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Identifizierung neuer Bindungspartner von Gephyrin, einem Strukturprotein inhibitorischer Synapsen
(2002)
Synapsen sind spezialisierte Zellkontakte, die der Kommunikation von Nervenzellen dienen. Für eine effiziente Signalübertragung ist es erforderlich, daß an diesem Prozeß beteiligte Proteine präzise und in hoher Dichte an der Synapse angereichert vorliegen. Die selektive Akkumulation von Glyzinrezeptoren sowie der verbreitetesten GABAARezeptoren an inhibitorischen Synapsen wird durch das periphere Membranprotein Gephyrin vermittelt. Gephyrin bindet direkt an die β-Untereinheit des Glyzinrezeptors und kann diesen vermittels seiner Affinität zu polymerisiertem Tubulin am Zytoskelett verankern. Um mehr über die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung und Funktion von inhibitorischen Synapsen zu erfahren, sollten in der vorliegenden Arbeit neue Interaktionspartner von Gephyrin identifiziert werden. Hierzu wurde das Zwei-Hybrid-System in Saccharomyces cerevisiae zur Analyse einer cDNA-Bank aus dem Gehirn von Ratten verwendet. Dies resultierte in der Sequenzaufklärung von 24 potentiellen Gephyrin-bindenden Proteinen. Von diesen erwiesen sich vier in einem weiteren Bindungsexperiment als positiv und kommen daher als hochaffine Interaktionspartner in Frage. Es handelte sich um die eng verwandten Dynein light chains-1 und -2 (Dlc-1/-2), den Natrium-Kalzium-Austauscher NCX2 und ein Fragment eines bisher unbekannten Proteins, das nicht weiter untersucht wurde. Im Einklang mit einer möglichen Interaktion zwischen NCX2 und Gephyrin gelang es zu zeigen, daß NCX2 sowie das verwandte Protein NCX3 in neuronalen Primärkulturen an inhibitorischen Synapsen mit Gephyrin-Immunreaktivität kolokalisierten. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Untersuchung der Interaktion zwischen Gephyrin und Dlc-1/-2. Die Bindedomäne von Gephyrin für Dlc-1/-2 konnte auf den Bereich von Aminosäuren 181-243 eingegrenzt werden, und eine Gephyrinmutante ohne dieses Bindemotiv wies keine Affinität zu Dlc-1/-2 auf. Sowohl endogenes als auch rekombinant exprimiertes Dlc-Protein kolokalisierte mit aus der Überexpression in HEK-Zellen resultierenden zytosolischen Gephyrinaggregaten. Weiter gelang die Coimmunpräzipitation von Komplexen aus Gephyrin und Dlc-1/-2 aus transfizierten HEK-Zellen, und bakteriell exprimierte GST-Fusionsproteine von Dlc-1 bzw. Gephyrin reicherten den jeweils anderen Bindungspartner aus Hirnextrakt an. In neuronalen Primärkulturen waren Dlc-Proteine zu großen Anteilen zytoplasmatisch lokalisiert, darüberhinaus jedoch in Abhängigkeit von der Zelldichte an inhibitorischen Synapsen angereichert. Dlc-1/-2 sind Komponenten der Motorproteinkomplexe Dynein und Myosin-Va, in welchen sie möglicherweise als Adapter für zu transportierende Lasten dienen. Es ist daher denkbar, daß Gephyrin über Dlc-1/-2 mit einem aktiven Transportprozess verbunden wird. Zur Untersuchung dieser Frage wurden EGFP-epitopmarkierte Gephyrinproteine in hippokampalen Neuronen exprimiert und auf ihre subzelluläre Lokalisation untersucht. Sowohl EGFP-Gephyrin als auch die Deletionsmutante ohne Dlc-Bindemotiv waren zuverlässig an inhibitorischen Synapsen angereichert, ein Lokalisationsdefekt aufgrund fehlender Dlc-Bindung wurde nicht beobachtet. Dieses Ergebnis spricht gegen eine essentielle Rolle von Dlc-1/-2 und möglicherweise assoziierten Motorproteinen im Transport von Gephyrin zur Synapse. Aktiver Transport kann jedoch andere Funktionen im Zusammenhang mit der subzellulären Lokalisation von Gephyrin haben, wie etwa im retrograden Transport zum Zellkörper des Neurons. Diese Frage wird in weiteren Experimenten zu untersuchen sein.
Mit der fortschreitenden Verkleinerung von Prozessoren und Speicherbausteinen in der Mikroelektronik ist der Einsatz neuer Materialien oft unumgänglich. Zur Zeit steht Siliciumdioxid, das als Dielektrikum in Transistoren eingesetzt wird, im Blickfeld des Interesses. Die kleiner werdenden Strukturen führen hier zu dünneren SiO2-Schichten, was bei Schichtdicken unter 2 nm einen Anstieg der Tunnelströme im SiO2 zur Folge hat. Dies stellt für die Bauelemente ein erhöhtes (Kurzschluss-) Risiko dar. Seit geraumer Zeit finden spezielle Speicherzellen große Aufmerksamkeit, in denen Perowskite für die Gate-Oxidschichten zum Einsatz kommen. Sie sind charakterisiert durch hohe Dielektrizitätskonstanten (ε > 20, SiO2 ~ 4 ) oder weisen ferroelektrische Eigenschaften auf. Als interessante Kanditaten für das Dielektrikum gelten zur Zeit BST (Barium-Strontium-Titanat), SBT (Strontium-Bismut-Tantalat) oder PZT (Blei-Zirkonium-Titanat). Die Einführung neuer Materialien in die Chip-Technologie ist immer mit einem Risiko verbunden. Einer der Hauptfaktoren für die Ausbeutelimitierung bei der Produktion von Halbleiterbauelementen ist die Metallkontamination auf Silicium-Oberflächen. Aufgrund ihrer Eigenschaften können Metallverunreinigungen die elektrischen Eigenschaften von Halbleiterbauelementen schädigen. Bisherige Untersuchungen an oben genannten Schichten konzentrierten sich auf das elektrische und physikalische Verhalten. Wenig war bislang bekannt über das Kontaminationsverhalten und dadurch bedingte Auswirkungen/Risiken auf die Bauelemente. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Kontaminationsaspekte, insbesondere während Hochtemperaturprozessen, einiger Metalle auf Silicium (100)-Oberflächen näher untersucht. Das Hauptaugenmerk lag hierbei neben dem Adsorptions- und Desorptionsverhalten auf der Diffusion folgender Elemente: Barium, Strontium, Bismut, Iridium und Platin. Erkenntnisse über die Reaktivität der Metalle bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen sollten mögliche Risikofaktoren des Einsatzes neuer obiger Dielektrikum-Schichten aufzeigen. Die Ergebnisse für die untersuchten Elemente der II. Hauptgruppe, Barium und Strontium sprechen für ein träges Reaktionsverhalten während der Temperprozesse. Unter den vorliegenden Bedingungen wurden die Metalle im nativen oder thermischen Oxid eingelagert (gute Oxidbildner) und ließen sich mittels einer Oxid-Ätzung vollständig von der Si-Oberfläche entfernen. Unabhängig von der Atmosphäre (N2, O2) und der Si-Oberfläche (hydrophil, hydrophob) waren keine Quer-Kontaminationen durch Desorption zu beobachten. Angesichts der starken Tendenz zur Oxid-Bildung bzw. Einlagerung ließ sich keine nennenswerte Diffusion ins Si-Substrat erkennen. Ferner war ein Einfluss auf die Oxidationsrate und Oberflächenrauhigkeit nicht zu beobachten. Mit Blick auf den Einsatz in der CMOS-Technologie stellen Barium und Strontium, wegen ihres geringen Diffusionsvermögens, keine Gefahr für die Si-Substrateigenschaften dar. Sie können jedoch als Verunreinigungen Si-Oxid zu einer Anreicherung an zusätzlichen positiven Ladungen führen und sich negativ auf die Qualität des Oxids auswirken. Bismut präsentierte sich auf hydrophilen Si-Substraten insbesondere unter N2-Atmosphäre als sehr volatil. Dieses Verhalten, höchstwahrscheinlich flüchtiger Bi-Oxide, kann durch Gasphasentransport zu Quer-Kontaminationen benachbarter Si-Substrate führen. Unabhängig von der Temperatmosphäre lassen sich Quer-Kontaminationen ausschließlich auf oxidierten Si-Substraten beobachten, was auf die Notwendigkeit eines bereits vorhandenen dünnen Siliciumoxids als Voraussetzung für eine Quer-Kontamination hindeutet. Eine mögliche Erklärung wäre in der Bildung von weniger flüchtigen Bi-Silikaten zu finden. Die enormen Verluste an Bismut auf hydrophoben Oberflächen finden eine Begründung in dem hohen Abdampfverhalten des vermutlich reduktiv abgeschiedenen Bismuts auf dem Silicium Ähnlich wie Barium und Strontium bevorzugt Bismut den Verbleib im Oxid während Oxidationsprozessen (Bildung von Oxiden und mgl. Bi-Silikaten). Auch hier wiesen die Verunreinigungen keinen Einfluss auf das Oxidwachstum sowie dessen Oberflächenrauhigkeit auf und ließen sich mit einer Oxid-Ätzung von der Si-Oberfläche entfernen. Tiefenprofil- und ELYMAT-Untersuchungen ließen keine Diffusion und schädliche Einflüsse auf die Eigenschaften des Siliciums beobachten. Prozesstechnisch gesehen ist die Bildung möglicher Bi-Silikate unerwünscht, da sie wegen der unterschiedlichen Dichte des SiO2 zu Stress-Regionen auf dem Wafer führen können [21]. Weiterhin besteht gerade in der hohen Flüchtigkeit und Quer-Kontamination ein hohes Kontaminationsrisiko für die Prozess-Apparaturen, andere Wafer und somit der „Verschleppung“ in andere Technologien. Von einer anderen Seite zeigten sich die untersuchten Metalle der Platingruppe, Iridium und Platin. Verunreinigungen an Iridium diffundieren, unabhängig von den RTPBedingungen, ins Si-Substrat und führen zu einer eindeutigen Verringerung der Ladungsträgerlebensdauer („Liftime-Killer“ [45]). Hier zeigten in O2 behandelte Substrate niedrigere Eindringtiefen, was auf eine stärkere Desorption flüchtiger Oxidverbindungen und denkbaren Ir-O-Si-Verbindungen im SiO2 [174] zurückgeht. Parallel hierzu waren Quer-Kontaminationen zu beobachten die durch die Flüchtigkeit von IrO3 erklärt werden können. Ferner führen Verunreinigungen an Iridium zu einem geringeren Oxidwachstum. AFM-Untersuchungen unterstützen die Vermutung einer Ir-Silicidierung an der SiO2/Si-Grenzfläche unter N2-Atmosphäre und forcieren die Bildung von diffusionseinschränkenden Ir-Verbindungen unter O2. Das in der Halbleiter-Technologie bereits eingesetzte Platin ist ausreichend untersucht worden [45] und begleitete die Untersuchungen als Referenzelement. Aus der Literatur bereits bekannt, zeigt Platin ein ausgeprägtes Diffusionsvermögen in das Si-Substrat, unabhängig von dem Temperaturprozess. Dort wirkt es als Generations-/ Rekombinationszentrum und reduziert die Lebensdauer der Ladungsträger. Quer-Kontaminationen waren generell nicht zu beobachten, da unter den vorliegenden Versuchsbedingungen keine flüchtigen Pt-Verbindungen gebildet werden. Dem Iridium ähnlich zeigte Platin bei 1000°C unter O2 im Vergleich eine etwas niedrigere Oxiddicke, was ebenfalls in der Bildung einer Diffusionsbarriere bzw. Pt-O-Si-Bereichen [174] einen möglichen Interpretationsansatz findet. Hinsichtlich des Einsatzes in der Halbleitertechnologie stellen Iridium und Platin wegen ihrer Eigenschaften (hohe Mobilität sowohl im SiO2 und Si, Gasphasentransfer (Ir unter O2), Reduktion der Ladungsträgerlebensdauer) ein enormes Risiko- und Störpotential dar. Während bei Bismut ebenso die Gefahr der Quer-Kontamination besteht, sind die Metalle Barium und Strontium dagegen als weniger kritisch einzustufen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Eigenschaften heißer dichter Kernmaterie in relativistischen Schwerionenkollisionen mit Hilfe transporttheoretischer Methoden untersucht. Dabei wurden über einen weiten Energiebereich von 1 A GeV am GSI/SIS18 über BNL/AGS und GSI/SIS200 bis hin zu 160A GeV Einschußenergie am CERN/SPS verschiedene Observablen diskutiert und mit eigenen Modellrechnungen verglichen. Zunächst wurden in Kapitel 1 in die theoretischen Grundlagen der mikroskopischen Transporttheorie eingeführt und die wichtigsten semiklassischen mikroskopischen Transportmodelle vorgestellt. Das unter eigener Mitwirkung am Institut für Theoretische Physik entstandene Transportmodell, das UrQMD-Modell, wurde im Rahmen dieser Arbeit bis zur Versionsnummer 1.3 verbessert und erweitert. Das Modell und ein Überblick verschiedener Observablen im Modell wurden bereits früher gemeinsam publiziert. Die ausführliche Diskussion dieses Modells in der jetzigen Fassung findet sich in Kapitel 2. Besonders der komplexe Kollisionsterm wird detailliert und systematisch beschrieben. Wo vorhanden, werden die implementierten Kanäle und Wirkungsquerschnitte den experimentellen Daten gegenübergestellt. In Kapitel 3 wurde eine Methode zur relativistisch korrekten Berechnung von Baryon und Mesonendichten sowie von Energiedichten entwickelt. Mit dieser Methode konnten Zeitentwicklungen und Ortsraumverteilungen von Dichten im Bereich von 1 bis 160 A GeV erstellt werden. Im Vordergrund der Analysen stand die Fragestellung, welches Raum-Zei-tVolumen die Hochdichtephase in Abhängigkeit von der Einschuß energie einnehmen kann. Bemerkenswertes Ergebnis dieser Untersuchungen war, daß die maximal erreichbare Dichte zwar mit der Einschußenergie monoton ansteigt, je doch eine besonders ausgedehnte und langlebige Phase hoher Baryonendichte bei Einschußenergien zwischen 5 und 10 GeV/Nukleon erreicht wird. Auch wurde am Beispiel des Systems Uran-Uran bei 23 A GeV untersucht, inwieweit durch den Einsatz deformierter Kerne die Hochdichtephase intensiviert werden kann. Die Rechnungen haben gezeigt, daß die vorhergesagte Steigerung der Baryondichte um 30% bei Verlängerung der Hochdichtephase um 50% nicht realistisch ist. In weiteren Analysen wurden die in Schwerionenkollisionen erreichbaren Energiedichten diskutiert, sowie eine Interpretation der nichtformierten Hadronen als ein "partonischer" Freiheitsgrad vorgestellt. Es hat sich gezeigt, daß der partonische Beitrag zur Energiedichte vor allem in der Frühphase der Kollision bei weitem überwiegt. Im Kapitel 4 wurde ein Modell zur Produktion von Kaonen in der Nähe der Produktionsschwelle vorgestellt. Die elementaren Produktionskanäle wurden hier über hoch massige Resonanzen modelliert, im Gegensatz zu anderen vorgeschlagenen Modellen, die direkte Parametrisierungen vornehmen. Desweiteren wurden alle implementierten Produktions und Streukaäale von seltsamen Hadronen im Vergleich mit experimentellen Daten diskutiert. Das Kapitel 5 widmete sich ausschließlich der Produktion von Mesonen bei SIS18 Energien. Zunächst wurde ausführlich auf den Produktions und Absorptionsprozeß von Pionen im System Pi-N-Delta eingegangen. Sowohl Spektren als auch Multiplizitäten in Abhängigkeit von der Anzahl an Partizipanten im UrQMD wurden mit experimentellen Daten von TAPS und FOPI verglichen. Die Ergebnisse legen nahe, daß die Pionproduktion bis 2 A GeV im Rahmen der mikroskopischen Transporttheorie vollständig verstanden werden kann, wenn neben dem Delta1232 auch alle höheren Resonanzzustände sowie multiste-pAnregungen in die Rechnung einbezogen werden. Auch die Produktion von Kaonen in Abhängigkeit von der Anzahl an Partizipanten und der Systemgröße wurde diskutiert. Auch hier können die gemessenen Zusammenhänge qualitativ im Rahmen des mikroskopischen Modells verstanden werden. Zum Abschluß des Kapitels wurden Ausfrierzeiten, radien und dichten für einzelne Baryonen und Mesonenspezies analysiert. Zentrales Ergebnis dieser Untersuchungen ist, daß es bei einer Schwerionenreaktion keineswegs zu einem simultanen Ausfrieren aller Hadronspezies bei gleicher Dichte und gleichem Radius kommt, sondern daß die Ausfrierverteilungen eine komplexe Zeit und Ortsraumstruktur aufweisen, die u.a. von den Wirkungsquerschnitten und Produktionsmechanismen für die einzelnen Spezies abhängt. In Kapitel 6 wurden die erst kürzlich publizierten Daten der NA49Kollaboration bei 40, 80 und 160 A GeV einer detaillierten Analyse mit dem UrQMD-Modell unterzogen, sowie Vorhersagen für die geplanten Messungen bei 20 A GeV gemacht. Es konnte gezeigt werden, daß es für den Vergleich von Modellrechnung mit dem Experiment notwendig ist, genau die gleiche Zentralitätsbestimmung wie im Experiment zu benutzen. Eine einfache Beschränkung auf ein festes Stoßparameterintervall führt zur Selektion einer falschen Gruppe von Ereignissen. Ein Vergleich des Abstoppverhaltens von Protonen, Hyperonen, Antiprotonen und Antihyperonen hat gezeigt, daß zwar die Dynamik der Baryonen im Rahmen des UrQMD-Modells gut verstanden werden kann, jedoch die Produktion der Antibaryonen um ein mehrfaches unterschätzt wird. Verschiedene Erklärungsmodelle, wie screening oder die Verletzung des detaillierten Gleichgewichts bei Stringzerfällen wurden diskutiert. Auch der starke Einfluß der Implementierung von Annihilationskanälen konnte aufgezeigt werden. Zum Schluß des Kapitels wurde die Produktion von Kaonen und Antikaonen im Modell und im Experiment einer genauen Analyse unterzogen. Die Modellrechnungen legen nahe, daß bei SPS-Energien weder Kaonen noch Antikaonen als direkte Signael der frühen Phase der Kollision betrachtet werden können. Zwar wird die Gesamtseltsamkeit des Systems im wesentlichen in den ersten, harten Kollisionen erzeugt, jedoch finden hinterher noch zahllose Kollisionen mit Seltsamkeitsaustausch statt, bevor Kaonen und Antikaonen endlich ausfrieren. Im letzten Kapitel schließlich wurden die Analysen auf die Daten vom BNL/AGS ausgedehnt und ein vergleichender Überblick über den gesamten Energiebereich von SIS18 bis SPS vorgenommen. Um die Robustheit sowohl der Observablen als auch der mikroskopischen Transporttheorie zu testen, wurden bei acht Energien die Form der Spektren von Protonen, Pionen, Kaonen, Lambdas und Sigmas in Rechnungen mit zwei unabhängigen Transportmodellen und den experimentellen Daten verglichen. Desweiteren wurden für alle Spektren sowohl die 4-Pi -Daten als die Werte bei Mittrapidität ermittelt und als Funktion der Einschußenergie mit den experimentellen Daten verglichen. Schließlich wurden aus den Multiplizitäten Hadron-Hadron-Verhältnise gebildet und diese wiederum mit den Daten verglichen. Neben vielen interessanten Detailerkenntnissen konnte das folgende grobe Bild entwickelt werden: Die korrekte Produktion von Seltsamkeit, sowohl in Hyperonen als auch in Kaonen, gelingt beiden hadronischen Modellen, ohne daß besondere nichthadronische Effekte angenommen werden müßten, über den gesamten Energiebereich. Die Pionproduktion wird bei den verschiedenen Energien mal von dem einen, mal von dem anderen Modell besser beschrieben, nie jedoch sind die Abweichungen größer als etwa 20%. Die Teilchenverhältnisse, deren qualitativer Verlauf ein mögliches Signal für einen Phasenübergang sein soll, werden trotz guter Beschreibung der Pionen und sehr guter Beschreibung der Kaonen von beiden Modellen qualitativ völlig unterschiedlich vorhergesagt. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Rechnungen legen also nahe, daß zum einen die Rolle der Seltsamkeitsproduktion als Indikator für nichthadronische Physik überdacht werden sollte, und zum anderen der qualitative Verlauf des K +/Pi -Verhältnisses aufgrund der geringen Fehlertolleranz nicht als belastbarer Beweis eines Phasenübergangs gesehen werden sollte.
ZIELSETZUNG: Die postoperative kardiale Ventrikelfunktion ist stark mit den Auswirkungen der kardialen Ischämie und den Auswirkungen der extrakorporalen Zirkulation (EKZ) assoziiert. Um die alleinigen Auswirkungen der EKZ auf die postoperative linksventrikuläre Herzfunktion zu untersuchen, wurde ein Leitfähigkeitskatheter verwendet mit dem die linksventrikuläre Funktion mit Hilfe der Druck-Volumen Beziehung vor und nach EKZ erfasst werden konnte. METHODEN: 22 drei Wochen alte Schweine wurden sternotomiert und einer normothermen EKZ von 1 h ausgesetzt. Der Leitfähigkeitskatheter wurde in den linken Ventrikel eingeführt. Die endsystolische Druck-Volumen-Beziehung (ESPVR), der linksventrikuläre enddiastolische Druck (LVEDP) und der systemische Gefässwiderstand (SVR) wurden in Ruhephasen vor und 15 Min nach EKZ in Gruppe A (n=11) gemessen. Gruppe B (n=11) diente als Kontrollgruppe ohne EKZ. ERGEBNISSE: Vor der Implementierung der EKZ wurden in beiden Gruppen keine signifikanten Unterschiede efunden. Als Mass für eine eingeschränkte LV Funktion wurde eine signifikant niedrigere Steigung der ESPVR (mmHg/ml) in der EKZ-Gruppe nach Abgang von der HLM im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt (1,69 ± 0,51 vs. 1,86 ± 0,55; p<0.0081). In der EKZ-Gruppe war der maximale Druckanstiegsgeschwindigkeits- Index dP/dtmax index (mmHg/sec/kg) signifikant erniedrigt (1596,10 ± 339,51 vs. 2045,0 ± 205,57; p<0.03). In Gruppe A war die Steigung der EDPVR (mmHg/ml) signifikant erniedrigt (7,21 ± 2,20 vs. 5,43 ± 1,36; p = 0,0293), während der LVEDP (mmHg) signifikant erhöht war (11,67 ± 2,59 vs. 5,39 ± 0,92; p<0.001). Zudem konnte ein signifikant niedrigerer systemischer Gefässwiderstand- Index(SVR)(dyn.sec.cm-5/kg) in der Kontrollgruppe gemessen werden (1407,30 ± 176,44 vs. 1676,94 ± 312,96; p<0.0001). SCHLUSSFOLGERUNG: Auch ohne ischämischen Arrest führt der Einsatz der EKZ zu einer signifikanten Einschränkung der LV Funktion in der frühen post EKZ Phase. Dies sollte bei der Entscheidungsfindung für die Wahl der Operationsstrategie bedacht werden.
In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Ansätze zur Korrektur/Eliminierung von Punktmutationen in Nukleinsäuren untersucht. Im ersten Ansatz wurden chimäre RNA/DNA-Hybride zur Korrektur von einer Punktmutation im p22phox-Gen ausgetestet, während im zweiten Ansatz ein „Hammerhead“-Ribozym zur Eliminierung von mutierter N-ras-RNA untersucht wurde.
Bisher existieren keine etablierten Methoden zur Überwachung einer Therapie mit GPIIb/IIIa Antagonisten. Die Dosierung erfolgt nach empirisch erhaltenen Schemata. Um eine antiaggregatorische Therapie mit GPIIb/IIIa Antikörpern (Reopro®) zu überwachen ist neben der turbidimetrischen Agonisten induzierten Aggregation die Bestimmung der Fibrinogenbindung mittels Durchflußzytometrie denkbar. Neue orale GPIIb/IIIa Antagonisten werden derzeit in klinischen Studien geprüft. Zukünftige Indikationen, wie eine dauerhafte antiaggregatorische Therapie in der Primärprophylaxe und der Sekundärprophylaxe nach kardiovaskulären Ereignissen benötigten die Einhaltung eines engen niedrigeren therapeutischen Bereich als bei der Behandlung nach einer PTCA. Dies ist auch im Hinblick optimaler Effektivität bei gleichzeitiger Limitierung von haemorrhagischen Komplikationen notwendig. Bisher ist nicht bekannt, ob die in einigen Studien benutzten Methoden (Aggregation, Durchflußzytometrie und Blutungszeit) zum Monitoring einer Therapie mit GPIIb/IIIa Antikörpern auch für ein Therapiemonitoring von oralen peptidomimetischen Antagonisten übertragbar sind. Ein adäquates Monitoring dieser Substanzen dürfte für ihre Weiterentwicklung unabdingbar sein, besonders vor dem Hintergrund der bisher durchgeführten Studien, die alle fehlgeschlagen sind und bei denen kein Therapiemonitoring durchgeführt wurde. In dieser Arbeit wurden folgende Methoden verglichen: Turbidimetrische Aggregometrie, Impedanzaggregometrie, Fibrinogenbindung und Blutungszeit. Für die durchflußzytometrische Bestimmung der Fibrinogenbindung wurde eine Vollblutmethode entwickelt mit der selektiv die Rezeptorblockade unterschiedlicher Fibrininogenrezeptorantagonisten bestimmt werden kann. Zunächst konnte gezeigt werden, daß verminderte Zellzahlen in der Probenaufbereitung keine Fehlerquelle darstellen. Lysierte Erythrozyten, auch in niedrigen Konzentrationen können den Meßansatz dagegen erheblich stören. Dadurch kommt zu einer linearen Aktivierung der Thrombozyten. Um Verdünnungseffekte bei einer Peptidomimetikatherapie während der Probenaufbereitung zu bestimmen, wurden Verdünnungsreihen mit SR121566a (einem peptidomimetischen Prodrug) gespiked und die Fibrinogenbindung bestimmt. Dabei konnte eine Reduktion der Hemmung der Fibrinogenbindung nachgewiesen werden. In einer klinischen Studie wurde die turbidimetrische Aggregometrie mit der durchflußzytometrischen Bestimmung der Fibrinogenbindung verglichen. Die Probanden wurden mit ASS und/oder Clopidogrel vorbehandelt und es erfolgte eine Probenentnahme vor und nach Medikamenteneinnahme. Ein Teil der Proben wurde mit SR121566a und Abciximab in vitro gespiked. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigten eine dosisabhängige Inhibition der Fibrinogenbindung bei allen vier Substanzen, die auch additiv wirkten. Die Hemmung lag in einem Bereich von 0% bis 95%. Im Gegensatz dazu war die induzierte Aggregometrie unterhalb einer 50% Rezeptorblockade nahezu normal und damit als Monitoringtest nicht geeignet. Der therapeutische Bereich bei zukünftigen Indikationen von einer Therapie mit oralen GPIIb/IIIa Hemmern in der Sekundärprävention von kardiovaskulären Ereignissen benötigt eine standardisierte und sensitive Methode zum Monitoring. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß die durchflußzytometrische Bestimmung von Fibrinogen am GPIIb/IIIa Rezeptor in 1:1 verdünntem Vollblut eine gute Möglichkeit für die Etablierung therapeutischer Bereiche in der Langzeitprophylaxe bietet.
Ein transgenes Mausmodell zur Untersuchung der Zink-vermittelten Modulation des Glyzinrezeptors
(2002)
Zink (Zn2+) ist ein im Zentralnervensystem der Säuger weitverbreitetes Metallion, das in kleinen synaptischen Vesikeln hoch angereichert wird. Zink-reiche Vesikel sind besonders gut dokumentiert in exzitatorischen Synapsen, z.B. im Hippocampus, sie werden jedoch auch in inhibitorischen Synapsen von Neuronen des Rückenmarks oder der Retina gefunden. Nach exozytotischer Freisetzung dieser Vesikel in den synaptischen Spalt können Zink-Konzentrationen von bis zu zehn mikromolar erreicht werden. In vitro hat Zink modulatorische Effekte auf eine Vielzahl von Neurotransmitter-Rezeptoren, so u.a. auf Glutamat-Rezeptoren vom AMPA-, NMDA-, oder Kainat-Typ, aber auch auf GABAA- und Glyzinrezeptoren (GlyR). Zink wurde daher als endogener Neuromodulator vorgeschlagen. Der modulatorische Effekt von Zink auf den GlyR ist biphasisch: Niedrige mikromolare Konzentrationen bewirken eine Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme, höhere mikromolare Konzentrationen dagegen deren Inhibition. Dieser potenzierende Effekt von Zn2+ kann in transfizierten HEK 293 Zellen oder cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten durch eine Punktmutation im N-terminalen Bereich des α1-Polypeptids aufgehoben werden (D80A (Lynch et al., 1998), oder D80G (Laube et al., 2000)). Ein revers-genetischer Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit benutzt, um Rückschlüsse auf die physiologische Relevanz der Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme durch Zn2+ zu gewinnen: In einem „Knock-In“ Mausmodell wurde durch homologe Rekombination in ES-Zellen eine Mutation in der kodierenden Sequenz des GlyRα1-Genlocus eingeführt, die den o.g. AS Austausch (D80A) in der adulten ligandenbinden Untereinheit des GlyR bewirkt. Um die Veränderung des Genlocus zu minimieren war die als Selektionsmarker bei der Einführung der Mutation benötigte Neor-Kassette von zwei loxP-Sequenzen flankiert, und konnte so nach dem Nachweis des homologen Rekombinationsereignisses durch Wirkung der Cre-Rekombinase wieder entfernen werden. Nach Blastozysteninjektion homolog rekombinierter ES-Zellen zur Herstellung chimaerer Tiere und Keimbahntransmission der Mutation in einem Teil dieser Chimaeren konnten so Mauslinien mit zwei verschiedenen mutierten Allelen generiert werden: In zwei Linien wurde das intronisch miteingeführte Neor-Element bereits in ES-Zellen in vitro deletiert, wonach lediglich eine der loxP-Sequenzen verbleibt; in einer dritten Linie wurde der Selektionsmarker als intronische Insertion belassen. Während heterozygote Tiere aller drei Linien keinerlei offensichtliche Auffälligkeiten zeigen, findet sich bei homozygot-mutanten Tieren aller Linien ein mit der zweiten postnatalen Woche eintretender Phänotyp, dessen auffälligste Symptome eine verstärkte akustisch oder taktil induzierbare Schreckreaktion, ein erhöhter Muskeltonus, taktil induzierbarer Tremor und generalisierter Myoklonus sowie ein verlangsamtes Wiederaufrichten sind. Dieser Symtomkomplex ähnelt stark dem der spontanen Mutationen des GlyRs spasmodic, spastic oder oscillator und weist auf einen Verlust glyzinerger Inhibition als Ursache hin. Die verschiedenen Allele verursachen unterschiedlich starke Phänotypen: Das mutierte Allel, in welchem die Neor–Kassette deletiert ist, bewirkt einen schwachen Phänotyp, wohingegen das Verbleiben des intronischen Neor-Elements einen schwerwiegenderen Phänotyp zur Folge hat, und homozygote Tiere bis auf wenige Ausnahmen bis zur achten Lebenswoche sterben. Die Immunoblot-Analyse zeigt, daß bei homozygot mutanten Tieren dieser stärker betroffenen Linie ein partieller Verlust der Proteinexpression der GlyRα -Untereinheit auftritt. Dagegen ist in Tieren, in denen die Neor-Kassette deletiert ist, keine Verringerung der GlyRα-Expression durch Immunoblot nachweisbar. Der milde Phänotyp ist demnach am einfachsten durch den spezifischen pharmakologischen Effekt der Mutation, d. h. den Verlust der Zn2+-induzierten Potenzierung des GlyR, erklärbar. Hiermit wurde erstmals ein Hinweis daraufhin gewonnen, daß niedrige mikromolare Konzentrationen von Zn2+ für die physiologische Funktion des adulten GlyR notwendig sind. Darüberhinaus unterstreichen die Ergebnisse das Potential des GlyR als Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Muskel-relaxierender oder sedativer Substanzen, die - ähnlich der Wirkung von Zn2+ - einen potenzierenden Effekt auf die glyzinerge Inhibition haben.
