die Bildung von Ethylphenidat nicht nachgewiesen werden. In-vitro zeigten die Leberenzyme außerdem für die Ethylphenidatbildung eine Sättigung durch hohe Konzentration von Methylphenidat (Sättigung ab 0,7 mg/l) und Ethanol (Sättigung ab 5,3 g/L), die durchaus in der Anflutungsphase nach Medikamentenaufnahme in der Leber vorliegen können. Der Metabolismus zu Ritalinsäure wurde durch Ethanol deutlich gehemmt. Die enzymatische Reaktion war außerdem signifikant (p < 0,01) durch Natriumfluorid hemmbar. Bei zusätzlicher Inkubation mit Kokain (äquimolar zu Methylphenidat), konnte ebenfalls eine signifikant Verringerung der Bildung (p < 0,01) von Ethylphenidat und Ritalinsäure gezeigt werden. Dies gab einen Hinweis auf das am Metabolismus beteiligte Enzym, die humane Carboxylesterase 1A, die den Metabolismus von Kokain katalysiert. Außerdem konnte eine geringfügige Bildung von Ethylphenidat bei Inkubation von Methylphenidat und Ethanol in Serum gezeigt werden, die über eine durch Fluorid hemmbare Esterase katalysiert wurde. Im Probandenversuch fand sich in Kombination mit Ethanol ebenfalls die Bildung von Ethylphenidat. Die Konzentrationen lagen im Bereich von 0,3-3,2 mikro g/l. Methylphenidat wurde im Bereich von 4,6-28,6 mikro g/l und Ritalinsäure in einem Bereich von 187-442 mikro g/l nachgewiesen, was sich mit Ergebnissen anderer Studien deckt. Aus den quantitativen Daten wurden die pharmakokinetischen Parameter nach Einkompartimentmodell ermittelt. Für Methylphenidat wurden dabei anders als bei Kokain, bei dem sich nach Ethanolaufnahme die Wirkstoffkonzentrationen signifikant erhöhen, keine signifikanten Unterschiede bei Vergleich der 3 untersuchten Konditionen festgestellt, obwohl sich tendenziell höhere Wirkstoffkonzentrationen bei Einnahme zusammen mit Ethanol zeigten. Die Ethanolgabe vor anstatt nach Methylphenidateinnahme verzögerte die Ritalinsäurebildung (tmax 2,6 vs. 1,8 h) und im Vergleich zu der Einnahme von Methylphenidat ohne Ethanol lagen die maximalen Werte (Cmax) signifikant niedriger. Bezüglich Ethylphenidat konnte eine Erhöhung (p < 0,05) der Cmax und der Area under the curve gefunden werden, wenn Alkohol vor Methylphenidat eingenommen wurde. Im Vergleich zu Kokain, das fast 1:1 zu Kokaethylen umgesetzt wird, konnte Ethylphenidat aber nur in Spuren nachgewiesen werden. Ein Proband zeigte neben hohen Methylphenidatkonzentrationen (> 25 ng/ml) niedrige Ritalinsäurekonzentrationen (< 90 ng/ml) bei normaler Ethylphenidatbildung, was auf eine Hemmung des Methylphenidatmetabolismus bezüglich der Hydrolyse zu Ritalinsäure hindeutete. Dieser Proband wurde als „poor metabolizer“ klassifiziert. Von Kokaethylen ist bekannt, dass es bei verlängerter Halbwertszeit eine ähnlich ausgeprägte Wirkung wie Kokain besitzt. Die Eliminationshalbwertszeit von Ethylphenidat war dagegen deutlich kürzer als die von Methylphenidat (1,5 vs. 2,6 h). Die Pharmakodynamik von Ethylphenidat wurde in der Studie nicht erfasst, aus den subjektiven Berichten der Probanden ergaben sich jedoch keine deutlichen Unterschiede in der Medikamentenwirkung bei gleichzeitigem Konsum von Ethanol und Methylphenidat im Vergleich zur alleinigen Methylphenidateinnahme.
LINE-1-Retrotransposons sind für die Entstehung von über 35 % des menschlichen Genoms verantwortlich. Während ihre Aktivität entscheidend zur Evolution von Säugetieren allgemein und des Menschen im Speziellen beigetragen hat, kann die L1-Expression und die L1-vermittelte Retrotransposition schädigende Auswirkungen für die Wirtszelle haben (Goodier und Kazazian, 2008). Die Liste der dokumentierten, durch L1-Aktivität hervorgerufenen Erkrankungen umfasst gegenwärtig ca. 65 Fälle von genetischen bzw. Tumorerkrankungen und wird immer länger. Um die Anzahl schädigender L1-Retrotranspositionsereignisse zu minimieren, hat der menschliche Organismus Strategien entwickelt, um die L1-Retrotransposition zu kontrollieren. Eine dieser Strategien ist die Inhibition der L1-Aktivität durch Mitglieder der APOBEC-Proteinfamilie, wobei deren jeweilige Mechanismen der L1-Inhibition gegenwärtig noch nicht aufgeklärt sind. Es war daher das Ziel dieser Arbeit, Einblicke in die Mechanismen der Hemmung der L1-Retrotransposition durch Mitglieder der Familie der humanen APOBEC3-Proteine zu bekommen, wobei eine Fokussierung auf den durch APOBEC3C vermittelten Mechanismus vorgenommen wurde. Aufbauend auf kürzlich publizierte Daten zur Hemmung der L1-Retrotransposition durch die APOBEC3-Proteine A3A, A3B, A3C und A3F (Bogerd et al., 2006; Chen et al., 2006; Muckenfuss et al., 2006) wurde eine Arbeitshypothese entwickelt, welche die L1-Inhibition durch APOBEC3-vermittelte Deaminierung von Cytosinen der L1-cDNA unter der Beteiligung von Faktoren des „Base Excision Repair“-Weges erklärt. Diese Arbeitshypothese steht im Einklang mit der Abwesenheit nachweisbarer G-zu-A-Hypermutationen von L1-Kopien wie sie für die APOBEC3-spezifische Deaminaseaktivität charakteristisch sind, sowie mit der Existenz 5’-verkürzter genomischer L1-Kopien. Die Ergebnisse aus in silico-Analysen der 5’-Enden von 38 L1-Neuinsertionen aus Zellkulturexperimenten, die in Anwesenheit von endogen exprimiertem A3B, A3C und A3H retrotransponiert waren, sowie von 885 genomischen, endogenen L1-Kopien waren in Übereinstimmung mit unserer Arbeitshypothese, da in beiden Fällen Guanin als erste fehlende L1-Nukleobase am L1-5’-Ende statistisch signifikant überrepräsentiert vorliegt. Während für die Inhibition von L1 durch A3A dessen Deaminaseaktivität notwendig ist, wurde gezeigt, dass A3C die L1-Retrotransposition über einen deaminaseunabhängigen Mechanismus hemmt. Die L1-Inhibition durch A3C erforderte sowohl eine funktionelle Dimerisierungsdomäne als auch eine intakte RNA-Bindedomäne. Die Identifizierung von A3C und L1-ORF1p in derselben Saccharosegradientenfraktion sowie die Kolokalisation beider Proteine im Zytoplasma von HeLa- bzw. 143B-Zellen sprechen für eine Interaktion von A3C mit L1-ORF1p bzw. L1-RNPs. Da eine direkte Interaktion von A3C und L1-ORF1p mittels Immunopräzipitation nicht nachgewiesen werden konnte, spricht dies dafür, dass die Interaktion nicht auf einen direkten Kontakt zwischen A3C und L1-ORF1p beruht. Eine direkte Interaktion zwischen A3A und L1-ORF1p konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Vielmehr spricht die Abhängigkeit der A3C-vermittelten Hemmung von der intakten RNA-Bindedomäne, experimentelle Daten, welche eine Interaktion mit L1-RNPs vorschlagen, sowie die Kolokalisation von A3C und L1-ORF1p im Zytoplasma für eine Sequestrierung der L1-RNPs, die Behinderung des nukleären Imports der L1-RNPs oder aber eine Blockierung der TPRT-Initiation als mögliche Mechanismen der A3C-vermittelten Hemmung der L1-Retrotransposition.