Der Einfluss konventioneller und modifizierter hyperglykämischer Reperfusion mit und ohne Alprostadil auf die Ischämie- und Reperfusionsschäden des Skelettmuskels wurde an 24 Schweinen untersucht. Nach der Narkose wurden sechs Versuchstiere als in vivo Kontrollgruppe instrumentiert und für 7,5 Stunden ohne Ischämie beobachtet (Gruppe1, n = 6). Bei den anderen Versuchstieren wurde eine künstliche Ischämie der Hinterläufe durch Abklemmen der infrarenalen Aorta für sechs Stunden hervorgerufen. Im Anschluß daran folgte in Gruppe 2 (n = 8) eine konventionelle Reperfusion mit normalem Blut unter systemischem Druck. Gruppe 3 (n = 5) und Gruppe 4 (n = 5) erhielten in den ersten 30min der Reperfusionsphase eine modifizierte hyperglykämische Reperfusion im Verhältnis von einem Teil Reperfusat zu sechs Teilen Blut. Die Zusammensetzung des Reperfusats war: 500ml 10-prozentiger Glukoselösung, 200ml Citrat–Phosphat–Dextrose (CPD), 10ml Tromethamol (THAM), 125ml Aspartat und Glutamat in einer Konzentration von jeweils 13mmol/l und 180ml Kochsalzlösung (0.9%). Die Gruppe 4 erhielt zusätzlich zur modifizierten Reperfusion 20μg Alprostadil. Beide Gruppen wurden unter kontrollierten Bedingungen (intraaortaler Druck von 40mmHg, Blutfluß von 400–500ml pro min und einer konstanten Temperatur von 37°C) reperfundiert. Die sechsstündige komplette Ischämie führte zu einem hochsignifikanten Rückgang des Muskel pH–Wertes, der Muskeltemperatur und des Bewegungsgrads im Kniegelenk des Schweinehinterlaufs. Die energiereichen Phosphate nahmen um etwa 50%, verglichen mit den Ausgangswerten, ab, und in der systemischen Zirkulation zeigte sich ein beträchtlicher Anstieg der CK, der LDH und des Kaliums. Im Anschluss an die sechsstündige ischämische Periode führte die konventionelle Reperfusion unter systemischem Druck zu schweren Reperfusionsschäden. Als Zeichen der Zellschädigung zeigte sich im Verlauf der 90-minütigen Reperfusion eine erhebliche Zunahme des Wassergehalts im Skelettmuskel, der Muskelrigidität und der systemischen CK-, LDH- und Kaliumkonzentration. Der Blutfluß in der Extremität und in der A. Iliaca, der Sauerstoff- und Glukoseverbrauch nahmen signifikant ab, und die Konzentration der Gesamtadeninnukleotide sowie der Muskel-pH lagen am Ende der Reperfusionsphase auf dem postischämisch niedrigen Niveau. Im Gegensatz zur konventionellen Reperfusion konnte aufgezeigt werden, dass eine deutliche Verbesserung des Metabolismus und der Funktion der Beine erreicht werden kann, indem die Art der Reperfusion und die Zusammensetzung des Reperfusats in den initialen 30 Minuten der Reperfusionsphase modifiziert werden (Gruppe 3 und Gruppe 4). Die modifizierte hyperglykämische Reperfusion (Gruppe 3) vermochte den Sauerstoffverbrauch den Kontrollwerten anzugleichen und verhinderte die Ausbildung von Gewebsödemen. Desweiteren konnten hierdurch der Gehalt der Adeninnukleotide im Gewebe zu 93% den Ausgangswerten angeglichen und die CK-, LDH- und Kaliumfreisetzung signifikant erniedrigt werden. Der Bewegungsgrad im Kniegelenk des Schweinehinterlaufs als Maß für die Muskelrigidität und Funktionalität war im Vergleich zur konventionellen Reperfusion deutlich erhöht. Zudem resultierte die Bereitstellung des hyperglykämischen Reperfusats in einer hochsignifikanten Zunahme des Glukoseverbrauchs im Vergleich zur Kontrollgruppe und der konventionellen Reperfusion. Der Zusatz von Alprostadil (Gruppe 4) zeigte bezüglich der Ödem-entstehung, der CK-, LDH- und Kaliumfreisetzung und dem Glukose- und Sauerstoffverbrauch vergleichbare Ergebnisse mit Gruppe 3. Ausserdem zeigte sich ein signifikanter Anstieg des des intramuskulären pH–Werts und der Blutfluß in der Arteria iliaca war, verglichen mit Gruppe 3 und sogar mit Gruppe 1 (Kontrolle), signifikant erhöht. Auch der Bewegungsgrad als Maß für die Muskelrigidität lag höher als in Gruppe 3 und war vergleichbar den Ausgangswerten. Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen noch einmal die Wichtigkeit der Entwicklung von Behandlungsstrategien speziell in der initialen Reperfusionsphase, um weiteren Schaden an dem ohnehin durch Ischämie geschädigten Gewebe zu vermeiden. Zukünftige Studien sollten Hinweise darauf geben, inwiefern weitere Modifikationen der initialen Reperfusion zur Erhaltung der Skelett-muskulatur und deren Funktion beitragen können.
Gephyrin ist ein Protein mit strukturellen und enzymatischen Eigenschaften. Ein Aspekt der strukturellen Funktion ist die synaptische Verankerung inhibitorischer Rezeptoren an das Zytoskelett. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass ein Interaktionspartner von Gephyrin, Collybistin, die Organistion des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Die enzymatische Funktion von Gephyrin besteht in der Synthese eines Kofaktors, welcher für die Aktivität von Molybdoenzymen notwendig ist. Das gezielte Ausschalten des für Gephyrin kodierenden Gens weist im Mausmodell einen letalen Phänotyp auf. Als Ursache hierfür kommen die fehlende synaptische Aggregation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren in neuronalem Gewebe, sowie die fehlende Aktivität von Molybdoenzymen in peripheren Organen in Frage. Da sowohl Molybdän-Kofaktor-Defizienzen beim Menschen, wie auch bestimmte Mutationen von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren bei Mäusen letal sind, kann der beobachtete Phänotyp nicht eindeutig zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit verfolgt zwei Ziele. Das erste ist eine Einengung der Binderegion von Collybistin an Gephyrin. Dabei konnte diese durch immunzytochemische und biochemische Methoden auf wenige Aminosäuren genau beschrieben werden. Verschiedene Strukturvorhersageprogramme weisen auf eine helikale Struktur für diesen Sequenzabschnitt hin. Der Austausch der Aminosäuren R107, D108, R111 und E117 mit Alanin führt über den Verlust ionischer Ladungen zum Verlust der Bindungseigenschaft. Das zweite verfolgte Ziel ist die Einführung eines transgenen Konstrukts, welches nur die Molybdän-Kofaktor-Synthesefunktion wiederherstellen soll, in den genetischen Hintergrund der Gephyrin-„knock-out“ Maus. Ziel dieser Analyse ist die Herstellung eines Phänotyps, bei dem die inhibitorische Transmission in einer Weise gestört ist, welche Symptome der Molybdän-Kofaktor-Insufizienz ausschließt. So sollte die Ursache für die Letalität der Gephyrin-Mutation zugeordnet werden können. Dazu wurde das pflanzliche Gephyrin-Homolog Cnx1 in ein Expressionskonstrukt kloniert, und nach biochemischer, immunzytochemischer und funktioneller Analyse in heterologen Zellen in eine Wildtyp-Mauslinie injiziert. Diese wurde mit Geph-/--Mäusen gekreuzt und die daraus resultierenden homozygoten, transgenen Tiere analysiert. Diese Tiere sterben ebenso wie die Geph-/--Mäuse am Tag der Geburt. mRNA des Transgens konnte in Hirn und Leber nachgewiesen werden, das Protein allerdings nur in Hirnextrakten. Dementsprechend lag die Aktivität des für die Lebensfähigkeit von Säugetieren wichtigsten Molybdoenzyms, der Sulfitoxidase, in Leberextrakten nur bei 30%. Eine morphologische Untersuchung von Gehirnschnitten ergab keine Auffälligkeiten. Eine Immunhistochemische Analyse von Rückenmarkschnitten zeigte in Übereinstimmung mit Beobachtungen an Gephyrin-„knock out“-Mäusen diffus verteilte Glyzin-Rezeptoren. Somit wurde eine Maus mit beeinträchtigter inhibitorischer synaptischer Transmission und partiell wiederhergestellter Molybdän-Kofaktor Biosynthese hergestellt. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der Aktivität der Sulfitoxidase in Leberextrakten verschiedener Geph-/- + cnx Tiere wäre ein Unterschied in der Lebenserwartung verschiedener Tiere zu erwarten gewesen, wenn die Defizienz dieses Molybdoenzyms die Ursache für den letalen Phänoyp gewesen wäre. Da die transgenen Tiere aber wie die Geph-/- Mäuse wenige Stunden nach der Geburt sterben, ist davon auszugehen, dass der beschriebene Phänotyp auf das Fehlen der strukturellen Eigenschaften von Gephyrin zurückzuführen ist, und nicht von einer durch Beeinträchtigung des Schwefelstoffwechsels hervorgerufene progressive Schädigung des ZNS.
Auf der Basis komplexer Paaruntersuchungen mit dem erweiterten Gießen-Test (pro Partner sieben Auswertungsbögen) werden zwölf Paare beschrieben und analysiert, die in einer Beziehungskrise die Psychosoziale Ambulanz der Frankfurter Universitätsklinik aufsuchten, um Beratungsgespräche und gegebenenfalls therapeutische Hilfe in Anspruch zu nehmen. Der Erweiterung der Testanwendung auf die Erfassung der Einfühlungsbilder beider Partner (eingefühltes Selbst- und Beziehungsbild sowie eingefühltes Partnerbild, Moeller 1979, siehe 3. Methodik) lag unter anderem die Vermutung zugrunde, dass die — immer auch von der Durchlässigkeit des Partners abhängige — Einfühlungsfähigkeit Aufschluss über den Grad der Beziehungsintensität sowie der Kommunikation des Paares zu geben vermag. Anders formuliert: gravierende Einfühlungsdefizite können möglicherweise auf eine Beziehungsstörung hinweisen, die - wie auch immer bedingt - mit einem zu geringen Austausch über die inneren Befindlichkeiten zusammenhängt. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die untersuchten Paare ausnahmslos aufgrund einer Beziehungskrise um professionelle Hilfe nachsuchten, sodass mit globalen oder selektiven Einfühlungsdefiziten zu rechnen ist, aber unter Umständen auch mit einer brüchig gewordenen kollusiven emotionalen Abwehr (Dicks, 1969, S. 68 ff.) die sich in einer — auf den ersten Blick — hohen wechselseitigen Rollenbestätigung niederschlagen wird (siehe 2. Einführung). Die vorliegende Studie demonstriert, welche Aussagen aus den direkten Profilvergleichen hergeleitet werden können, zu denen systematisch auch die Beziehungsbilder einbezogen werden, welche die inneren Veränderungen der Partner in der Beziehung spiegeln. Im Anschluss an jeden Profilvergleich wird gezeigt, inwieweit - ausgehend von je spezifischen Auffälligkeiten - intensive Analysen von Paarbeziehungen anhand der Konzentrierten Paardokumentation durchgeführt werden können (siehe 4.1 Profilvergleiche und dynamische Interpretationen). Damit wird das diagnostische Potenzial des erweiterten Gießen-Tests ausgelotet, indem von einfachen über intra-individuelle und inter-individuelle Vergleiche hin zu komplexen neuen Formen von Gegenüberstellungen geprüft wird, ob und wie die Konzentrierte Beziehungsdokumentation in einer diagnostischen Gesamtschau eine im Aufwand zu vertretende empirische Kontrolle des therapeutischen Prozesses ermöglicht. Weiter soll untersucht werden, inwieweit sie im Rahmen der Erstuntersuchung zu einer Verbesserung und Erweiterung der Paardiagnostik dient. Sie soll damit einen Beitrag zum besseren Verständnis der zwischenmenschlichen Beziehung, der „Dyadologie“ (Moeller 2002) leisten, die das intuitive Wissen um Liebesbeziehungen in Wissenschaft verwandelt, die „Scientification of Love“ (Odent, 1999).
In dieser Arbeit wird erstmals der Einfluss von psychischen Belastungen von männlichen Berufsfeuerwehrleuten im Wachalltag und im Einsatz auf das psychische Befinden im Längsschnitt mittels zwei Erhebungswellen untersucht. In der Literatur finden im Zusammenhang mit Befindensbeeinträchtigungen lediglich die Belastungen im Einsatz eine Berücksichtigung. Die Einsatzkräfte verbringen während ihrer Dienstzeit 30% im Einsatz und 70% im Wachalltag. Wir erwarten, dass die psychischen Belastungen im Einsatz stärker ausgeprägt sind, die Stressoren für den Dienst auf der Wache jedoch die besseren Prädiktoren für die Vorhersage von psychischem Befinden darstellen. In einer Wiederholungsmessung wurden männliche Feuerwehrbeamte aus sieben Berufsfeuerwehren mittels Fragebogen befragt. Die selben Feuerwehrleute haben zu t1 und t2 identische Fragen für die Arbeitsbereiche Wachalltag und Einsatz beantwortet. Aus zwei verwertbaren Datenmengen der Erhebungszeitpunkte verblieb eine Gesamtstichprobe von 861 Einsatzkräften. Auf der Basis von LISREL-Modellen wurden unter Berücksichtigung von Occasion-Faktoren und umgekehrter Kausaleffekte die Auswirkungen der erhobenen Regulationsanforderungen und Regulationsproblemen sowie von Handlungsspielraum für den Einsatz und für den Wachalltag geschätzt und auf die Kriterien der kurzfristigen und langfristigen Beeinträchtigung und Arbeitszufriedenheit abgebildet. Unsere Hypothesen konnten in weiten Bereichen begründet werden. Bei stärker ausgeprägten Stressoren im Einsatz erweisen sich die Stressoren des Wachalltags als die besseren Prädiktoren für kurzfristige Beeinträchtigungen und Arbeitszufriedenheit. Psychosomatische Beschwerden wirken sich eher umgekehrt auf die Stressoren aus. Stressoren, die ‚echte’ Einsätze charakterisieren, begünstigen das psychische Wohlbefinden.
Die Chemoresistenz von Tumoren ist ein schwerwiegendes Problem in der Krebstherapie. Insbesondere das maligne Melanom gilt aufgrund seiner ausgeprägten Therapieresistenz als nahezu unheilbar. Ein erster Schritt zur Verbesserung der Chemotherapie von Tumoren ist das Verständnis von Mechanismen, die der Resistenz zugrunde liegen. Für die Aufklärung der Mechanismen ist die Molekularbiologie des chemoresistenten Phänotyps von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen im Transkriptionsmuster analysiert, die mit dem Erwerb von Chemoresistenz in Melanomzellinien einhergehen. Die Melanomzellinie MeWo wurde mit Abkömmlingen, die erworbene Resistenz gegen die DNA-schädigenden Agenzien Etoposid (MeWoEto1), Cisplatin (MeWoCis1) und Fotemustin (MeWoFote40) aufweisen, bezüglich ihres Transkriptionsmusters verglichen. Um zunächst eine möglichst große Anzahl von Genen in die Analyse einzubeziehen, wurden initiale Genexpressionsanalysen unter Verwendung des RZPD UniGene 1 Arrays durchgeführt. Dieses Array repräsentiert ca. 31.500 cDNA Sequenzen, die bei einer geschätzten Redundanz von 1,44 einer Anzahl von 21.875 verschiedenen Transkripten entsprechen. Geht man davon aus, dass der Mensch insgesamt über ca. 30.000 Gene verfügt, wurde durch die Verwendung dieses Arrays ein großer Teil aller humanen Gene untersucht. Unter definierten Selektionskriterien wurden 126 Gene ausgewählt, die als im chemoresistenten Phänotyp differentiell exprimiert angesehen wurden. Diese 126 Gene wurden mit 1.143 weiteren tumorassoziierten Genen für die Zusammenstellung und Produktion eines chemoresistenzspezifischen Kandidatengen-Arrays ausgewählt. In verifizierenden Analysen unter Verwendung des Kandidatengen-Arrays wurde eine differentielle Expression für 57 der initial selektierten Gene sowie für weitere 209 tumorassoziierte Gene festgestellt. Die in diesen Analysen angewandten Kriterien für die Definition differentieller Genexpression wurden in exemplarischen Northernblot-Analysen geprüft. Hier zeigte sich eine qualitative Übereinstimmung der Ergebnisse beider Methoden von 81,4%. Da zur Zeit noch keine Hochdurchsatz-Methoden für funktionelle Analysen zur Verfügung stehen, wurde versucht, den Kreis vielversprechender Kandidaten durch eine Integration von Ergebnissen anderer Experimente einzuengen. In Clusteranalysen zur Untersuchung von Verwandtschaftsgraden zwischen den resistenten Zellpopulationen zeigte die MeWoEto1-Zellinie eine vergleichsweise hohe Stabilität in ihrem Genexpressionsmuster über einen Zeitraum von ca. 2,5 Jahren, während MeWoCis1 und MeWoFote40 hier beträchtliche Schwankungen aufwiesen. Die Expressionsmuster der letzteren resistenten Linien zeigten zum spätesten analysierten Zeitpunkt Konvergenz, nachdem sie zunächst deutlich voneinander abwichen. Da die Wirkung sowohl von Cisplatin als auch von Fotemustin zur Bildung von DNA-Addukten führt, kann die Konvergenz als Ergebnis einer fortschreitenden Optimierung der Resistenz in beiden Linien gedeutet werden. Einzelne Gene wie z.B. PEPP2 und CRYAB, die konvergierend differentielle Expression zeigten, können demnach als vielversprechende Kandidaten für eine funktionelle Relevanz in der Resistenz gegen Cisplatin und Fotemustin betrachtet werden. Neben der Clusteranalyse wurden Ergebnisse von vergleichenden genomischen Hybridisierungen (CGH), der Untersuchung einer Deregulation von Kandidatengenen in mehreren der resistenten Linien oder nach Kurzzeitbehandlung von MeWo-Zellen mit den Zytostatika sowie Literaturdaten verwendet, um die Relevanz der differentiellen Expression für einzelne Gene zu validieren. Danach wurden unter anderen die apoptoserelevanten Gene CRYAB und STK17A sowie MPP1, AHCYL1, CYR61 und STMN3 als vielversprechende Kandidaten eingestuft. Ein weiteres bis dahin unbekanntes Gen aus der C2H2-Zinkfinger-Genfamilie, für das in initialen Analysen sowie in Northernblot und RT-PCR-Experimenten eine Überexpression in MeWoCis1 und MeWoEto1 nachgewiesen werden konnte, wurde bezüglich seiner mRNA-Sequenz vervollständigt und im Detail analysiert. Für dieses Gen konnte phänotyp- bzw. gewebespezifisches differentielles Spleissen sowie differentielle Polyadenylierung nachgewiesen werden. Das alternative Spleissen von Exon 3, dem aufgrund seiner ausgeprägten Homologie zu bereits charakterisierten KRAB A Domänen die Funktion der transkriptionalen Repression zugewiesen werden kann, könnte für ein phänotypspezifisches Transkriptionsprogramm verantwortlich sein. Ausgehend von insgesamt 267 differentiell exprimierten Genen konnte der Kreis vielversprechender Kandidaten durch die Integration von Daten aus anderen Experimenten auf ca. 20 Gene eingeengt werden. Unmittelbar im Anschluss and die Dissertation werden diese Gene in funktionellen Analysen bezüglich ihrer Relevanz für den chemoresistenten Phänotyp analysiert.
Untersuchungsgegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Häufigkeit somatischer Erkrankungen bei psychisch Kranken sowie deren Diagnostik und Therapie. Auf dem Hintergrund des Literaturstudiums ergaben sich für die Untersuchung drei Themenschwerpunkte: 1. Erfassung und Beschreibung der somatischen Erkrankungen, Vordiagnosen und Erstdiagnosen (Aufnahmediagnosen) bei den im Untersuchungszeitraum stationär psychiatrisch behandelten Patienten der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie des Klinikums Offenbach (Häufigkeitsaspekt) 2. Erfassung und Beschreibung der im Verlauf der stationären psychiatrischen Behandlung durchgeführten somatischen Diagnostik und/oder Therapie, auch in Kooperation mit den somatischen Abteilungen des Klinikums Offenbach (Konsiliaraspekt) 3. Erfassung und Beschreibung möglicher Zusammenhänge zwischen somatischen und psychiatrischen Erkrankungen, die Abgrenzung von Risikogruppen, die Erfassung der hausärztlichen Versorgung vor der stationären Aufnahme sowie die Klärung der Frage, ob und ggf. in welchem Umfang die körperliche „Mitbehandlung“ eines psychisch Kranken die stationäre Behandlungsdauer verlängert (Interdependenzaspekt) 10.2 Untersuchte Teilpopulationen Das besondere Augenmerk lag auf den Probanden mit den am häufigsten verzeich¬neten psychiatrischen Diagnosen nach ICD 9 wie paranoide Psychose (295), affektive Erkrankung (296), Alkoholabhängigkeit (303), Drogen- und Medika¬men¬tenmißbrauch (305) sowie Demenzerkrankungen (290, 293, 294). Als besondere Risikogruppen wurden zudem seit über fünf Jahren psychisch Erkrankte, Frauen, Suchterkrankte (291, 292, 303, 304, 305) und ältere Menschen (hier über 60jährige) gesondert betrachtet. 10.3 Untersuchungsrahmen Die Untersuchung wurde in Form eines bei der Entlassung eines jeden Patienten im Untersuchungszeitraum von insgesamt 12 Wochen vom jeweiligen behandelnden Arzt auszufüllenden Fragebogens retrospektiv durchgeführt. Sowohl psychiatrische als auch somatische Erkrankungen wurden nach ICD 9 erfaßt. Informationen zum Frage¬bogen, den Rahmenbedingungen und der Untersuchungsdurchführung sind dem Anhang zu entnehmen. 10.4 Darstellung der wichtigsten Ergebnisse Zum Themenschwerpunkt 1: Vorliegende somatische Erkrankungen Bei insgesamt 197 in die Untersuchung aufgenommenen Patienten wurden 157 somatische Vorerkrankungen erfaßt, pro Proband waren somit rein statistisch 0,8 körperliche Vordiagnosen zu verzeichnen. Betroffen waren in erster Linie Demenzerkrankte, Substanzmißbrauch betreibende Probanden sowie über 60jährige Patienten. Frauen waren etwa doppelt so häufig wie Männer vorerkrankt und litten zudem verstärkt unter Mehrfacherkrankungen. Auffallend selten wurden somatische Vordiagnosen bei Probanden mit schizophrener Psychose zur stationären Aufnahme „mitgebracht“. Zusammenhänge zwischen somatischen Vorerkrankungen und psychiatrischen Störungen ließen sich nicht herstellen. Im Untersuchungszeitraum waren insgesamt 217 somatische Erkrankungen thera¬peutisch und/oder diagnostisch zu betreuen. Die Erkrankungsrate lag, vergleichbar mit Ergebnissen der deutschen Untersuchung von RÖHR, SCHÜRMANN und TÖLLE (1996), bei 90,7%. Je Untersuchtem wurden durch¬schnittlich 1,1 körperliche Störungen beschrieben. Zwischen den erfaßten somatischen Störungen und den psychiatrischen Erkran¬kungen ergaben sich mit Ausnahme von Patienten mit einer Suchterkrankung oder einer Abhängigkeitsproblematik wenig Verknüpfungen. Diese Probanden litten unter den bekannten Folgestörungen. Die höchste somatische Krankheitsrate pro Kopf wurde bei Demenzerkrankten gefunden, gefolgt von den über 60jährigen Probanden und Frauen. Am häufigsten registriert wurden Verletzungen und Vergiftungen, Erkrankungen des Nervensystems und der Sinnesorgane, Herzkreislaufstörungen, Endokrinopathien und Krankheiten des Verdauungssystems. 129 (59,4%) dieser Störungen wurden neu festgestellt; je Proband wurden statistisch somit 0,65 vorher nicht bekannte Störungen erfaßt. Dieses Ergebnis fügt sich ein in die Mehrzahl der in der Literatur beschriebenen Resultate. Neu diagnostizierte Störungen betrafen wiederum zumeist Demenzerkrankte, gefolgt von Frauen und Substanzmißbrauch betreibenden Personen. Bei schizophren Er¬krank¬ten wurde, abweichend von vorbeschriebenen Ergebnissen, auffallend selten eine somatische Erstdiagnose gestellt. Bei den Krankheitsbildern handelte es sich, neben der großen Anzahl von akut aufgetretenen Störungen wie Verletzungen und Vergiftungen und schlecht be¬zeich¬neten Symptomen wie Blutwertveränderungen und Fieber um Störungen im Rah¬men bekannter Krankheiten des Kreislaufssystems und der Sin¬nesorgane. Von langjährigen somatischen Erkrankungen waren insbesondere seit über fünf Jahren psychisch Kranke, aber auch schizophren Erkrankte betroffen. Zum Themenschwerpunkt 2: Durchgeführte somatische Diagnostik und/oder Therapie Im Rahmen der routinemäßigen somatischen Aufnahmediagnostik wurden neben der internistischen und neurologischen Untersuchung bei fast allen Patienten die Blut- und Urinparameter bestimmt. Bei 76,6% der Probanden wurde ein EKG geschrieben, während sich 35% der Patienten einer Röntgenuntersuchung des Thorax unterziehen mußten. Ein CT oder MNR des Schädels bei psychiatrisch Erstbehandelten kam nur in seltenen Fällen zum Einsatz. Die behandelnden Ärzte der Klinik für Psychia¬trie und Psychotherapie des Klinikums Offenbach wurden 227 mal somatisch eigenverantwortlich diagnostisch und/oder therapeutisch tätig. In der Mehrzahl behandelten sie vorbekannte Erkrankungen, bei denen eine bekannte Medikation fortgesetzt, weitergehende Diagnostik betrieben oder die Patienten einer weiteren Beobachtung unterzogen wurden. Am häufigsten als „Körpermediziner“ waren sie tätig für Patienten mit einer Demenzerkrankung, über 60jährige Probanden und Suchterkrankte, jedoch nur in seltenen Fällen für schizophren Erkrankte. Insgesamt wurden 131 Konsile für 63 Patienten angefordert, d.h. daß etwa ein Drittel der primär psychiatrisch Kranken einer fachärztlichen Mitbehandlung durch Ärzte anderer Disziplinen bedurfte. Die Mehrzahl der konsiliarischen Anfragen gingen an die Innere Medizin, die Chirurgie und die Dermatologie. Der größte Anteil der Konsile wurde für Demenzerkrankte, über 60jährige und für Frauen angefordert. Schizophren Erkrankte benötigten die geringste Zahl somatischer Konsultationen. Der Hauptanteil an Konsilen erfolgte aufgrund von Verletzungen und Vergiftungen. In den Konsiliarsberichten wurden 188 Empfehlungen ausgesprochen. Zumeist handelte es sich dabei um weiterführende Diagnostik und den Einsatz einer lokalen oder systemischen Medikation. Verbindungen zwischen den somatischen konsiliarischen Empfehlungen und der psychiatrischen Diagnose des Probanden ließen sich nicht aufzeigen. Die meisten konsiliarischen Untersuchungen erfolgten innerhalb von drei Tagen im Anschluß an die Anfrage. Bei 71,4% der Patienten war die Beantwortung gut lesbar dargestellt, bei 81,8% wurde eine Diagnose gestellt. In keiner Konsilantwort wurde ein Diagnoseschlüssel verwendet. Lediglich bei einem geringen Anteil der Probanden verblieben zunächst Unklarheiten hinsichtlich der weiteren Vorgehens¬weisen, bei einem ebenfalls geringfügigen Teil kam es mit unterschiedlichen Begründungen nicht zur Umsetzung der konsiliarischen Empfehlung. Als zufriedenstellend empfanden die psychiatrisch tätigen Ärzte die Zusammenarbeit mit den somatischen Kollegen in 87,3% aller Fälle. Zu Themenschwerpunkt 3: Mögliche Zusammenhänge zwischen somatischer und psychiatrischer Erkrankung, ambulanter somatischer Vorbehandlung und sozialer Situation Hausärztlich oder fachärztlich wurden 54,8% der Probanden betreut. Diese litten zumeist an Endokrinopathien, Krankheiten des Nervensystems und der Sinnesor¬gane, der Verdauungsorgane und des Herz- und Kreislaufsystems. Einen Arzt hatten innerhalb von drei Monaten vor der stationären psychiatrischen Aufnahme 34,5% der Patienten in der Mehrheit der Fälle aufgrund der o.g. Störungen aufgesucht. 47 Patienten, die unter neu diagnostizierten Störungen litten, gaben an, haus¬ärztlich betreut zu werden und diesen innerhalb von drei Monaten im Vorfeld der stationären Aufnahme konsultiert zu haben. Die Rolle des Hausarztes in der soma¬tischen Versorgung der Probanden ließ sich gleichwohl nicht eindeutig einschätzen, da die meisten erfaßten Erkrankungen (Verletzungen und Vergiftungen; unspezifische Symptome) in vielen Fällen zu den akut auftretenden Störungen zählen. Am häufigsten konsultierten Demenzerkrankte einen Arzt, gefolgt von den über 60jährigen. Auffällig selten suchten Schizophrene den Hausarzt auf. Die soziale Situation beeinflußte das Verhalten der Probanden bezüglich Arztbe¬suchen nur wenig, allerdings gingen allein Lebende vergleichsweise häufiger und von sozialer Unterstützung Lebende eher seltener zum Arzt. Zwischen der Dauer der stationären psychiatrischen Behandlung und der erfolgten somatischen Diagnostik und Therapie lassen sich nur bei einer sehr kleinen Anzahl von Probanden Beziehungen herstellen; die stationäre psychiatrische Behandlung verlängerte sich nur in Einzelfällen durch somatische Diagnostik und/oder Therapie. 10.5 Kurzdarstellung der Ergebnisse - In der untersuchten Population bestand eine häufige Koinzidenz zwischen psychischen Störungen und somatischen Erkrankungen mit Schwerpunkten auf neu festgestellten Krankheiten und seit über fünf Jahren bestehenden Leiden. - Sowohl die Gesamtheit der erfaßten Störungen als auch die Erstdiagnoserate körperlicher Erkrankungen fügt sich ein in die Mehrzahl der aus der Literatur bekannten Ergebnisse. - Die Einteilung des Klientels nach Risikogruppen erwies sich als aussagekräftig: Demenzerkrankte und Probanden im Alter über 60 Jahren litten erwartungsgemäß vermehrt unter somatischen Störungen; bei Probanden mit Substanzmißbrauch lag die höchste Erstdiagnoserate vor; bei seit über fünf Jahren psychisch Erkrankten war die größte Anzahl chronifizierter somatischer Krankheiten zu beobachten. - Schizophren Erkrankte waren, abweichend von vorbeschriebenen Ergebnissen, seltener von somatischen Störungen betroffen. - Psychiatrisch tätige Mediziner waren in erster Linie in der Behandlung bekannter körperlicher Störungen aktiv, indem sie eine vorbekannte Medikation verordneten oder weiterführende Diagnostik betrieben. Hauptsächliche Zielgruppen waren Demenz¬erkrank¬te, über 60jährige Probanden und Frauen. - Somatische Konsile wurden schwerpunktmäßig von der Internistischen Klinik, der Chirurgie und der Dermatologie angefordert. Die ausgesprochenen Empfeh¬lun¬gen bestanden in einer systemischen oder lokalen Therapie und dem Einsatz weitergehender Diagnostik. Besonders häufig ergingen Konsilanforderungen für Demenzerkrankte, über 60jährige Probanden und Frauen. Auffällig war ein hoher Anteil an Mehrfachkonsultationen für einzelne Probanden in diesen Teilpopula¬tionen, was in den komplexen Behandlungsstrategien für diese Patienten begründet ist. - Die Mehrzahl der somatischen Konsile entsprach den für psychiatrische Kon¬sultationen entwickelten Qualitätskriterien, die Kooperation wurde in den weitaus überwiegenden Fällen von den psychiatrischen Ärzten als gut beurteilt. - Neu diagnostizierte Störungen waren unabhängig von der gegebenen haus¬ärztlichen Vorbehandlung und den Konsultationen des Hausarztes im Vorfeld des stationären Aufenthalts zu beobachten. Sie betrafen allerdings häufig akut auftretende Erkrankungen. - Nach Einschätzung der psychiatrisch tätigen Ärzte wurden nur wenige Probanden mit der Zielsetzung einer somatischen Diagnostik oder Therapie in die Klinik für Psychia¬trie und Psychotherapie aufgenommen; auch die Behandlungsdauer der Patienten verlängerte sich nur in Ausnahmefällen durch somatische Maßnahmen. - Für Suchterkrankte ließ sich, als einzige der untersuchten Gruppen, eine Verbindung zwischen der psychiatrischen und den beobachteten somatischen Störungen herstellen.
Gehirne von an Scrapie erkrankten Tieren sind histopathologisch durch Vakuolisierung, Astrogliose, Neurodegeneration und charakteristische PrPSc-Ablagerungen gekennzeichnet. Die pathologischen Mechanismen, die zu diesen Veränderungen führen, sind noch weitgehend unverstanden. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression in Scrapie-infizierten Mausgeweben kann zu einem besseren Verständnis der pathogenen Mechanismen dieser Erkrankung auf molekularer Ebene beitragen. Auch könnten einige der differentiell exprimierten Gene zur Entwicklung eines auf Surrogatmarkern basierenden Testsystems beitragen oder für die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Intervention nützlich sein. Um im Verlauf der Scrapieerkrankung in Mäusen hoch- oder herunterregulierte Gene zu identifizieren, wurden RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) und suppression subtractive hybridisation (SSH) an Hirn- und Milzproben Scrapie-infizierter Mäuse und gesunder Kontrolltiere durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anhand eines differentiellen Screening-Schrittes, Sequenzanalysen und Northernblots bestätigt. Durch einen Datenbankabgleich der erhaltenen Sequenzen wurden mehrere Kandidaten identifiziert. Einige davon, wie GFAP, Apolipoprotein D, Vimentin, Mx-Protein, MHC I und II wurden bereits als in Scrapie-infizierten Gehirnen hochreguliert von anderen Arbeitsgruppen publiziert. Eine differentielle Regulation weniger weiterer Kandidaten, wie Cytochromoxidase, Ubiqitinierungsfaktor E4a und das herunterregulierte Stathmin wurden bisher noch nicht beschrieben. Auch eine bisher unbekannte differentiell exprimierte Sequenz wurde gefunden. Ergänzend zu den Untersuchungen auf Nukleinsäureebene wurde die 2DElektrophorese für Gehirngewebe zur Untersuchung der differentiellen Expresssion auf Proteinebene unter Berücksichtigung posttranslationaler Modifikationen etabliert. Protokolle für die Vorbereitung von Mäusegehirnproben, die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung und der 2. Dimension, sowie Färbeprotokolle für qualitative und quantitative Analysen der Gele unter Berücksichtigung der Erfordernisse nachfolgender MALDI-Analysen wurden erarbeitet.