Zur genomweiten Genexpressionsanalyse werden Microarray-Experimente verwendet. Ziel dieser Arbeit ist es, Methoden zur Präprozessierung von Microarrays der Firma Affymetrix zu evaluieren und die VSN-Methode für Experimente mit weniger als 1000 Zellen zu verbessern. Bei dieser Technologie wird die Expression jedes Gens durch mehrere Probessets gemessen. Jedes Probeset besteht aus einem Perfect-Match (PM) und einem dazugehörigen Mismatch (MM). Der Expressionswert pro Gen wird durch ein vierstufiges Verfahren aus den einzelnen Probe-Werten berechnet: Hintergrundkorrektur, Normalisierung, PM-Adjustierung und Aggregation. Für jeden dieser Schritte existieren mehrere Algorithmen. Dazu dienten die im affy-Paket des Bioconductor implementierten Methoden MAS5, RMA, VSN und die Methode sRMA von Cope et al. [Cope et al., 2006] in Kombination mit der Methode VSN von Huber et al. [Huber et al., 2002]. Den ersten Teil dieser Arbeit bildet die Reanalyse der Datensätze von Küppers et al. [Küppers et al., 2003] und Piccaluga et al. [Piccaluga et al., 2007] mit der VSN-Methode. Dabei konnte gezeigt werden, dass die VSN-Methode gegenüber Klein et al. [Klein et al., 2001] Vorteile zeigt. Bei beiden Datensätzen wurden zusätzliche Gene gefunden, die für die Pathogenese der jeweiligen Tumorarten wichtig sein können. Einige der zusätzlich gefunden Gene wurden durch andere wissenschaftliche Arbeiten bestätigt. Die Gene, die bisher in keinem Zusammenhang mit der untersuchten Tumorart stehen, sind eine Möglichkeit für die weitere Forschung. Vor allem der Zytokine/Zytokine Signalweg wurde bei beiden Reanalysen als überrepräsentiert erkannt. Da für einige Microarray-Experimente die Anzahl der Zellen und damit die Menge an mRNA nur begrenzt zur Verfügung stehen, müssen die Laborarbeit und die statistischen Analysen angepasst werden. Hierzu werden fünf Methoden für die Präprozessierung untersucht, um zu evaluieren, welche Methode geeignet ist, derartige Expressionsdaten zu verrechnen. Auf Basis eines Testdatensatzes der bereits zur Etablierung des Laborprozesses diente werden Expressionswerte durch empirische Verteilung, Gammaverteilung und ein linear gemischtes Modell simuliert. Die Simulation lässt sich in vier Schritte einteilen: Wahl der Verteilung, Simulation der Expressionsmatrix, Simulation der differentiellen Expression, Sortierung der Probes innerhalb des Probesets. Anschließend werden die fünf Präprozessierungsmethoden mit diesen simulierten Expressionsdaten auf ihre Sensitivität und Spezifität untersucht. Während sich bei den empirisch und gammaverteilt simulierten Expressionsdaten kein eindeutiges Ergebnis abzeichnet, hat sVSN bei den Daten aus dem linear gemischten Modell die größte Sensitivität und die größte Spezifität. Der in dieser Arbeit entwickelte sVSN-Algorithmus wurde zum ersten Mal angewendet und bewertet. Abschließend wird ein Teildatensatz von Brune et al. verwendet und hinsichtlich der fünf Präprozessierungsmethoden untersucht. Die Ergebnisse der sVSN-Methode wird im Detail weiter verfolgt. Die zusätzlich gefunden Gene können durch bereits veröffentlichte Arbeiten bestätigt werden. Letztendlich zeigt sich, dass neuere statistische Methoden (wie das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte sVSN) bei der Analyse von Affymetrix Microarrays einen Vorteil bringen. Die sVSN und sRMA Methoden zeigen Vorteile, da die Probes nach der Normalisierung gewichtet werden, bevor diese aggregiert werden. Die MAS5-Methode schneidet am schlechtesten ab und sollte bei geringen Zellmengen nicht eingesetzt werden. Für die Analyse mit geringer Menge an mRNA müssen weitere Untersuchungen vorgenommen werden, um eine geeignete statistische Methode für die Analyse der Expressionsdaten zu finden.
In Anbetracht der Bedeutung einer Metastasierung eines Mamma- Karzinoms in Hinblick auf Therapie und Prognose der Patientin ist es von Bedeutung, möglichst sensitive und spezifische Methoden zum frühzeitigen Nachweis von Metastasen anzuwenden. Nach wie vor stehen diesbezüglich radiologische Verfahren an erster Stelle, sind jedoch mit einer Reihe von Nachteilen behaftet. Aufgrund dieser Tatsache wurden in einer Vielzahl von Studien eine Reihe von Knochenmarkern bezüglich ihrer Aussagekraft beim metastasierten Mamma- Karzinom untersucht. Der Knochenmarker Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid wird im Rahmen der Kollagensynthese beim Knochenaufbau freigesetzt und erlaubt somit Rückschlüsse auf den Knochenstoffwechsel. Inwieweit die Werte von Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid einen veränderten Knochenstoffwechsel beim metastasierten Mamma- Karzinom repräsentieren, war Ziel dieser Studie. Zu diesem Zweck wurden die Serum Proben von 80 Patientinnen mit Mamma- Ca untersucht. Die Bestimmung der Werte für den Knochenmarker Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid erfolgte mit Hilfe des ElektroChemiLumineszenz Immuno Assay „ECLIA“ von Roche Diagnostics. Um die Aussagekraft des Markers weiter zu bestimmen, erfolgte eine Unterteilung des Patientenkollektivs in Patientinnen prä- und postmenopausal. Die Werte für Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid wurden nun bezüglich ihrer Relation zum Ausmaß der Metastasierung weiter untersucht. Im Rahmen dieser Studie konnte ein Zusammenhang zwischen der Höhe der Prokollagen Typ I aminoterminales Propetid Werte und einer Knochenmetastasierung aufgezeigt werden. Dennoch scheint der Knochenmarker Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid aufgrund unterlegener Spezifität und Sensitivität nicht geeignet, herkömmliche Methoden zum Nachweis von Knochenmetastasen zu ersetzen. Es ist jedoch denkbar, die Bestimmung von Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid als zusätzliche Methode zur Einschätzung und Überwachung der Entwicklung von Knochenmetastasen einzusetzen.
Hintergrund und Fragestellung: Die Studie untersucht den Einfluss von Propofol im Vergleich zu Midazolam als Sedativum bei der Ösophagogastroduodenoskopie (ÖGD) im Hinblick auf die psychomotorischen Funktionen von Patienten mit Leberzirrhose und einer minimalen hepatischen Enzephalopathie (HE). Patienten und Methoden: Patienten mit einer Leberzirrhose ohne Zeichen einer klinisch manifesten HE wurden einer ÖGD in therapeutischer Absicht (Ösophagusvarizenligatur) unterzogen. Insgesamt 60 Patienten wurden randomisiert, entweder um Propofol (n = 40) oder Midazolam (n = 20) als Sedativum für die Endoskopie zu erhalten. Die beiden Gruppen waren hinsichtlich ihres Alters, Geschlechts und des Child-Stadiums der Leberzirrhose vergleichbar. Alle Patienten absolvierten zweifach eine psychometrische Testung, den sog. PSE-Syndrom-Test (der u.a. einen Zahlenverbindungstests (ZVT) beinhaltet), einmal vor und 2 Stunden nach Beendigung der Endoskopie. Die Art (diagnostisch/therapeutisch) und Dauer der Endoskopie waren ebenfalls in beiden Gruppen vergleichbar. Die zur Durchführung der Testbatterie benötigten Zeiten als auch der ermittelte PSE-Score wurden dokumentiert. Die Basisdaten vor Endoskopie wurden mit den nach der Endoskopie erzielten Ergebnissen verglichen. Die Aufwachzeit und -qualität nach der Sedierung wurden mit dem sog. Post-Anesthesia Recovery Score (PARS) ermittelt und dokumentiert. Zum Vergleich wurden die psychometrischen Tests auch bei einer „Kontroll-Gruppe“ von 20 lebergesunden Patienten erhoben, welche ebenfalls im Abstand von 2 Stunden evaluiert wurden, ohne sich jedoch einer Endoskopie oder Sedierung zu unterziehen. Ergebnisse: Sowohl die Unterschiede der Zeiten der Durchfürhung des ZVT-A vor und nach Sedierung (mediane delta-Zeit Propofol-Gruppe, -9,5 sec [95 % KI, -15,7 bis -4,6 sec] und Midazolam-Gruppe, 11 sec [95 % KI, -1,2 bis 16,1 sec], p = 0,0021), und auch der mediane delta-PSE-Score (Propofol-Gruppe, 1 [95% KI, 0,5 bis 1,5] und Midazolam-Gruppe, -1 [95 % KI, -1,5 bis 0,2], p = 0,0009) waren in der Propofol-Gruppe signifikant besser. Darüber hinaus war die Aufwachzeit und -qualität bei der Propofol-Gruppe im Vergleich zur Midazolam-Gruppe signifikant günstiger (7,8 ± 2,9 min, vs. 18,4 ± 6,7 min; PARS 6,1 ± 1,1 vs. 8,2 ± 1,3; beide p < 0,001). Folgerungen: Der Gebrauch von Propofol im Rahmen der endoskopischen Sedierung ist mit gewissen Gefahren, wie z.B. kardio-respiratorischen Nebenwirkungen, assoziiert und macht ein intensives Monitoring erforderlich. Allerdings verursacht Propofol keine akute Verschlechterung der psychomotorischen Funktionen bei Patienten mit Leberzirrhose und minimaler hepatischer Enzephalopathie. Darüber hinaus ist die Aufwachzeit verkürzt und die Qualität des Aufwachens bzw. der Erholung nach der Sedierung signifikant verbessert. Bei Patienten mit Leberzirrhose sollte Propofol daher bevorzugt gegenüber Midazolam zur Sedierung verwendet werden.