Zur Zeit basiert die Behandlung der Infektion mit dem Humanen-Immunschwäche-Virus (HIV) ausschließlich auf einer Chemotherapie, die das Virus nicht eradiziert, sondern in seiner Vermehrung hemmt. Diese Therapie muß lebenslang erfolgen. Die Wirksamkeit der Medikamente ist, auch in einer Kombinationstherapie, durch die Entwicklung von Resistenzen limitiert. Diese begründet sich zum einen in der Selektion resistenter Virusmutanten. Zum anderen weisen experimentell und in Studien gewonnene Ergebnisse auf die Beteiligung zellulärer Faktoren am Therapieversagen hin. Über die Rolle zellulärer Prozesse bei der Resistenzentwicklung gegen die in der HIV-1 Therapie eingesetzten Nukleosidalen-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren ist jedoch noch wenig bekannt. NRTIs sind Prodrugs und werden durch zelleigene Kinasen aktiviert. Eine verminderte Expression oder Aktivität dieser Kinasen kann zu subtherapeutischen intrazellulären Wirkspiegeln führen. In der vorliegenden Arbeit wurden anhand einer T-lymphoiden Zellkultur (H9) die zellulären Mechanismen, die nach einer langdauernden Zidovudin (AZT) Exposition eine zelluläre AZT-Resistenz bewirken, und Methoden diese Resistenz zu umgehen bzw. zu verhindern, untersucht. Es zeigte sich, daß die kontinuierliche AZT-Exposition eine verminderte Expression der Thymidinkinase 1 (TK1) bewirkt. Dies führt zu einer verminderten AZT-Phosphorylierung und letztendlich zu geringeren Wirkstoffspiegeln des antiretroviral wirksamen Metaboliten AZT-Triphosphat (AZT-TP). In AZT resistenten H9 Zellen zeigte AZT eine verminderte Zytotoxizität, und eine um mehr als den Faktor 1000 verminderte antiretrovirale Aktivität. Als mögliche Ursachen für die verminderte Expression der TK1 wurden die DNA-Methylierung und die Histon-Deacetylierung, zwei Faktoren, die Hand in Hand die Genexpression auf transkriptioneller Ebene beinflussen, untersucht. AZT resistente Zellen zeigten in immunzytochemischen Färbungen eine starke Histon-Deacetylierung. Die Behandlung resistenter Zellen mit Trichostatin A (TSA), einem Hemmstoff der Histon-Deacetylierung führte jedoch nicht zu einer Erhöhung der TK1 mRNA-Spiegel. Die Behandlung resistenter Zellen mit 5-AZA-C, einem Inhibitor der Methyltransferase 1 (DNMT1) erhöhte sowohl die Expression der TK1 als auch die Zytotoxizität und die antiretrovirale Aktivität von AZT. Darüber hinaus verminderte die gleichzeitige Behandlung von H9 Zellen mit AZT und 5-AZA-C die Resistenzentwicklung gegen AZT erheblich. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß in den AZT resistenten Zellen die Expression der „de novo“ Methyltransferasen 3a und 3b (DNMT3a / 3b) erhöht ist. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß eine „de novo“ Methylierung des TK1-Gens durch die DNMT3a und DNMT3b die Ursache für die verminderte TK1 Expression in AZT resistenten H9 Zellen ist. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit gezeigt, daß einige amphiphile Heterodinukleosidphosphate, die nach intrazellulärer Spaltung monophosphorylierte Nukleosidanaloga freisetzen, die AZT Resistenz überwinden können. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten, daß eine spezifische Hemmung der „de novo“ Methyltransferasen oder der Einsatz monophosphorylierter Substanzen die Wirksamkeit einer antiretroviralen Therapie erheblich verbessern können, indem sie zelluläre Faktoren, die eine Phosphorylierung von AZT vermindern und dadurch zum Versagen von AZT als antiretroviralem Therapeutikum führen, unterdrücken bzw. umgehen.
Das Forschungsziel dieser Arbeit war die Abklärung der Frage, ob sich in implantierten Intraokularlinsen der Marke Acrysof®, die in Deutschland kurz nach deren Markteinführung erworben wurden, Mikrovakuolen im Optikkörper befinden. Diese sogenannten Glistenings, die der Hersteller auf eine neuartige Verpackung zurückführte, welche ausschließlich in den Vereinigten Staaten Verwendung fand, führten in den USA zu Explantationen und zum Rückruf so verpackter Kunstlinsen dieses Typs. Unser Arbeitsprogramm umfaßte hauptsächlich die Untersuchung von Patienten, bei denen eine Acrysof®-Intraokularlinse implantiert wurde, an der Spaltlampe und anschließende Dokumentation mittels Fotospaltlampe. Zusätzlich wurden Sehschärfebestimmungen durchgeführt. Analog wurden Untersuchungen und Dokumentationen bei Patienten, denen im gleichen Zeitraum und vom gleichen Operateur eine herkömmliche PMMA-Kunstlinse implantiert wurde, durchgeführt. In allen untersuchten Intraokularlinsen des neuen Modells aus Acryl konnten Mikrovakuolen festgestellt und fotografisch dokumentiert werden. Diese Veränderungen konnten in keiner der PMMA-Kunstlinsen beobachtet werden. In unseren Ergebnissen fanden sich sonst durchgehend Hinweise auf die mittlerweile von anderen gewonnenen Erkenntnisse über die neue Linse. Es konnten keine Hinweise auf eine Visusminderung durch die Glistenings festgestellt werden. Die Analyse der Literatur ergab, daß nach dem heutigem Stand der Erkenntnisse über die Glistenings, von einer Flüssigkeitsaufnahme in den Optikkörper der IOL ausgegangen wird. Die Flüssigkeit sammelt sich in einige mikrometer großen Räumen in der Polymerstruktur der Kunstlinse. Diese Mikrovakuolen werden durch die Brechkraftdifferenz zwischen deren Inhalt und dem IOL-Material optisch sichtbar und erscheinen bei der Spaltlampenuntersuchung als multiple Glitzerpunkte. Experimentelle Arbeiten haben gezeigt, daß die Ausbildung der Mikrovakuolen durch Temperaturschwankungen und durch die Anwesenheit von Serum begünstigt wird. Ein verstärktes Vorkommen der Glistenings bei Patienten, bei denen sich durch Beeinträchtigung der Blut-Kammerwasser-Schranke oder der Blut-Retina-Schranke, Serumbestandteile im Kammerwasser befinden können, hier sind besonders Diabetiker zu nennen, wurde von einigen Autoren berichtet. Auch wir konnten bei einer nachträglichen Auswertung unserer Unterlagen Hinweise darauf finden, daß es bei solchen Patienten zur verstärkten Glisteningbildung kommt. Die Aussage der Herstellerfirma, die Glistenings hingen mit der neuartigen Verpackung und Sterilisation der IOLs in dem AcryPak-System, welches nur in den USA zum Einsatz kam und 1995 vom Markt genommen wurde, zusammen, wurde durch unsere Ergebnisse widerlegt. Besonders die frühere englischsprachige Literatur spiegelt einen Konsens mit der vom Hersteller vertretenen Auffassung wider. Neuere Arbeiten, die unsere Ergebnisse bestätigen weisen auf ein Poster auf einem Kongress 1999 in Seattle als erstes bekanntwerden von Glistenings in herkömmlich verpackten AcrySof®-IOL hin, obwohl schon frühere Berichte von Autoren aus Europa, auch von unserer Arbeitsgruppe, vorlagen. Die Mikrovakuolen haben nur in sehr seltenen Einzelfällen, bei denen es zu massenhaftem Vorkommen gekommen war, zu Beeinträchtigungen der Sehfunktionen geführt und eine Explantation erforderlich gemacht. Trotzdem sind weitere Forschungen, für die wir einige Ansätze vorschlagen, notwendig. Auch das Vorkommen von schwerwiegenden Trübungen bei anderen Kunstlinsentypen zeigt die Notwendigkeit für verstärkte Forschungen und gesetzliche Regulierungen auf diesem Gebiet. Insbesondere die hervorragend niedrigen Nachstarraten, die mit der Implantation von AcrySof®-Kunstlinsen einher gehen, berechtigen jedoch zu ihrer Weiterverwendung. Während es unwahrscheinlich scheint, daß die Glistenings noch schwerwiegende Probleme bereiten werden, so ist jedoch gesichert, daß durch die Verwendung von AcrySof®Kunstlinsen weniger YAG-Laser-Kapsulotomien notwendig sind. Daß sich damit auch die mit diesem Eingriff verbundenen Kosten und Komplikationen reduzieren ist selbstredend. Der Verlauf der Forschungen zu diesem Thema wird dargelegt. Die Notwendigkeit präziserer Studienaufbauten und besserer technischer Ausstattung wird deutlich. Durch den fortgeführten Einsatz der AcrySof®-IOL wurde die ophthalmologische Sichtweise der IOL verändert. Die IOL wird heute als Implantat betrachtet, welches die Aphakie korrigiert aber auch den Nachstar verhüten soll. Im kleinen Rahmen der Entwicklungsgeschichte der IOLs selbst, könnte dies den Beginn einer neuen IOL-Generation bedeuten.
Die alpha-Untereinheiten von Ionenkanälen assemblieren durch eine Tetramerisierung von Coiled-Coils
(2002)
Der spannungsabhängige Kaliumkanal EAG1 besitzt eine carboxyterminale 40 Aminosäuren lange Domäne, die für die Assemblierung von vier alpha-Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal verantwortlich ist. Die Zielsetzung dieser Arbeit war zunächst die Analyse der Sekundärstruktur dieser Assemblierungsdomäne, sowie die Identifikation weiterer Ionenkanäle, die im Carboxyterminus eine strukturelle Homologie zur Assemblierungsdomäne des EAG1- Ionenkanals zeigen. Darüber hinaus sollten Aussagen über die Bedeutung der Domäne für die Funktion des jeweiligen Ionenkanals getroffen werden. Computergestützte Analysen der Sekundärstruktur ergaben, dass strukturell konservierte homologe Domänen in den Familien der durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen (CNG), in den spannungsabhängigen kaliumselektiven Kanälen (neben EAG, auch in ELK, ERG und KCNQ), in den calciumabhängigen Kaliumkanälen (SK, IK), in den nicht selektiven Kationenkanälen (PKD) und in den Calciumkanälen (TRP) zu finden sind. Diese Ionenkanäle zeigen in computergestützten Analysen Domänen, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer Coiled-Coil Struktur im Caboxyterminus. Im zweiten Teil ging es darum, die berechnete Sekundärstruktur experimentell zu belegen. Dazu wurden die caboxyterminal gelegenen Proteinbereiche mit einer Möglichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils exemplarisch von den Kanälen EAG1, EAG2 und ERG1 als Peptide synthetisiert und analysiert. Anhand von Gelfiltrationsexperimenten und Lichtstreuung wurde die Stöchiometrie der Peptid-Assemblierung als Tetramerisierung identifiziert. Mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie konnte ein hoher alpha-helikaler Strukturanteil und eine außerordentliche Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen gezeigt werden. Aus diesen Daten kann, in Übereinstimmung mit computergestützten Analysen der Aminosäuresequenz, geschlossen werden, dass die Peptide zu tetrameren Coiled-Coils assemblieren. In Analogie kann diese Art der Zusammenlagerung ebenfalls für die alpha-Untereinheiten der Ionenkanäle angenommen werden, für die in computergestützten Analysen eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils berechnet werden konnte. Die dafür verantwortliche Domäne wurde als „Tetramerisierende Coiled-Coil“ (TCC) Domäne benannt und kann als generelles Strukturmotiv angenommen werden. Im dritten Teil wurde ein auf Oberflächen-Plasmonresonanz basierender Proteininteraktionstest entwickelt, der es ermöglicht, die Kinetik der Tetramerisierung in Echtzeit zu verfolgen. Für die Peptide, deren Aminosäuresequenz der TCC-Domäne eines funktionellen Ionenkanals entsprach, konnte eine Ausbildung homomerer Komplexe gezeigt werden. Eine stabile heterologe Interaktion konnte nur zwischen den aus einer Proteinunterfamilie stammenden Domänen EAG1 und EAG2 gemessen werden. Dagegen interagierten diese Peptide nicht mit der Interaktionsdomäne aus ERG1. Die TCC-Domäne ist demnach in der Lage, die Spezifität der Bindung zu bestimmen. Aufbauend auf den Ergebnissen der Sekundärstrukturanalyse stand nun die Bedeutung der TCC-Domäne für die Funktionalität des jeweiligen Ionenkanals im Zentrum dieser Arbeit. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Austausch einer hydrophoben Aminosäure gegen eine polare Aminosäure innerhalb des Coiled-Coils drastische Auswirkungen auf die Funktion dieser ca. 40 Aminosäuren langen Domäne hatte. Diese Peptide lagen nur noch zu einem geringen Anteil als Tetramere vor und wiesen eine deutlich geringere Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen auf. Im Proteininteraktionsassay äußerte sich der Einfluss des Austausches in einer rascheren Assoziations- und Dissoziationsphase im Vergleich zu den tetrameren Coiled-Coil Peptiden. In vivo durchgeführte elektrophysiologische Messungen an Ionenkanalkonstrukten bestätigten die physiologische Relevanz der TCC-Domäne. Die Abwesenheit dieser Domäne in HERG1 führte zu einem Verlust der Funktion des Ionenkanals. Diese konnte jedoch durch Klonierung der entsprechenden TCC-Domäne des EAG1-Ionenkanals in den HERG1-Ionenkanal wieder hergestellt werden. Das Ionenkanalkonstrukt, bestehend aus dem HERG1-Kanal mit der TCC-EAG1 Domäne konnte, im Gegensatz zu dem HERG1 Wildtyp, funktionelle Heteromultimere mit EAG1 alpha- Untereinheiten bilden, so dass ein Ionenkanal mit veränderten Eigenschaften elektrophysiologisch beschrieben werden konnte. Die Relevanz der TCC-Domäne für die Funktionalität des Ionenkanals wird auch durch natürlich vorkommende Mutationen belegt. Diese beeinflussen die Struktur und damit die Funktion der TCC-Domäne. In Datenbanken des humanen Genoms konnten 38 Mutationen in sieben verschiedenen Genen identifiziert werden, die die Struktur der Coiled-Coil Domäne der resultierenden Ionenkanäle beeinflussen. Diese Mutationen äußern sich in zahlreichen phänotypischen Krankheitsbildern.
Die somatische Gentherapie ist eine neuartige Therapieform, bei der Gensequenzen in Zielzellen eingebracht werden, um die verschiedensten Defekte auf molekularer Ebene zu beheben. Für die Entwicklung von Vehikeln, mit denen dieser Gentransfer effizient durchzuführen ist, werden in vielen Studien modifizierte Retroviren verwendet. Mit Hilfe des Transport- und Integrationsmechanismus der Retroviren ist es möglich das genetische Material stabil in das Genom der Zielzellen zu integrieren. Im Hinblick auf eine lebenslange Heilung bestimmter Erbkrankheiten können die retroviralen Vehikel auch zum Gentransfer in Stammzellen verwendet werden. Eine wichtige Rolle spielt die stabile Genexpression der eingeschleusten Sequenzen, um einen Therapieerfolg auf lange Sicht zu erreichen. In vielen Studien erfolgte jedoch eine Erniedrigung der Genexpression nach mehreren Wochen und auch das Ausbleiben der Transkription oder Translation des therapeutischen Gens konnte beobachtet werden. Das Abschalten therapeutischer Gene wird meist durch zelluläre Mechanismen hervorgerufen, hierzu gehören Methylierungen bestimmter Chromosomenabschnitte oder die Bindung von Repressormolekülen an Promotorregionen. Die Sequenzumgebung mit der das therapeutische Genmaterial in das Genom der Zielzellen integriert, ist somit besonders wichtig. Die viralen Sequenzen, die zum Einschleusen und für die Integration des therapeutischen Gens notwendig sind, tragen oft erheblich zur Expressionshemmung bei. Ein retroviraler Vektor, der nach Integration der proviralen DNA alle nicht benötigten viralen Sequenzen selbständig deletiert, würde störende Einflüsse durch umgebende Sequenzen vermindern. Das therapeutische Gen verbliebe mit wenigen viralen Sequenzen in der Zelle. Ein System, das nach Integration des therapeutischen Gens alle nicht erwünschten viralen Sequenzen selbständig und gezielt entfernt, stellt das entwickelte Cre/loxPVektorsystem dar. Dieser retrovirale Vektor enthält ein spezifisches Rekombinationssystem, das nach Integration der proviralen DNA in das Genom einer Zelle alle nicht benötigten viralen Sequenzen selbständig deletiert. Das therapeutische Gen verbleibt mit wenigen Sequenzen im Zielzellgenom. Störende Einflüsse durch transkriptionelles Silencing oder Translationshemmung durch umgebende Sequenzen werden damit vermindert. Die Anordnung der Gene und Sequenzen zur Entwicklung eines selbstdeletierenden Cre/loxP-Vektors wurde für die stabile Expression eines Markergenproduktes untersucht. Das modifizierte Gen des Nervenwachstumsfaktors LNGFR (LNGFR, engl. – Low Affinity Nerve Growth Factor Receptor) diente anstelle eines therapeutischen Gens als Modell für eine Proteinexpression in verschiedenen Zielzellen. In dieser Studie wurde ein konventionelles retrovirales Vektorsystem mit den entwickelten Cre/loxP-Vektoren verglichen. Beide Vektorsysteme integrierten das LNGFRD-Gen zusammen mit den nötigen viralen Sequenzen in das Genom der Zielzellen. Nach Integration des konventionellen Vektors blieb die Sequenzumgebung des LNGFRD-Gens erhalten. Durch das Cre/loxPVektorsystem konnten die störenden viralen Sequenzen durch den spezifischen Rekombinationsmechanismus entfernt werden und nur die LNGFRD-Expressionskassette verblieb mit wenigen Elementen im Genom der Zielzellen. Mit beiden Vektorsystemen konnte eine Expression des LNGFD-Rezeptors erreicht werden, wobei die zu erreichende Expressionshöhe des Rezeptor mit dem Cre/loxP-Vektorsystem zum Teil erhöht war, im Vergleich zum Kontrollsystem. Der Anteil an Zellen, die nach Gentransfer den LNGF-Rezeptor exprimierten, war nach einigen Modifikationen ebenfalls vergleichbar mit dem System des konventionellen Gentransfervektors. Die Verwendungsmöglichkeiten des entwickelten Cre/loxPVektorsystems sind auf vielen Gebieten denkbar. Retrovirale Vektoren werden zum einem zur Behandlung von monogenen Erbkrankheiten verwendet, bei denen das therapeutische Gen den Defekt des fehlerhaften Gens ausgleicht. Ein retroviraler Cre/loxP-Vektor könnte hierbei zu einer lebenslangen Expression des Genprodukts genutzt werden. Außerdem könnten Gene transferiert werden, die nur temporär exprimiert werden sollen. Hierzu könnte ein induzierbarer Cre/loxP-Vektor verwendet werden. Zur Bekämpfung von Krebs oder HIV werden Untersuchungen mit Apoptose-Genen und Suizid-Genen durchgeführt, die bei einer unerwünschten Immunreaktion mit Hilfe des Cre/loxPSystems eliminiert werden könnten. Für die Zell- und Gentherapie werden zur Zeit Studien zur kontrollierten Expansion von Stammzellen und Endothelzellen durchgeführt, wobei Genen verwendet werden, die diesen Zellen einen Proliferationsvorteil verschaffen. Die vollständige Abschaltung dieser Gene nach der Zellexpansion ist wünschenswert. Mit dem Cre/loxP-Vektorsystem könnte eine reversible Immortalisierung erzielt werden, was die Sicherheit einer späteren Transplantation erhöhen würde. Die Deletion weiterer viraler Sequenzen erhöht außerdem die Sicherheit des Gentransfers für eine erstrebenswerte lebenslange Integration von Gensequenzen. Die Möglichkeiten zur Mobilisierung eingeführter retroviraler Sequenzen durch Mutationen oder Rekombinationen mit endogenen Viren wird stark vermindert, da Elemente, wie das virale Verpackungssignal oder virale Genkassetten entfernt werden können. Der entwickelte Cre/loxP-Vektor ist außerdem ein selbstdeletierender Vektor, der nicht nur die spezifischen Bindestellen der loxP-Elemente enthält, sondern auch das CreGen zur Rekombination. Die spezielle Anordnung der Elemente zur Rekombination erlaubt nicht nur eine spezifische Rekombination, sondern auch die Deletion des Gens der CreRekombinase. Das Cre/loxPSystem deletiert sich somit selbständig, was einen weiteren Sicherheitsaspekt darstellt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Expression der zytokininduzierbaren Zelladhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und E-Selectin in der fetomaternalen Einheit zu untersuchen. Außerdem sollte examiniert werden, ob sich die Expression dieser Zelladhäsionsmoleküle im zeitlichen Verlauf der Schwangerschaft ändert. Weiterhin sollte geprüft werden ob die termingerechte und auch die vorzeitige Wehentätigkeit mit einer geänderten Adhäsionsmolekülexpression in gestationsspezifischen Geweben verbunden ist. Hierbei sollte zwischen infektionsbedingter vorzeitiger Aktivierung bei Chorioamnionitis und vorzeitiger Aktivierung ohne Vorhandensein einer Infektion differenziert werden. Zu diesem Zweck wurden Kryostatschnitte von Plazenten und fetalen Membranen von 71 Patientinnen der Universitätsfrauenklinik Frankfurt angefertigt und mit mAk gegen die gesuchten Moleküle immunhistologisch untersucht. Unter Berücksichtigung des Schwangerschaftsalters, des Geburtsmodus sowie des Vorhandenseins einer klinisch und histologisch nachweisbaren Chorioamnionitis konnten die Patientinnen fünf verschiedenen Kollektiven zugeordnet werden. Um die Adhäsionsmolekülexpression im ersten Trimenon zu überprüfen, wurde Plazentagewebe gewonnen nach Abruptio (n=10) untersucht. Der Einfluß der Wehentätigkeit wurde durch die Gegenüberstellung von Plazenta und Eihäuten, welche nach Sectio gewonnen wurden (n=12) mit gestationsspezifischen Geweben, welche nach vaginaler Geburt am Termin (n=19) gewonnen wurden, determiniert. Bei Frühgeburt wurde die infektionsbedingte vorzeitige Aktivierung bei klinisch und histologisch nachweisbarer Chorioamnionitis (n=10) und die vorzeitige Aktivierung ohne Nachweis einer Infektion (n=17) unterschieden. Um die Lokalisation von Zelladhäsionsmolekülen in der fetomaternalen Einheit festzustellen, wurden als Positivkontrollen Cytokeratin, HLA-ABC und PECAM (CD31) eingesetzt. Cytokeratin war auf allen Zellen epithelialer Herkunft ( Trophoblastzellen, Amnionepithel ) zu finden. Die MHC-Klasse-I-Antigene wurden auf kernhaltigen Zellen der gestationsspezifischen Gewebe exprimiert: auf Mesenchym- und Endothelzellen der plazentaren Villi, auf Deziduazellen, sowie gelegentlich auf Zellen im Amnionmesenchym der Eihäute. Erwartungsgemäß war der villöse Trophoblast HLA-ABC negativ, ebenso das Amnionepithel und Chorion der Eihäute. Mit mAk gegen PECAM, das an interzellulären Junktionen von Endothelzellen exprimiert wird, konnten alle Gefäßendothelien der fetomaternalen Einheit intensiv angefärbt werden. Die zytokininduzierbaren Adhäsionsmoleküle VCAM-1 und E-Selectin konnten immunhistologisch generell nicht in gestationsspezifischen Geweben nachgewiesen werden. Das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1 dagegen konnte auf maternalen und fetalen Endothelzellen sowie auf fetalen Makrophagen im Amnionmesenchym lokalisiert werden. Seine Expression änderte sich im Verlauf der Schwangerschaft. Ab der 12. SSW zeigte sich eine beginnende ICAM-1-Expression durch die plazentare Dezidua. Im ersten Trimenon konnte es nur in einem Fall auf Zellen, vermutlich LGL, und Endothelien der plazentaren Dezidua nachgewiesen werden. Wehenloses Gewebe, gewonnen nach Sectio exprimierte in der 37. SSW ICAM-I auf fetalem Stammzottenendothel und in der 38. SSW ICAM-I auf fetalem Terminalzottenendothel. Das Deziduaendothel der Eihäute kann in der 38. SSW mit mAk gegen ICAM-I angefärbt werden. Eine Expression auf fetalem Endothel erfolgte hier gegen Ende des letzten Trimenons.Bei vorzeitiger Aktivierung, sei es bei Chorioamnionitis oder ohne Vorliegen einer Infektion, war bereits im zweiten Trimenon (ab SSW 18) eine ICAM-I-Expression auf fetalen Endothelzellen vorhanden. Die ICAM-1-Expression durch plazentare Deziduaendothelien, gewonnen nach Sectio, ist stets signifikant niedriger als die Expression durch entsprechende Gewebe, die nach vaginaler Spontangeburt am Termin gewonnen wurden. Die stärkste ICAM-I-Expression durch Endothelzellen der fetomaternalen Einheit lag bei vaginaler Spontangeburt am Termin und bei vorzeitiger Aktivierung ohne Vorliegen einer Infektion vor. Bei physiologischen Wehen am Termin waren v. a. die maternalen Blutgefäße in der Dezidua von Plazenta und Eihäuten hochgradig ICAM-I-positiv, aber auch fetale Stammzottengefäße exprimierten intensiv ICAM-1. Bei vorzeitiger Aktivierung ohne Infektion trat noch eine starke ICAM-I-Expression durch die fetalen Endothelien der Terminalzotten hinzu, so daß in diesem Fall eine umfassende Endothelaktivierung in allen Kompartimenten vorlag. Bei infektionsbedingter Frühgeburt mit Vorliegen einer Chorioamnionitis fand die Endothelexpression von ICAM-I v.a. in dezidualen Gefäßen der Eihäute statt. Plazentare Gefäße exprimierten ICAM-1 nur relativ gering, ohne sich hierbei signifikant von wehenlosem Gewebe, gewonnen nach Sectio, zu unterscheiden. Hierbei wurden zusätzlich zahlreiche ICAM-I-positive Zellen im Amnionmesenchym nachgewiesen, wohl bedingt durch ein zelluläres Infiltrat und die Aktivierung ortsständiger fetaler Makrophagen. Ausgehend von diesen Ergebnissen scheint das Zelladhäsionsmolekül ICAM-1 in der fetomaternalen Einheit sowohl zum Einsetzen von termingerechten Wehen als auch zur vorzeitigen Beendigung der Schwangerschaft beitragen zu können. Durch eine vermehrte Leukozytenextravasation in die gestationsspezifischen Gewebe, sowie durch eine verbesserte Antigenpräsentation und effektivere antigenspezifische Reaktionen könnte ICAM-I am Th2-Th1-Shift, der zur Beendigung der Schwangerschaft führt, beteiligt sein. Hierbei führt eine vermehrte Produktion von inflammatorischen Th1- Zytokinen über eine gesteigerte Prostaglandinproduktion in der fetomaternalen Einheit zur Zervixreifung und Wehenauslösung. Das zytokininduzierbare ICAM-1 kann möglicherweise auch regulativ in die Produktion von Zytokinen und deren Rezeptoren eingreifen. Auch durch endokrine (Östradiol) und parakrine (Prostaglandin E2) Substanzen ist die Expression von ICAM-1 auf Endothelzellen induzierbar. Möglicherweise könnten, neben der Induktion durch inflammatorische Zytokine, derartige Signalstoffe im Blut die bei Wehentätigkeit verstärkte ICAM-I-Expression auf fetalen und maternalen Endothelien der gestationsspezifischen Gewebe auslösen.
Hitze-Stress-Transkriptionsfaktoren (Hsfs) stellen die zentralen regulatorischen Komponenten einer Signal-Transduktionskette dar, welche die Aktivierung von Hitze-Stress-induzierbaren Genen bewirken. Die Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) führte zu der Entdeckung von 21 Genen, die für putative Hsfs codieren. Aufgrund struktureller Charakteristika und phylogenetischer Analysen wurden die 21 Hsfs in die Klassen A, B und C aufgeteilt. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung der Hsf Familie aus Arabidopsis. Um generelle Konzepte zur Funktion von pflanzlichen Hsfs als Aktivatoren zu unterstützen, wurden als Ausgangspunkt ausgewählte Hsfs aus Lycopersicon peruvianum (Tomate) zu detaillierten Analysen herangezogen. Hsfs besitzen, ähnlich anderen Transkriptions -aktivierenden Proteinen, eine modulare Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Module der 21 Arabidopsis Hsfs untersucht, die für den Oligomerisierungs-Zustand, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transkriptions-aktivierende Potential von Bedeutung sind. Essentiell für die Funktion von Klasse A Hsfs als Transkriptions-Aktivatoren sind kurze Peptidmotive, die durch aromatische und große hydrophobe Aminosäure-Seitenketten geprägt sind, die in einer sauren Umgebung eingebettet sind (AHA Motive: aromatic, large hydrophobic and acid amino acid residues). Es wurde mit GST pull-down Assays gezeigt, dass AHA Motive mit ausgewählten Transkriptions-Komplexen interagieren. Das generelle Konzept für AHA Motive als kohäsive Elemente zur Interaktion mit der Transkriptions- Maschinerie wurde durch Mutationsanalysen verifiziert, besonders detailliert am Beispiel von LpHsfA2 und LpHsfA1 aus Tomate in Reporter-Assays in Tabak-Protoplasten und Hefe als auch GST pull-down Experimenten gezeigt. Im Kontrast zu den Klasse A Hsfs besitzen Klasse B und C Hsfs keine AHA Motive. Diese zeigten auch keine eigene Aktivator-Funktion aber Experimente deuten darauf hin, daß sie Coregulatoren für Klasse A Hsfs darstellen. Es wurde gezeigt, dass diese pflanzliche Besonderheit bei Tomate als auch Arabidopsis existiert. Alle 21 Arabidopsis Hsfs wurden als Transkripte nachgewiesen, ihre Expression verhält sich sehr dynamisch in bezug auf Hitze-Stress als auch Entwicklungssignale. Die präsentierte funktionelle Charakterisierung der Hsf Familie von Arabidopsis gibt erste Einsichten in das komplexe Netzwerk der Hsfs und demonstriert bereits, dass im Vergleich zu anderen Organismen, wie z.B. Drosophila und Hefe mit einem Hsf und Säugern mit drei Hsfs, das komplexe pflanzliche Hsf System eine fein regulierte und effiziente Voraussetzung für Pflanzen darstellt, um schnell und vor allem erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren, denen sie nicht entfliehen können.
Es war Gegenstand dieser Arbeit, die Zahl und das Vorkommen der Sporen der Bacillus Spezies im Vergleich zu anderen Parameter in der Trinkwasseruntersuchung die bisher im §37 des Infektionsschutzgesetzes eingesetzt wurden an 288 Wasserproben von verschiedenen Wassergewinnungsanlagen und Trinkwassersystemen nachzuweisen, um das Verhalten der Sporen der Bacillus Spezies in diesen Bereichen zu beschreiben und mit den bisher üblichen Keimen der Trinkwasseruntersuchung in Beziehung zu setzen. Es sollte überprüft werden, ob eine Korrelation zwischen der Koloniezahl und der Zahl der aeroben Sporenbildner nachgewiesen werden kann. Es wurden 77 Wasserproben aus dem Leitungswassersystem der Uni-Klinik Frankfurt entnommen und auf Vorkommen von Sporen der Bacillus Spezies, Koloniezahl, E. coli und Coliformen Bakterien untersucht. Alle 77 Wasserproben konnten bei einem Erfahrungsrichtwert von 10 KBE in 100 ml Trinkwasser und einer Koloniezahl von 100 pro 1ml Trinkwasser als zufrieden stellend angesehen werden. An keine der Proben konnte ein Wachstum von E. coli festgestellt werden, an 7 Wasserproben konnten Coliforme Bakterien nachgewiesen werden. Es konnte keine Korrelation zwischen Sporen der Bacillus Spezies und der Koloniezahl beim Leitungswassersystem der Uni-Klinik Frankfurt festgestellt werden. Von den 113 untersuchten Flachbrunnen von privaten Haushalten (Oberflächenwasser), konnten nach den strengen Trinkwasserverordnungsrichtlinien nur 60 Proben als zufrieden stellend bezeichnet werden, da aber diese Wassergewinnungsanlagen hauptsächlich zur Bewässerung dient, ist es unbedenklich. An keine der Wasserproben konnten Coliforme Bakterien nachgewiesen werden, und an 10 Wasserproben konnte E. coli nachgewiesen werden. Bei diesen Wassergewinnungsanlagen konnte eine Korrelation zwischen Sporen der Bacillus Spezies und der Koloniezahl nachgewiesen werden. Es wurden 82 Grundwasserproben der Stadtwerke Hanau entnommen, davon waren 35 Wasserproben gechlort und aufbereitet, 28 Wasserproben ungechlort und aufbereitet und 19 Proben waren ungechlortes Rohwasser. Vergleicht man die Werte der einzelnen Wasserarten miteinander, so stellt man fest, dass die Sporenzahl fast identisch ist, Werte zwischen 0-32 pro 100 ml Wasser. Die Aufbereitung und Chlorung des Wassers verändert die Sporenzahl nicht. Die Koloniezahl ist bei Rohwasser aber deutlich höher als bei aufbereiteten und gechlorten Wasser. Der Höchstwert bei gechlorten und aufbereiteten Wasser betrug 200 Kolonien pro 100 ml Wasser, bei aufbereiteten und ungechlorten Wasser stieg der Wert auf 4800 Kolonien an und bei Rohwasser sogar auf 5500 Kolonien pro 100 ml Wasser. In nur einer Rohwasserprobe konnte E. coli nachgewiesen werden, keine der Proben enthielt Coliforme Bakterien. Der Wert des Korrelationskoeffizienten war beim ungechlorten Rohwasser am Höchsten und beim aufbereiteten und gechlorten Wasser am niedrigsten. Vergleicht man die 6 Wasserproben des Oberflächenwassers der Wahnbach Talsperre mit den 4 Proben des Mains und des Rheins miteinander, so stellt man fest, dass in allen Wasserproben alle untersuchten Bakterienarten nachweisbar waren. Die höchste Koloniezahlkonzentration von 1.420.000 pro 100 ml wurde im Oberflächen-wasser des Mains nachgewiesen, der zweithöchste Wert von 960.000 pro 100 ml war im Oberflächenwasser des Rheins. Die höchste Sporenzahl von 26.000 pro 100 ml wurde in der Wasserprobe der Wahnbach Talsperre ermittelt, der Main und der Rhein hatten fast identische Werte zwischen 2700 und 5800 Sporen pro 100 ml Wasser. Der höchste Korrelationskoeffizient wurde hier bei den Wasserproben der Wahnbach Talsperre ermittelt, der niedrigste Wert wurde bei den Wasserproben des Rheins ermittelt. Auf Grund ihres differenzierten Nährstoffbedarfs kann sich die Gattung Bacillus in nährstoffärmeren Biotopen nicht vermehren und befinden sich deshalb vermehrt in Oberflächenwasser und den oberen Erdschichten. Sie stellen im Grundwasser und den Folgebereichen seiner Nutzung einen Indikator für den Grad der Kontamination des Wassers mit Abfallstoffen dar. Obwohl der Nachweis der Sporen der Bacillus Spezies sehr leicht erbracht werden kann, und in jedem Stadium der Untersuchung nachweisbar ist, muß bei der Entnahme der Wasserprobe sehr vorsichtig gearbeitet werden, da es in den oberen Bodenschichten leicht zu einer Einschleppung der Sporen der Bacillus Spezies kommen kann und somit zu einer Ver-fälschung der Ergebnisse. Bei Korrekter Probeentnahme ist aber die Aussagekraft der Sporen der Bacillus Spezies sehr hoch. Ein Vorteil der Auszählung der Sporen ist, dass die analytische Methode nur Sporen misst, andere Bakterienformen werden nicht gezählt. Die Auszählung der Sporen und der Koloniezahl sind zwei der wertvollsten Parameter der Wasserqualität. Die Konzentration der Sporen liegt im Grundwasser und seinem Folgebereich zwischen 0,39 und 1,81 pro 100 ml Wasser. In Oberflächenwasser liegt die Konzentration der Sporen der Bacillus Spezies zwischen 1050 und 4500 pro 100 ml Wasser. Die ermittelten Werte dieser Arbeit entsprechen fast alle den Normwerten. Das Vorkommen aller im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Bakterienarten mit sehr hoher Bakterienanzahl konnte nur in den nährstoffreichen Oberflächenwasserproben von Rhein, Main und der Wahnbach Talsperre nachgewiesen werden. Von den 288 untersuchten Wasserproben können 264 Proben unter Betrachtung der Grenzwerte als hygienisch einwandfrei bezeichnet werden. Nach dem heutigen Stand der Literatur ist der Nachweis der Sporen der Bacillus Spezies ein wertvoller und aussagekräftiger Parameter für den Grad der Wasserverschmutzung mit Abfallstoffen, er ist ein Maß für die Effizienz der Aufbereitung bzw. der Kontamination des Grundwassers und somit ein geeigneter Parameter für die hygienische Trinkwasseruntersuchung.
Einleitung: Die kurzkettige Fettsäure Butyrat, die im Gastrointestinaltrakt durch bakterielle Fermentation aus nicht resorbierten Ballaststoffen und komplexen Kohlenhydraten der Nahrung gebildet wird, konnte in zahlreichen in vitro-Untersuchungen ihre chemopräventiven Eigenschaften demonstrieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der Butyrat-induzierten Differenzierung und Wachstumshemmung von Kolonkarzinomzellen näher zu charakterisieren. Methodik: Die Versuche wurden an den kolorektalen Karzinomzelllinien Caco-2 und SW620 durchgeführt, die unter Standardbedingungen kultiviert wurden. Für einen Teil der Experimente wurden zusätzlich die Pankreaskarzinomzelllinien MiaPaca-2 und Capan-1 verwendet. Zytotoxische Effekte wurden durch Messung des Enzyms Laktatdehydrogenase im Überstand ausgeschlossen. Die Zellzahl wurde mittels Kristallviolettfärbung und die Proliferation über den Einbau von 5-Bromo-2‘-deoxyuridin (BrdU) während der DNA-Synthese bestimmt. Die Zelldifferenzierung wurde anhand der Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase quantifiziert. Rezeptorbindungsstudien mit [3H]1,25-Dihydroxyvitamin D3 wurden zur Ermittlung der Vitamin D Rezeptor- (VDR-) Bindungsaktivität durchgeführt, die Menge an VDR mRNA wurde über PCR quantifiziert. Die Proteine wurden mittels Western Blot und die Zellzyklusdistribution mit Hilfe eines Durchflusszytometers analysiert. Ergebnisse: Butyrat [3 mmol/L] sowie sein Prodrug Tributyrin, in 3-fach niedrigerer Konzentration eingesetzt ([1 mmol/L]), hemmten das Wachstum der Pankreaskarzinom-zelllinien MiaPaca-2 und Capan-1 ähnlich effektiv. Auch die apoptose- und differenzierungsfördernden Wirkungen von Butyrat und Tributyrin waren vergleichbar. In der Kolonkarzinomzelllinie Caco-2 erwies sich Butyrat in der Wachstumshemmung und Differenzierungsinduktion als etwas stärker wirksam. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) [10-6 mol/L] besaß in der Zelllinie Caco-2 ebenfalls proliferationshemmende und differenzierungsinduzierende Eigenschaften, die allerdings nur mäßig ausgeprägt waren. Die Kombination aus Butyrat und 1,25-(OH)2D3 wies in etwa eine additive antiproliferative Wirkung auf, wohingegen die Zelldifferenzierung synergistisch verstärkt wurde. Der potenzierende Effekt auf die Differenzierung ließ sich in der Pankreaskarzinomzelllinie Capan-1 bestätigen. Rezeptorbindungsstudien in Caco-2 Zellen ergaben, dass Tributyrin die spezifische Bindung von 1,25-(OH)2D3 an seinen Rezeptor erhöhte, ohne die Affinität des Liganden zu seinem Rezeptor zu beeinflussen. Auf RNA- und Proteinebene ließ sich eine zeit- und dosisabhängige Steigerung der VDR-Expression durch Tributyrin oder Butyrat in den Kolonkarzinomzelllinien Caco-2 und SW620 beobachten. Andere kurzkettige Fettsäuren ähnlicher Struktur beeinflussten hingegen die VDR-Expression in Caco-2 Zellen nur geringfügig oder gar nicht. Die Butyrat-induzierte Differenzierung von Caco-2, SW620 und Capan-1 Zellen ließ sich durch die Kombination mit dem VDR-Antagonisten ZK 191732 [10-5 mol/L] aufheben. Auch der durch die 48-stündige Butyrat-Behandlung von Caco-2 und SW620 Zellen verursachte G0/G1-Zellzyklusstop verschwand vollständig nach Koinkubation mit ZK 191732. Die genauere Untersuchung des molekularen Mechanismus, der dem Butyrat-induzierten Zellzyklusstop zugrundelag, erbrachte eine verminderte Expression der zellzyklusregulierenden Proteine Cyclin D1, E und A sowie der cyclinabhängigen Kinasen cdk2, 4 und 6 durch Butyrat. Weiterhin verstärkte Butyrat die Expression der cdk-Inhibitoren p21Waf1/Cip1 und p27Kip1. Die Butyat-induzierten Veränderungen in den Proteinmengen von p21Waf1/Cip1, cdk6 und Cyclin A ließen sich durch die Kombination mit 1,25-(OH)2D3 synergistisch verstärken und durch die Koinkubation mit ZK 191732 aufheben. Im Gegensatz hierzu wurden die durch Butyrat verursachten Änderungen in der Expression von p27Kip1, cdk2, cdk4, Cyclin D1 und Cyclin E weder durch 1,25-(OH)2D3 verstärkt noch durch den VDR-Antagonisten vermindert. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse demonstrieren, dass Butyrat, das natürlicherweise durch die Nahrung im Darmlumen präsent ist, eine Reihe zellulärer Prozesse in Kolonkarzinomzellen beeinflusst, die schließlich in einer Proliferationshemmung, Differenzierung und Apoptose der Zellen resultieren. An der Regulation dieser Prozesse durch Butyrat ist der VDR zumindest teilweise beteiligt. Dies erklärt die synergistische Wirkung der Kombination aus Butyrat und 1,25-(OH)2D3 auf die Zelldifferenzierung, den Zellzyklusstop sowie auf die Expression verschiedener zellzyklusregulatorischer Proteine in Karzinomzellen. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass Butyrat, als Prodrug in Form von Tributyrin verabreicht, von pharmakologischem Interesse hinsichtlich der Chemoprävention oder -therapie des Kolonkarzinoms sein könnte.
Die Untersuchung wurde auf dem Hintergrund von M.L. Moellers klinischer Arbeit mit Paaren und der Weiterentwicklung der Paardiagnostik und Paartherapie entwickelt. Sie steht im Kontext einer neuen interdisziplinären Forschungsrichtung in der Medizin, die sich den Zusammenhängen von Paarbeziehung und Gesundheit widmet. Das Untersuchungsinstrument ist das GT-7er-Set, in dessen Zentrum das Beziehungsbild steht. Die salutogenen und pathogenen Effekte der Beziehung auf das Selbsterleben wurden auf der Basis der Theorie der Paarstörung (s. 3.1) erläutert und bis in die frühen, ersten Bindungserfahrungen zurückverfolgt und beschrieben (s. 3.3). Zentrale Wirkmechanismen der Beziehungsinteraktion wie Übertragungsprozesse und Empathie wurden auf die Wirkfaktoren des therapeutischen Verfahrens, der Gruppenanalyse, bezogen, aus dem das noch wenig erforschte Verfahren der Paargruppenanalyse entwickelt wurde. Es wurden dynamische Prozesse von Frauen und Männern mit Paarproblemen in einem gruppenanalytischen Behandlungssetting untersucht. Die zentralen Fragen lauteten, inwiefern das Selbst- und Beziehungserleben der Paare zu Beginn (T1) und nach einem Jahr Teilnahme in einer Paargruppe (T2) mit den unter 3.1 formulierten zentralen Annahmen zur Theorie der Paarstörung in Zusammenhang gesehen werden kann und ob die allgemeinen Wirkmechanismen der Gruppenanalyse im paargruppenanalytischen Setting, die im Teil 4.1 und 4.2 beschrieben wurden, nach einem Jahr zu einer Veränderung des Selbst- und Beziehungserlebens geführt haben. Im Selbstbild (GT1) ließen sich für die untersuchten Paare keine Veränderungen im Untersuchungszeitraum nachweisen. Unterschiede zeigten sich im Beziehungsbild (GT3) sowohl für die Gesamtstichprobe wie auch für Männer und Frauen getrennt betrachtet, darüber hinaus wurden nach einem Jahr geringere Beziehungsbildunterschiede zwischen Männern und Frauen ermittelt. Die Ergebnisse liefern Hinweise sowohl auf das Vorhandensein der bipersonalen Abwehrformation als auch auf deren Modifizierbarkeit im therapeutischen Prozeß. Der Wirkfaktor Beziehung mit den angenommenen erlebens- und verhaltenseinschränkenden Auswirkungen bei belasteten Paaren konnte in Form von Bildervergleichen (GT1–GT3, GT5–GT7) dargestellt werden. Er zeigt ein Spannungsverhältnis an, das sich im Erleben der Männer nach einem Jahr verändert hat (Tendenz auf Skala 4 Grundstimmung und Skala 6 Maskulinität). Bezogen auf die vermutete Wirkung der Beziehung auf den Anderen zeigten sich für die Gesamtstichprobe signifikante Differenzveränderungen bezüglich der Depressivitätswerte (Skala 4 Grundstimmung). Nach einem Jahr vermuten die Frauen eine größere Diskrepanz auf dieser Erlebensdimension bei ihren Männern: Sie glauben, daß sich ihre Männer in der Beziehung depressiver fühlen als im Allgemeinen und erfassen damit die oben beschriebene Tendenz der Differenzveränderung (GT1–GT3) ganz richtig. Da in der Paartheorie den empathischen und projektiven Prozessen innerhalb des Paares eine fundamentale Bedeutung beigemessen wird, zielt die zweite Untersuchungsrichtung auf die Frage, ob Filter der intrapersonellen und interpersonellen Wahrnehmung im Sinne globaler oder selektiver Einfühlungsdefizite erkennbar sind und ob sich diese im Untersuchungszeitraum verändern. Anders als angenommen zeigten sich die untersuchten Paare als durchweg empathiefähig, vor allem im Sinne der Fähigkeit zu einer instrumentellen Empathie. Die wechselseitige Wahrnehmung und Einfühlung fiel allerdings für das beziehungsbezogene Selbsterleben (GT3) niedriger aus als für das allgemeine Selbstbild (GT1). Diese Diskrepanz kann als ein Ausdruck der in der Beziehung eingeschränkten Fähigkeit zu wechselseitiger empathischer Reaktion verstanden werden (s. 3.2.). Diese Beobachtungen und Ergebnisse stützen die Annahme einer bipersonalen Abwehrformation, die mit selektiven Einfühlungsdefiziten einhergeht. Systematische Veränderungen dieser Fähigkeit konnten im Beobachtungszeitraum nicht nachgewiesen werden. Konzeptuell kann sich die vorliegende Untersuchung nicht an allen in der Psychotherapie- Evaluationsforschung als bedeutsam angesehenen methodischen Gütekriterien messen lassen (Leuzinger et al. 2001, 193ff.; Sandell 1997, 348ff.), sie stellt eher einen Ausschnitt einer Prozeß- oder Verlaufsforschung dar. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung haben somit Vorstudien- oder Pilotstudien-Charakter, sie sind primär entdeckungs- und nicht feststellungsorientiert. Mit der vorliegenden Untersuchung und den parallel in den anderen Arbeiten untersuchten Fragestellungen des Forschungsprojektes ist ein erster Schritt gemacht, Paare in einem paargruppenanalytischen Behandlungssetting zu untersuchen. Weitere Verlaufsforschung und Untersuchungen bei Ende und nach Abschluß der Therapie sind erforderlich.
Zwischen dem 01.01.1988 und dem 30.10.1995 wurden in der Chirurgischen Klinik I – Klinik für Allgemein-, Visceral-, Gefäß- und Thoraxchirurgie - der Städtischen Kliniken Offenbach am Main an 856 Patienten insgesamt 942 Hernioplastiken durchgeführt. Das Ziel dieser retrospektiven Aufarbeitung ist es mittels Analyse der Krankengeschichten und postoperativer Fragebogenerhebung, die eigenen Ergebnisse nach Leistenhernien-operationen und der mit diesem Thema verbundenen Probleme vor dem Hintergrund einer großen Anzahl unterschiedlicher Operationsverfahren zu überprüfen. Die Rücklaufquote der Fragebogenaktion betrug 67,6%. Damit fanden 566 Primär- und 71 Rezidivhernien Eingang in die Studie. Patienten mit Femoralhernien und kindliche Leistenhernien wurden nicht berücksichtigt. Die Fragebogenaktion erfolgte 36 bis 130 Monate postoperativ, damit lag die Nachkontrollzeit im Mittel bei 77 Monaten (6 Jahre und 5 Monate). Primäre Leistenhernien wurden in 68,2% nach Bassini, in 28,1% nach Shouldice, in 1,6% nach Lichtenstein, in 1,6% nach Lotheissen und in 0,5% im Rahmen einer Laparotomie operiert. Rezidivleistenhernien wurden in 64,8% nach Bassini, in 12,7% nach Shouldice, in 19,7% nach Lichtenstein und in 2,8% nach Lotheissen operiert. An intraoperativen Komplikationen kam es nur in einem Fall zur akzidentiellen Verletzung der Arteria femoralis. Ansonsten traten keine weiteren intraoperativen Komplikationen auf. Die Rate der allgemeinen Komplikationen lag bei 4,1%. Hier dominierten die Pneumonien und Harnwegsinfekte. Bei konsequent durchgeführter low-dose-Heparinisierung kam es nur in einem Fall zu einer tiefen Beinvenenthrombose. Die Letalitätsrate lag bei 0,6%. Hier zeigte sich der Anstieg der Letalität bei Notfalleingriffen wegen Inkarzeration. Lokale Frühkomplikationen wie beispielsweise Hämatome oder Wundinfektionen traten in 7,4% der Fälle auf. Adipositas scheint zu einer erhöhten Rate an Wundinfektionen zu führen. Dabei ließ sich weder ein Einfluß der Ärztequalifikation auf die Komplikationsrate feststellen, noch war eine Verfahrensabhängigkeit zu beobachten. Insgesamt 11,9% der Patienten klagten über Schmerzen, die in 7,1% der Fälle ausstrahlenden Charakter im Sinne eines Ilioinguinalis- oder Ramus-genitalis-Syndromes hatten. Eine Exhairese des Nervus ilioinguinalis reduzierte die Inzidenz von ausstrahlenden Schmerzen. Dieser Vorteil wird jedoch mit vermehrten Auftreten von Sensibilitätsstörungen im Versorgungsgebiet des Nervens erkauft. Nach Rezidiveingriffen war die Inzidenz von chronischen Leistenschmerzen erhöht. Ein sicherer Einfluß der Verfahrenswahl auf die Inzidenz von chronischen Leistenschmerzen war nicht zu erkennnen. Ausnahme bildete das Verfahren nach Lichtenstein. Die Implantation von alloplastischen Material scheint zu einer erhöhten Inzidenz von chronischen Leistenschmerzen zu führen. Die Gesamtrezidivrate lag bei 10,0%. Nach Primäreingriffen lag die Rezidivrate bei 9,0%. Bei primären direkten Leistenhernien ist das Shouldice-Verfahren (Rezidivrate: 4,6%) dem Bassini-Verfahren (Rezidivrate: 11,4%) deutlich überlegen. Beim Betrachten aller Primärhernien zeigt sich der Vorteil des Shouldice-Verfahrens nicht so deutlich (8,0% beim Bassini-Verfahren versus 7,0% beim Shouldice-Verfahren). Somit ist bei kleinen indirekten Leistenhernien das Einsetzen des Bassini-Verfahrens nach der Originalmethode mit einem Mitfaßen der Fascia transversalis zu vertreten. Bei der Verfahrenswahl sollte somit der klinische Befund berücksichtigt werden, damit die chirurgische Therapie maßgeschneidert werden kann, denn die eigentliche Prüfstrecke bei Primärhernien stellen große mediale und kombinierte Leistenhernien dar. An dieser Stelle ist prinzipiell eine einheitliche Klassifikation der Leistenhernien, wie von Schumpelick oder Nyhus vorgeschlagen, zu fordern, damit Gleiches mit Gleichem verglichen werden kann. Abzulehnen bleibt die die Implantation eines Vicrylnetzes in die Bruchlücke mit einer Rezidivrate von insgesamt 20,3%. Die Re-Rezidivrate aller Rezidiveingriffe lag bei 18,3% und spiegelt die Schwierigkeit der operativen Versorgung der Rezidivhernie wider. Die Re-Rezidivrate des Shouldice-Verfahrens von 20,0% ist auf Grund der niedrigen Fallzahl (n=5) sicherlich nicht aussagekräftig und dürfte bei höheren Fallzahlen deutlich niedriger liegen. Erstaunlich ist die niedrige Re-Rezidivrate des Bassini-Verfahrens bei Rezidivhernien von 8,6%, die in der Mehrzahl der Publikationen deutlich höher liegt. Auf den ersten Blick ernüchternd stellt sich die Rezidivrate beim Lichtenstein-Verfahren mit 35,3% dar. Vor dem Hintergrund, daß das Lichtenstein-Verfahren nur bei Rezidivhernien und bei einer großen Primärhernie angewandt wurde, läßt sich insgesamt ein nicht ganz so schlechtes Bild gewinnen, obgleich eine weitere deutliche Senkung der Rezidivrate wünschenswert wäre. Zahlreiche Veröffentlichungen ermutigen zu einer vermehrten Anwendung präperitonealer Prothesen. Jedoch sollte die Anwendung des Lichtenstein-Verfahrens auf Rezidivhernien, bzw. Mehrfachrezidivhernien und voluminöse Hernien beschränkt bleiben. Insgesamt läßt sich feststellen, daß die Operation der Leistenhernie eine für alle Erfahrungsgruppen gut geeignete Operation darstellt. Die Rezidivraten unterschieden sich hinsichtlich der Ärztequalifikation nicht wesentlich. Unter dem Vorbehalt der kleinen Fallzahlen der „Nicht-ITN-Verfahren“ läßt sich die Tendenz erkennen, daß bei alternativen Anästhesieverfahren, insbesondere bei Spinal- und Lokalanästhesie, die Rezidivrate niedriger liegt. Denkbar als Grund der höheren Rezidivrate beim Intubationsverfahren wäre der häufig auftretenden Hustenreiz bei der Extubation und damit verbundenen erhöhten intraabdominellen Druckspitzen mit der Gefahr des Einreisens einzelner Nähte. Auch unter dem Gesichtspunkt der Risikominderung und der wachen Kooperation des Patienten mit der Möglichkeit intraoperativen Beurteilung der anatomischen Verhältnisse und Suffizienz der Reparation durch den Valsalva-Preßversuch läßt insbesondere die Lokalanästhesie attraktiv erscheinen. In dieser Studie traten nach zwei Jahren erst 68,8% der festgestellten Rezidive auf. Damit würde ein Zweijahres-follow-up, wie in vielen Studien angewandt, nicht zur Bestimmung der Rezidivrate ausreichen. Unter dem Gesichtspunkt des Zeitpunktes des Auftretens des Rezidives, zeigte sich, daß das Lichtenstein-Verfahren häufig zu Frührezidiven neigt. Zwischen den beiden gängigen Operationsmethoden - Bassini und Shouldice - gab es jedoch keine statistisch signifikante Unterschiede hinsichtlich der Rezidivzeitpunkte. Erwartungsgemäß bestätigte sich, daß Rezidive vermehrt bei direkten und kombinierten Leistenhernien, sowie bei Patienten mit Risikoerkrankungen auftreten. Somit sollten beim Vergleich von Rezidivraten den Risikofaktoren der Kollektive Beachtung geschenkt werden, um eine direkte Vergleichbarkeit zu ermöglichen. Eine simultane Zweitoperation führte jedoch nicht zu einer erhöhten Gesamtrezidivrate, jedoch zu einer erhöhten Frührezidivrate.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein klinisches Alarmsystem für septische Schock-Patienten aufgebaut. Zweckmäßigerweise wurden hierfür metrische körpereigene Variablen verwendet, da Analysen belegt haben, dass die metrischen Daten besser zur Alarmgenerierung geeignet sind als die symbolischen Daten. Für das Training des adaptiven Neuro-Fuzzy-Systems wurden die Daten der letzten Tage des Intensivaufenthalts verwendet, da in diesem Zeitraum, im Gegensatz zu den ersten Tagen, eine gute Klassifikationsperformanz erreicht wurde. Die daraus resultierenden Alarmhistorien liefern zuverlässige Hinweise für den Intensivmediziner auf besonders kritische Patienten. Durch diese Arbeit wird es möglich werden, den medizinischen SOFA-Score, der aus 10 Variablen zusammengesetzt ist, durch die einfachere Kombination "Systolischer Blutdruck / Diastolischer Blutdruck / Thrombozyten" zu ersetzen mit einer mindestens genauso guten Performanz. Durch die Hinzunahme weiterer Variablen ist es möglich, die Performanz des SOFA-Scores zu überbieten, wobei der SOFA-Score bereits die beste Klassifikationsperformanz unter den getesteten Scores erreichte. Die erzeugten Regeln konnten die Klassifikationsentscheidung sinnvoll untermauern. Im Gegensatz zur automatischen Regelgenerierung war es Ärzten nicht möglich ahnlich sinnvolle formale Regeln zu formulieren.
Der Nucleus suprachiasmaticus (SCN) ist der übergeordnete circadiane Schrittmacher (die “Tageszeitenuhr“) der Säugetiere. Er generiert den circadianen Rhythmus und synchronisiert diesen mit den diurnalen Signalen (Zeitgebern) aus der physikalischen Umwelt. Die Generierung der circadianen Rhythmik findet innerhalb einzelner SCN-Neurone (“clock cells“), die einen Multi-Oszillatoren-Veband bilden, statt. Die asynchronen Individualrhythmen der “clock cells“ werden zu einem gemeinsamen Haupt-Rhythmus, den circadianen Rhythmus, synchronisiert. Die entscheidende Rolle bei der Synchronisation der Individual-Rhythmen wird dem inhibitorischen – in fast allen SCN-Neuronen vorkommenden – Neurotransmitter Gamma- Amino-Buttersäure (GABA) zugeschrieben. Der gemeinsame Haupt-Rhythmus wird weiterhin durch exogene Zeitgeber auf die 24-stündige Periodik der Umweltsignale getriggert. Der dafür wichtigste Zeitgeber ist das Licht. Die Licht-Informationen werden retinal perzipiert und chemisch durch den Neurotransmitter Glutamat an den SCN übermittelt. Der Schlaf – als prominente Komponente circadianer Rhythmen – scheint ebenso vom GABAergen System des SCN gesteuert zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das GABAerge System von Goldhamstern einschließlich seines glutamatergen Eingangssystems und der GABAergen Efferenzen analysiert. Diurnale Fluktuationen der untersuchten Komponenten des GABAergen Netzwerkes wurden auf ihre Beteiligung an Synchronisationsvorgängen im SCN beleuchtet. Die semiquantitative Analyse mit Hilfe von HPLC, Immuncytochemie und Immunoblot- Verfahren erbrachte eindeutige diurnale Fluktuationen aller untersuchten Komponenten des GABAergen Systems im Goldhamster-SCN. Während der Dunkelphase wurde das GABAerge-System aktiviert: die GABA-Synthese (GAD56/67), der Gesamt-GABA-Gehalt und die GABA-Wiederaufnahme (Entsorgung) aus dem synaptischen Spalt durch GABA-Transporter (GAT-1) zeigten eine nächtliche Reaktivitätssteigerung. Dies wurde durch die Erhöhung der nächtlichen GABA-Freisetzung aus SCN-Gewebekulturen (slice-Kulturen) ergänzt. In einer weiteren Untersuchung wurde die Zusammensetzung des GABAA-Rezeptors, der an den Synchronisationsvorgängen im SCN beteiligt ist, näher charakterisiert. Im SCN von Goldhamstern wurden die GABAA-Rezeptor- Untereinheiten alpha 2, alpha 3, beta 1 und beta 2/3 (schwach vertreten) nachgewiesen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das GABAerge System an der Schlafregulation beteiligt ist. Die Komponenten des GABAergen Systems (Gesamt-GABA, GAD56/67, GAT-1) im SCN von Goldhamstern wiesen während des Schlafs im Vergleich zum wachen Tier identischer photoperiodischer Phasenlage erhöhte Reaktivität auf. Die Komponenten des glutamatergen Systems, welchem die Lichtinformationsübermittlung an das GABAerge System im SCN obliegt, zeigten ebenfalls eine diurnale Fluktuation. Die Maxima der Immunreaktivität für die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten (GluR1, GluR2/3) am Tage deuten auf eine optimale Beteiligung dieser Komponenten an der Lichtvermittlung und auf einen Triggereffekt von Glutamat hin. Der Gesamt-Glutamat-Gehalt im SCN wies zwar erhöhte Werte während der Nacht auf, jedoch konnte keine Aussage über die Menge des funktionellen Neurotransmitters gemacht werden, da nur ein Bruchteil der Gesamt-Glutamat- Menge als Neurotransmitter wirkt. Die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten zeigten eine – im Vergleich zu wachen Tieren derselben photischen Phasenlage – erhöhte Reaktivität bei schlafenden Goldhamstern. Die Hochregulation der GABAergen Systems während der Nacht unterstützt die Hypothese, dass GABA-Pulse – verabreicht zu einem bestimmten Tageszeit – Rhythmen individueller SCN-Neurone (“clock cells“) synchronisieren können. Die Synchronisation der GABAAusschüttung zu bestimmten Tageszeiten aus allen SCN-Neuronen wird durch das glutamaterge System getrieben. Alle untersuchten Komponenten zeigten dabei konsensuelle Reaktivitätsmuster, die als erhebliche Kontrastverstärkung der Hell- und Dunkelphase gewertet werden müssen. Die Unterschiede in der Reaktivität des GABAergen und glutamatergen Systems zwischen schlafenden und phasengleich untersuchten wachen Tieren stellen deren große Bedeutung für die Schlafregulation heraus.
Einfluß von Rho-GTPasen und Aktin auf den cortikalen Membrantransport in Xenopus laevis-Oozyten
(2002)
Rho-Isoform-spezifische Änderungen der Zelloberfläche. Durch Bestimmung der Anzahl plasmamembranständiger Na,K-Pumpen bzw. der elektrischen Membrankapazität als Maße für die Zelloberfläche wurde der Einfluss verschiedener rekombinanter Rho-GTPasen auf den kortikalen Membranfluss an Xenopus-Oozyten untersucht. RhoA, RhoB, RhoC, RhoD und Cdc42 führten zu einer Abnahme der Zelloberfläche, wohingegen RhoE, RhoG und Rac1 eine Vergrößerung hervorriefen. Die Rho-GTPase TC10 hatte keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Die Veränderung der Zelloberfläche wurde durch elektronenmikroskopische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen verifiziert: Oozyten zeigten nach Überexprimierung von RhoA eine deutliche Reduktion der Mikrovilli, wohingegen die dominant-aktive Form von RhoG (V12-RhoG) zu einer Verlängerung der Mikrovilli führte. Für die Wirkstärke der Rho-GTPasen, die die Oberfläche in ihrer Wild-Typ Form reduzierten, konnte folgende Rangfolge ermittelt werden: RhoB > RhoA > RhoD > RhoC > Cdc42. In der Gruppe der Rho-Proteine, die eine Vergrößerung der Zelloberfläche bewirken, zeigte RhoE den größten Effekt, gefolgt von Xenopus-RhoG, humanem RhoG und Rac1. Aus den Untersuchungen ging ferner hervor, dass dominantaktive Formen der Rho-GTPasen nicht unbedingt stärker wirken als die Wildtypform. Auch einige dominant-negative Formen führten trotz des inhibierten GDP/GTP-Austausches zu unerwarteten Veränderungen der Zelloberfläche. GTPasen anderer Familien wie Arf1, Arf6 oder Rab5a, für die eine Rolle beim vesikulären Transport gut dokumentiert ist, hatten keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Für die Änderung der Zelloberfläche erwies sich das Vorhandensein eines Cterminalen Lipidankers als essentiell, da Rho-GTPase-Mutanten, die infolge des Fehlens eines kritischen Cysteinrestes nicht mehr isoprenyliert werden können, keine Änderung der Zelloberfläche bewirkten. Die Analyse von RhoB-RhoG-Chimären brachte keine eindeutigen Hinweise auf das Vorhandensein einer für die Zelloberflächenregulation entscheidenden weiterer Region. Sowohl N-terminal- als auch C-terminal-gelegene Sequenzabschnitte waren zur Ausbildung des vollen Effektes notwendig. Identifizierung möglicher RhoA-Effektoren. Die Untersuchung von RhoAEffektormutanten, bei denen die Interaktion mit spezifischen Effektormolekülen durch Mutation in der Effektorregion inhibiert war, ergab, dass die Abnahme der Zelloberfläche weder durch Rhophilin, mDia, Kinectin, Citronkinase oder ROK vermittelt wird. Auch der ROK-Inhibitors Y-27632 konnte den RhoA-Effekt nicht blockieren. Nach diesem Ausschlußverfahren konnte die Proteinkinase N (PKN, PRK) als einziger möglicher Effektor für den durch RhoA ausgelösten Internalisierungsprozeß ermittelt werden. Wechselwirkung zwischen Rho und Aktin. Rho-Proteine gelten als endscheidene Regulatorproteine des Aktinzytoskeletts. Als Reaktion auf bestimmte extrazelluläre Signale kontrollieren diese Proteine Aufbau und Zerfall des Aktins. Untersucht wurde hier der Einfluß der Aktinumstrukturierung auf den Rho-vermittelten Membrantransport. Die das Aktin-Zytoskelett gegensätzlich beeinflussenden Substanzen Cytochalasin B, Cytochalasin D und Phalloidin hatten keinen bzw. nur einen schwachen Effekt auf die Oozyten-Oberfläche. Die Rho-vermittelte Zelloberflächenänderungen wurden von diesen Substanzen nicht blockiert. Dagegen bewirkten die das Aktin-Zytoskelett depolymerisierenden Substanzen Latrunculin A und C2-Toxin eine starke Reduzierung der Zelloberfläche. Die Reduzierung unter Latrunculin A kam auch dann zustande, wenn zuvor RhoE überexprimiert wurde, welches selbst die Zelloberfläche stark vergrößert. Wurde zunächst C2-Toxin in Oozyten injiziert und anschließend RhoE überexprimiert, ergab sich keine Veränderung der Membrankapazität im Vergleich zu einer nicht injizierten Kontrolloozyte. Der Effekt von Latrunculin A wurde blockiert, wenn Rho-GTPasen durch Vorbehandlung der Oozyten mit Rho-spezifischen Toxinen (ToxB und C3- Toxin) inaktiviert wurden. Daraus folgt, dass der Effekt von Latrunculin A und C2-Toxin davon abhängt, dass aktivierbares Rho zur Verfügung steht. Jasplakinolid, eine Aktin stabilisierende Substanz, führt ebenfalls zu einer starken Verringerung der Zelloberfläche, die jedoch durch Toxin-Vorhandlung nicht blockierbar und damit RhoA-unabhängig war. Auswirkung der GAP-Wirkung von ExoS auf die Rho-Aktivität. Die Injektion von ExoS, einem Toxin, das gegenüber Rho GAP-Aktivität aufweist, führt zu einer Vergrößerung der Zelloberfläche. Die GAP-Wirkung von ExoS konnte durch das CNFToxin, daß aufgrund einer Aktivierung von Rho zu einer Verminderung der Zelloberfläche führt, nicht aufgehoben werden. Auch die dominant-aktiven Formen von RhoA (V14-RhoA, Q61-RhoA) konnten die GAP-Wirkung von ExoS nicht blockieren. ExoS kann im Gegensatz zu anderen GTPase-aktivierenden Proteinen eine Interaktion mit der deamidierten Form von Rho eingehen und somit den Aktivitätszustand durch GTPHydrolyse beenden. Wechselwirkung zwischen Bordetella Dermonekrose-Toxin (DNT) und Rho. Die biologische Wirkung von DNT resultiert aus einer Deamidierung und Transglutaminierung von Rho-GDP nach Freisetzung von GDI. Aufgrund dieser Modifikationen kommt es zum Verlust der GTP-Hydrolyse-Aktivität und somit zur Bildung einer konstitutiv-aktiven Form von Rho. In Zusammenarbeit mit Prof. Aktories (Pharmakologisches Institut, Freiburg), gelang es, die Aminosäure Lysin als ein weiteres Substrat neben Spermidin und Putrescin für den Transglutaminierunsprozeß des Toxins DNT zu identifizieren.
Geschichte, Baubeschreibung und Baugeschichte der Marktkirche St. Bonifatius in Bad Langensalza
(2002)
Die Marktkirche Sankt Bonifatius in Bad Langensalza, kurz Kirche im folgenden Text, ist der monumentalste erhaltene gotische Sakralbau zwischen Erfurt, Gotha, Mühlhausen und Weißensee. Bislang liegen nur ältere, kurze Beschreibungen der Kirche vor. Diese Arbeit führt neue, bisher unveröffentlichte, Unterlagen und Erkenntnisse zu einer Bestandsaufnahme zusammen. Sie umfaßt eine Betrachtung des Baukörpers, der Einordnung der Bauabfolge auf der einen und der Zuordnung des Gefundenen auf der anderen Seite. Ob und wie die Kirche in ihrer heutigen Form so geplant war und in ihrer Verwendung keine Änderungen erfolgte soll in dieser Arbeit soweit wie möglich geklärt werden. Genauso, ob sie ursprünglich in der Form errichtet wurde wie sie uns heute vor Augen steht. Da die Schmuckformen nicht sehr üppig sind, ist ein stilistischer Vergleich, wenn er nicht deutlich nachweisbar ist, mit anderen Kirchen oder Bauten nur in geringen Maße möglich. Die Einbindung der Kirche in die Kulturlandschaft Mittelthüringens, ihre Stellung und Bedeutung in der Stadt Bad Langensalza wird durch die Baugeschichte der Kirche mit dargestellt werden. Genauso werden alle mit ihr verknüpften Ereignisse und Unterlagen in der Arbeit dargestellt, die nicht leicht zugänglichen sind im Anhang publiziert.