Feministische Politik in der Türkei ist das Ergebnis von jahrelangen, politischen Kämpfen, Aushandlungsprozessen, Verhandlungen und umkämpften Strategien der feministischen Bewegung in einer politischen Gesellschaft und Öffentlichkeit, die durch eine hegemoniale Männlichkeit gekennzeichnet ist. Die politischen Praktiken und die frauenpolitischen Artikulationen der feministischen Bewegung stützen sich auf wertvolle Ressourcen, wie feministische Wissensaneignung, feministischen Aktivismus und die Sammlung von Erfahrungen in einer langjährigen, politischen Auseinandersetzung mit den patriarchalen, männerbündischen und männlichhegemonialen Gesellschaftsstrukturen in der Türkei. Dass die feministische Bewegung hierbei auch ein Potential für eine gesamtgesellschaftliche, demokratiefördernde und emanzipatorisch-transformierende Bewegung aufweist, liegt auf der Hand. Politischoppositioneller Radikalismus und fundamentale Gesellschafts- und Demokratiekritik sind politische Charakteristiken der feministischen Bewegung, die sie als eine der emanzipatorischsten sozialen Bewegungen in der Türkei seit den 1980ern in die politische Gesellschaft trägt. Die gegenwärtigen feministischen Debatten über die vermeintliche "NGOisierung" der feministischen Bewegung, den "Projektfeminismus" (vgl. Sirman 2006; Üstündag 2006; Bora 2006; Yalcin 2006; Hacivelioglu 2008), die Bündnisse mit staatlichen Institutionen und Akteuren bzw. Akteurinnen und den dadurch eingetretenen Verlust der ihr "einst" innewohnenden, gesamtgesellschaftlichen Radikalität (vgl. Mutluer 2007a; Üstün 2007a; Coban 2008) sind in Anbetracht der politischen Dynamik und Wirkungsmacht, die sich die feministische Bewegung seit 2000 wieder aneignen konnte, notwendige Auseinandersetzungen um eine politische "Neupositionierung" in der politischen Gesellschaft und der sich verändernden politischen Konjunktur in der Türkei. ...
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der auf die Regulation des Gleichgewichts der Haut einwirkt. Ein NO produzierendes Enzym in der Haut ist die endotheliale NO- Synthase, deren Aktivität unter anderem durch Caveolin-1 und das 2002 von Zimmermann et al. neu identifizierte Protein Nostrin (=eNos traffic inducer) reguliert wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang der immunhistologische Nachweis von Nostrin in menschlicher Haut und in den Zellkulturlinien von HaCaT, Melanozyten, HEK und G361. In allen 138 Gewebeproben gesunder und kranker menschlicher Haut wurde Nostrin immunhistologisch mit einem polyklonalen Nostrin Antikörper und immunhistologischer Polymere in der Epidermis nachgewiesen. In gesunder Haut (14 Präparate) war Nostrin in allen Schichten der Epidermis gleichmäßig entweder homogen oder punktförmig verteilt. Bei den histologischen Schnitten von Patienten, die an Psoriasis (20 Präparate) und atopischer Dermatitis (22 Präparate) litten, kam es zu einem Verlust von Nostrin in den basalen Schichten der Epidermis und einer Anreicherung in den oberen Schichten. Zusätzlich lagen das punktförmige und homogene Färbemuster parallel vor, wobei das Stratum granulosum bevorzugt punkförmig und alle anderen Schichten bevorzugt homogen angefärbt waren. Bei den Schnitten von Patienten, die an einer aktinischen Keratose (15 Präparate) oder Morbus Bowen (20 Präparate) litten, war eine ähnliche Veränderung gegenüber der gesunden Haut wie bei den entzündlichen Dermatosen zu beobachten. Bei entzündlichen Dermatosen und Präkanzerosen liegt eine Proliferations- und Differenzierungsstörung vor, so dass Nostrin möglicherweise diese entweder mit beeinflusst oder durch diese beeinflusst wird. Tumorzellen von spinozellulären Karzinomen (SCC) (18 Präparate), Basalzellkarzinomen (BCC) (12 Präparate) und malignen Melanomen (MM) (17 Präparate) enthielten scheinbar weniger Nostrin als nicht entartete Zellen. Insgesamt waren die SCC mit einem Mittelwert von 54% und einem Median von 63,5% gegenüber den BCC mit einem Mittelwert von 30% und einem Median von 33% und den MM mit einem Mittelwert von 7,8% und einem Median von 5% am Nostrin reichsten. Es ist bekannt, dass NO an der Entartung von Zellen beteiligt sein kann, denn es hat sowohl einen fördernden als auch einen hemmenden Effekt auf die Tumorzellbiologie (Weller et al. 2002, Xu et al. 2002). Die immunhistologische Färbung der Dermis zeigte, dass das kollagene Bindegewebe kein Nostrin aufweist und dass Haarschäfte, Schweiß- und Talgdrüsen Nostrin reich sind. Gefäße zeigten entgegen den Beobachtungen an Endothelzellkulturen nur eine sehr geringe Expression von Nostrin. In den vier Zellkulturen konnte mit einem monoklonalen Nostrin Antikörper und einem Fluoreszenz gekoppelten Zweitantikörper Nostrin nachgewiesen werden. Die Keratinozytenzelllinie HaCaT wies sehr viel Nostrin auf, das vesikulär oder filamentartig verteilt war. Bei der Tumorzelllinie HEK war viel weniger Nostrin sichtbar. Auch die Melanozyten und Melanomzellen (G361) enthielten weniger Nostrin als HaCaT. Die Beobachtungen entsprechen den Ergebnissen der Schnittpräparate von gesunder und kranker Haut. Die vier Zelllinien wurden zusätzlich mit einem polyklonalen Antikörper gegen Caveolin-1 angefärbt. Caveolin-1 konnte in allen vier Zelllinien nachgewiesen werden und kolokalisiert partiell mit Nostrin an Vesikeln im perinukleären Raum. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass Nostrin auch in der Haut Einfluss auf die NO Produktion hat und somit an der Pathologie der Hautkrankheiten mitbeteiligt sein kann.