Septine bilden eine neue Klasse filamentbildender kleiner GTPasen, die ursprünglich in der Hefe Saccharomyces cerevisiae aufgrund ihrer Funktion in der Cytokinese entdeckt wurden. Mittlerweile wurde gezeigt, dass Septine nicht nur in Pilzen, sondern auch im gesamten Tierreich vorkommen. In Säugern sind bisher zehn Isoformen, die z. T. in mehreren Spleißvarianten auftreten, beschrieben worden. Die Tatsache, dass Septine auch in postmitotischen Geweben wie dem Hirn exprimiert werden, weist darauf hin, dass Septine zumindest in Säugetieren nicht nur in der Zellteilung eine Rolle spielen. Die nachgewiesene Interaktion eines Säugerseseptins mit dem für die Fusion sekretorischer Vesikel essentiellen Membranprotein Syntaxin-1 (Beites et al., 1999) und die Koimmunopräzipitation eines Septinkomplexes mit Antikörpern gegen den Sec6/8-Komplex (Hsu et al., 1998), der beim zielgerichteten Transport sekretorischer Vesikel eine Rolle spielt, deuten darauf hin, dass Säugerseptine ein Funktion bei Transportprozessen spielen könnten. Um weitere Hinweise über die Wirkungsweisen von Septinen zu erhalten, wurden in dieser Arbeit zwei Screening-Systeme angewendet, um Interaktionspartner von Septinen zu identifizieren. Bei einem Suppressor-Screen mit einer Hefe-Septinmutante (cdc1-11) wurden zwei andere Hefeseptine als Suppressoren identifiziert (Cdc3p und Cdc12p), was auf eine Redundanz in der Funktion dieser Septine hinweist. Außerdem wurden Hefe-Zwei-Hybrid-Screens durchgeführt, bei denen eine cDNA-Bank aus adultem Rattenhirn nach potentiellen Interaktionspartnern des N-Terminus und des C-Terminus des Säuger-Septins rSLPa durchsucht wurde, das wegen der oben genannten Koimmunpräzipitation mit Komponenten des Sec6/8-Komplexes möglicherweise eine Rolle in Transportprozessen spielt. Als möglicher Interaktionspartner des N-Terminus von rSLPa wurde die lange Isoform der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 identifiziert. Die Interaktion konnte in vitro mittels GST-Fusionsproteinen in Kopräzipitations-Experimenten zwar nicht eindeutig verifiziert werden. Jedoch wurde in Koexpressionsexperimenten eine Kolokalisation von rSLPa mit iPLA2 beobachtet, was zumindest auf eine mögliche Interaktion beider Proteine in vitro hindeutet. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die gefundene Interaktion eindeutig zu verifizieren. Als Interaktionspartner des C-Terminus von rSLPa wurden drei verschiedene Septine identifiziert: KIAA0202, Pntl2 und ein Klon mit hoher Homologie zu Septinen (DKFZp566C224). Die Interaktion von rSLPa und KIAA0202 wurde durch Kolokalisationsstudien in COS-7 Zellen bestätigt. Bei der weiteren Untersuchung verschiedener Säugerseptine und deren Interaktionen wurde die filamentbildende Eigenschaft der Septine näher charakterisiert. Mithilfe von Mutanten, die die Fähigkeit, GTP zu binden, verloren hatten, konnte nachgewiesen werden, dass die GTP-Bindung eine wichtige Funktion in der Filamentbildung hat. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der N-Terminus von rSLPa dessen Lokalisation an Aktinstressfasern vermittelt. Mit spezifischen Antiseren, die gegen rSLPa und Septin6 hergestellt wurden, wurde die Expression dieser Septine in verschiedenen Rattengeweben untersucht. Außerdem wurde gezeigt, dass beide Septine während der Entwicklung in etwa gleich bleibenden Mengen in verschiedenen Regionen des Gehirns exprimiert werden, was die Annahme unterstützt, dass diese Septine nicht ausschließlich eine Rolle in der Zellteilung spielen. Die Lokalisation von endogenem sowie überexprimiertem rSLPa wurde in hippocampalen Neuronen untersucht. rSLPa ist nicht synaptisch, sondern in Anreicherungen direkt neben synaptischen Kontakten, bzw. unterhalb von dendritischen Dornfortsätzen lokalisiert. Diese Lokalisation von rSLPa weist neben einer Funktion des Septins in Transportprozessen auch auf eine Rolle in der Kompartimentalisierung der Plasmamembran von Neuronen hin.
Aus dem Bereich der, bei Sportlern vermehrt auftretenden dermatologischen Erkrankungen, werden nach ausführlicher Darstellung der Mykoseproblematik in unterschiedlichen Sportbereichen, die Prävalenz und prädisponierende Faktoren für die Tinea pedis-Infektionen bei einem Kollektiv von 235 Marathonläufern erhoben. Auf Grundlage der gewonnenen Studienergebnisse sollen Prophylaxeempfehlungen für die Sporttreibenden formuliert und Grundlagen für weiterführende Studien geschaffen werden. Zur medizinischen Einführung in die Studienthematik wird im zweiten Kapitel ein Exkurs in die Fuß- und Nagelpilzerkrankungen vorangestellt. Die klinischen Krankheitsbilder und klassische Transfektionswege von Tinea pedis interdigitalis, Onychomykosen und Tinea pedis vom Mokassin-Typ werden so weit beschrieben, wie es für das Verständnis der Studie notwendig ist. Die Studie basiert auf drei, mit insgesamt 296 Teilnehmern, zwischen Februar 1998 und Juni 2000 durchgeführten Pilotstudien. Im Verlauf der Pilotstudien wurden unterschiedliche Studienschwerpunkte, so zum Beispiel die Fragen nach der mykologischen Prävalenz von Sportlern, ob Mykoseerreger auch in Sportschuhen nachgewiesen werden können oder ob Sportler und Schuh schnell und effektiv saniert werden können bearbeitet. Über die Durchführung der Pilotstudien hinweg wurde ein Prüfbogen entwickelt, der es im Rahmen einer Sportgroßveranstaltung, dem Euro Marathon 2000, in Frankfurt ermöglichte, studienrelevante Variablen der Stichprobenmitglieder vor bzw. parallel zu den durch Mediziner durchgeführten klinischen Inspektionen zu erfassen. Die klinischen Befunde wurden durch anschließende labortechnische Untersuchungen überprüft und spezifiziert. Auf der Basis des gewonnenen Datenmaterials wurden die primären Fragestellungen: „Wie hoch ist die mykotische Infektionsrate bei der Stichprobe? Welche Verteilung der mykotischen Erkrankungen Onychomykose, Tinea pedis interdigitalis oder Mokassin-Typ liegen bei der untersuchten Stichprobe vor? Welche Abhängigkeiten zwischen erhobenen Begleitvariablen und mykotischen Erkrankungen können festgestellt werden?“ sowie die sekundären Fragestellungen: „Wie sind die mykotischen Erkrankungen auf die einzelnen Füße, Zehen, Zehenzwischenräume verteilt? Welchen Ausprägungsgrad weisen die mykotischen Erkrankungen im Fußbereich auf? Sind Abhängigkeiten zwischen Ausprägungsgrad und erhobenen Begleitvariablen festzustellen? Welche Erreger können durch die Laboruntersuchungen nachgewiesen werden? Können frühere Pilot-Studienergebnisse durch diese Studie bestätigt werden?“ mit Hilfe statistischer Verfahren, ausgewertet und interpretiert. Die Probanden wiesen zu 59,6% positive mykotische Befunde im Fußbereich auf. Einige der erhobenen Begleitvariablen, so zum Beispiel Alter der Sportler und Anzahl der betriebenen Sportarten, stehen in signifikantem Zusammenhang zum Auftreten positiver mykologischer Befunde. Weitere Einflussvariablen liesen bei der Korrelationsanalyse Gefährdungstendenzen erkennen. Mit Hilfe der logistischen Regression wurde die Hypothese „Die Wahrscheinlichkeit für positive mykotische Befunde ist abhängig von der Anzahl der vorhandenen Risikofaktoren“ stufenweise in ein Modell mit den vier Risikofaktoren: Alter des Sportlers >= 40 Jahre, nur ein bis zwei betriebene Sportarten, drei und mehr Sportschuhe in Gebrauch und Gewicht >= 70 kg angepasst und überprüft. Die Darstellung von vier exemplarischen Einzelfällen veranschaulicht die in den Korellationsbetrachtungen uni- und multivariat beschriebenen Risikofaktoren. Die Arbeit schließt mit einem therapeutischen Exkurs, in dem für die drei beschriebenen Tinea pedis-Infektionen die gängigen Therapien aber auch pespektivisch zu erwartende Wirkstoffkombinationen genannt werden. Sportspezifische und allgemeine Prophylaxeempfehlungen komplettieren das letzte Kapitel.
Die Vorteile von konuskronengestütztem Zahnersatz für den Patienten sind bekannt: Hoher Trage- und Kaukomfort, bequeme Handhabung, einfache Mundhygiene, Selbstreinigungseffekt durch den Speichel, sekundäre Verblockung durch die Suprakonstruktion, axiale Belastung der Pfeilerzähne, Kombinationsfähigkeit von Implantaten mit natürlichen Pfeilern und prospektive Erweiterungsfähigkeit. Bisher jedoch verhinderten die aufwändige Herstellung und die Problematik der Passungspräzision eine breite Anwendung dieser Art von Zahnersatz. Insbesondere für eine günstige Langzeitprognose von Implantaten wird absolute Spannungsfreiheit der Suprastruktur gefordert. In vielen Ländern z. B. auch in den USA, in denen die entsprechende zahntechnische Infrastruktur fehlt, können doppelkronengestützte Prothesen nicht hergestellt werden. Mit der Methode der definitiven intraoralen Fügung von Gerüstkomponenten können diese Anforderungen an die Passungspräzision problemlos erfüllt werden. Gleichzeitig wird die zahntechnische Fertigung vereinfacht und damit Zeitaufwand und Kosten geringer. Durch diese vereinfachte Herstellung und die Kostenreduzierung wird doppelkronengestützter Zahnersatz für eine größere Patientenklientel verfügbar. Ziel der Studie war, das neuartige Behandlungsvorgehen methodisch zu optimieren und die Verweildauer und die klinischen Auswirkungen von intraoral gefügtem doppelkronenverankerten Zahnersatz zu evaluieren. Im Zeitraum von 1992 bis 1998 wurden 61 Patienten mit 64 Prothesen, deren Gerüste an insgesamt 238 Fügestellen definitiv intraoral geklebt wurden, versorgt. Nach der Fertigstellung wurden die Daten des Zahnersatzes (Anzahl, Art und Verteilung der Pfeiler, Werkstoffkombination, Design und Vorbehandlung der Fügestellen und Zeitpunkt der Klebung) dokumentiert. 51 dieser Patienten mit 53 Prothesen und insgesamt 209 Fügestellen konnten halbjährlich kontrolliert werden. Die Nachuntersuchung umfasste eine klinische Untersuchung, eine lichtmikroskopische Kontrolle und eine Evaluation der Patientenmeinung mittels Fragebogen. Eine Klebestelle versagte bereits nach 14 Monaten unter Risiko: Der Klebespalt war aufgrund mangelnder Kongruenz von Patrize und Matrize zu breit, was die Stabilität der Klebung massiv reduzierte. Alle anderen Prothesen wiesen nach durchschnittlich 38,93 Monaten (Min = 18, Max = 85 Monate) eine spannungs- und schaukelfreie Passung auf. Die Klebestellen zeigten auch bei lichtmikroskopischer Untersuchung keine Läsionen, die auf ein Nachlassen der Klebung hindeuten. Freiliegendes Klebekomposit an einer Prothese musste wegen Auswaschungen nachgefüllt werden. Die REM-Aufnahmen einer im Mundmilieu durchgeführten Klebung zeigen den innigen Verbund des Klebekomposits mit den metallischen Prothesenkomponenten. 90 % der befragten Patienten gaben einen schaukelfreien Sitz ihrer Prothese an, lediglich 4 % beklagten Probleme beim Herausnehmen der Prothese. Mit "gut" bzw. "sehr gut" bezeichneten 84 % der Patienten den Tragekomfort der Prothese; 90 % der Patienten bezeichneten den Halt ihrer Prothese mit "zufrieden" bis "sehr gut". Die intraorale Fügung ist eine robuste, fehlertolerante Methode, die eine hochpräzise Passung gewährleistet. Obwohl keine Ausschlusskriterien zur Auswahl der Patienten bestanden, wurde eine außerordentlich hohe Zuverlässigkeit der Methode von 99,58 % erreicht. Aufgrund der starren Lagerung des Zahnersatzes können die kinetikbedingten Folgen wie z. B. Zahnlockerungen, Unterfütterungen, Bruchreparaturen und Schraubenlockerungen bei Implantaten auf ein Minimum reduziert werden. Durch die intraorale Fügung wird eine Prophylaxe oraler Strukturen erreicht, und die Folgebehandlungen und damit auch –kosten reduziert. Zudem erhält der Patient einen Zahnersatz, der einerseits sehr hohen Trageund Kaukomfort bietet und andererseits eine einfache Mundhygiene gewährleistet. Durch die klinische Bewährung können alle Nachteile einer Lötung, insbesondere die Gefahr der Allergisierung durch Korrosionsprodukte, umgangen werden. Zusammen mit der Silikatisierung/Silanisierung mittels dem Rocatec®-Verfahren haben sich die Reparatur-Möglichkeiten von verblendetem Zahnersatz erweitert, da keine Wärmebehandlung mehr notwendig ist. Das intraorale Fügeverfahren bildet die Grundlage für zukunftsweisende Entwicklungen: Mit präfabrizierten Implantatabutments kann die laborseitige Herstellung von Primärkronen und Matrizen ersetzt und damit der Zahnersatz kostengünstiger hergestellt werden. Das metallische Prothesengerüst kann unter erhöhtem Platzbedarf durch Glasfaserverbund-Werkstoff ersetzt werden, was die Herstellung von nahezu metallfreiem doppelkronengestütztem Zahnersatz für entsprechend sensibilisierte Patienten ermöglicht.
Mycophenolat Mofetil hat die Zulassung zur immunsuppressiven Behandlung nierentransplantierter Patienten seit sieben Jahren. Mycophenolat Mofetil entfaltet seine immunsuppressive Wirkung über eine Hemmung der Lymphozytenproliferation. Das Nebenwirkungsprofil dieser Substanz unterscheidet sich in klinisch bedeutsamen Aspekten von den der überwiegend verwendeten Immunsuppressiva vom Typ der Calcineurininhibitoren wie Cyclosporin A und Tacrolimus und der heute seltener verwendeten antiproliferativen Substanz Azathioprin. In der vorliegenden Arbeit werden die klinischen Daten des Verlaufes über 6 Monate von 85 nierentransplantierten Patienten untersucht, deren immunsuppressives Therapieschema wegen unerwünschter Nebenwirkungen der bisherigen Therapie auf Mycophenolat umgesetzt wurden. Grund der Therapieumstellung war am häufigsten (48,2%) eine Nierenfunktionsverschlechterung unter der bisherigen Therapie, die überwiegend mit den potentiell nephrotoxischen Calcineurininhibitoren durchgeführt wurde. Die Umstellung war von einer signifikanten Besserung der Nierenfunktion, gemessen an dem Serumkreatinin und der Kreatininclearance, gefolgt. Ebenso war eine Verbesserung der Blutdruckeinstellung zu beobachten, die Anzahl der eingenommenen Blutdruckmedikamente konnte reduziert werden. Eine typische Nebenwirkung der Therapie mit Azathioprin sind Veränderungen im Blutbild mit reduzierter Leukozytenzahl und Störung der Erythropoese. Mit der Umstellung auf Mycophenolat Mofetil wurde eine deutliche Besserung der Blutbildindizes erreicht. Die Hepatoxizität des Azathioprins war ebenfalls reversibel, unter Mycophenolat Mofetil war ein signifikanter Abfall der Serumaktivität der Leberindikatorenzyme zu beobachten. Bei 13% der Patienten mußte Mycophenolat Mofetil wegen darunter aufgetretener neuer Nebenwirkungen abgesetzt werden. Diarrhoen traten bei fast 5% der Patienten auf, sie waren der häufigste Grund zum Absetzen des Medikamentes. Weitere für Mycophenolat typische Nebenwirkungen waren andere gastrointestinale Störungen wie Übelkeit, Erbrechen und abdominelle Schmerzen. Die immunsuppressive Wirkung des Mycophenolat Mofetil war gut, es wurden keine gehäuften Abstoßungsreaktionen nach der Umstellung beobachtet. Es fanden sich auch keine Zeichen einer Überimmunsuppression, die sich beispielsweise durch eine Zunahme von Infekten bemerkbar gemacht hätte. Die Daten dieser Untersuchung legen den Schluß nahe, daß im Falle ernster Nebenwirkungen der herkömmlichen immunsuppressiven Therapie eine Umstellung auf Mycophenolat Mofetil erfolgversprechend durchgeführt werden kann.
Die Induzierte Polarisation (IP) ist ein geoelektrisches Verfahren und wurde ursprünglich zur Exploration von Erzvorkommen entwickelt. Neben metallischen Leitern, tragen auch Tonminerale, der Porenraum und die chemische Zusammensetzung der Porenlösung zur Polarisierbarkeit eines Unter-grundes bei. Die spektrale Induzierte Polarisation (SIP) untersucht die Polarisierbarkeit in einem Frequenzbereich von 1 mHz bis 1 kHz und nutzt diese aufgezeichneten Spektren zur Unterscheidung von Materialien. Früher mit einem enormen messtechnischen Aufwand verbunden, führte der gerätetechnische Fort-schritt in den letzten beiden Jahrzehnten dazu, dass die SIP vermehrt in der Umweltgeophysik zum Einsatz kommt. Zu den Fragestellungen gehören die Detektion von Altlasten und der Grundwasser-schutz. In der Archäologie ist die Induzierte Polarisation bislang ein kaum verwendetes Verfahren. Im Rahmen des Graduiertenkollegs „Archäologische Analytik“ der J. W. Goethe- Universität wurde die Entwicklung einer Multielektroden-Apparatur SIP-256 begonnen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Fortführung dieser Entwicklung. Da sich die wissenschaftliche Fragestellung während dieser Promotion auf die Erkundung archäologischer Objekte beschränkt, galt es zunächst automatisierte Messabläufe zu realisieren, die es erlauben, die komplexe elektrische Leitfähigkeit kleinräumiger 2D- bzw. 3D-Strukturen zu erfassen. Die Verwendung der SIP-256 führte zu einer erheblichen Ver-kürzung der Messzeit und war entscheidend für die Realisierung dieser Arbeit. Den zweiten Schwerpunkt der Arbeit bildet die Suche nach Anwendungsgebieten für die SIP innerhalb der archäologischen Prospektion. Basierend auf den Ursachen von Polarisationseffekten werden im Rahmen dieser Arbeit drei Anwendungsgebiete vorgestellt. Das erste Anwendungsgebiet nutzt die Vorteile der SIP bei der Prospektion von Erzen. Auf einem mittelalterlicher Verhüttungsplatz bei Seesen am Harz konnten im Vergleich zu einer konventionellen Widerstandsmessung mehr Schlackegruben lokalisiert werden. Während einer deutsch-bulgarischen Grabungskampagne in Pliska (Bulgarien) 1999 gelang es, durch eine flächenhafte Anwendung der IP einen Siedlungshorizont über Lehmablagerungen nachzuweisen. Die Überreste eines Gebäudes erzeugten einen messbaren Polarisationseffekt. Die frühmittelalterlichen Siedlungsreste befinden sich mit 2 bis 3 m in relativ großer Tiefe und konnten bei einer anschließenden Ausgrabung freigelegt werden. Eine Kernfrage war, ob Holzobjekte mit Hilfe der SIP zu detektieren sind. Mit Hilfe von Labormessungen an der TU Clausthal konnte geklärt werden, dass Holz ein polarisierbares Material ist. Zu den untersuchten Proben gehören Hölzer aus einem bronzezeitlichen Bohlenweg, die von Ausgrabungen im Federseemoor (Kreis Biberach) stammen. Durch die Untersuchungen im Labor motiviert, folgte eine Feldmessung über dem Bohlenweg. Es gelang, erstmals ein Holzobjekt mit spektraler Induzierter Polarisation zu detektieren. Holz spielt durch die dendrochronologische Datierung von Fundstellen eine wichtige Rolle, konnte aber bislang noch mit keiner geophysikalischen Methode zufriedenstellend prospektiert werden. Abschließend kann gesagt werden, dass sich die spektrale Induzierte Polarisation als wertvolle Methode in der archäologischen Prospektion etablierte. Strukturen, welche mit einer konventionellen Widerstandsmessung nicht zu erkennen waren, konnten durch die SIP eindeutig identifiziert werden. Natürlich müssen die vorliegenden Ergebnisse noch durch weitere Messungen bestätigt werden, jedoch zeichnet sich ab, dass sich mit der fortschreitenden gerätetechnischen Entwicklung, welche zu schnelleren Messabläufen führt, wichtige Zusatzinformationen durch die spektrale Induzierte Polarisation gewinnen lassen.
Ziel der Arbeit war es, das biotechnologische Potenzial des zellulären Schleimpilzes D. discoideum in Bezug auf die Expression von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren im allgemeinen und von Muskarin-Rezeptoren im besonderen zu untersuchen. Langfristiges Ziel war dabei, mit Hilfe von Dictyostelium discoideum ein leicht zugängliches und kostengünstiges Screeningsystem zur Testung potenzieller muskarinerger Liganden zu entwickeln. Im Rahmen der Arbeit wurden alle humanen Muskarin-Rezeptor-Subtypen M1 bis M5 untersucht. Ausgehend von entsprechenden Expressionsplasmiden für Säugerzellen wurde zunächst mittels PCR die DNA der jeweiligen Rezeptor- Subtypen amplifiziert (Plasmide des Subtyps M2 wurden aus den Arbeiten von Herrn Dr. Guido Voith aus unserer Arbeitsgruppe übernommen). Die DNA wurde dabei zusätzlich mit Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme versehen, die eine nachfolgende Klonierung in Expressionsplasmide für Dictyostelium discoideum ermöglichten. Zur Klonierung wurden in erster Linie Expressionsplasmide verwendet, die in der Arbeitsgruppe um D. Manstein entwickelt wurden. Diese Plasmide ermöglichen die Expression der klonierten Gene unter der Kontrolle verschiedener Promotoren. Dies sind zum einen der starke, konstitutive Aktin-15 Promotor und zum anderen der schwache und in gewissen Grenzen regulierbare Discoidin-1-Mü Promotor. Außerdem wurde in Expressionsplasmiden der starke und induzierbare Ras-Promotor eingesetzt. Mit den klonierten Plasmiden wurden dann transgene Dictyostelium-discoideum-Stämme erzeugt. Die Stämme wurden zunächst mittels Northern-Blot auf das Vorhandensein und die Transkription der entsprechenden DNA der Muskarin- Rezeptor-Subtypen untersucht. Für alle Muskarin-Rezeptor-Subtypen konnten die jeweiligen Transkripte nachgewiesen werden. Als Nachweis für korrekt in die Zellmembran eingebaute Rezeptormoleküle dienten Bindungsstudien mit dem Radioliganden [3H]-N-Methylscopolamin. Für den humanen Subtyp M5 konnte kein funktionelles Rezeptorprotein nachgewiesen werden, unabhängig von der Art des Expressionsplasmides oder des verwendeten D.-discoideum- Stammes. Die funktionelle Expression der Rezeptoren M1, M3 und M4 konnte bei den beiden axenischen Stämmen AX2 und AX3 nachgewiesen werden. Bei Plasmiden mit Aktin-15-Promotor, welche zusätzlich zum Rezeptorgen eine Dictyostelium discoideum eigene Signalsequenz zwischen Promotor-DNA und Rezeptor-DNA enthielten, wurden etwa 300 Rezeptoren pro Zelle für M1 und M4 gefunden. In Abhängigkeit vom verwendeten Plasmid konnten für M3 etwa 200 bis 7000 Rezeptoren pro Zelle nachgewiesen werden. Parallel zu den Radioliganden-Bindungsstudien wurde mit den Rezeptor-Subtypen M1, M2 und M4 am Aufbau von Assays gearbeitet, mit denen eine mögliche Kopplung zwischen stimuliertem Rezeptor und endogenen G-Proteinen nachgewiesen werden könnte. Zum einen wurde untersucht, ob die Stimulation der Muskarin-Rezeptoren zu einer Polymerisation von Aktin-Filamenten führt, wie dies durch den endogenen Liganden cAMP geschieht. Zum anderen wurde durch mehrfach transformierte D.-discoideum-Stämme, die neben dem Rezeptorgen noch das Beta- Galaktosidasegen als Reportergen, die Alpha-Untereinheit eines humanen G-Proteins und einen endogenen Transkriptionsfaktor exprimierten untersucht, ob durch Stimulation der Muskarin-Rezeptoren eine Expression des Rezeptorgens induziert werden kann. Diese wäre dann in einem automatisierbaren Testsystem über Messung der Beta- Galaktosidaseaktivität leicht nachweisbar. Als Variante dieses Testsystem wurde schließlich der von Joachim Tillner (Tillner, 1997) bereits zur Untersuchung teratogener Stoffeigenschaften verwendete Versuchsaufbau herangezogen. In keinem der verwendeten Assays konnte jedoch eine Kopplung von fremd exprimiertem Rezeptor an endogene GProtein- vermittelte Signaltransduktionswege nachgewiesen werden. Als mögliche Gründe für diese Ergebnisse wurden folgende Punkte diskutiert: Zum einen sind die in unserem Expressionssystem erreichbaren Rezeptorzahlen von 300 bis 7000 heterolog exprimierten Rezeptoren pro Zelle vermutlich zu gering im Vergleich zu den um zwei Zehnerpotenzen höher liegenden endogenen Rezeptoren, zum anderen sind die Säugerzellen evolutionär wahrscheinlich zu weit von D. discoideum entfernt, als dass eine effektive Wechselwirkung des stimulierten Rezeptors mit der Zelle stattfinden kann. Dictyostelium discoideum hat sich daher als kaum geeignetes Testsystem zur Untersuchung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren aus Säugern herausgestellt.
Untersuchung biochemischer Parameter des Lipidstoffwechsels bei chirurgischen Intensivpatienten
(2002)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die biochemischen Zusammenhänge von häufig auftretenden Störungen des Fettstoffwechsels unter den Bedingungen der längerfristigen postoperativen Intensivtherapie zu untersuchen. In die Untersuchung eingeschlossen wurden Patienten mit einer Mindestaufenthaltsdauer auf der chirurgischen Intensivpflegestation von sieben Tagen, bei denen im Verlauf dieses Aufenthalts der prozentuale Anteil der alpha-Lipoproteine (elektrophoretisch) auf 20 % oder darunter bzw. der Cholesterinesterquotient auf 50 % oder darunter sank. Die Ergebnisse der Lipidelektrophorese korrelieren bei Seren von Gesunden gut mit Ergebnissen der Referenzmethode Ultrazentrifugation. Bei chirurgischen Intensivpatienten, die z. T. starke Veränderungen des Lipoproteinstoffwechsels aufweisen, ist die Lipidelektrophorese als Methode nur bedingt geeignet, denn es ergeben sich deutliche Abweichungen der Ergebnisse im Vergleich zu denen der Ultrazentrifugation. Bei den untersuchten Intensivpatienten, in deren Seren keine elektrophoretische Mobilität der alpha-Lipoproteine feststellbar war, konnten dennoch Lipoproteine mit hoher Dichte (HDL2 und HDL3) per Ultrazentrifugation nachgewiesen werden. Im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen waren in diesen Fraktionen allerdings die Konzentrationen von Apolipoprotein AI und auch die berechnete Gesamtmasse der Fraktionen signifikant vermindert. Mit der elektrophoretischen Trennmethode wurde der prozentuale beta-Lipoproteinanteil im Serum signifikant höher berechnet als der Anteil der Lipoproteine mit geringer Dichte (LDL) nach Trennung durch Ultrazentrifugation, der alpha-Lipoproteinanteil wurde signifikant niedriger berechnet als der HDL-Anteil. Nach Ultrazentrifugation der Patientenseren wurden stark veränderte Zusammensetzungen der einzelnen Lipoproteinfraktionen beobachtet. Der Anteil des freien Cholesterins war bei diesen Patienten in allen vier Lipoproteinfraktionen signifikant erhöht. Extrem niedrige Cholesterinesteranteile fanden sich in LDL- und HDL-Fraktionen. Da in diesen Fraktionen andererseits die Triglycerid-Anteile erhöht waren, wiesen die Lipoproteinpartikel im Vergleich zum Normbereich veränderte Kernzusammensetzungen auf. Bei den Intensivpatienten war der Quotient Kernbestandteile/Oberflächenbestandteile insbesondere in den beiden HDL-Fraktionen signifikant erniedrigt, woraus sich auf verkleinerte Lipoproteinpartikel schließen läßt. Erniedrigte Serumkonzentrationen von Cholesterinestern und abnormale Lipoproteinzusammensetzungen korrelierten mit signifikant verminderter, teils ganz fehlender in vitro Cholesterinveresterung. Zugleich lag Apolipoprotein AI, welches als Cofaktor des Enzyms Lecithin-Cholesteryl-Acyl-Transferase (LCAT) fungiert, in den HDL-Fraktionen nur in sehr niedrigen Konzentrationen vor. Bei den Patienten, in deren Serum keine LCAT-Aktivität nachweisbar war, konnten dennoch Cholesterinester in allen Fraktionen gemessen werden. Eine stark erniedrigte oder fehlende LCAT-Aktivität gilt als prognostisch ungünstig, kann aber reversibel sein. Signifikant erniedrigt war der prozentuale Anteil des Linolats an den Esterfettsäuren im Serum, während der prozentuale Anteil des Oleats signifikant erhöht war. Dadurch erhöhte sich auch der Quotient Oleat/Linolat (18:1 / 18:2) in signifikanter Weise. Der signifikant erhöhte Serumacylquotient (18:1 + 18:2) / 16:0 weist darauf hin, daß die Konzentrationen der freien ungesättigten C 18–Fettsäuren im Vergleich zur Palmitinsäure erhöht waren. Die vorgestellten Ergebnisse verdeutlichen die Komplexität des Fettstoffwechsels insbesondere im Hinblick auf die Entgleisungen bei intensivpflegepflichtigen chirurgischen Patienten.
In dieser Arbeit werden grundlegende Untersuchungen zum Verständnis der dynamischen Wechselwirkungsmechanismen atomarer Projektile mit Festkörperoberflächen vorgestellt, die zur Emission von Sekundärionen führen. Der zentrale Ansatzpunkt ist dabei die Vermessung der Dynamik über die geschwindigkeits- und winkeldifferentielle Verteilung der emittierten Sekundärionen. Dazu wurde ein neuartiges Spektrometer entwickelt, in dem jedes in einem homogenen elektrischen Feld abgelenkte Sekundärion durch seine Flugzeit (TOF) und den Auftreffort auf einen 2-dimensionalen (XY) ortsempfindlichen Detektor charakterisiert wird. Das Prinzip basiert auf dem in Gastargetexperimenten erfolgreich eingesetzten Frankfurter Meßsystem COLTRIMS (COLd Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy). Dieses System wurde weiterentwickelt und erstmalig in Frankfurt in einem Festkörperexperiment zur geschwindigkeits- und winkeldifferentiellen Spektrometrie von Sekundärionen angewendet. Ein zusätzliches Merkmal gegenüber herkömmlichen Spektrometern ist die Möglichkeit der einfachen Variation des Einfallswinkels 0p vom Projektil zum Target. Die korrekte Transformation der gemessenen Daten in eine 3-dimensionale Anfangsgeschwindigkeitsverteilung bedingt eine möglichst präzise Eichung des Spektrometers. Dazu wurde die in diesem Zusammenhang neuartige Methode des Strahlprofilmonitors entwickelt und eingesetzt. Durch die Wechselwirkung des Projektils mit einem nicht lokalisierten Gastarget erzeugt es auf seinem Weg durch das Spektrometer eine Spur aus Ionen. Die Gasionen befinden sich im Verhältnis zu den von dem Festkörper emittierten Sekundärionen nahezu in Ruhe. Daher kann über die Analyse der Projektilspur auf die zur Eichung notwendigen, aber im Experiment nicht direkt zugänglichen Parameter, wie Flugzeit (T0) und Auftreffort (x0/y0) für Teilchen mit der Geschwindigkeit v0z = v0x = v0y = 0, geschlossen werden. Die systematische Variation von Projektil- (He0/N0/Ar0, Ep = 0.2 - 2.2 MeV, 0p = 37°-78° relativ zur Oberflächennormalen) und Targeteigenschaften (Au/C/LiF/Al) erlaubt ein gezieltes Studium der dynamischen Wechselwirkung zwischen Projektilen und Festkörperoberflächen. Das untersuchte H+-Sekundärion entstammt einer Festkörperoberfläche bedeckenden quasistabilen Kontaminationsschicht, die im wesentlichen aus den Adsorbaten H2, H2O, CxHy besteht. Die gemessenen H+-Geschwindigkeitsverteilungen besitzen ein Maximum etwa bei v0 ungefähr gleich 25-35 km/s mit Ausläufern (abhängig von 0p) bis hin zu 240 km/s. Bei sinkender Projektilgeschwindigkeit zeigt die Verteilung der emittierten H+-Sekundärionen bei hohen Emissionsgeschwindigkeiten (v0 > 60 km/s) eine stark ausgeprägte Asymmetrie in der von dem einfallenden Projektil und der Oberflächennormalen definierten Ebene. Ionen werden mit einer hohen Geschwindigkeit (bis zu 140 km/s bei 0p = 45°) unter einem Winkel von ca. 90° zum Projektil, unabhängig von 0p, emittiert. Diese Asymmetrie wird durch eine binäre Kollision des Projektils mit dem Wasserstoff verursacht. Die Variation der Projektilgeschwindigkeit ist korreliert mit der deponierten Energie des Projektils im Festkörper. Daher kann in der Dynamik der Sekundärionen deutlich der Beitrag des nuklearen Anteils an der totalen Energiedeposition aufgezeigt und getrennt werden. Bei Emissionsgeschwindigkeiten v0 < 60 km/s zeigt sich eine starke Abhängigkeit von den Targeteigenschaften. Bei konstantem Einfallswinkel beobachten wir eine Verschiebung der Maxima von v0 max ungefähr gleich 26.5 km/s bei Au-, über 27.9 km/s bei Al- bis hin zu 32.5 km/s bei LiF-Targets. Es zeigt sich keine meßbare Abhängigkeit vom Einfallswinkel des Projektils bei Auund C-Targets, dagegen eine deutliche Verschiebung der Maxima hin zu größeren Geschwindigkeiten bei dem Al- (v0 max ungefähr gleich 27.5 km/s - 30 km/s) und dem LiF-Target (v0 max ungefähr gleich 32.5 km/s - 35.5 km/s) mit einer Vergrößerung von 0p. Ionen mit v0 < 30 km/s werden zum Großteil rückwärts in Richtung des einfallenden Projektils emittiert. Au und C sind gute, LiF und das mit einer Al2O3-Schicht überzogene Al dagegen schlechte elektrische Oberflächenleiter. Die Verschiebung der Verteilungen bei einem schlechten elektrischen Leiter ist ein Hinweis auf den zeitabhängigen Zerfall des Projektilspurpotentials im Festkörper. Die Zunahme der Emissionsgeschwindigkeit v0 bei Vergrößerung von 0p ist in der Vergrößerung der effektiven Targetdicke begründet und ein Hinweis auf eine targetdickenabhängige Neutralisationszeit des geladenen Spurkerns durch Elektronen des Substrats. Korrelationen im Sekundärionenemissionsprozeß bezüglich Impuls- und Energieerhaltung zwischen einem emittierten H+-Sekundärion und einem möglichen zweiten Sekundärion wurden nicht beobachtet. Über die Eichung hinaus eröffnen sich zusätzlich noch einige vielversprechende Anwendungsmöglichkeiten des Strahlprofilmonitors. Zum einen ermöglicht er a) in der Gasmassenspektrometrie eine exakte Korrektur der Ionenflugzeit unabhängig vom Ort der Ionisation und zum anderen bildet er b) eine innovative Methode zur Kartographie lokaler elektrischer Felder und c) ferner einen alternativen Zugang zur Vermessung von Projektilstreuwinkeln. Die Verwendung eines ortsempfindlichen Detektors in der „kinematischen“ Materialanalyse verbindet simultan gute Tiefenprofilauflösung mit dem Nachweis eines großen Raumwinkels zugunsten einer besseren Statistik. Die Kenntnis der Emissionscharakteristik bewährt sich zudem in der Massenanalyse in der Unterscheidung von Ionen fast identischer Massen.
Zielsetzung der ultrarelativistischen Schwerionenphysik ist es, hoch verdichtete und stark erhitzte Kernmaterie (gemeint ist hierbei nicht nur die Materie der Atomkerne, sondern allgemein stark wechselwirkende Materie) im Labor zu erzeugen und deren Eigenschaften zu untersuchen. Gitter-QCD Rechnungen sagen bei einer kritischen Energiedichte von 1-2 GeV/fm3 einen Übergang der hadronischen Materie in eine partonische Phase, dem Quark-Gluon-Plasma, voraus. Neben anderen Observablen wurde die Seltsamkeitsproduktion als mögliche Signatur für den Materiezustand quasifreier Quarks und Gluonen vorgeschlagen. Im Vergleich zu elementaren Nukleon-Nukleon-Reaktionen beobachtet man in Schwerionenkollisionen generell eine Überhöhung der Seltsamkeitsproduktion. Inwieweit dieser Unterschied bei allen Schwerpunktenergie auf rein hadronische Phänomene zurückgeführt werden kann, oder ob partonische Gleichgewichtseffekte eine wesentliche Rolle spielen, ist derzeit eines der wichtigen Themen der Schwerionenphysik. Antworten auf diese Fragen erhofft man sich aus der Untersuchung der Energieabhängigkeit der Erzeugung seltsamer Hadronen. Die NA49 Kollaboration hat deshalb am CERN-SPS ein Energie-Scan Programm aufgelegt, in dem zentrale Blei-Blei-Kollisionen bei 40, 80 und 158 A·GeV untersucht wurden. In dieser Arbeit wird die Produktion von Lambda und Antilambda Hyperonen bei den drei verschiedenen Strahlenergien untersucht. Lambda Hyperonen, die 30-60% der produzierten s-Quarks enthalten, erlauben neben der Seltsamkeitsproduktion gleichzeitig auch den durch die kollidierenden Kerne erzeugten Effekt der Baryonendichte zu studieren. Das NA49 Experiment führt präzise Messungen des hadronischen Endzustands über einen weiten Akzeptanzbereich durch. Die geladenen Sekundärteilchen werden in vier hochauflösenden Spurdriftkammern gemessen. Neutrale seltsame Teilchen (Lambda, Antilambda und K0s) werden anhand ihrer Zerfallstopologie identifiziert. Die untersuchten Lambda Hyperonen werden über drei Rapiditätseinheiten um den Bereich zentraler Rapidität und mit Transversalimpulsen von 0,4 und 2,5 GeV/c gemessen. Die Temperaturparameter der Lambda und Antilambda Transversalimpulsverteilungen bei zentraler Rapidität sind für die drei Energien im Rahmen der Fehler gleich. Als Funktion der Schwerpunktenergie beobachtet man einen Anstieg des Lambda-Temperaturparameters, was durch eine Erhöhung des kollektiven transversalen Flusses erklärt werden kann. Erste Ergebnisse zur Proton-Produktion zeigen einen ähnlichen Trend. Die Rapiditätsverteilungen der Lambda sind breiter als die der Antilambda-Hyperonen. Die Lambda Rapiditätsverteilung verbreitert sich mit ansteigender Schwerpunktenergie von einer bei zentraler Rapidität konzentrierten Verteilung bei 40 A·GeV zu einem flachen Verlauf bei 158 A·GeV. Die Lambdas enthalten Beiträge der extrem kurzlebigen Sigma 0, die elektromagnetisch in ein Lambda und ein Photon zerfallen. Die in der Analyse selektierten Lambda und Antilambda sind aufgrund der gewählten Qualitätskriterien nahezu frei von Beiträgen mehrfachseltsamer Baryonen. Der systematische Fehler der Spektren konnte zu 9% abgeschätzt werden. Die Korrekturen und die Analyseprozedur wurden durch die Extraktion des K0s Mesons bei 158 A·GeV und den Vergleich dieser Ergebnisse mit denen der geladenen Kaonen überprüft. Man stellt eine gute Übereinstimmung fest. Zusammen mit Ergebnissen bei niedrigeren Energien läßt sich die Anregungsfunktion der Lambda und AntiLambda Hyperonen studieren. Während die Lambda Multiplizität bei mittlerer Rapidität nach dem Anstieg bei niedrigen Energien im SPS-Energiebereich leicht abfällt bzw. die totale Multiplizität saturiert, beobachtet man für die AntiLambda einen stetigen Anstieg als Funktion der Schwerpunktenergie. Das <Lambda>/<Pi>-Verhältnis in Kern-Kern-Kollisionen zeigt einen steilen Anstieg im AGS-Energiebereich mit anschließendem Maximum und einem Abfall bei SPS-Energien. Dagegen beobachtet man in Nukleon-Nukleon-Reaktionen eine Saturation dieses Verhältnisses bei etwa der höchsten AGS-Energie. Die Normierung auf die Pionen dient dem Vergleich der Produktionsraten in Kern-Kern-Stößen mit denen der elementaren Systeme und ist unabhängig von der Anzahl der beteiligten Nukleonen. Das Maximum des Lambda/Pi Verhältnisses liegt zwischen 10 und 40 A·GeV, wie es von statistischen Modellen vorhergesagt wird. Die Energieabhängigkeit des Lambda/Pi-Verhältnisses läßt sich dementsprechend gut mit dem Statistischen Modell von Cleymans, Redlich et al. beschreiben. Der generelle Trend des Lambda/Pi Verhältnisses wird von den mikroskopischen Modellen (UrQMD, HSD, RQMD) richtig wiedergegeben, wobei jedoch die Datenpunkte (besonders für 40 A·GeV) unterschätzt werden. Die Vorhersagen des UrQMD- und HSD-Modells für die Lambda Rapiditätsverteilung zeigen sehr gute Übereinstimmung mit den Daten. Die Diskrepanz im Lambda/Pi Verhältnis ist somit auf die überschätzte Pion-Produktion zurückzuführen. Die AntiLambda Produktion wird von dem UrQMD- und RQMD-Modell um mehr als einen Faktor zwei unterschätzt. Die Lambda und Antilambda Produktionsraten für alle drei Energien und die totale K0s Multiplizität bei 158 A·GeV fügen sich in einer statistischen Modellanalyse von Becattini in die Systematik der anderen Teilchen ein. Der Seltsamkeits-Saturationsfaktor gamma s zeigt keine große Änderung als Funktion der Energie. Das AntiLambda/Lambda Verhältnis bei mittlerer Rapidität, das den Paarproduktionsprozess widerspiegelt, steigt rapide von AGS- bis RHIC-Energien an. Der gleiche Trend ist für das ¯p/p Verhältnis beobachtbar. Das AntiLambda/¯p Verhältnis erlaubt das Zusammenspiel der Produktions und Annihilationsprozesse zu studieren. Im SPS-Energiebereich steigt dieses Verhältnis mit abnehmender Schwerpunktenergie leicht an. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden auf der Strange-Quark-Matter Konferenz 2001 [1] und der Quark-Matter Konferenz 2002 [2] vorgestellt und diskutiert.
Um die Privatsphäre der Kinder und deren Eltern zu schützen, wurden die Fotos der Kinder aus dieser PDF-Datei entfernt. Interessierte Eltern oder Fachleute können die vollständige Arbeit als PDF-Datei (11 MB) zum Download bei http://www.leona-ev.de/piper/ oder chrispiper@freenet.de anfordern. Chromosomenstörungen gehören mit einer Häufigkeit von 1,8/1000 Neugeborene zu den häufigeren angeborenen Störungen. Die Mehrzahl der betroffenen Kinder stirbt bereits intrauterin in der Frühschwangerschaft, weil schon Nidation bzw. die frühe Embryonalentwicklung durch die Chromosomenstörung verhindert werden. Etwa 50% aller Spontanaborte sind durch eine Chromosomenstörung verursacht. Einige Chromosomenstörungen wie z.B. komplette Trisomie 14 oder 16 führen immer zu einem Abort, so daß keine die normale Schwangerschaft überlebenden Patienten bekannt sind. Bei den Trisomien 13 und 18 enden 95% der Schwangerschaften mit einem Abort, bei der häufigeren Trisomie 21 sterben 80% der Patienten intrauterin. Von den lebendgeborenen Kindern mit Chromosomenaberrationen sterben wiederum viele schon im ersten Lebensjahr, zumeist aufgrund schwerer Fehlbildungen, insbesondere Herzfehlern und Nierenfehlbildungen. Während der Phänotyp der häufigeren Chromosomenstörungen gut bekannt ist, gibt es bis auf die Trisomie 21 nur wenige Untersuchungen zu ihrem Verlauf. Systematische Daten zur psychomotorischen Entwicklung der Patienten, zu Komplikationen, zu möglichen Therapien sowie zur Effektivität der Therapien fehlen völlig. So wird auch heute noch in vielen Arztbriefen davon ausgegangen, daß Kinder mit Trisomie 13 oder 18 innerhalb der ersten Lebensmonate versterben und deshalb werden Therapien - wenn überhaupt - nur verzögert oder partiell eingeleitet. Darüber hinaus wird den Eltern durch die Prognose eines schnellen und frühen Todes ein Verlauf suggeriert, der im Einzelfall eben nicht eintreten muß. Die Beziehung zum Patienten, die Erwartungen an den Patienten sowie der Umgang mit dem Patienten, die gesamte Lebensplanung einer Familie und viele Dinge mehr werden dadurch in eine nicht gerechtfertigte Richtung gelenkt. Bei einigen Patienten führte falsche Voraussage eines „baldigen frühen Todes“ soweit, daß die Eltern und die Umgebung ständig darauf wartete, daß der Patient stirbt und die Diagnose von Eltern und Ärzten bezweifelt wurde als das Kind die ersten Lebensjahre überlebte. Mehrfach wurden deshalb Chromosomenanalysen wiederholt, um die Diagnose zu überprüfen. Gerade in unserer Zeit, in der die Intensivmedizin und die operativen Techniken auch Patienten mit komplexen Fehlbildungen ein Überleben ermöglichen, gibt es deshalb immer mehr Patienten mit Chromosomenstörungen, die ein höheres Lebensalter erreichen. Daraus folgt unmittelbar, daß mehr Daten über ältere Patienten mit Chromosomenstörungen gewonnen werden müssen, um bessere und individuellere Therapien zu entwickeln.
Die rechtzeitige Diagnose und Behandlung kindlicher Katarakte ist von großer Wichtigkeit. Ein Hindernis in der visuellen Achse während der Periode sensorischer Vulnerabilität führt zur Amblyopie, insbesondere wenn diese innerhalb der ersten 3 Lebensmonate stattfindet.Wir untersuchten inwiefern sich das Wachstum der Augen je nach verschiedenen Kataraktformen verhält. In unserer Studie wurden retrospektiv die Krankenakten von 44 Patienten mit 58 erkrankten Augen ausgewertet, die im Zeitraum von 1992-1996 an der Augenklinik des Frankfurter Universitätsklinikums, Abteilung für Kinderaugenheilkunde, operiert wurden. Das Alter zum Zeitpunkt der Operation reichte in der Gruppe der 29 (50,0%) kongenitalen Katarakte von 1 Woche bis 10 Jahren, mit einem Durchschnitt von 2 Jahren und 5 Monaten. Die 16 (27,6%) Augen mit entwicklungsbedingter Katarakt waren in einem Alter zwischen 3 und 14 Jahren, mit einem Durchschnittsalter von 6 Jahren und 11 Monaten operiert worden, während das Alter zum Zeitpunkt der Operation bei den 13 (22,4%) traumatischen Katarakten von 3 Jahren und 4 Monaten bis 9 Jahren reichte, mit im Mittel 6 Jahren und 3 Monaten. Die Bulbuslängen veränderten sich in einem mittlerem Beobachtungszeitraum von 3 Jahren und 1 Monat bei den kongenitalen Katarakten um durchschnittlich 2,34 mm von 19,80 auf 22,14 mm, in der Gruppe der entwicklungsbedingten Katarakte um durchschnittlich 0,86 mm von 22,33 auf 23,19 mm und bei den Augen mit traumatischer Katarakt um durchschnittlich 1,53 mm von 21,95 auf 23,48 mm. Unsere mit dem U-Test nach Mann und Whitney durchgeführten Vergleiche ergaben, bis auf zwei Ausnahmen, keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Bulbuslängenwachstum in den verschiedenen Alters- und Ursachengruppen. Als wichtig erwies sich jedoch das signifikant unterschiedliche Bulbuslängenwachstum von 1,52 mm im Vergleich der 18 Augen mit schlechter Sehschärfe (Augen mit einem Visus von 0,2 und darunter) zu den 34 Augen mit guter Sehschärfe (Augen mit einem Visus von 5,0 und darüber). Augen mit schlechter Sehschärfe zeigten ein signifikant höheres Längenwachstum als Augen mit guter Sehschärfe. Bei dem Vergleich der 14 kongenital beidseitig aphaken Augen zu den 13 entwicklungsbedingt beidseitig pseudophaken Augen zeigte sich ein signifikant höheres Wachstum von Augen mit kongenitaler Katarakt. Einschränkend auf dieses Ergebnis wirkt, dass die entwicklungsbedingte Katarakt in einem Alter entstanden ist, als die Phase mit dem größten Wachstumsschub der Augen schon vorüber war. Dadurch nimmt sie weniger Einfluß auf die Längenentwicklung des Auges als eine kongenitale Katarakt. Das Alter zum Zeitpunkt der Operation scheint der wichtigste Faktor für die Längenentwicklung des Augen zu sein. Eine kongenitale Katarakt mit ihrem frühen Operationszeitpunkt hat großen Einfluß auf die Längenentwicklung des Auges. Kongenital einseitig aphake Augen zeigten allgemein im Vergleich zu anderen Gruppen nach der Geburt und Operation häufig das größte Bulbuslängenwachstum. Die Früherkennung und frühest mögliche Behandlung einer kindlichen Katarakt sowie die Amblyopienachbehandlung sind neben einer erfolgreichen Operation für das Erreichen einer guten Sehschärfe von größter Bedeutung.
Die hier durchgeführten Untersuchungen an Staphylococcus aureus ATCC 6538 unter Verwendung von Silbernitrat als Desinfektionsmittel auf Standard-CSA sowie Agar-Agar mit Kalliumtelluritzusatz hatten das Ziel, den Einfluss von Silbernitrat-Ionen auf den Keim zu untersuchen. Hier galt es nicht nur die Schädigung von Silbernitrat-Ionen auf Staphylokokken zu untersuchen, sondern zusätzlich zu prüfen, ob eine Reduzierung der Pathogenität der Keime nach vorheriger Desinfektion stattfindet. Die Empfindlichkeit der geschädigten Bakterien gegenüber Tellurit, wie in diesen Untersuchungen verwendet, löste das früher verwendete Mäusepathogenitätsmodell ab. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Keimzahl zum einen durch eine erhöhte Konzentration des Silbernitrats, zum anderen durch eine verlängerte Einwirkzeit reduziert wurde. Weiterhin ist ersichtlich, dass eine Minderung der Pathogenität nach Desinfektion eintrat. Der mit Tellurit versetzte CSA-Agar hemmte das Wachstum stärker als bei den Platten ohne Zusatz. Dies zeigt eine erhöhte Empfindlichkeit der Keime gegenüber Tellurit. Eine weitere Virulenzminderung trat mit zunehmender Telluritkonzentration auf. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass Kalliumtellurit eine Wachstumshemmung auf das Bakterium Staphylococcus aureus bewirkt. Da sich in den Kontrollansätzen ohne Desinfektionsmittel die Keimzahl ebenfalls mit zunehmender Telluritkonzentration reduzierte, bestätigt dies, dass die Eignung von Hemmstoffen - im vorliegendem Fall Kalliumtellurit - nur in einem engen Konzentrationsbereich für die Erfassung geschädigter Keime geeignet ist.
Ziel der vorliegenden Studie war es , drei moderne Ni-Ti- Instrumentensysteme hinsichtlich ihrer Aufbereitungsfähigkeiten an stark gekrümmten Kanälen (Kriterium nach Schneider et al, 1971) zu vergleichen. 60 gekrümmte Kanäle extrahierter humaner Molaren des Oberkiefers wurden, nach Vorverteilung der Krümmungswinkel, randomisiert in die drei Testgruppen verteilt. Der Versuchsaufbau entsprach einer modifizierten Bramante-Methode. Jeder Kanal wurde dabei, von der apikalen Region ausgehend, in mindestens 5 Querschnitte zersägt. Nach Repositionierung im Testbehältnis wurden alle Kanäle mit Hilfe des EndoSteppers® von einem Behandler aufbereitet. Prä- und postoperative Bilder der Kanalquerschnittsflächen wurden digitalisiert und mit Hilfe einer Bildverarbeitungs-software (Image 2000) vermessen. Die Flächenveränderungen, die Aufbereitungs-zeiten, sowie die Arbeitslängenverluste und die Frakturhäufigkeit wurden erfasst und mittels One-Way-ANOVA, dem Kruskal-Wallis-Test und dem Duncan-Test statistisch ausgewertet. Die mittlere Arbeitszeit war bei RaCe TM signifikant geringer als bei FlexMaster®. Die signifikant höchsten Abträge an der Kanalwand wurden bei RaCe TM, im Vergleich zu den beiden anderen Testgruppen, verzeichnet. Arbeitslängenverluste waren bei allen Instrumentensystemen zu verzeichnen, wobei FlexMaster® einen signifikant geringeren Mittelwert im Vergleich zu RaCe TM aufwies. 17 Instrumente frakturierten, wobei mit 11 Brüchen bei RaCe TM die größte Zahl zu vermerken war. FlexMaster®-Instrumente frakturierten nicht. Klinische Relevanz: Im Zuge dieser Studie konnte festgestellt werden, dass sich FlexMaster®-Instrumente aufgrund einer näher an der ursprünglichen Kanalform liegenden Aufbereitung in Verbindung mit dem EndoStepper® besonders zur Aufbereitung von stark gekrümmten Wurzelkanälen eignen. Von der Benutzung der RaCe TM-Instrumente ist, zumindest in Verbindung mit der hier verwendeten EndoStepper®-Software, aufgrund des hohen Frakturrisikos abzuraten.
Fettsäuren haben vielfältige Funktionen im Organismus. Sie sind der wichtigste Energieträger des menschlichen Körpers. Fettsäuren sind Bestandteil menschlicher Membranen und Ausgangspunkt für die Biosynthese biologisch aktiver Substanzen. Der Abbau der Fettsäuren und deren energetische Verwertung geschieht im Mitochondrium, dem Ort der ß-Oxidation. Hierfür werden die Fettsäuren mit Hilfe des aus 3 Enzymen bestehenden Carnitin- Palmitoyltransferase-Systems aus dem Cytosol in das Mitochondrium transportiert. Dazu werden langkettige Fettsäuren durch die Acyl-CoA-Synthetase aktiviert und - an Carnitin gebunden - in das Innere der Mitochondrien geschleust. Die Carnitin-Palmitoyltransferase 1 (CPT 1) ist an der Innenseite der äußeren Mitochondrienmembran gebunden und katalysiert die Kopplung von L-Carnitin an die aktivierte Fettsäure unter Freisetzung von Coenzym A. Das so enstandene Acyl-Carnitin passiert mit Hilfe der Carnitin- Acylcarnitin-Translokase (CAC) die innere Mitochondrienmembran. An der Innenseite der mitochondrialen Innenmembran überträgt die Carnitin-Palmitoyltransferase 2 (CPT 2) den Fettsäurerest des Acyl-Carnitins auf Coenzym A, wobei Acyl-CoA und freies Carnitin entsteht. Nun schließt sich der Abbau der Fettsäuren, die ß-Oxidation an. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Carnitin-Palmitoyltransferase 1 in Entzündungszuständen und die Klärung der Frage, ob Stickstoffmonoxid (NO) einen Einfluss auf die Regulation der CPT 1 hat. Darüberhinaus wurde die Wirkung von PPAR-a (peroxisome proliferator-activated receptor-a) auf die induzierbare NO-Synthase (iNOS) und damit die Generierung von NO untersucht. Die Experimente wurden an Ratten-Mesangiumzellen durchgeführt. Interleukin 1ß stimuliert die Expression der CPT 1 auf mRNA und Protein-Ebene. In Kombination mit Palmitat und Carnitin konnte die Expression der CPT 1 signifikant gesteigert werden. Es konnte gezeigt werden, dass NO ein potenter Stimulator der Carnitin-Palmitoyltransferase 1 ist. Mesangiumzellen, die mit NO und IL-1ß kombiniert stimuliert wurden, zeigten bereits nach 2 Stunden eine Reduktion der Expression auf das Niveau der unstimulierten Kontrolle. IL-1ß und L-NG-Monomethyl- Arginin (L-NMMA), ein spezifischer Inhibitor der induzierbaren NO-Synthase erhöhen die CPT-1 Expression. In einem Tiermodell des hämorrhagischen Schocks wurde die CPT 1 mRNA Expression signifikant reprimiert, die Gabe eines iNOS-Inhibitors konnte diese Herunterregulierung wieder aufheben. Stickstoffmonoxid spielt eine sehr wichtige Rolle bei Entzündungsreaktionen. Die induzierbare NO-Synthase ist das verantwortliche Enzym für die Produktion von großen Mengen NO. Die NO-Synthase (NOS) katalysiert die Umsetzung von L-Arginin unter Sauerstoffverbrauch in Citrullin unter Entstehung von NO. Der Mechanismus , der für einen verzögerten Beginn der Transkription von vier Stunden mit darauf folgender mehr als 24-stündiger immenser mRNA Synthese. nach einer Zytokinstimulation verantwortlich ist, ist noch nicht verstanden. Der Untersuchung dieser verzögerten und anhaltenden iNOS Expression lag die Hypothese zugrunde, dass die Zytokin-induzierte iNOS Transkription zuerst durch NFkB und C/EBP Transkriptionsfaktoren ausgelöst und anschließend durch andere Mediatoren verlängert und verstärkt wird. Zur Identifizierung möglicher regulatorischer Elemente wurden 4,5 kb der 5' flankierenden Region des iNOS Promotors aufwärts des Transkriptionsstarts kloniert. Mittels Analyse der DNase 1 hypersensitiven Bereiche der 5'Region des iNOS Gens konnten zwei hypersensitive Stellen identifiziert werden (DHS1: 1300bp; DHS2: 3000bp). Beide Stellen enthalten putative PPAR-Bindestellen. Zur weiteren Untersuchung wurde die Wirkung des PPAR-a auf die iNOS analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass der PPAR-a Agonist Wy 14643 in Kombination mit IL-1ß in der Lage ist sowohl Aktivität, Protein als auch die mRNA der iNOS zu steigern. Transfektionsexperimente mit deletierten und mutierten iNOS Promotorfragmenten zeigten, dass DHS1 das für die Stimulation verantwortliche DNA Fragment enthält. Mittels Elektrophoretic-Mobility-Shift-Assay konnte gezeigt werden, dass der PPAR-a Agonist Wy 14643 die Bindung des PPA-Rezeptors an DHS1 verstärkt.
Mithilfe der klinischen Routinemethode, TRAK-Assay®, wurden bei Patienten TSH-Rezeptor-Antikörpern (TRAK) nachgewiesen, um die Diagnose M. Basedow zu erhärten oder auszuschließen. Diese Methode ist aber nur in der Lage die Gesamtheit aller TRAK zu erfassen. In dieser Studie wurde eine andere Methode, der cAMP-Assay verwendet, bei welchem Chinesische Hamster Ovarien (CHO)-Zellen eingesetzt wurden, die auf ihrer Oberfläche stabil exprimierte humane TSH-Rezeptoren besitzen, und welcher in der Lage ist, zwischen dem Vorhandensein von funktionsstimulierenden und funktionsblockierenden Antikörpern zu unterscheiden. Die Differenzierung zwischen diesen verschiedenen Antikörper-Typen kann wichtige Hinweise dafür liefern, warum das klinische Bild bei vielen Erkrankten nicht mit dem Vorhandensein oder der Höhe der TRAK korreliert und Anhaltspunkte über die Prognose über den weiteren Verlauf der Erkrankung geben. Große Patientenkollektive von insgesamt mehr als 300 Patienten wurden auf das Vorhandensein von TRAK im Serum untersucht, getrennt nach TRAK mit stimulierender und blockierender Funktion. Neben Patienten mit M. Basedow wurden in diese Studie auch Patienten einbezogen, welche an Hashimoto-Thyreoiditis, an einer anderen Autoimmunerkrankung, an nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen oder an Thyreoiditis de Quervain erkrankt waren. Bei Patienten mit M. Basedow wurde außerdem der Einfluß der thyreostatischen Behandlungsdauer auf das Auftreten von TRAK mit stimulierender und blockierender Funktion untersucht. Material und Methode Es wurde die CHO- Zelllinie JP 26 verwendet. Die Zellen wurden kultiviert mit IMDM- Medium, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin, 5% FCS in einer 5%igen CO2-Atmosphäre bei 37°C. Für den cAMP-Assay wurden die Zellen in 96-Well-Platten angezüchtet. 24 Stunden später wurden die CHO-Zellen, nach Entfernung des Kulturmediums, zur Ermittlung funktionsstimulierender TRAK, mit 60 µl hypotonem KRB- Puffer, 20 µl IMBX (Isobutylmethylxanthine) und 20 µl Patientenserum für zwei Stunden inkubiert. Zur Ermittlung funktionsblockierender TRAK wurden 40 µl KRB, 20 µl IMBX, 20 µl Patientenserum und 20 µl TSH (Konz. 0,5 mU/ml) verwendet. Die cAMP-Konzentration wurde mittels eines kompetitiven Radioimmunoassays (BIOTRAK® cAMP) und eines Gamma-Counters gemessen. Ergebnisse Mit dieser Methode läßt sich zeigen, dass nicht nur bei Patienten mit M. Basedow signifikant hohe Titer mit funktionsstimulierenden und funktionsblockierenden Antikörpern vorhanden sind. Funktionsstimulierende TRAK wurden bei 25,7% der Hashimoto-Thyreoiditis-Patienten, bei 5,56% der Patienten mit schilddrüsenunabhängigen Autoimmunerkrankungen (M. Addison, Diabetes mellitus Typ 1) und bei 17,4% der Patienten mit nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen detektiert. Funktionsblockierende TRAK waren in signifikanter Höhe bei 19,15% der Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis, bei 27,78% mit schilddrüsenunabhängigen Autoimmunerkrankungen und bei 50% mit nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen aufzufinden. Die Gruppe der Thyroiditis-de Quervain-Patienten zeigte keine signifikanten Unterschiede im Vorkommen von Antikörpern zur Kontrollgruppe. In der Gruppe der M. Basedow-Patienten konnten bei 52,1% funktionsstimulierende Antikörper entdeckt werden. Bei den Patienten, welche weniger als vier Wochen thyreostatisch behandelt wurden, konnten in ca. 10% mehr Antikörper-positive Fälle detektiert werden, als bei Patienten mit einer Behandlungsdauer von mehr als neun Monaten. Nur 9,62% der M. Basedow-Patienten hatten laut cAMP-Assay TRAK mit blockierender Funktion. Diese verteilen sich ausschließlich auf Patienten, welche seit mindestens neun Monaten in thyreostatischer Behandlung waren. Der hier verwendete cAMP ist ein geeignetes Verfahren zur Differenzierung unterschiedlicher TRAK-Typen, was mit dem herkömmlichen TRAK-Assay® nicht möglich ist. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass Antikörper gegen den TSH-Rezeptor nicht nur bei Patienten mit M. Basedow vorkommen, sondern auch bei Patienten anderer Schilddrüsen- und Autoimmunerkrankungen. Es wird außerdem deutlich, dass eine thyreostatische Behandlung mit einer Dauer über neun Monaten bei M. Basedow-Patienten zum gehäuften Auftreten von funktionsblockierenden Antikörpern führt.
Einleitung und Zielsetzung: In der vorliegenden Arbeit sollte der Nachweis von TSH-Rezeptorantikörpern mittels eines Bindungsassays und JP26- Zellen erbracht werden. TSH-Rezeptorantikörper (TRAK) werden in Seren von vielen Patienten mit einer Autoimmunthyreoiditis entdeckt. Der in dieser Arbeit ausgewählte Radioimmunassay verwendet chinesische Hamster Ovarienzellen (CHO-Zellen), die humanen TSH-Rezeptoren exprimieren. Der Bindungsassay basiert auf dem Prinzip der Verdrängung von radioaktiv markiertem bovinem-TSH (Tracer) durch vorhandene TSH-Rezeptorantikörper im Patientenserum. Dabei ist es nicht entscheidend, ob es sich um funktionsblockierende oder funktionsstimulierende TRAK handelt. Der verwendete Bindungsassay gilt als einer der sensitivsten, kompetitiven Bindungsassays für die Detektion von TRAK und kann deshalb ein relevanter Verlaufsmarker bei Patienten mit Morbus Basedow und Hashimoto sein. Material und Methode: Die JP26-Zellen wurden ausgewählt, weil sie sich mit einer Anzahl von 2.000 TSH-Rezeptoren an ihrer Oberfläche gut mit der TSH-Rezeptordichte humaner Thyreozyten vergleichen lassen. Die verwendeten Patientenseren wurden unterteilt in 5 Gruppen: Gruppe 1: Morbus Basedow (n = 85), Gruppe 2: Kontrollgruppe (n = 76), Gruppe 3: Hashimoto-Thyreoiditis (n = 29), Gruppe 4: Andere Autoimmunerkrankungen (n = 14), Gruppe 5: Nicht-autoimmune Schilddrüsenerkrankungen (n = 38). Die Morbus Basedow-Gruppe wurde zusätzlich untergliedert in floride und länger als 9 Monate behandelte Gruppen sowie in TRAK positive und TRAK negative Gruppen: Gruppe 1A: floride und positive TRAK, Gruppe 1B: floride und negative TRAK, Gruppe 1C: behandelt und positive TRAK, Gruppe 1D: behandelt und negative TRAK. Die kultivierten JP26-Zellen wurden mit einer Zellanzahl von 300.000 Zellen / Well zusammen mit IMDM-Medium in 24-Lochplatten aufgeteilt. Am nächsten Tag wurden die in 5 %iger CO2-Atmosphäre bei 37°C inkubierten Lochplatten mit PBS gewaschen. Danach wurde 150 ml modifizierter KRB-Puffer, 50 ml Serum und 50 ml 125 I-bTSH in jede Vertiefung pipettiert. Die bestückten Lochplatten wurden diesmal bei 4°C über 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die JP26-Zellen mit 0,5 ml 4 °C kalten KRB-Puffers gewaschen und mit 0,5 ml 1 N Natronlauge (NaOH) gelöst. Die verbliebene Radioaktivität wurde zuletzt im gamma-Counter gemessen. Ergebnisse: Gruppe 1: 31 %, Gruppe 2: 5 %, Gruppe 3: 17 %, Gruppe 4: 0 %, Gruppe 5: 16 %. Gruppe 1A: 80 %, Gruppe 1B: 0 %, Gruppe 1C: 36 %, Gruppe 1D: 14 %. Schlußfolgerung: Die Sensitivität der TRAK-Nachweise in der MB-Gruppe war entgegen aller Erwartungen niedriger als im Routinelabor. Dies lag vermutlich auch an einer sehr hohen Affinität des verwendeten bovinen-TSH-Tracers für TSH-Rezeptoren. Es fanden sich jedoch bemerkenswerte Ergebnisse in der Gruppe der Hashimoto- Thyreoiditis und der nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen. In beiden Gruppen konnten in mehreren Seren ( 17 bzw. 16 % ) positive TRAK-Werte nachgewiesen werden. Daraus läßt sich schließen, daß die in vorliegender Arbeit angewendete Untersuchungsmethode eine höhere Sensitivität zum Nachweis von TRAK bei Hashimoto- Thyreoiditis besitzt. Gewichtige und neueste Studien, sowie Ergebnisse von Untersuchungen der gleichen Arbeitsgruppe, die sich mit zwei unterschiedlichen Assays zur Unterscheidung funktionsblockierender und funktionsstimulierender TRAK befaßt haben, stützen diese Aussage. Letztlich liegt der Schluß nahe, daß es sich bei den in diesen beiden Gruppen nachgewiesenen TSH-Rezeptorantikörpern, um überwiegend funktionsblockierende TRAK handelt. Dagegen erscheint zum TRAK-Nachweis, insbesondere funktionsstimulierender TRAK bei Morbus Basedow Patienten, die Anwendung einer auf kompetitiver Hemmung beruhende Untersuchungs-methode nur unzureichend sensitiv. Das in vorliegender Arbeit angewendete Verfahren eignet sich offenbar vergleichsweise besser zur Detektion funktionsblockierenden TRAK.