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei motivationale Erklärungsmodelle, Zielorientierungen und das kognitiv-motivationale Prozessmodell, im Rahmen des selbstregulierten Lernens integriert. Selbstregulationsprozesse sind nach Carver und Scheier (1981) zyklisch angelegt. Zu den Bestandteilen der Selbstregulation gehören nach Boekaerts (1999)Regulation der Informationsverarbeitung, Regulation des Lernprozesses und Regulation des Selbsts. Auf dieser Ebene sind die Zielorientierungen angesiedelt. In dieser Arbeit das 2 x 2 Modell von Elliot und McGregor (2001) herangezogen. Es berücksichtigt zwei Dimensionen, die Valenz (Annäherungs- und Vermeidungskomponente) und die Kompetenz (Vergleichsmaßstab intern und extern). Hieraus resultieren: 1) Lern-Annäherungs-Ziele (positive Valenz & interner Vergleich, 2) Lern-Vermeidungs-Ziele (negative Valenz & interner Vergleich), 3) Leistungs-Annäherungs-Ziele (positive Valenz & externer Vergleich) und 4) Leistungs-Vermeidungs-Ziele (negative Valenz & externer Vergleich). Diese vier Zielorientierungen sind der erste Teil des integrierten Modells, der zweite zentrale Teil ist das kognitiv-motivationale Prozessmodell (Vollmeyer & Rheinberg, 1999, 2006). Ausgangspunkt ist die aktuelle Motivation, die aus 1) der Erfolgswahrscheinlichkeit, 2) der Misserfolgsbefürchtung, 3) dem Interesse und 4) der Herausforderung als unabhängige Faktoren besteht. Diese aktuelle Motivation wirkt nicht direkt auf die Leistung, sondern durch kognitive (hier: Metakognition) und motivationale (hier: Flow-Erleben) Mediatoren. Es wurden drei Fragestellungen bearbeitet. Die erste Fragestellung betraf das Zusammenspiel der Zielorientierungen und der aktuellen Motivation. Eine Überprüfung dieses integrierten Motivationsmodell erfolgte mittels Pfadanalyse. Die zweite und dritte Fragestellung befasste sich spezifisch mit dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell. Es wurden Subgruppen auf der Basis der aktuellen Motivation identifiziert und ihre Bedeutung für die Mediatoren und die Leistung untersucht. Die dritte Fragestellung fokussierte den Prozesscharakter des Modells. Hier erfolgten Analysen über den Arbeitsprozess hinweg. Die Fragebögen (Achievement Goal Questionnaire (Elliot & McGregor, 2001), Metakognitionsfragebogen (aufbauend auf LIST (Wild, 2000) und Metacognitive Awareness Inventory (Schraw & Dennison, 1994), Fragebogen zur aktuellen Motivation (Rheinberg, Vollmeyer & Burns, 2001), Flow-Kurz-Skala (Rheinberg, Vollmeyer & Engeser, 2003)) und die Problemlöseaufgaben (Sudokus) wurden in einer Pilotstudie getestet. An der Hauptstudie nahmen 202 Personen teil (73% weiblich). Das integrierte Motivationsmodell geht davon aus, dass eine positiver Effekt der Zielorientierungen als Personenvariable auf die aktuelle Motivation besteht. Die aktuelle Motivation als Startpunkt des situationalen Geschehens wiederum wirkt positiv auf die Mediatoren Flow-Erleben und Metakognition, hat aber keinen direkten Effekt auf die Leistung. Dieser wird nämlich über die Mediatoren vermittelt. Deswegen wird ein positiver Effekt des Flow-Erlebens und der Metakognition auf die Leistung erwartet. Das Zusammenwirken der beiden Mediatoren kann aus dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell nicht abgeleitet werden. Ob ein Zusammenhang besteht oder nicht wird geprüft. Für das Vorwissen wird ein positiver Effekt auf die aktuelle Motivation und die Leistung erwartet. Die Pfadanalyse zur Überprüfung des integrierten Motivationsmodells zeigte, dass eine Integration nicht nur theoretisch sinnvoll ist, sondern auch empirisch gestützt wird. Die Bedeutung der Metakognition als kognitiver Mediator wurde gezeigt. Die zweite Fragestellung fokussierte auf die aktuelle Motivation. Auf der Basis dieser wurden mittels Clusteranalyse drei distinkte Gruppen identifiziert: hoch Motivierte, niedrig Motivierte und ängstlich Motivierte (vergleichbar zu Vollmeyer & Rheinberg, 2004). Diese Gruppen unterschieden sich hinsichtlich ihres Flow-Erlebens, ihrer Metakognition und ihrer Leistung. Die hoch Motivierten erlebten am meisten Flow, berichteten mehr Metakognition und zeigten bessere Leistung. Der Prozesscharakter des kognitiv-motivationalen Prozessmodells stand im Mittelpunkt der dritten Fragestellung. Diese Analyse über die drei Sudokus hinweg zeigte eine ähnliche Entwicklung des Flow-Erlebens bei den hoch und niedrig Motivierten. Vom ersten zum zweiten Sudoku stieg es an, um dann wieder abzufallen. Dies war bei der Metakognition nicht der Fall. Die hoch Motivierten berichteten einen stärkeren Rückgang der Metakognition beim dritten Sudoku als die niedrig Motivierten. Bei der Leistung zeigte sich für die hoch Motivierten ein Anstieg beim zweiten Sudoku und dann ein Rückgang beim dritten, wohingegen die Leistung der niedrig Motivierten kontinuierlich abfiel. Abschließend wurden die Schwierigkeiten und Grenzen der vorliegenden Arbeit diskutiert und Implikationen der Ergebnisse für die Theorieentwicklung und ihre Bedeutung für den Anwendungskontext aufgezeigt.
Im adulten Säugerhirn findet Neurogenese in der SVZ der Seitenventrikel kontinuierlich statt. Eine Vielzahl von Signalsystemen steuert in komplexer Weise zelluläre Antworten und reguliert die Proliferation, Differenzierug und Wanderung NSZ. Gegenwärtig ist nur wenig über die zugrundeliegenden Signalwege bekannt. Zunehmend gibt es Hinweise darauf, dass Nukleotide an diesen Prozessen beteiligt sind. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, das die Nukleotide ADPbetaS und UTP in kultivierten NSZ der adulten SVZ einen schnellen Kalziumeinstrom induzieren und die Wachstumsfaktor-vermittelte NSZ-Proliferation steigern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System zur Kultivierung adhärenter adulter NSZ etabliert. Die Untersuchungen zeigen, dass adulte NSZ eine Vielzahl an P2Y- und P2X-Rezeptoren, sowie die Nukleotid-hydrolysierenden Enzyme NTPDase2 und TNAP exprimieren. Untersuchungen der ADPbetaS-, UTP- und EGF-vermittelten Signalwege zeigen, dass alle drei Agonisten eine ERK1/2- und CREB-Phosphorylierung induzieren, wobei sich die zeitlichen Charakteristika zwischen den Nukleotiden und EGF unterscheiden. Inhibierungsexperimente geben Einblicke in die dabei aktivierten Signalkaskaden und weisen auf eine ADPbetaS-induzierte Transaktivierung des EGF-Rezeptors hin. Während UTP über den P2Y2-Rezeptor wirkt, übt ADPbetaS seine Funktion über den P2Y1- und P2Y13-Rezeptor aus. Die Daten implizieren zudem, dass Nukleotide und EGF gleiche Zielproteine über verschiedene Signalwege induzieren und dass sie das Potenzial besitzen, bei der Kontrolle der Zellproliferation in der adulten Neurogenese synergistisch zu agieren. Vergleichende Analysen mit kultivierten NSZ aus Wildtyp-, P2Y1- und P2Y2-Rezeptor-Knockout-Mäusen belegen ein verändertes Antwortverhalten in Gegenwart von ADPbetaS, UTP und EGF und lassen kompensatorische Mechanismen vermuten. Die Resultate dieser Arbeit demonstrieren zudem, dass ATP, ADPbetaS, UTP und EGF die Migration von NSZ induzieren. Parallel dazu konnten Veränderungen des Aktinzytoskelletes, wie die Zunahme an F-Aktin, die Bildung von Stressfasern und eine Veränderung der Zellmorphologie gezeigt werden. Diese Prozesse gehen mit einer Aktivierung der Proteinkinasen Akt und FAK einher. Die Daten weisen darauf hin, dass Nukleotide und EGF für die Zytoarchitektur der SVZ und die Wanderung von Neuroblasten zum OB eine wichtige Rollen spielen könnten.
Anliegen: Der hausärztlich-ambulanten Versorgung von depressiven Patienten kommt eine zentrale Bedeutung zu. Ein wichtiges Symptom von Depressionen ist Suizidalität. Suizidgedanken bleiben im Hausarztkontakt jedoch oftmals unerkannt. Eine verbesserte Kenntnis von Prädiktoren für Suizidgedanken speziell bei depressiven Patienten in der Primärversorgung kann dazu beitragen, die Erkennung von Suizidgedanken durch den Hausarzt zu verbessern und dadurch eine rechtzeitige Intervention zu ermöglichen. Mit Prädiktoren für Suizidgedanken explizit bei depressiven Patienten in der Primärversorgung haben sich bislang nur wenige Studien befasst, mit teilweise heterogenen Ergebnissen. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, an einer großen Stichprobe von Patienten mit Major Depression aus der Hausarztversorgung Prädiktoren für Suizidgedanken zu untersuchen. ...