Verschiedene Nanopartikel, darunter Gelatine- und Albuminnanopartikel und Cyanoakrylatnanopartikel mit Butyl- und Hexylseitenketten, wurden in dieser Arbeit auf ihre Tauglichkeit als Trägersystem zum Einsatz für einen späteren Gentransfer in Bronchialepithelzellen erprobt. In der Zellkultur wurden dazu an primären humanen Bronchialepithelzellen und an der Zelllinie 16HBE14o Zytotoxizitätstest nach Inkubation mit oben genannten Nanopartikeln durchgeführt. Weiterhin wurden qualitative und quantitative Aspekte der Anreicherung von fluoreszenzmarkierten Gelatine- und Albuminnanopartikeln in diese Zellen mit dem konfokalen Laserrastermikroskop und dem Durchflußzytometer untersucht. Zusätzlich evaluiert wurde die inflammatorische Potenz von Gelatine- und Albuminnanopartikeln mittels einer quantitativen Interleukin-8-Bestimmung. Es konnte gezeigt werden, dass Cyanoakrylate aufgrund eines hohen zytotoxischen Effekts nicht für die Behandlung von Bronchialepithelzellen geeignet sind. Hierbei zeigten Cyanoakrylate mit kurzen Butylseitenketten eine ausgeprägtere Zytotoxizität als jene mit langen Hexylseitenketten. Gelatine- und Albuminnanopartikel hingegen zeichneten sich durch sehr geringe bis fehlende Zytotoxizität aus. Mit dem konfokalen Laserrastermikroskop konnte die Aufnahme von fluoreszenzmarkierten Gelatine- und Albuminnanopartikel in das Zellinnere von primären Bronchialepithelzellen dokumentiert werden. Erstmals wurde somit eine Nanopartikelaufnahme in Zellen nachgewiesen, die nicht zum mononukleären Phagozytensystem gehören. Die Versuche zur zellulären Aufnahme der Nanopartikel mit verschiedenen Inkubationsbedingungen zeigten, dass primäre Bronchialepithelzellen und 16HBE14o-Zellen Gelatine- und Albuminnanopartikel in einem aktiven, stoffwechselabhängigen Prozess aufnehmen, der am ehesten der Phagozytose entspricht. Ferner haben sich Albuminnanopartikel im Rahmen dieser Versuche als bioadhäsiv erwiesen. Mit dem Durchflußzytometer ließ sich schließlich eine Konzentrationsabhängigkeit der Aufnahme fluoreszenzmarkierter Gelatine- und Albuminnanopartikel zeigen und feststellen, dass alle Zellen einer Zellpopulation von primären Bronchialepithelzellen oder 16HBE14o-Zellen Nanopartikel aufnehmen. Selbst primäre Zellen, die durch die Kultur auf Membraneinsätzen auf einem hohen Differenzierungsniveau gehalten wurden, nahmen Nanoparikel auf. Eine quantitative Interleukin-8-Bestimmung zeigte schließlich, dass Gelatine- und Albuminnanopartikel keine Inflammation in primären humanen Bronchialepithelzellen und der Zelllinie 16HBE14o verursachen. Abschließend lässt sich sagen, dass die hier erprobten Nanopartikel bezüglich ihrer Zytotoxizität und ihrem inflammatorischem Potenzial als geeignet für den Gentransfer erscheinen. Die Aufnahme der Nanopartikel in das Zellinnere ist vielversprechend für eine spätere Expression von Transgenen in Bronchialepithelzellen.
Ziel dieser Arbeit war die Klärung des pathogenen Mechanismus einer Mutation im kardialen Myosinbindungsprotein C Gen. Diese Mutation (eine G-Insertion), die zu einer intern deletierten mRNA mit vorzeitigem Stop Codon führt, wurde im Rahmen einer HCM- Familienanalyse identifiziert. Ein C-terminal verkürztes MyBP-C war jedoch im Herzgewebe eines Patienten nicht nachweisbar (Moolman et al., 2000). Es stellte sich die Frage, ob die Krankheit in dieser Familie auf einen "dominant-negativen" Effekt von sehr wenigen veränderten Proteinen oder auf einen Mangel an normalem MyBP-C (Haploinsuffizienz) zurückzuführen ist. Zur Überprüfung einer möglichen Suppression des mutierten Allels auf mRNA Ebene wurde eine semiquantitative RT-PCR-Analyse myokardialer RNA durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die nicht-mutierte mRNA in einem vierfachen Überschuß gegenüber der mutierten mRNA im Patienten-Herzgewebe vorliegt. In Modellversuchen wurde sodann die Expression der intern deletierten mRNA in transient transfizierten Zellen untersucht. Hierfür wurden drei MyBP-C cDNAs verwendet: (1) die vollständige Wildtyp cDNA (WT), (2) eine intern deletierte cDNA, die mit dem vorzeitigen Stop-Codon endet (MTI) und (3) eine cDNA, die sich nur durch die interne Deletion von der WT-Sequenz unterscheidet (MTII). Aufgrund einer Leserahmenverschiebung enthält die cDNA MTII (wie die mutierte Patienten-mRNA) zusätzlich zum nativen Stop-Codon ein vorzeitiges Terminationscodon. In COS-1 Zellen führten alle drei cDNAs zur Synthese der erwarteten Genprodukte. In neonatalen Kardiozyten wurde nur das verkürzte Protein vom Typ MTI eindeutig exprimiert. Die cDNA MTII führte nicht, bzw. nur in sehr geringem Ausmaß zur Synthese eines verkürzten MyBP-C (Western Blot). Die Analyse immunfluoreszent markierter Kardiozyten für das c-myc/MyBP-C-Fusionsprotein und für Titin ergab folgende "steady state" Expressionen: WT>MTI>>MTII. In der Mehrzahl der Zellen, die MTI oder MTII exprimierten, lagen die Rumpfproteine diffus im Cytoplasma vor, ohne eine erkennbare Veränderung der endogenen Sarkomerstruktur hervorzurufen. Ein relativ geringer Anteil von Zellen zeigte eine korrekte, sarkomere Inkorporation der verkürzten Proteine. Aufgrund der unterschiedlichen "steady state" Konzentration von MTI und MTII in Kardiozyten und aufgrund der Expressionsunterschiede in den verschiedenen Zelltypen wurde ein zelltypspezifischer und intron-unabhängiger Mechanismus vermutet, der die Suppression der Nonsense-mRNA (MTII) und damit eine Reduktion der Synthese des verkürzten MyBP-C bewirkt. Dieser Effekt wurde auf den Einfluß von Sequenzen zurückgeführt, die sich in der reifen mRNA 3' vom vorzeitigen Stop-Codon befinden. Zur Eingrenzung dieser Sequenzen wurde der Bereich zwischen dem vorzeitigen und dem nativen Stop-Codon in überlappende Fragmente unterteilt und an das Stop-Codon der cDNA MTI angefügt. Die transiente Expression dieser cDNA-Konstrukte (MTI-DSE I, II, III, I/II) führte in Kardiozyten ebenfalls zu einer reduzierten Synthese des verkürzten MyBP-C. Die erhaltenen Ergebnisse, d.h. sowohl die reduzierte Transkriptmenge des mutierten MyBP-C Allels im Patienten- Herzgewebe als auch die geringe Akkumulation verkürzter MyBP-C Proteine in transient transfizierten Kardiozyten erklären den pathogenen Mechanismus der untersuchten MyBP-C Mutation nicht vollständig. Jedoch unterstützen sie die Vermutung, dass die Abwesenheit des verkürzten MyBP-C auf einer Suppression der MyBP-C Nonsense-mRNA basiert und bekräftigen die Vorstellung, dass die HCM in der untersuchten Familie mit einem Mangel an Myosinbindungsprotein C im Myokard assoziiert ist (Haploinsuffizienz). Ein "dominant- negativer" Effekt einer sehr geringen Menge von veränderten Molekülen auf die Struktur oder auf die regulatorische Funktion der kardialen Sarkomere kann allerdings nicht völlig ausgeschlossen werden.
Die Peritonitis bezeichnet eine durch Bakterien oder chemische Noxen ausgelöste Entzündung des Peritoneums. Entwickelt sich aus der lokalisierten Entzündung der Bauchhöhle durch Abstrom bakterieller Bestandteile in die systemische Zirkulation eine generalisierte Sepsis mit multiplem Organversagen, beträgt die Letalität trotz chirurgischer Herdsanierung, intensivmedizinischer Betreuung und potenter Antibiotikatherapie 20-50%. Eine entscheidende Rolle in der Abwehr der Peritonitis tragen polymorphkernige Leukozyten. PMNL werden bei einer Infektion der Abdominalhöhle durch chemotaktile Botenstoffe zum Fokus gelockt und tragen durch Phagozytose der Bakterien und Sauerstoffradikalproduktion entscheidend zur Elimination der Mikroorganismen bei. Viele Untersuchungen weisen jedoch auch darauf hin, daß überschießend aktivierte zirkulierende PMNL für die Pathologie des septischen multiplen Organversagens mitverantwortlich sind. Die vorliegende Studie dient der Charakterisierung der Sauerstoffradikalproduktion emigrierter und zirkulierender PMNL bei Patienten mit sekundärer Peritonitis. Hierfür wurde mit Hilfe der luzigenin- bzw. luminolverstärkten Chemilumineszenz die extra- sowie intrazelluläre Sauerstoffradikalproduktion polymorphkerniger Leukozyten bestimmt. Dabei wurde die Sauerstoffradikalproduktion von Patienten mit unkompliziertem Verlauf einer Peritonitis mit der der Peritonitispatienten mit systemischen Komplikationen (septischer Schock, multiples Organversagen) verglichen. Acht Patienten nach abdominalchirurgischer Operation ohne Infektion dienten als Kontrollen. Eine Aktivierung der extrazellulären und intrazellulären Sauerstoffradikalproduktion polymorphkerniger Leukozyten war durch rezeptorabhängige und rezeptor-unabhängige Stimuli möglich. Bei Patienten nach abdominalchirurgischer Operation ohne Infektion war die Sauerstoffradikalproduktion der in die Bauchhöhle emigrierten PMNL höher als die zirkulierender PMNL. Auch bei Patienten mit einer unkomplizierten Peritonitis war die Sauerstoffradikalproduktion der intraabdominalen Granulozyten stärker aktivierbar als die der zPMNL. Im Gegensatz hierzu war jedoch bei Peritonitispatienten mit systemischen Komplikationen die extrazelluläre sowie auch die intrazelluläre Sauerstoffradikal-produktion emigrierter, intraabdominaler PMNL reduziert. Die stimulierte Sauerstoff-radikalproduktion zirkulierender PMNL war bei Patienten mit schwerer Peritonitis hochgradig aktivierbar und übertraf die der emigrierten PMNL. Die hohe Sauerstoffradikalproduktion zirkulierender PMNL bei Patienten mit kompliziertem Verlauf einer Peritonitis verbunden mit einer erniedrigten Sauerstoffradikalproduktion emigrierter polymorphkerniger Leukozyten sprechen für eine überaus starke systemische Aktivierung der Leukozyten. Dagegen scheint die lokale Abwehr im Rahmen einer schweren Peritonitis supprimiert. Die bei der vorliegenden Untersuchung erfaßten hohen intraabdominalen Zytokinkonzen-trationen könnten für eine Deaktivierung emigrierter Leukozyten verantwortlich sein. Zudem könnte die systemische Hyperinflammation polymorphkerniger Leukozyten mit einer vorzeitigen Einleitung der Apoptose und konsekutiver lokaler Immunparalyse verbunden sein. Wenig ist bis heute über die Modulierbarkeit emigrierter, intraabdominaler polymorphkerniger Leukozyten durch antiinflammatorische Substanzen bekannt. Daher wurde in der vorliegenden Untersuchung die Suppression der Sauerstoff-radikalproduktion emigrierter polymorphkerniger Leukozyten durch verschiedene antiinflammatorische Substanzen erprobt. Der Einfluß dieser Substanzen auf die Phagozytoseaktivität emigrierter PMNL wurde mit Hilfe der Durchflußzytometrie evaluiert. Chloramin, Buflomedilhydrochlorid und Pentoxiphyllin konnten die Sauerstoffradikal-produktion der emigrierten polymorphkernigen Leukozyten supprimieren, ohne die Phagozytosekapazität der Leukozyten zu beeinträchtigen.
Es wurden 1000 von der Polizei in und um Frankfurt am Main in der Praxis ermittelte AAK-Messwerte und die entsprechenden BAK, die im Zentrum der Rechtsmedizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main bestimmt wurden, einer statistischen Auswertung unterzogen. In die Auswertung sind alle aus den Untersuchungsunterlagen entnehmbaren Parameter, wie Geburtsdatum der Probanden, Geschlecht, Datum und Uhrzeit der AA-Entnahme, AAK, Datum und Uhrzeit der Tat, zuständiges Polizeirevier, AAK-Messgerät, BAK, Datum und Uhrzeit der Blutentnahme, eingeflossen. Die statistische Auswertung hat ergeben, dass die durchschnittliche Differenz aller AAK- und BAK-Werte bei -0,02 Promille liegt, mit einer Standardabweichung von ±0,35 Promille bei einer maximalen Differenz von -1,13 Promille nach unten und +2,81 Promille nach oben. Die Standardabweichung von ±0,35 Promille wurde als Grenzwert zur Überprüfung der Korrelation der wahrscheinlichen BAK zum Zeitpunkt der AAK-Bestimmung gewählt. Trotz der großen Spanne des Grenzbereichs von 0,7 Promille wurden nur 77,9% der AAK-BAK-Paare als korrelierend ermittelt. Bei Festlegen individueller Grenzwerte, gebildet aus der minimalen bzw. der maximalen BAK zum Zeitpunkt der AAK-Bestimmung, erwiesen sich nur noch 34,7% der Wertepaare als korrelierend. Der durchschnittliche BAK-AAK-Quotient betrug 1:2181, mit einer Standardabweichung von ±1:473. Die Quotientenspanne lag zwischen 1:0 und 1:4480. Als einziger, eindeutig nachzuweisender Faktor für die Beeinflussung der AAK-Messwerte galt die tatsächliche Höhe der BAK. Je höher die Probanden-BAK war, umso größer waren die AAK-Abweichungen von der BAK. Erwähnenswert ist, dass die AAK-Messgeräte der Firma Dräger (Alcotest® 7310 und 7410), auf Redox-Halbleiter-Gassensoren aufbauend, die indirekte BAK im Durchschnitt zu hoch, während die Brennstoffzellen-Geräte LMB S-D3 der Firma LMB Laborservice GmbH die indirekte BAK im Durchschnitt zu niedrig angaben. Die Untersuchung der Wertepaare aus AAK und minimaler BAK zum Zeitpunkt der AAKBestimmung im Vergleich zu den vom Gesetzgeber vorgegebenen Promille-Stufen für ein bestimmtes Strafmaß (0,3 Promille, 0,5 Promille, 0,8 Promille, 1,1 Promille, 1,6 Promille, 2,0 Promille, 3,0 Promille) hat ergeben, dass bei dem vorliegenden Datenmaterial 203 Probanden eine zu niedrige und 239 Probanden eine zu hohe Strafe erhalten hätten, wenn die AAK als alleiniges Maß verwendet worden wäre. Diese Fehleinschätzung wäre eingetreten, weil die AAK der Probanden über bzw. unter den oben genannten Grenzwerten lag und sich ihre BAK umgekehrt unter bzw. über denselben Werten befand. Es lässt sich feststellen, dass eine Berechnung der BAK aus dem Ethanolgehalt der Atemluft nicht möglich ist, weil viele Faktoren die AAK-Messung beeinflussen, die bisher unberücksichtigt blieben und auch von modernen, hochpräzisen AAK-Messgeräten schwerlich erfasst werden können. Daher gilt die Empfehlung, die AAK-Messung nur als Vorprobe und zum Screening zu verwenden. Bei juristischen Begutachtungen sollte nur die BAK verwendet werden, weil diese als einziger Wert präzise und beweissicher ist und außerdem über den Trunkenheitszustand eindeutig informiert. Betroffene sollten auf jeden Fall auf einer BAK-Untersuchung bestehen und die AAK als Messwert in Frage stellen.
Die verschiedenen Typen von Nervenzellen sind durch die differentielle Expression terminaler Differenzierungsgene charakterisiert. Dies sind z.B. Gene, deren Produkte die Synthese und den Transport der verwendeten Neurotransmitter gewährleisten. Die Expression dieser Gene wird während der Entwicklung durch spezifisch exprimierte Transkriptionsfaktoren reguliert. In der Entwicklung sympathischer Nervenzellen sind Mitglieder aus der Familie der basic Helix-Loop-Helix-(bHLH)-Transkriptionsfaktoren und der paired-Homöodomänen-Faktoren identifiziert worden, deren Expression in Vorläuferzellen aus der Neuralleiste durch das Signalmolekül BMP4 induziert wird und die an der Regulation des sympathischen Phänotyps beteiligt sind. Nullmutanten des bHLH-Faktors Mash1 und des Homöodomänen-Faktors Phox2b zeigen eine stark gestörte Entwicklung der sympathischer Nervenzellen. Weitere bHLH-Faktoren, dHand und eHand, vermögen in vitro die Expression noradrenerger Differenzierungsgene in Neuralleistenzell-kulturen zu induzieren. Ob diese Faktoren in vivo eine Rolle in der entwicklungsabhängigen sympathischen Differenzierung spielen, kann im Mausmodell nicht untersucht werden, da die Nullmutanten noch vor der Sympathogenese sterben. Das Huhnembryo bietet das ideale Modellsystem, die Rolle von Transkriptionsfaktoren in vivo zu untersuchen und durch Kopplung embryologisch-experimenteller und molekularer Verfahren die Faktoren gezielt in bestimmten Geweben zu exprimieren. In dieser Arbeit werden Experimente dargestellt, welche die Rolle dieser Transkriptionsfaktoren genauer definieren. Durch die viral induzierte Expression von Phox2a und Phox2b im Huhnembryo wird gezeigt, dass die Expression dieser Faktoren ausreicht, in multipotenten Vorläuferzellen des Brachialnervs und des Hinterwurzelganglions die Differenzierung sympathischer Nervenzellen zu induzieren. Dieser Phänotyp umfasst neben der Expression typisch noradrenerger und panneuronaler Gene ebenfalls die Expression der Transkriptionsfaktoren Phox2a und -b, dHand und Cash1. Es wird gezeigt, dass dHand im Laufe der sympathischen Entwicklung noch vor den noradrenergen und panneuronalen Differenzierungsgenen exprimiert wird. Auch dHand ist in der Lage, nach viraler Misexpression in multipotenten Vorläuferzellen des Embryos Differenzierung zu sympathischen Nervenzellen auszulösen. Weiter wird gezeigt, dass die Überexpression von BMP4 im Huhnembryo dazu führt, dass undifferenzierte Vorläuferzellen im Brachialnerv zu sympathischen Nervenzellen differenzieren. Mash1 vermag nach Überexpression die Expression neuronaler Gene im Brachialnerv und umliegenden Mesoderm zu induzieren. Die Bildung sympathischer Nervenzellen im Bereich des Brachialnervs wird ebenfalls induziert. Diese exprimieren wiederum neben den noradrenergen und panneuronalen Genen auch die Transkriptionsfaktoren Phox2a/b und dHand. Die Ergebnisse zeigen überzeugend das Vermögen der Transkriptionsfaktoren Phox2a/b, dHand und Mash1 den komplexen sympathischen Phänotyp in multipotenten Vorläuferzellen aus der Neuralleiste zu induzieren. Besonders wichtig sind hierbei die Ergebnisse nach dHand-Überexpression. Hiermit wird erstmals gezeigt, dass dieser bHLH-Transkriptionsfaktor in vivo eine hervorragende Rolle innerhalb der Regulation noradrenerger und neuronaler Gene einnimmt. Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen zeigen darüber hinaus, dass während der Normalentwicklung in Vorläuferzellen des peripheren Nervensystems die Expression einer Gruppe von Transkriptionsfaktoren induziert wird. Deren Mitglieder werden in einer festgelegten zeitlichen und epistatischen Reihung exprimiert. Jeder Einzelne dieser Transkiptionsfaktoren ist ausreichend, in Vorläuferzellen die Entstehung sympathischer Nervenzellen auszulösen. Dabei wird die Expression der anderen Mitglieder dieser Gruppe induziert. Es handelt sich also nicht um eine lineare Kaskade von Transkriptionsfaktoren, sondern um ein Netzwerk von Faktoren, die ihre Expression gegenseitig regulieren und vermutlich gemeinsam die Expression terminaler Differenzierungsgene steuern.
Mechanismus der funktionell relevanten Kopplung von Kontaktallergenen in dendritischen Zellen
(2002)
Über die Signaltransduktion in Langerhanszellen, den antigenpräsentierenden Zellen der Epidermis, ist bisher nur wenig bekannt. Mit ein Grund dafür ist die schlechte Verfügbarkeit reiner Langerhanszellen aufgrund ihrer geringen Zahl und der schwierigen Präparation, die häufig schon zur Voraktivierung dieser Zellen führt. Humane unreife und reife dendritische Zellen erwiesen sich als geeignete Modellzellpopulation für kutane antigenpräsentierende Zellen. Mit Hilfe dieser Modellzellen wurde die Beteiligung von zentralen Signaltransduktionswegen nach Interaktion mit dem Kontaktallergen TNCB untersucht. 1. Zum ersten Mal wird gezeigt, dass TNCB in den ersten 10 Minuten nach der Haptenisierung bei dendritischen Zellen intrazellulär lokalisiert ist. Die Stimulation von DC mit dem starken Kontaktallergen TNCB führte zu einer Aktivierung der ERK1/2 MAP Kinase. Dieses Ergebnis entspricht der Vorstellung, dass starke Kontaktallergene in subtoxischen Konzentrationen zellulären Streß bei MAP Kinasen auslösen und somit zu einer für die Kontaktallergie typischen Antigenpräsentation führen. 2. Die Tyrosinphosphorylierung wurde bereits in vorausgegangenen Arbeiten (Kuhn, 1998; Brand, 2002) als Charakteristikum für haptenbehandelte Monozyten und humane dendritische Zellen herausgestellt. Diese Ergebnisse konnten mit humanen unreifen und reifen DC weitergeführt werden. Proteinbiochemisch ergab das Kontaktallergen TNCB ein spezifisches und reproduzierbares Muster hyperphosphorylierter Proteinbanden. Der gemessene Anstieg an Phosphotyrosin beruhte auf der gesteigerten Aktivität von Protein Tyrosin-Kinasen. 3. In weiteren Untersuchungen wurden Proteine massenspektrometrisch analysiert, die tyrosinphosphoryliert waren und gleichzeitig TNCB gebunden hatten. Es wurden drei Proteine identifiziert: Gewebstransglutaminase bei 74-80kD, Thyroidhormon Bindeprotein bei 58kD und Aktin bei 38kD. Nach Literaturrecherchen war die Transglutaminase am vielversprechendsten und wurde auf ihre Aktivität innerhalb der Kontaktallergen-induzierten Signaltransduktionskaskade hin untersucht. Drei strukturell verschiedene Stoffe, das Kontaktallergen TNCB, die Retinsäure (RA) und ein Phorbolester (PMA) induzierten eine starke, proteinbiochemisch meßbare Tyrosinphosphorylierung der ERK1/2 MAP Kinase. Aus der Literatur war die RA für eine Aktivierung der tTG bekannt (Antonyak et al., 2002) und PMA als Stimulator der ERK1/2 MAP Kinase (Chen et al., 2002; Lee et al., 2002) - aus diesem Grund wurden sie als Positivkontrolle mitgeführt. 4. Mittels Immunpräzipitation wurde der Nachweis, dass TNCB an die tTG bindet, erbracht. Dies war der erste Indikator für eine Bedeutung der tTG als Zielstruktur für ein Kontaktallergen. 5. TNCB, RA und PMA lösen eine gesteigerte Transamidierungsaktivität der tTG aus, die essentiell zur Induktion der ERK-Phosphorylierung ist. Dies wurde durch einen Transamidierungs Aktivitäts Assay bestimmt (Zhang et al., 1998), einem Nachweis der tTG Aktivität mittels Inkorporation von biotinylierten Polyaminen in lokale Proteine. 6. Sowohl die tTG Aktivität als auch die ERK-Phosphorylierung nach TNCB Stimulation konnten durch den spezifischen Inhibitor der Transamidierungsaktivität der tTG MDC gehemmt werden. Dies war ein zweiter Hinweis, dass die enzymatische Aktivität der tTG eine große Rolle spielt. Das gleichzeitige Ausbleiben der Transamidierung und der ERK-Phosphorylierung deutet auf den deutlichen Einfluß der tTG auf den Signaltransduktionsweg der ERK1/2 MAP Kinase hin. Analysen mit anderen starken Kontaktallergenen, wie z.B. Thiomersal und Chlormethylisothiazolon/ Methylisothiazolon bieten zukünftige Forschungsansätze zur weiteren Charakterisierung der funktionellen Bedeutung der tTG und des ERKWeges. Interessant wären auch Untersuchungen zur Hochregulation der tTGExpression in DC von 24-72 Stunden nach einer Inkubation mit TNCB, RA und PMA. Auch sind weitere Untersuchungen zur Signaltransduktionskaskade im Hinblick auf die erforderlichen, nachgeschalteten Elemente interessant, wie z.B. der von der tTG aktivierten Protein B Kinase AKT (Antonyak et al., 2002) sowie beteiligter Kinasen des ERK-Weges.
Die Messung von heteronuklearen 15N-Relaxationszeiten (Longitudinale, transversale sowie heteronukleare NOE) bei verschiedenen Magnetfeldstärken (500, 600 und 800 MHz 1H Larmorfrequenz) ergeben Informationen über interne dynamische Prozesse in Biomolekülen. Diese verschiedenen Relaxationsraten sind voneinander abhängig und über die spektrale Leistungsdichtefunktion miteinander gekoppelt. Die mikrodynamischen Parameter des NH-Peptidrückgratvektors (der Ordnungsparameter S2 und die effektive interne Korrelationszeit te) sowie der Beitrag des konformationellen Austausches zur transversalen Relaxationsrate der Austauschparameter Rex wurden für einige Proteine errechnet und angepaßt. Das Human ILBP gehört zur Familie der intrazellulären Lipidbindungsproteine (LBP), die in der Lage sind, Fett- und Gallensäuren spezifisch zu binden und in Cytosol zu transportieren. Viele verschiedene Typen von LBPs sind bis heute identifiziert worden. Diese Proteine enthalten 127 - 135 Aminosäurereste und werden nach dem Gewebe benannt, aus dem sie isoliert wurden. Human-ILBP enthält 127 Aminosäurereste und besteht haupsächlich aus 10 antiparallelen beta-Faltblattsträngen, die eine beta-Fassstruktur mit einer großen Bindungstasche bilden, und zwei alpha-Helices. ILBP hat die Tendenz, Gallensäuren oder Fettsäuren zu binden. Diese geringe Tendenz zur liganden Spezifität ist entweder in der Struktur oder in seiner Dynamik begründet. Aus diesem Grund kann die Untersuchung der Dynamik des Human ILBP (apo- und holo-Form) in zwei Zeitfenstern zum besseren Verständnis der Funktion führen. Für die nicht-terminalen Peptidrückgratgruppen wurde ein S2-Parameter> 0,8 mit einen Durchschnitt von 0,88 beobachtet, was auf eine niedrige Mobilität im ganzen Protein in einem Nano- zu Picosekunden-Zeitfenster deutet, wobei eine Korrelationszeit von tc = 6.25 ns für ILBP (apo-form) und tc = 6.10 ns für ILBP (holo-Form) beobachtet wurde. Apo- und holo-Form (mit Taurocholat als Ligand) zeigen eine ähnliche Dynamik in diesem Zeitfenster. Überdurchschnittliche S2-Werte der alpha-Helix I deuten eine geringe Flexibilität des Peptidrückgrats an, während alpha-Helix II als Teil der Portalregion eine höhere Beweglichkeit zeigt. Austauschparameter Rex wurden hauptsächlich in den Regionen der Ligandenbindung nachgewiesen. Die hier beschriebenen Eigenschaften unterscheiden sich von denen des H-FABP und des E-FABP. Offensichtlich unterscheiden sich verschiedene Mitglieder der LBP-Familie wie ILBP (Human oder Schwein), H-FABP und E-FABP in der Funktion und Dynamik des Peptidrückgrats. In der vorliegenden Arbeit wurden die transversalen 15N CSA/DD-kreuzkorrelierten Kreuzrelaxationsraten bestimmt. Für die Bestimmung der Anisotropie des chemischen Verschiebungstensors wurde des Verhältnis zwischen den Auto- und Kreuzrelaxationsraten in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke genutzt, wobei es möglich war, die Orientierung und Größe des CSA-Tensors einzelner Aminosäurereste zu bestimmen. Bei dieser Methode (wie auch in vielen anderen Studien gezeigt) wurde keine Korrelation zwischen der Sekundärstruktur des Proteins und den 15N CSA-Werten festgestellt. Zum Vergleich der CSA-Konstanten der ILBP-Spezies wurden die entsprechenden Parameter der RNaseT1 gemessen. Alle Daten wurden im Hinblick auf strukturelle Details kritisch diskutiert.
Für diese Arbeit wurden anhand zweier relativ kleiner Kollektive von 35 DAT-Patienten und 12 gesunden Non-DAT-Kontrollpersonen (Rechtshänder) 18F-FDG-PET-Bilddatensätze des Gehirns angefertigt und standardisiert mit dem halbautomatischen Regionalisierungsverfahren RegWindow hinsichtlich der Stoffwechselraten in interessierenden Hirnregionen nach HERHOLZ et al. (1990) in der Überarbeitung nach HALBER et al. (1995) für das PC-Programm RegWindow analysiert und ausgewertet. Für die Non-DAT-Kontrollgruppe läßt sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen den mit RegWindow und Metabolischer Index ermittelten Metabolic Ratios bestätigen. Die Metabolic Ratios stimmen bezüglich den Literaturangaben der beiden Referenzstudien nach HALBER (1995) und HERHOLZ et al. (1990) sehr gut überein. Mit der Non-DAT-Kontrollgruppe ist auf einem Signifikanzniveau von P=0,95 eine direkte Proportionalität zwischen dem Alter und dem daraus resultierend erniedrigten Metabolic Ratios abzuleiten. Jeweils zehn Lebensjahre führen zu einer Minderung des Metabolic Ratios um 2 Prozent. Für das in dieser Arbeit untersuchte DAT-Gesamtkollektiv wird eine lineare Abhängigkeit des Metabolic Ratios vom MMST-Score des psychometrischen Tests mit hoher Signifikanz nachgewiesen. Die Abhängigkeit liefert eine eindeutige 1:1 Korrelation: Eine Minderung des Score-Wertes um eins hat im Mittel eine Minderung des Metabolischen Ratios um 1 Prozent zur Folge und umgekehrt. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit läßt sich ein Cut-off-Wert von 1,075 zur Trennung des Non-DAT- vom DAT-Kollektiv berechnen. Dieser ermöglicht eine vollständige Trennung beider Kollektive bei einer Sensitivität und Spezifität von 100 Prozent. Die Ergebnisse der Stoffwechselratenanalyse bestätigen eine signifikante Stoffwechselratenminderung in drei von den vier nach HALBER (1995) und HERHOLZ et al. (1990) typischerweise betroffenen (affected) Hirnregionen. In der Reihenfolge vom höchsten zum niedrigeren Einfluß der DAT auf die Stoffwechselminderungen ergibt sich die Rangfolge Gyrus angularis, gefolgt von Gyrus temporalis inferior, Gyrus supramarginalis und Gyrus temporalis medius. Als typischerweise nicht betroffene (non-affected) Regionen konnten die Gyri praecentralis und postcentralis sowie Cuneus bestätigt werden. Als eindeutig non-affected kann zusätzlich der Thalamus klassifiziert werden. Für einige nicht klassifizierte Hirnregionen werden ebenfalls signifikante Stoffwechselratenminderungen nachgewiesen, deren Aufnahme als typischerweise betroffene Hirnareale in den Algorithmus für RegWindow zur Berechnung des Metabolic Ratios vorgeschlagen wird. Diese lauten: Lobulus parietalis inferior, Praecuneus, Hippocampus, Lobulus parietalis superior und Gyrus frontalis superior. Internationale Arbeitsgruppen (siehe Kapitel 4.4.1) konnten für diese Hirnregionen im PET Stoffwechselratenminderungen bestätigen sowie in anderen bildgebenden Diagnoseverfahren Atrophien und Perfusionsdefizite ebenfalls nachweisen. Für die Gyri angularis, temporalis inferior und medius, supramarginalis und den Lobulus parietalis inferior konnte ein unilateraler Befall mit Stoffwechselratenminderung im Anfangsstadium der DAT nachgewiesen werden.