Die Nieren von COX-2-/--Mäusen zeigen um den Tag P21 u.a. einen verminderten Quotienten aus Nierengewicht zu Körpergewicht, zu kleine Glomeruli, einen schmalen Kortex und zystische Veränderungen, sowie hyperplastische Glomeruli in rindenfernen Bereichen. Die Befunde an den Nieren von COX-1-/- und COX-2-/- Mäusen lassen vermuten, dass es sich um COX-2 abhängige Effekte handelt, die erst im postnatalen Abschnitt der Nephrogenese in Erscheinung treten. Da COX-1-/--Mäuse keine Pathologien der Nieren aufweisen und es zwischen Wildtyp-Mäusen und COX-2-/--Mäusen an den ersten Tagen bis etwa Tag P10 keine Unterschiede des Phänotypes der Nieren gibt. Nach Gabe von Indomethacin während des letzten Trimenons der Schwangerschaft wurde auch bei Menschen über eine gestörte Nierenfunktion mit Oligohydramnion sowie histologischen Veränderungen berichtet. Bisher war allerdings unklar, inwiefern die unterschiedlich klinisch eingesetzten Coxibe sich in ihrer Wirkung auf die Nierenentwicklung unterscheiden und ob sie die Nephrogenese in gleichem Maße stören können. In der vorliegenden Arbeit wurde der postnatale Abschnitt der Nephrogenese von Mäusen unter Gabe der experimentellen COX-2 Inhibitoren SC-236 und SC-791, der selektiven COX-2-Inhibitoren Celecoxib, Etoricoxib, Lumiracoxib, Rofecoxib und Valdecoxib, der klassischen NSAIDs Diclofenac und Naproxen, der experimentelle COX-1 Inhibitor SC-560 und das Celecoxib-Derivat DMC untersucht. Zunächst wurden die Tiere von Tag P1 bis Tag P21 mit den oben genannten Substanzen nach einem festen Schema behandelt, anschließend wurden die Nieren präpariert und histologisch aufgearbeitet. Als Parameter der Untersuchung der Nierenentwicklung wurde die Reduktion der Nierenquotienten, der mittleren Durchmesser der Glomeruli und der kortikalen Dicke, sowie der Anteil an Glomeruli im Rindenbereich und einer Verschiebung der Verteilung der Glomeruli, hin zu kleineren Durchmessern herangezogen. Verglichen mit der Referenzgruppe, die keine Veränderungen der Nephrogenese gezeigt hatte, zeigte sich ein Effekt auf die Morphologie der Nieren in unterschiedlichem Ausmaß, bei allen selektiven COX-2-Inhibitoren, sowie den klassischen NSAIDs. Weder SC-560, noch DMC zeigten bei dieser Studie einen Effekt auf die Nephrogenese. Des weiteren wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht ob und an welchen postnatalen Tagen die COX-2-Expression erhöht ist. Dazu wurden an den Tagen P2, P4, P6 und P8, sowie an Tag P21 unbehandelte C57/BL6-Mäuse getötet und deren Nieren entnommen. Sowohl auf mRNA, als auch auf Proteinebene konnte an Tag P4 in den TaqMan-Analysen, bzw. an Tag P6 in den Western Blot-Analysen eine signifikant erhöhte Expression der COX-2, verglichen mit Tag P21 festgestellt werden. Daraus ergab sich nun die Frage, ob die Inhibition der COX-2 an diesen Tagen ausreicht, eine Veränderung im Sinne der oben genannten Veränderungen an der Niere zu zeigen. Dazu wurde eine Gruppe von Tieren nur von Tag P1 bis Tag P6 mit dem experimentellen COX-2-Inhibitor SC-236 behandelt und an Tag P21 mit Tieren verglichen, die entweder von Tag P1 bis Tag P21 SC-236 erhielten oder das Lösungsmittel DMSO. Die Nieren zeigten ebenfalls signifikante Unterschiede zu den Nieren aus der Referenzgruppe. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass es sich um einen Gruppeneffekt der NSAIDs auf die COX-2 abhängige Nephrogenese handelt. Des weiteren zeigte sich, dass die COX-2-Expression in den Nieren an den ersten Lebenstagen der Maus erhöht ist und die COX-2 Inhibition an diesen Tagen eine irreversible Störung der Nephrogenese nach sich zieht. Die Konsequenz aus diesen Ergebnissen sollte sein, dass NSAIDs nicht mehr in der Spätschwangerschaft, z.B. zur Tokolyse oder zur Behandlung des Polyhydramnions eingesetzt werden. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Tatsache, dass auch bei AT1-/-- und ACE-/--Mäusen über eine veränderte Morphologie der Nieren berichtet wurde. Des weiteren sind beide Systeme, COX-2 und RAAS, an der Regulation der Nierenphysiologie beteiligt und verknüpft. In der vorliegenden Arbeit wurde nun die Wirkung des ACE-Inhibitors Enalapril und des AT1-Antagonisten Telmisartan auf Parallelen zur COX-2 abhängigen Nephrogenese untersucht. Lediglich die Nierenquotienten waren bei beiden Substanzen vermindert. Es zeigten sich bei der Behandlung mit Enalapril verminderte Volumina der Glomeruli, eine verminderte kortikale Dicke und ein erhöhter Anteil von Glomeruli im Rindenbereich.
Das Gehirn als Hypoxie-empfindlichstes Organ des menschlichen Körpers ist auf eine konstante Blutversorgung angewiesen. Zur Gewährleistung der Unabhängigkeit von systemischen hypo- bzw. hypertensiven Blutdruckschwankungen, existieren verschiedene Regulationsmechanismen, welche den cerebralen Blutfluss (CBF) in einem weiten Bereich (arterieller Mitteldruck zwischen 60 - 150mmHg) konstant halten. Zu diesen Mechanismen gehören die Blutdruck-adaptierte Autoregulation, die metabolische Vasoreaktivität sowie die neurovasculäre Kopplung. Außerhalb des physiologischen Autoregulationsbereichs folgt der CBF druckpassiv den Schwankungen des systemischen Blutdrucks. Ischämische Hypoperfusion oder Gefäßwand-schädigende Blutdruckspitzen können die Folge sein. Zusätzlich führen verschiedene cerebrovasculäre Erkrankungen zu einer Einschränkung der cAR. Zu diesen gehören die cerebrale Mikroangiopathie, Stenosen bzw. Verschlüsse der A. carotis interna (ACI), der Schlaganfall sowie das Schädel-Hirn-Trauma (SHT). Eine valide Untersuchungsmethode zur Messung der cAR mit geringem apparativen Aufwand und fehlender Strahlenbelastung ist die transcranielle Doppler-Sonographie (TCD). Allerdings stellt eine Verfälschung der Messergebnisse durch verstärkte Streuung des Ultraschallsignals an der Schädelkalotte (schlechtes Schallfenster [sSF]) eine relevante Fehlerquelle dar. Mit steigendem Lebensalter finden sich in bis zu 30% der Bevölkerungen insuffiziente Schallbedingungen. Ziel der vorliegenden Studie war es daher festzustellen, ob die Dauerinfusion eines Ultraschallkontrastmittels (Levovist®) bei der TCD-Autoregulationsmessung an Probanden mit künstlich verschlechtertem Schallfenster eine valide Messung verschiedener Autoregulationswerte ermöglicht. 45 unselektierte Personen mit gutem Schallfenster aus dem Patientengut der Neurologie der J.W.G.-Universität Frankfurt am Main wurden in die Studie eingeschlossen. Die Doppler-Signalqualität, die Blutflussgeschwindigkeiten, der Pulsatilitätsindex nach Gosling und King (PI) sowie die Autoregulationsparameter Phasendifferenz (PD) und Kreuzkorrelations-Koeffizient (Mx) wurden anhand der über das transtemporale Schallfenster abgeleiteten A. cerebri media (ACM) beidseits bestimmt. Zur Imitation des sSF wurde eine Lage Aluminiumfolie ohne Veränderung der Sondenposition zwischen Ultraschallsonde und Haut eingebracht. Die Messungen erfolgten nach einem standardisierten Protokoll in drei Durchgängen (native Messbedingungen, künstliche Schallfensterverschlechterung, Infusion des Ultraschallkontrastmittels (KM) Levovist® [300 mg/min] bei bestehendem sSF) in einem Zeitraum von je 15 Minuten in Ruhe und je 3 Minuten während metronomischer Atmung. Mit künstlicher Verschlechterung des Schallfensters zeigte sich eine signifikante Verfälschung aller erhobenen Messparameter. Die mittlere Flussgeschwindigkeit in der ACM und die mittlere Energie des Doppler-Spektrums verringerten sich um 40%, bzw. um 22%, wohingegen sich der PI verdreifachte. Ebenso veränderten sich die Autoregulationsparameter mit einer Abnahme der PD um durchschnittlich 8 - 10° und des Kreuzkorrelations-Koeffizienten Mx von 0.308 +/- 0.170 auf 0.254 +/- 0.162. Die Verringerung der PD täuscht eine pathologische Einschränkung der cAR vor. Diese Einschränkung entspricht z.B. der einer 75 - 99%-igen Stenose der ACI und kann darüber hinaus auch bei einer Reihe weiterer cerebrovasculärer Erkrankungen (z.B. lakunäre Infarkte bei cerebraler Mikroangiopathie, Subarachnoidalblutung [SAB], maligne Hypertonie) beobachtet werden. Die Abnahme des Kreuzkorrelations-Koeffizienten Mx täuscht im Gegensatz dazu eine scheinbar intakte cAR (Mx < 0.3) vor. Bei Patienten mit schwerem Schädel-Hirn-Trauma (SHT), SAB oder Stenose der ACI besteht in diesem Fall die Gefahr, eine optimale Prävention von Sekundärschäden nicht gewährleisten zu können, da frühe Hinweise auf eine Schädigung des Gehirns, ausgelöst durch verminderte cerebrale Autoregulation, unter Umständen fehlen. Die Infusion des Ultraschallkontrastmittels Levovist® konnte diese Effekte der künstlichen Verschlechterung des Schallfensters auf die Autoregulationsparameter über den gesamten Messzeitraum fast vollständig ausgleichen (PD nativ vs. KM 38.2 +/- 10.0 vs. 37.2 +/- 12.3 und Mx nativ vs. KM 0.308 +/- 0.170 vs. 0.323 +/-0.163). Auch die übrigen erfassten Messparameter näherten sich durchweg den Werten unter nativen Messbedingungen an. Die Verwendung eines Ultraschallkontrastmittels bei der transcraniellen Doppler-Sonographie erhöht also die Validität der Messung der cerebralen Autoregulation bei Patienten mit schlechtem Schallfenster. Eine klinische Relevanz entsteht im besonderen, da sowohl ein schlechtes Schallfenster, als auch cerebrovasculäre Erkrankungen, welche im Zusammenhang mit einer verminderten cerebralen Autoregulation stehen, bevorzugt bei älteren Menschen anzutreffen sind.
Die Studie zur holozänen und pleistozänen Umweltgeschichte Süd-Kameruns betrachtet den Aussagewert alluvialer Ablagerungen der Flüsse Boumba, Dja, Nyong, Ntem und Sanaga für die Paläoumweltforschung. Die zugrundeliegende Forschungsarbeit fand im Rahmen des ReSaKo-Projektes, als Teil der interdisziplinären DFG-Forschergruppe 510 (“Ökologischer Wandel und kulturelle Umbrüche in West- und Zentralafrika”) statt, welches die zeitliche und räumliche Korrelation zwischen Klimawandel, Landnutzungsstrategien und kulturellen Innovationen während der “First Millennium BC Crisis” untersucht hat. Hierfür wurde der ökologisch sensitive Bereich des tropischen bis äquatorialen, immergrünen bis halb-immergrünen Guineisch-Kongolesischen Regenwaldes und dessen Übergangszone zur Savanne im Süden Kameruns ausgewählt. Als Hauptziele galten dabei zum einen der Nachweis und die Interpretation umweltgeschichtlich verwertbarer Alluvionen in einer diesbezüglich bisher unerforschten Region und zum anderen die Korrelation der Befunde mit bereits vorliegenden terrestrischen und hemi-pelagischen Paläoumweltarchiven zur weiteren Rekonstruktion der Paläoumweltbedingungen im westlichen (monsunalen) Äquatorialafrika. Nach der Identifizierung geeigneter Arbeitsgebiete entlang verzweigter, mäandrierender und verflochtener bis anastomosierender Flussabschnitte mittels Fernerkundung von Satellitenbildszenen (LANDSAT ETM+ und ASTER), wurden unter Verwendung physiogeographischer und geomorphologischer Arbeitsmethoden ausgedehnte Feldarbeiten während der Trockenzeiten der Jahre 2005-2008 durchgeführt. Zahlreiche Bohrarbeiten (161 Handbohrungen bis 550 cm Tiefe) zur Sedimentprobennahme (1093 Proben) innerhalb der Alluvial- und Auenbereiche der fluvialen Systeme lieferten einen umfassenden Einblick in die Stratigraphie und fluvial-morphologische als auch paläoökologische und –hydrologische Entwicklung der verschiedenen fluvialen Ökosysteme. Die mehrschichtigen, sandigen bis tonigen Alluvionen enthalten Paläooberflächen (z. B. Gyttjen, reliktische Sümpfe, fossile organische Lagen/Horizonte), die hervorragende zusätzliche Proxydaten-Archive für die Rekonstruierung umweltgeschichtlicher Bedingungen darstellen. Bohrtransekte und die Interpretation von Korngrößensequenzen (Verfeinerung, Vergröberung) und Paläooberflächen aus solchen alluvialen Sedimentarchiven stellen ein wichtiges, diagnostisches Instrument bei der Rekonstruktion paläoökologischer und paläohydrologischer Bedingungen und Veränderungen dar und belegen zeitweise einsetzende Austrocknung und Bodenbildung in den Auen sowie die Entstehung von Sümpfen, Mudden, Altarmen und Altwasserseen. Dies zeugt eindeutig von einer modifizierten Dynamik der fluvialen Systeme als Reaktion auf endogene Steuer-größen und (fluss-)interner Variabilität (equilibrium). Eine Vielzahl (76) von 14C (AMS)-Datierungen an organischem Sediment und Makroresten aus diesen Alluvionen lieferten spätpleistozäne bis rezente Alter (~48 – 0,2 ka BP). Die dazugehörigen δ13C-Werte (-35.5 bis -18.0 ‰) belegen für den Großteil der Untersuchungsstandorte (außer Oberläufe des Nyong und Sanaga) den Fortbestand von C3-Spezies dominierter Galleriewald-Ökosysteme entlang der Flusssysteme (“fluviale Regenwaldrefugien”) trotz einiger klimatischer Veränderungen/Aridisierungen (z. B. Letztes Glaziales Maximum um etwa 20.000 BP). Trotz der bestehenden Schwierigkeiten bei der Interpretation tropischer Sedimentarchive (z. B. Hiatusproblematik) und fluvialer Archive im Allgemeinen, unterstützen weitere sedimentologische und pedologische Analysen (bodenchemische und -physikalische Laboranalysen: Korngrößen, Kohlenstoff [Ctot], Stickstoff [N], Eisengehalt [Feo und Fed], pH, Munsell-Farben und C/N) und ausgewählte 14C (AMS)-Datierungen und δ13C-Bestimmungen diesen Beitrag zur hypothetischen Rekonstruktion der umweltgeschichtlichen und paläohydrologischen Entwicklung des Untersuchungsraumes. Die Interpretation des Alluvialarchivs liefert zusätzlich fundierte Informationen hinsichtlich der komplexen Zusammenhänge zwischen Klima, Ozean, fluvialen und ökologischen Systemen und anthropogener Einflussnahme in einem regional weitestgehend unerforschten Gebiet mit hoch-sensitiven tropischen Ökosystemen. Die Ergebnisse zeigen eine hohe Korrelation mit früheren Paläoumweltstudien, die über Untersuchungen an weiteren terrestrischen (lakustrin und palustrin) und hemi-pelagischen Archiven dieser Region gewonnen werden konnten. Sie bekräftigen Milanković- bis sub-Milanković-skalige Fluktuationen (bes. Präzession-Zyklus) der Intensität des westafrikanischen Monsuns und daraus resultierende klimatische, hydrologische und ökologische Modifikationen im Untersuchungsgebiet, was wiederum weitreichende Telekonnektionen und Reorganisationen impliziert. Insgesamt können im Liegenden grobkörnige, sandige sedimentäre Einheiten, welche turbulente fluvial-morphologische Bedingungen und geöffnete Landschaftsstrukturen während des Spätpleistozäns (48-30 ka BP) vermuten lassen, von fein-sandigen LGM-zeitlichen (22-16 ka BP) und mächtigen schluffigen bis tonigen, holozänen Sedimenteinheiten im Hangenden unterschieden werden, welche eher stabilisierte und saisonale Umweltverhältnisse widerspiegeln. Größere Um- und Verlagerungen innerhalb der Alluvialbereiche (v. a. Gerinnebettverlagerungen, Versumpfung) konnten für den Übergang vom Pleistozän zum Holozän (14-10 ka BP) nachgewiesen werden. Weitere einschneidende Veränderungen traten im Spätholozän auf (um 4, 2 und 0,8 ka BP), wahrscheinlich begünstigt durch die einsetzende Sesshaftwerdung Bantu sprechender Volksgruppen im tropischen Regenwald Zentralafrikas und die Einführung der Metallurgie um 3 ka BP. Die Informationen über regionale umweltgeschichtliche Oszillationen und Variationen im Prozess- und Landschaftsgefüge sind in den alluvialen Sedimenten gut dokumentiert und erhalten geblieben und ergänzen somit frühere Ergebnisse (z. B. ECOFIT Programm) zur spätquartären Umweltgeschichte des vom Monsun geprägten westlichen Äquatorialafrikas. Die Ergebnisse bestätigen vor allem die Bedeutung und Anwendbarkeit tropischer (afrikanischer) alluvialer Sedimente für die Paläoumweltforschung und belegen zudem, dass neben (neo-)tektonischen Impulsen das Klima die tragende Rolle in der Gestaltung der Landschaft und der Dynamik, sowie der Entwicklung der Flusseinzugsgebiete gespielt hat.
Die schwere Sepsis ist trotz verbesserter Therapiemethoden der modernen Intensivmedizin mit einer erheblichen Mortalität behaftet und septische Erkrankungen verursachen in Deutschland Schätzungen zufolge ca. 60.000 Todesfälle pro Jahr. Im Falle der gram-negativen Sepsis wird durch die Freisetzung von bakteriellen Zellwandbestandteilen wie LPS über die Bindung an Toll-like Rezeptoren, insbesondere TLR-4, eine systemische Immunreaktion ausgelöst. Diese kann dann über verschiedene Mechanismen zu systemischer Hypotension, Organversagen und schließlich zum Tod im Zuge der schweren Sepsis führen. Es hat sich allerdings herausgestellt, dass LPS auch in der Lage ist protektive Effekte auszulösen. So schützt die Gabe einer niedrigen Dosis LPS den Organismus vor verschiedenen Schädigungen, die in einem späteren Zeitintervall folgen. Beschrieben sind protektive Effekte in Modellen von Ischämie/Reperfusion, direktzellschädigenden Agenzien und auch gegenüber hochdosierter LPS-Gabe. In letztgenanntem Fall wird der gezeigte Effekt als LPS-Toleranz bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit sollte nun untersucht werden, ob niedrige Dosen von LPS einen protektiven Effekt bei einem folgenden LPS-Schock vermitteln können, wobei insbesondere Effekte auf die Leber, mit ihrer herausragenden Rolle in der Elimination von LPS aus dem Organismus, im Fokus der Experimente standen. Des Weiteren sollte eine mögliche Rolle der Häm-Oxygenase 1 (HO-1) im Zuge dieser Protektion untersucht werden, da verschiedene Arbeiten der letzten Jahre gezeigt haben, dass HO-1 in der Lage ist eine Protektion gegen verschiedene Arten der Zellschädigung zu vermitteln. Für die Untersuchungen wurde ein Tiermodell an der Ratte gewählt. Als wesentliche Ergebnisse sind festzuhalten, dass die Gabe von 1 mg / kg KG LPS (intraperitoneal) 24h vor Auslösen eines LPS-Schocks mit 6 mg / kg KG (intravenös) zu einer signifikanten Verbesserung der Kreislaufparameter und zu einer Verringerung der Leberzellschäden führt, gemessen am mittleren arteriellen Blutdruck bzw. an GOT und GPT im Serum der Tiere. Außerdem zeigt sich, dass die Gabe von niedrig dosiertem LPS zu einem Anstieg der HO-1 Konzentration der Leber im 24h Zeitverlauf führt und dass in den Lebern der Tiere, die eine Protektion durch LPS-Vorbehandlung erfahren haben, die HO-1 Menge signifikant gegenüber den nicht vorbehandelten Tieren erhöht ist. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die HO-1 eine wichtige Rolle in der Leberprotektion im Rahmen der LPS-Toleranz durch Vorbehandlung mit niedrig dosiertem LPS spielt. Das in dieser Arbeit verwendete Modell des LPS-Schocks stimmt dabei in vielen Bereichen mit den pathophysiologischen Veränderungen während einer gramnegativen Sepsis überein. Die Ergebnisse dieser Arbeit im Einklang mit den Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen zeigen also, dass durch eine gezielte Modulation der Immunantwort, z.B. über eine Induktion der HO-1 Produktion, eine Protektion des Organismus gegen einen im Intervall folgenden septischen Schock möglich sein könnte. Eine zeitlich abgestimmte und gezielte Modulation der inflammatorischen Prozesse bei Hochrisikopatienten, z.B. vor geplanten großen operativen Eingriffen oder Organtransplantationen, könnte daher in Zukunft helfen das Überleben dieser Patienten zu verbessern.
Die mitochondriale Atmungskette und insbesondere die Cytochrom c Oxidase als deren terminales Enzym sind essentiell für den Energiestoffwechsel eukaryotischer Zellen. Die Assemblierung der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase mit ihren bis zu 13 Untereinheiten ist noch nicht bis ins Detail aufgeklärt, aber es handelt sich um einen geordneten, stark regulierten Prozess, und Defekte der Assemblierung sind häufig Ursache für neurodegenerative und myopathische Erkrankungen. In Eukaryoten sind bisher mehr als 30 Proteine identifiziert worden, die an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt sind, darunter Surf1. Beim Menschen führt der Verlust von Surf1 zu einer letalen neurodegenerativen, als Leigh-Syndrom bezeichneten Krankheit, wobei die genaue Rolle von Surf1 bei der Assemblierung der Cytochrom c Oxidase unklar ist. Das Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans kann als Modellorganismus für die mitochondriale Atmungskette dienen, da seine aeroben Atmungskettenkomplexe eine deutliche Homologie zu denen der Mitochondrien auf weisen. P. dentrificans besitzt zwei homologe Gene für Surf1, die in Operons mit terminalen Oxidasen assoziiert sind: surf1c ist im cta-Operon lokalisiert, das für Untereinheiten der aa3-Cytochrom c Oxidase kodiert, und surf1q im qox-Operon, das die Gene für die ba3-Ubichinoloxidase enthält. Vorrangiges Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Gene und ihre Translationsprodukte zu charakterisieren und auf ihre Funktion hin zu untersuchen. Chromosomale Einzel- und Doppeldeletionen beider surf1-Gene führten zu einem spezifischen Aktivitätsverlust der jeweiligen Oxidase in Membranen, wobei surf1c und surf1q unabhängig von einander für ihre korrespondierenden Oxidasen zuständig sind und keine überlappenden Funktionen besitzen. Dies war der erste experimentelle Hinweis, dass ein Surf1-Protein auch bei der Assemblierung einer Chinoloxidase eine Rolle spielt. Untersuchungen an aufgereinigter aa3-Cytochrom c Oxidase ergaben, dass der Hämgehalt im Fall der surf1c-Deletion stark vermindert ist. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Vermutungen, dass Surf1 eine Rolle beim Häm-Einbau in UEI spielt. Diese Arbeit untersuchte zum ersten Mal aufgereinigtes Surf1-Protein und lieferte mit der Charakterisierung weitere Hinweise auf seine Rolle beim Häm a-Einbau in terminale Oxidasen. So konnte gezeigt werden, dass sowohl Surf1c und als auch Surf1q Häm a in vivo binden. Mit Hilfe spektroskopischer Methoden und der isothermen Titrationskalorimetrie konnte die Bindung von Häm a an apo-Surf1c und Apo-Surf1q quantifiziert werden. Beide Proteine binden Häm a mit submikromolaren Affinitäten in einer 1:1 Stöchiometrie. Ligandenbindungspektren wiesen weiterhin darauf hin, dass das Eisenatom des Häm a in Surf1 nur über fünf Liganden koordiniert ist. Über gerichtete Mutagenese konnte der konservierte Histidinrest His193 für Surf1c und His202 für Surf1q als möglicher fünfter Ligand des Eisenatoms identifiziert werden. Untersuchungen zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen zeigten eine direkte Interaktion zwischen der Häm a Synthase und den beiden Surf1-Proteinen in vivo und in vitro, die zuvor noch für kein anderes Surf1-Homolog beschrieben war. Zusätzlich konnte ein Transfer von Häm von der Häm a Synthase auf Surf1c bzw. Surf1q in vitro erreicht werden. Für Surf1c ließ sich außerdem eine Interaktion mit Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase nachweisen. Obwohl die Funktion von Surf1 im Rahmen der Biogenese der Cytochrom c Oxidase noch nicht abschließend geklärt werden konnte, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit nichtsdestotrotz klare Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Surf1 beim Einbau der Häm a-Kofaktoren, und ein neues Modell für die Funktion von Surf1 konnte erstellt werden.
Es ist gelungen, self-assembled Monolayers auf Wasserstoff-terminierten Germaniumoberflächen zu präparieren. Für die Charakterisierung wurden unterschiedliche Methoden herangezogen. Neben der Oberflächentopographie, die mit dem AFM untersucht wurde, konnten die Proben durch röntgenspektroskopische Methoden qualitativ und quantitativ vor, während und nach der Präparation analysiert werden. Im Zusammenspiel dieser Methoden war eine umfassende Interpretation der Ergebnisse möglich, die viele neue Erkenntnisse im Bereich der Grundlagenforschung auf dem Halbleitersubstrat Germanium (Ge) ermöglichten. Motivation für diese Arbeit war das Interesse, Ge als Substrat im Bereich der Halbleitertechnologie zu verwenden. Ge hat eine bessere Ladungsträgerbeweglichkeit und andere Vorteile gegenüber Silicium (Si). Der Einsatz scheitert momentan, da das ca. 1-2 nm dicke native Oxid auf der Oberfläche des Ge anders als beim Si wasserlöslich ist. Daher ist eine Renaissance der Grundlagenforschung auf diesem Gebiet zu verzeichnen. Auf der Suche nach einer definierten und passivierten Oberfläche lag der Gedanke nah, dieses Ziel durch das Self-Assembly thiolischer Alkane zu erreichen. Diese Methode ist auf Goldoberflächen sehr gut erforscht und man erhält aus einer entsprechenden Lösung durch einfachste nasschemische Präparation eine bei Laborbedingungen stabile Monolage. Um das Konzept der self-assembled Monolayers auf Ge zu übertragen, war es zunächst notwenig, die Oxidschicht des Substrats so zu entfernen, so dass eine Wasserstoff-terminierte Oberfläche zurückbleibt, die eine möglichst geringe Rauheit aufweist. Dies gelang letztendlich mit einem Tauchbad in verdünnter oder konzentrierter Fluorwasserstoffsäure (Flusssäure, HF) für 5 min bzw. 40 s. Die Rauheit der Proben wurde durch AFM-Aufnahmen bestimmt und liegt bei RMS=0,34 nm. Die chemische Beschaffenheit wurde durch XPS und Totalreflexionsröntgenfluoreszenz am Synchrotron (Sr-TXRF) untersucht. Die referenzfreie Quantifizierung zeigte, dass sich auf der Oberfläche noch Sauerstoff befand, der durch XPS auch dem auf der Oberfläche verbliebenem Wasser zugeordnet werden konnte. Durch Untersuchungen an der Absorptionskante des Sauerstoffs mit NEXAFS konnte diese These untermauert werden. In einem nächsten Schritt gelang die Präparation der SAMs mit Molekülen mit unterschiedlichen Kopfgruppen. Diese definierten die neuen Eigenschaften der Substratoberfläche und sind auch für die Verwendung des Substrats von großer Bedeutung. Es wurden die Kopfgruppen so gewählt, dass eine Detektion durch röntgeninduzierte Fluoreszenz möglich war. Daher fiel die Wahl auf ein fluoriertes Acetat und eine Phosphorsäure als Kopfgruppe jeweils eines Mercaptoundecans. Als Lösemittel diente schließlich wasserfreies Dichlorethan. Für die Abbildung der zunächst in Inseln wachsenden Monolage durch das AFM war die Kopfgruppe zwar unerheblich. Mit dieser Methode ließ sich der Einfluss der Kopfgruppe auf die Anordnung dokumentieren. Es war bei ausgewählten Proben möglich, eine Bedeckung der Oberfläche mit den Thiolen per AFM zu vermessen. Diese lag bei ca. 50 %. Ein Nachweis der Moleküle erfolgte unter anderem durch XPS. Durch diese Methode konnte allerdings noch nicht nachgewiesen werden, ob die Moleküle nur ungeordnet auf der Oberfläche adsorbiert sind, oder tatsächlich chemisch gebunden und aufgerichtet sind. Dies erfolgte durch Messungen an der Synchrotronstrahlenquelle. Durch referenzfreie TXRF konnte die Belegung des Substrats mit Fluor analysiert werden. Da das Fluor jedoch auch ein Rückstand des HF-Tauchbades hätte sein können, wurde durch NEXAFS nachgewiesen, dass bei den Proben, die lange in thiolischer Lösung waren, die Fluorspezies, die bei den frisch HF-getauchten Proben vorhanden ist, praktisch nicht mehr existiert. Im Umkehrschluss wurde auch eine auf Gold präparierte Monolage des gleichen Moleküls mit NEXAFS vermessen. Die Fluorspektren ähnelten sich trotz des unterschiedlichen Substrats. Bei der Röntgenfluoreszenz am Glanzwinkel (GIXRF) können Intensitätsmaxima ein stehendes Wellenfelds oberhalb des Substrats abhängig vom Winkel des einfallenden Strahls verändert werden. Diese Methode kam zum Einsatz um nachzuweisen, dass sich die Moleküle der Kopfgruppe oberhalb des Schwefels und oberhalb des Ge befinden. Durch mathematische Berechnungen ist man in der Lage, die Höhe der Monolage und den Verkippungswinkel der Moleküle zu ermitteln. Dieser lag bei ca. 45° und einer 1,4 nm hohen Monolage. Diese Aussagen wiederum stimmen mit den am AFM erzielten Ergebnissen in erster Näherung überein. Durch das Zusammenspiel fünf unterschiedlicher Methoden war es möglich, diese vielfältigen Erkenntnisse in dem Forschungsfeld der Ge-Oberflächen zu generieren.
Die Zellwand von Arabidopsis thaliana enthält große Menge an Hemicellulosen und Pektinen, deren Bestandteile sich hauptsächlich von UDP-Glucuronsäure ableiten. Die Bildung von UDP-Glucuronsäure wird in Pflanzen überwiegend durch die UDP-Glucose Dehydrogenase (UGD) katalysiert, die UDP-Glucose unter der Bildung von NADH in UDP-Glucuronsäure umwandelt. Arabidopsis thaliana besitzt vier UGD-Gene und ein Pseudogen, welche starke Homologien zu Genen anderer bekannter pflanzlicher UDP-Glucose Dehydrogenasen zeigen. Mit Hilfe von Promotor::GUS-Reportergenpflanzen und real time-PCR-Analysen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die vier UGD-Gene nicht nur in verschiedenen Geweben und zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Morphogenese exprimiert werden, sondern auch in unterschiedlicher Stärke. Dabei scheint jedoch zu jedem Zeitpunkt der Morphogenese, bis auf die Samenentwicklung, eine der vier UGD-Isoformen in Arabidopsis thaliana exprimiert zu werden. Eine biochemische Charakterisierung der verschiedenen Isoformen zeigte einen sehr ähnlichen Km-Wert von ca. 43 µM für NAD+, während sich die Km-Werte für UDP-Glucose deutlich voneinander unterschieden (123 - 335µM). Alle Isoformen unterlagen einer feedback-Hemmung durch UDP-Xylose. Dabei war eine starke Hemmung durch UDP-Xylose korreliert mit einer hohen Affinität zu UDP-Glucose. Neben NAD+ konnten alle untersuchten Isoformen in geringem Maße auch NADP+ als Cofaktor verwenden. Allerdings verringerte sich die Enzymaktivität dadurch um etwa 80%. Alternative Zuckersubstrate konnten dagegen nicht umgesetzt werden. Die biochemischen Unterschiede zwischen den UGD-Isoformen und die differentielle Expression ihrer entsprechenden Genekönnten eine wichtige Rolle bei der Regulation der Zellwandbiosynthese spielen. Denn die irreversible Oxidation von UDP-Glucose zu UDP-Glucuronsäure durch UGD fungiert als eine der Schaltstellen, an welcher der Kohlenstofffluss derpflanzlichen Zelle in Richtung Zellwandbiosynthese gesteuert werden kann. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen von Einfach-oder Doppel-knock out-Mutanten, bei denen durch eine T-DNA-Insertion ein oder zwei UGD-Gene ausgeschaltet waren, zeigte dementsprechend auch eine veränderte Zellwandzusammensetzung bei den Mutanten deltaUGD2, deltaUGD3 und deltaUGD1x deltaUGD4 und eine veränderte Funktion der Stomata bei deltaUGD1x deltaUGD4. Insgesamt waren die Phänotypänderungen gegenüber dem Wildtyp bei der Doppelmutante deltaUGD1x deltaUGD4 wesentlich ausgeprägter als bei den Einfachmutanten, was daran liegen könnte, dass der Ausfall eines UGD-Gens durch ein anderes kompensiert wird. Dafür sprechen auch die Ergebnisse der real time-PCR-Analyse, in der die Expression von UGD1, 2, 3 und 4 in sechs Tage alten Keimlingen des Wildtyps und der knock out-Mutanten untersucht wurde. Dort konnte nachgewiesen werden, dass sich das Ausschalten eines oder mehrerer UGD-Gene auf die Expression der übrigen UGD-Gene auswirkt.