Effektivität und Effizienz der hochauflösenden MRT in der Diagnostik akuter Handgelenksverletzungen
(2002)
Die konventionelle Röntgendiagnostik stellte lange Zeit das dominierende diagnostische Instrument zur Beurteilung von akuten Verletzungen des Handgelenkes und der umliegenden Strukturen dar. Da der klinische Verlauf nach Verletzungen des Handgelenkes häufig unbefriedigend und langwierig ist und nicht adäquat therapierte Verletzungen dieser Region mit einer hohen Rate an Sekundärkomplikationen einhergehen, galt es, die Diagnostik des Handgelenkes zu optimieren, da mit der konventionellen Röntgendiagnostik zum einen Frakturen übersehen, umgekehrt aber auch überdiagnostiziert werden können und zum anderen naturgemäß Bandverletzungen nicht ausreichend beurteilbar sind. Da Verletzungen des Handgelenkes meist bei berufstätigen jüngeren Menschen beobachtet werden, stellt dies ein großes ökonomisches Problem dar. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob durch den gezielten Einsatz der Magnetresonanztomographie in der Frühphase nach einem akuten Handgelenkstrauma, die Diagnostik verbessert werden kann, und inwieweit dies Einfluss auf die nachfolgende Therapieplanung und Therapie hat. Es gelang durch den Einsatz der MRT beim akuten Handgelenkstrauma in Fällen mit einer Diskrepanz zwischen dem unauffälligen oder unklaren konventionellen Röntgenbild und der deutlichen klinischen Symptomatik nicht nur in 10,7% der Fälle (n=6) der Nachweis einer okkulten Fraktur, sondern auch in 64,3% der Fälle (n=36) der Nachweis von Begleitverletzungen im Bereich der ligamentären Strukturen und des TFCC. In 39,3% (n=22) konnte durch die MRT der Verdacht auf eine Fraktur ausgeräumt, in weiteren 5,4% (n=3) eine Änderung bezüglich der Frakturlokalisation vorgenommen werden. Nur 11 der ursprünglich 36 konventionell radiologisch befundeten Verdachtsdiagnosen einer Fraktur konnten im MRT bestätigt werden. In 55,4% wurde die Diagnose und in 66,1% die Therapie geändert (bezugnehmend auf die Daten des ersten Radiologen, Tabelle IV-12). Den verbesserten chirurgischen Therapiemöglichkeiten insbesondere der ligamentären Verletzungen musste durch die Optimierung der MRT Rechnung getragen werden. Es gelang im Rahmen dieser Promotionsarbeit ein zeitsparendes Untersuchungsprotokoll zu erstellen, das es ermöglicht, eine optimale Diagnostik der knöchernen Strukturen des Handgelenkes sowie des Weichteilapparates in weniger als 10 Minuten Untersuchungszeit durchzuführen. T1- und T2-gewichtete STIR-Sequenzen in koronarer Schichtorientierung erwiesen sich als diagnostisch relevant. Aufgrund der verbesserten Diagnostik war es möglich, die Patienten rasch der jeweils optimalen Therapie zuzuführen. So konnten zum einen initial okkulte Frakturen und ausgeprägte Band- und Diskusverletzungen adäquat behandelt und zum anderen durch den sicheren Ausschluss von ossären Verletzungen frühzeitig lange Immobilisationszeiten vermieden werden. Dies stellte einen wesentlichen Benefit für die Patienten dar, da wiederholte Krankenhausbesuche und Röntgenaufnahmen, unnötige Immobilisationszeiten von bis zu 12 Wochen sowie inadäquate - gegebenenfalls invasive - Diagnostik (Arthrographie, Operation) vermieden werden konnten. Durch den frühzeitigen Ausschluss von Frakturen und relevanten ligamentären Läsionen mittels MRT konnte so eine Verkürzung der Arbeitsunfähigkeit in 15 Fällen erreicht werden, in 8 Fällen musste die Dauer der Arbeitsunfähigkeit aus therapeutischen Gründen verlängert werden. Dies spielt sowohl für den Arbeitnehmer als auch für den Arbeitgeber und - bei längeren Krankschreibungszeiten - für die Krankenkassen eine große Rolle. Betriebsausgaben durch Entgeltfortzahlung im Krankheitsfall können so reduziert werden. Aufgrund der wirtschaftlichen Folgen sollte nach unseren Erfahrungen in Fällen mit einem klinischen Verdacht auf eine Fraktur oder schwere Weichteilverletzungen im Bereich des Handgelenkes bei unauffälligem oder unklarem Nativröntgenbild der Einsatz der MRT unmittelbar, möglichst am Tag der Verletzung, erfolgen. Trotz der initial hohen Kosten der kernspintomographischen Untersuchung erscheint uns das Verfahren in der Akutdiagnostik von Handgelenkesverletzungen bei Diskrepanz zwischen dem unauffälligen Röntgenbild und der klinischen Symptomatik indiziert und kosteneffektiv, da durch die adäquate Therapie chronische Handgelenksinstabilitäten und Pseudarthrosen vermieden werden können und auf diese Weise eine Reduktion der Folgekosten möglich ist. Für die Zukunft werden weitere Studien notwendig sein, die die klinische Relevanz des Langzeitverlaufes der in der MRT erhobenen Befunde überprüfen.
Die Osseointegration in der dentalen Implantologie wurde anhand einer Literaturübersicht dargestellt und ausgewertet. Die Literaturübersicht beinhaltet Verlaufsstudien, in vitro und in vivo Studien, die ultrastrukturelle, biomechanische und biochemische Untersuchungen und deren Resultate aufzeigen. Im 1. Kapitel wurden die Kriterien zur Beurteilung des Implantaterfolges dargestellt. Es lässt sich feststellen, dass nicht nur ein Implantatverlust als Misserfolg zu bewerten ist, sondern auch klinische und röntgenologische Erfolgskriterien eine Rolle spielen. Die Mobilität, der Knochenabbau, Entzündungsreaktionen, Schädigungen von anatomischen Strukturen und die Funktionstüchtigkeit des Implantates werden mitbewertet. Im 2. Kapitel wurden die Voraussetzungen für die Erzielung der Osseointegration aufgezeigt. Zu diesen gehören die Physiologie der Knochenheilung, die Implantatwerkstoffe, das operative Vorgehen und die Einheilungsphase. Der Vorgang der Knochenheilung, speziell der primären Frakturheilung, wird der Implantateinheilung gleichgesetzt. Dies bedeutet, dass ein ausreichender belastungsfreier Zeitraum für die Implantateinheilung einzuhalten ist. Bei den Implantatwerkstoffen wurden die Metalle und die Keramiken verglichen. Der Implantatwerkstoff der Wahl ist aufgrund seiner mechanischen und biokompatiblen Eigenschaften das Titan. Andere Materialien, wie z.B. Tantal und Hydroxylapatit, haben sich als problematisch erwiesen. Beim operativen Vorgehen haben sich die Aspekte der atraumatischen, aseptischen und standardisierten Operationsbedingungen als vorteilhaft erwiesen. Der Einfluss der Knochenqualität und des Implantatdesigns auf die erreichbare Primärstabilität wurde dargestellt. Bei der Einheilphase wurde eine Übersicht über die bis dato gültigen Einheilzeiten gegeben. Die Vorgänge während der Implantateinheilung wurden unter Bezug auf die ultrastrukturellen Aspekte dargestellt. Der Einfluss von osteogenetischen Faktoren wurde speziell aufgezeigt. Die Implantateinheilung ist als komplexer Vorgang zu verstehen, bei dem die Wechselwirkung der verschiedenen Faktoren eine wichtige Rolle spielt. Die Morphologie des Interface wurde anhand von Studien diskutiert. Unterschiede in der Morphologie sind in Abhängigkeit von den Implantatwerkstoffen, der Remodelingphase und den verschiedenen Versuchstieren zu finden. Im 3. Kapitel wurden die Voraussetzungen für den Erhalt der Osseointegration besprochen. Zu diesen gehören die Knochenbelastung, die Konstruktionsprinzipien dentaler Implantate, die prothetischen Konzepte und Implantat-Systembeispiele. Bei der Knochenbelastung wurden die Aspekte der okklusalen Überbelastung, der axialen bzw. nicht-axialen Krafteinleitung, Zahn-Implantat- und rein implantat-getragene Rekonstruktionen und materialabhängige Faktoren der Suprakonstruktion berücksichtigt. Hierbei stellte sich heraus, dass Überbelastungen vermieden werden sollten. Die Art der Krafteinleitung sowie die Verbindung von Implantaten mit der natürlichen Bezahnung haben keinen negativen Einfluss auf die Osseointegration. Rekonstruktionen auf Kuststoffbasis werden als problematisch dargestellt. Bei den Konstruktionsprinzipien wurden die Bereiche des enossalen Teils, die Implantatdimension, die Implantatform, der Durchtritt durch die Weichgewebe und die Position der Implantatoberkante dargestellt. Die Unterschiede in den Konstruktionsprinzipien der dentalen Implantate sind heutzutage gering und sind in der Strukturierung der Oberflächen, der Positionierung der Implantatoberkante und im Durchtritt durch die Weichgewebe zu finden. Die Bedeutung der Weichgewebsmanschette beim Osseointegrationsvorgang wurde hervorgehoben. Die Vorteile von konischen Schraubenimplantaten im Vergleich zu Zylinderimplantaten werden aufgezeigt. Ein wurde ein Überblick über die etablierten Okklusionskonzepte und prothetischen Konzepte gegeben. Eine Abhängigkeit von der Ausgangssituation im natürlichen Restgebiss wurde festgestellt, so dass das Konzept sich nach dieser richten muss. Bei den Systembeispielen wurden sechs Implantattypen dargestellt: das Brånemark-System, das Astra-System, das Ankylos-System, das Frialit 2, das ITI- und das 3i-System. Im 4. Kapitel wurden weitere Einflüsse auf die Osseointegration diskutiert. Dazu gehören die Knochenqualität, die Regenerationsfähigkeit des Knochens, neue OP-Verfahren, "neue" Oberflächen und deren Wirkung auf die zelluläre Umgebung, die fraktionierte Lasteinleitung und die Früh- und Sofortbelastung. Die Beurteilung der Knochensituation, d.h. das Erkennen von Veränderungen, die Evaluation der Knochendichte und die Regenerationsfähigkeit des Knochens wurden als prächirurgische Aspekte besprochen. Neue Op-Verfahren wie die Knochen -kondensation und -verdrängung wurden als Möglichkeit vorgestellt, die eine Implantatversorgung auch in schwierigen anatomischen Verhältnissen erlaubt. Der Einfluss der Implantatoberfläche auf den Knochen-Implantatkontakt, die Verankerungsfestigkeit und die Zellaktivität wurde dargestellt. Bei den Implantatoberflächen ist erkennbar, dass eine Vergrößerung der Gesamtoberfläche durch Mikro und -Makrostruktur angestrebt wird. Eine optimale Primärstabilität durch einen besseren Verzahnungseffekt wird dadurch möglich. Die Prinzipien der fraktionierten Lasteinleitung und des progressive bone loadings, sowie die Früh- und Sofortbelastung wurden vorgestellt. Eine Verkürzung der Einheilphase und somit eine Frühbelastung ist unter optimierten Bedingungen möglich. Ein sich anschließendes Knochentraining verbessert die vorgefundene Knochensituation und somit die Prognose der Implantattherapie. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine Osseointegration unter Einhaltung von standardisierten Operationsbedingungen mit jedem der hier vorgestellten Implantattypen erzielbar ist. Beim Erhalt der Osseointegration spielen die Unterschiede bei den Implantattypen und die Belastung über die prothetische Versorgung eine wichtige Rolle.
Lipophile, sedimentgebundene Substanzen sind für endobenthische Tiere in hohem Maße bioverfügbar und können von diesen aufgenommen und angereichert werden. Für benthivore Fische besteht damit das Risiko, diese Chemikalien mit der Nahrung aufzunehmen. Die Aufkonzentrierung sedimentgebundener Chemikalien über zwei oder mehr trophische Ebenen (Biomagnifikation) kann somit durch die Bestimmung der Biokonzentration von Chemikalien in Fischen nach der OECD-Richtlinie 305 (OECD 1996) nicht adäquat erfasst werden. Zur standardisierten Bestimmung der Bioakkumulation und Biomagnifikation wurde eine einfache, zwei trophische Stufen umfassende Labornahrungskette etabliert. Diese bestand aus dem endobenthischen Oligochaeten Tubifex tubifex (MÜLLER) als Beute und dem Dreistachligen Stichling (Gasterosteus aculeatus LINNÉ) als Prädator. Die Experimente wurden mit 14C-markiertem Hexachlorbenzol und Terbutryn in dotiertem künstlichem Sediment und rekonstituiertem Wasser durchgeführt. Um den Einfluss einzelner Expositionspfade an der Gesamtanreicherung der Modellchemikalien zu quantifizieren, wurden die Fische gegenüber dotiertem Wasser bzw. dotiertem Sediment (Biokonzentrationsszenario), vorexponierten Würmern (Biomagnifikationsszenario) und Kombinationen dieser Aufnahmepfade (Bioakkumulationsszenario) exponiert. Sedimentgebundenes HCB wurde im Bioakkumulationsszenario sowohl in den Tubificiden (BAFWurm/Sediment (FG/FG) = 7,8) als auch in den Fischen (AFFisch/Wasser (FG/FG) = 52500; AFFisch/Sediment (FG/FG) = 47; AFFisch/Wurm (FG/FG) = 3,2) deutlich angereichert. Da die Gewebekonzentration von HCB im Räuber, auch auf Basis lipidnormierter Konzentrationen, die Konzentration in seiner Beute überstieg (AFFisch/Wurm (lipidnormiert) = 1,3), kann von einer Aufkonzentrierung der Chemikalie entlang der Labornahrungskette ausgegangen werden (Biomagnifikation). Es konnte gezeigt werden, dass die Exposition gegenüber der Kombination sämtlicher Aufnahmepfade zu deutlich höherer Anreicherung in den Fischen führte als im Falle einzelner Expositionspfade. Ein Vergleich der Ergebnisse der einzelnen Expositionsszenarien erlaubt den Schluss, dass HCB von den Fischen im Bioakkumulationsszenario zu ungefähr gleichen Teilen über das Wasser (45%) und über die Nahrung (41%) aufgenommen wurde, während die Anwesenheit kontaminierten Sediments nur mit 14% zur Gesamtanreicherung beitrug. 14C-Terbutryn wurde im Bioakkumulationsszenario - auf Basis der Gesamtradioaktivität - sowohl in den Tubificiden (AF Wurm/Sediment (FG/FG) = 4,4) als auch in den Fischen (AFFisch/Wasser (FG/FG) = 323; AFFisch/Sediment (FG/FG) = 10; AFFisch/Wurm (FG/FG) = 1,4) angereichert. Allerdings wurde Terbutryn in den Stichlingen zum überwiegenden Teil zu einem polareren Metaboliten transformiert (84%). Daher müssen zur Abschätzung der Anreicherung von Terbutryn die auf den Gehalt an Ursubstanz korrigierten Gewebekonzentrationen und Anreicherungsfaktoren betrachtet werden. Hierbei wird deutlich, dass Terbutryn nicht entlang der Labornahrungskette aufkonzentriert wurde (AFFisch/Wurm = 0,09). Ein Vergleich der Ergebnisse der einzelnen Expositionsszenarien zeigt, dass der Hauptaufnahmepfad von 14C-Terbutryn in Stichlingen das umgebende Wasser ist, während die Anwesenheit kontaminierten Sediments und die Aufnahme über die Nahrung eine untergeordnete Rolle spielen. Da die Messung der Bioakkumulation und Biomagnifikation von sedimentassoziierten Substanzen sehr aufwendig ist, werden zur Abschätzung ihres Risikopotentials vermehrt mathematische Modelle entwickelt und eingesetzt, die eine Chemikalienanreicherung in Nahrungsketten vorhersagen sollen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Vorhersagen dreier Modelle mit den experimentell ermittelten Daten verglichen. Hierdurch sollte sowohl die Eignung des entwickelten Testsystems als auch der verwendeten Modelle als nützliche Instrumente des environmental risk assessment überprüft werden. Die Vorhersagen der drei Modelle bei Applikation auf die Daten der Labornahrungskette stimmen gut mit den experimentell bestimmten Konzentrationen von HCB und Terbutryn in den Tubificiden und Fischen überein. Für HCB sagen alle drei Modelle eine Biomagnifikation in der Labornahrungskette vorher. Die Modelle unterschätzen die gemessenen Konzentrationen in den Fischen mit einem Faktor von 1,1 - 1,7 nur geringfügig. Die Konzentration in den Tubificiden wird vom Gobas/Morrison-Modell sehr präzise vorhergesagt (Unterschätzung um Faktor 1,1), während sie im Campfens/Mackay-Modell (Faktor 2,1) und Gobas-Modell (Faktor 6,3) deutlicher unterschätzt wird. Speziell die dem Campfens/Mackay- und Gobas-Modell zugrunde liegenden Annahmen zur Anreicherung in benthischen Organismen erwiesen sich für HCB und Tubificiden als unzureichend zu sein, da die Modelle hierbei nur die Aufnahme aus dem Porenwasser berücksichtigen. Für Terbutryn sind die Modellvorhersagen sehr viel ungenauer als für HCB, da vor allem die starke Metabolisierung von Terbutryn in den Stichlingen unterschätzt wird. Dies resultiert in einer Überschätzung der Terbutryn-Konzentration in den Fischen (Faktor 5,8 - 6,4). Allerdings bleiben zwei Punkte festzuhalten: 1) Die Modelle sagen keine Biomagnifikation von Terbutryn in der Labornahrungskette vorher. 2) Die Modellvorhersagen bestärken die Annahme, dass die Anreicherung von Terbutryn in den Fischen dominiert ist von der Aufnahme aus dem umgebenden Wasser über die respiratorische Oberfläche. Die analysierten Modelle können bei entsprechender Weiterentwicklung als nützliche Instrumente für eine erste Abschätzung des Risikos der Bioakkumulation sedimentgebundener, hoch lipophiler Substanzen in aquatischen Nahrungsketten im Rahmen der Risikoabschätzung (environmental risk assessment) dienen. Zum gegenwärtigen Entwicklungsstand ist die Labornahrungskette jedoch den Modellen vorzuziehen, da sie die konservativeren Daten liefert. Für eine abschließende Beurteilung der vorgestellten Methoden bedarf es allerdings einer Verbreiterung der Datenbasis.
In NE-Burkina Fasos wurden die Boden- und Reliefgenese (Erkundung des oberflächennahen Untergrunds, OSL-Datierungen) und die aktuelle Geomorphodynamik (Beregnungs- und Infiltrationsversuche, Luftbildauswertungen) der sahelischen Altdünenlandschaft und der angrenzenden endorheischen Becken untersucht. Zentrale Fragestellungen sind (1) die Altersstellung des häufig als erg récent bezeichneten Sekundärdünenreliefs auf dem Dünentop der spätpleistozänen Dünenzüge, (2) die jüngere Relief- und Bodenentwicklung vor dem Hintergrund der langen Nutzungsgeschichte (Hirsefeldbau und Viehzucht), und (3) die qualitative und quantitative Erfassung der aktuellen, denudativen und linearerosiven Prozesse, vorwiegend auf den Altdünen, in Abhängigkeit von Substrat, Oberflächenzustand und Nutzung. Die Akkumulation der Sekundärdünen fand während der spätpleistozänen ariden Periode (Ogolien) statt (19,6±1,1 ka und 23,8±1,6 ka v. H). Gleiches gilt für die äolischen Liegendsedimente der Nordabdachungen der Dünenzüge (21,9±2,1 ka und 23,2±2,1 ka v. H.). Unter Einbeziehung früherer Untersuchungen (ALBERT et al. 1997) ergibt sich daraus, dass sowohl die Dünenzüge an sich als auch ihr asymmetrisches Relief im N-S-Profil bereits während des Ogolien angelegt wurden. Die holozäne Landschaftsentwicklung ist durch Bodenbildung in den Altdünen und durch die fluvial-limnische Sedimentation in den endorheischen Becken (Mares) gekennzeichnet. Der häufig in der Literatur genannte aride Einschnitt um 8,2 ka v. H. kann weder absolutchronologisch noch paläopedologisch nachgewiesen werden. Vielmehr deutet die Verbreitung der Cambic bis Luvic-Chromic Arenosols, über dichtem Untergrund auch Gleyic Arenosols auf standörtlich unterschiedliche Bodenbildungsintensitäten und -prozesse in Abhängigkeit von Wasserhaushalt und geomorphodynamischer Beeinflussung hin. Die jüngere Landschaftsgeschichte ist zunehmend durch Landnutzung beeinflusst. Zwar konnte mit OSL-Altern von 4,5±0,2 ka und 4,7±0,8 ka v. H. lokal Sedimentumlagerung im Zusammenhang mit Later Stone Age-Aktivitäten nachgewiesen werden, für anthropogen induzierte Bodenerosion in größerem Umfang fehlen indessen die Hinweise. Der Wandel zur Kulturlandschaft setzte mit der eisenzeitlichen Siedlungsperiode ein. Kennzeichnend für diese, von der Zeitenwende bis zum 15. Jh. dauernden Epoche, ist der Nachweis des verbreiteten Hirseanbaus auf den Altdünen. Degradierte Böden auf den ehemaligen Feldern und mehrschichtige Kolluvien unterhalb, flächenhafte Bodendegradation in der Umgebung der alten Siedlungen sowie zunehmender Sedimenteintrag in die Mares sind die wichtigsten Indizien des 'human impact' dieser Epoche. Der Bezug zwischen der Nutzungsgeschichte und den korrelaten Sedimenten konnte im Einzelfall absolutzeitlich hergestellt werden (1064-979 cal. BP 14C). Aktuelle Bodendegradation findet in der Sahelzone sowohl fluvialerosiv als auch äolisch statt. Die fluvialerosive Bodenerosion überwiegt dabei flächenmäßig - auf den Glacis durch alle Prozesse des flächenhaften bis linearen Abtrags sowie auf den Altdünen überall dort, wo Bodenkrusten Oberflächenabfluss ermöglichen. Die feldbaulich genutzten Altdünenbereiche auf der Südseite der Dünenzüge und entlang der Nordhänge mit ihren pedogenetisch verfestigten Sanden und verkrusteten Oberflächen weisen stark reduzierte Infiltrationsraten auf und produzieren mit runoff-Koeffizienten von 21-94 % verstärkt Oberflächenabfluss. Neben flächenhafter Denudation tritt hier, überwiegend in Verbindung mit Trittbelastung, gehäuft Rinnen- und Gully-Erosion auf. Aufgrund der Verfestigung bieten diese Böden der äolischen Dynamik kaum Angriffsflächen. Einzig die kaum konsolidierten Sekundärdünen auf dem Dünentop sind die Landschaftseinheit mit dominierender Bodenerosion durch äolische Prozesse.
Untersucht wurde die spätpleistozäne und holozäne Diatomeenflora aus drei Teilgebieten der westlichen Ostsee, dem Kattegat, der Kieler Bucht und der Pommerschen Bucht. Die Ergebnisse bestätigen die hervorragende Eignung der Diatomeen als Indikatororganismen in der Paläoökologie. Anhand der Mikroflora war es möglich, die wechselhafte Geschichte der verschiedenen Ostsee-Teilgebiete detailliert nachzuvollziehen. Es konnten Lage und Ausdehnung der Paläogewässer während der verschiedenen Stadien der Ostsee-Entwicklung sowie verschiedene abiotische Faktoren der Paläoumwelt - Salinität, pH-Wert, Trophie, Temperatur und Wassertiefe - rekonstruiert werden. Zur Rekonstruktion von Salinität, Trophie und pH-Wert kamen erstmals verschiedene Indikationssysteme - der Halobienindex nach ZIEMANN (1971), das Trophie-Indikationssystem nach HOFMANN (1994) und die pH-Rekonstruktion nach ARZET (1987) - zur Anwendung. Kattegat Der Schwerpunkt der Untersuchung lag auf dem südwestlich der Insel Anholt gelegenen Teil des Kattegats. In den 22 Kernprofilen konnten insgesamt 596 Diatomeentaxa registriert werden. In den Ablagerungen des Spätglazials waren im gesamten Untersuchungsgebiet keine silifizierten Mikrofossilien nachweisbar. Die anhand der seismoakustischen Untersuchungen aufgestellte Gliederung der holozänen Sedimente in die Abschnitte Holozän 1 (H1), Holozän 2 (H2) und Holozän 3 (H3) konnte durch die Analyse der Diatomeenfloren bestätigt werden. Die Ablagerungen des Sedimentabschnitts H1 entstanden während einer Transgressionsphase. Das in Alleröd und Jüngerer Dryas trockengefallene Untersuchungsgebiet wurde zu Beginn des Präboreals vollständig transgrediert. Durch das Auftreten halobionter Diatomeentaxa konnte der Beginn der Transgression im Untersuchungsgebiet auf den Anfang des Präboreals und ein Alter von 10.200 Jahren BP datiert werden. Für die Hauptphase der Transgression wurde ein Alter von rund 9.700 bis 9.300 Jahren BP ermittelt. In Übereinstimmung mit den seismoakustischen Befunden und den Ergebnissen der Makrofossil-Analyse konnte der Sedimentabschnitt H2 als Ablagerung aus dem Mündungsgebiet eines Fließgewässers identifiziert und auf ein Alter von rund 9.300 bis 8.300 Jahren BP datiert werden; wahrscheinlich entwässerte der Ancylus-See zumindest zeitweilig über den großen Belt in diesen Abschnitt des Paläokattegats. Die Diatomeenflora indiziert eine überwiegend durch den Einstrom von Süßwasser beeinflusste Paläoumwelt und ein alkalisches und eutrophes Milieu. Das charakteristische Merkmal der Thanathozönosen ist der hohe Anteil an allochthonen Schalen. Die Analyse der autökologischen Präferenzen zeigt, dass durchschnittlich 30 % der Taxa ursprünglich aus anderen Gewässertypen stammen. Mithilfe der Diatomeenflora konnte der Sedimentabschnitt H2 in drei Abschnitte untergliedert werden. Der Abschnitt H2a wurde während der Bildung einer Landzunge abgelagert, die die Mündung des Fließgewässers vom Paläokattegat trennte. Die Thanathozönosen indizieren die zunehmende Beeinflussung durch den Einstrom von Süßwasser. Der Abschnitt H2b wurde vor rund 8.800 Jahren BP deponiert, während die Landzunge ihre größte Ausdehnung und Isolationskraft erreichte. Die Diatomeenflora indiziert die maximale Beeinflussung durch den Zustrom von Süßwasser. Im Sedimentabschnitt H2c indizieren die Thanathozönosen die Verlagerung der Landzunge infolge küstendynamischer Prozesse und eine zunehmende Beeinflussung durch Meerwasser. Der Sedimentabschnitt H3, der während einer erneuten Transgression vor ca. 8.300 Jahren BP deponiert wurde, ist in weiten Bereichen vollständig frei von silifizierten Mikrofossilien. Eine autochthone, aus überwiegend halobionten Taxa zusammengesetzte Diatomeenflora ließ sich lediglich in einem der Kernprofile nachweisen. Das charakteristische Taxon der Transgressionsfloren in den Sedimentabschnitten H1 und H3 ist Paralia sulcata. Typisch sind des Weiteren Actinoptychus senarius, Cymatosira belgica, Dimeregramma minor, Ehrenbergia granulosa und Plagiogramma staurophorum. Kieler Bucht Aus der Kieler Bucht stand ein Kernprofil zur Verfügung. In diesem Profil konnten insgesamt 344 Diatomeentaxa nachgewiesen werden. Die brackischen Ablagerungen entstanden in der Mastogloia-Phase und konnten mithilfe der Diatomeenflora in zwei Abschnitte - Mastogloia 1 (M1) und Mastogloia 2 (M2) - untergliedert werden. Der Sedimentabschnitt M1 wurde deponiert, während das Milieu des Paläogewässers durch sporadische Ingressionen über den Großen Belt beeinflusst wurde. Die Diatomeenflora indiziert einen Paläosalzgehalt von maximal 9 Promille, ein eutrophes und alkalisches Paläomilieu und eine geringe Wassertiefe. Die Veränderungen im Artgefüge der Thanathozönosen innerhalb des Sedimentabschnitts M2 belegen einen kontinuierlichen Anstieg der Salinität um mindestens 8 Promille und das Auftreten starker Strömungen. Die Sedimentation erfolgte während des Übergangs vom brackigen Mastogloia-Stadium zur marinen Littorina-Phase. Mithilfe der Diatomeenflora konnte nachgewiesen werden, dass sich in dem Paläogewässer der Kieler Bucht frühestens vor 7.100 Jahren BP marine Verhältnisse etablierten. Die Flora indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 17 und maximal 30 Promille. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Sedimentanalyse konnten die Ablagerungen der Littorina-Phase anhand der Diatomeenflora in zwei Subzonen - Littorina 1 (L1) und Littorina 2 (L2) - untergliedert werden. Während das Artgefüge in dem Abschnitt L1 auf große Strömungsgeschwindigkeiten während der Sedimentation hinweist, belegt die Flora in dem Abschnitt L2 eine deutliche Abnahme der Strömungsintensität. Pommersche Bucht In den neun Kernprofilen aus der Pommerschen Bucht konnten insgesamt 265 Diatomeentaxa identifiziert werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der geologischen Untersuchungen zeigt die Diatomeenflora, dass sich der südliche Abschnitt der Pommerschen Bucht nach dem Rückzug des Eisschildes bis in das Atlantikum hinein unabhängig vom nördlichen Teil entwickelte; erst während der Littorina-Phase wurde auch der südliche Abschnitt transgrediert. Mithilfe der Diatomeenflora wurde belegt, dass sich im Spätglazial vor ca. 12.000 Jahren BP im Süden der Pommerschen Bucht ein alkalischer, meso- bis schwach eutropher Süßwassersee etablierte. Die Thanathozönosen indizieren erhebliche Milieuunterschiede zwischen diesem See und dem Baltischen Eisstausee, der zeitweise den nördlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht bedeckte. Im frühen Holozän entwickelte sich im südlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht an gleicher Position wie im Spätglazial wiederum ein Süßwassersee, während der nördliche Abschnitt der Pommerschen Bucht vom Ancylus-See bedeckt war. Die Diatomeenfloren belegen, dass sich die Umweltbedingungen in beiden Paläogewässern ähnelten; sowohl im Norden als auch im Süden lag ein alkalisches und überwiegend eutrophes Milieu vor. Der Beginn der Mastogloia-Phase ist durch einen drastischen Wechsel im Artgefüge der Diatomeenflora gekennzeichnet; Taxa mit höherer Salinitätstoleranz, z. B. Epithemia turgida und Diploneis didyma, ersetzten die rein oligohalobe Ancylus-Flora. Die Veränderungen indizieren einen schwachen aber deutlichen Anstieg der Salinität im Norden der Pommerschen Bucht. Das charakteristische Taxon der Littorina-Phase ist die polyhalobe Planktonart Thalassionema nitzschioides. Es indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 13 Promille. Des Weiteren belegen die Diatomeen den stetig steigenden Wasserspiegel zu Beginn der Littorina-Phase. Chrysophyceen-Zysten, Chaetoceros-Sporen und die Skelette des Silicoflagellaten Distephanus speculum stellen in der Pommerschen Bucht wichtige Leitfossilien dar. Während Chrysophyceen-Zysten typisch für die Sedimente der Mastogloia-Phase sind, haben Chaetoceros-Sporen und Distephanus speculum charakteristischerweise ihren Verbreitungsschwerpunkt in den Ablagerungen des Littorina-Meers.
Die Lösung unbekannter Strukturen aus Pulverbeugungsdaten ist keineswegs eine Routineanwendung, und es steht noch einiges an Arbeit an, um die vorhandenen Methoden so weit zu automatisieren, daß sie von Nichtspezialisten, auch solchen mit kristallographischen Kenntnissen, direkt verwendet werden können. In dieser Arbeit konnte überzeugend dargelegt werden, daß die Anwendung des älteren Verfahrens der Fragmentsuche eine sehr gute Möglichkeit bietet, den Schwierigkeiten der Strukturlösung aus Pulverdaten erfolgreich zu begegnen. Durch graduelle Steigerung des Schwierigkeitsgrads bzw. der Komplexität der Strukturlösung von der anfänglichen Verwendung simulierter Pulverbeugungsdaten bekannter Strukturen über die Messung von Pulverbeugungsdiagrammen bekannter Strukturen bis hin zur Lösung unbekannter Strukturen konnte die sinnvolle Anwendbarkeit des Fragmentsuchprogramms PATSEE zweifelsfrei belegt werden. Die in den einzelnen Stadien der Untersuchungen diskutierten Einflüsse, wie die benötigte minimale Fragmentgröße oder die Fragmentqualität, lieferten entscheidende Hinweise für das Aufstellen einer einfachen Strategie zur Strukturlösung aus Pulverdaten mit PATSEE. So konnte gezeigt werden, daß für einen sinnvollen Strukturlösungsversuch in der Regel mehr als 50% des relativen Streubeitrags aller Atome in der asymmetrischen Einheit benötigt werden und daß sich diese Grenze nur durch die Verwendung qualitativ hochwertiger Pulverbeugungsdaten, wie sie an modernen Synchrotronringen erhalten werden können, durchbrechen läßt. Auch die Variation eines Torsionsfreiheitsgrads im Zuge der Rotationssuche kann entscheidende Vorteile verschaffen, wenn zwei für sich genommen zu kleine starre Bereiche miteinander kombiniert werden. Außerdem konnte die prinzipielle Verwendbarkeit sowohl mittels Kraftfeldmethoden berechneter als auch experimentell bestimmter Fragmente, wie sie in der CSD in großer Zahl bereitstehen, bestätigt werden. Die in PATSEE verwendete Vielzahl an Gütekriterien zur Beurteilung einer Lösung konnte auch im Falle von Pulverdaten im wesentlichen überzeugen. Zwar ist die Diskriminierung zwischen richtigen und falschen Lösungen bei weitem nicht so eindeutig in bezug auf alle Gütekriterien, aber zumindest wird eine sehr gute Bewertung hinsichtlich von CFOM - dem Gütekriterium, nach dem die Lösungen sortiert werden - und den beiden R-Werten RE(1) und RE(2) erreicht. Als etwas problematisch hat sich die Rotationssuche erwiesen, die nur auf der Beurteilung eines einzigen Gütekriteriums beruht. Da aber gerade der Rotationssuche als erstem Schritt der Fragmentsuche eine wichtige Bedeutung zukommt, ist der Anwender zu großer Sorgfalt bei deren Durchführung verpflichtet. Eine Grenze für Strukturlösungsversuche mit PATSEE stellen derzeit Strukturen mit mehreren Molekülen in der asymmetrischen Einheit dar. Da im einfachsten Fall (Z'= 2) bereits ein komplettes Molekül als Suchfragment einen relativen Streubeitrag von unter 50% aufweist, wird eine erfolgreiche Orientierung und Positionierung mit PATSEE nur noch für hervorragende Datensätze möglich sein. Für noch schwierigere Fälle (Z'> 2) oder für Verbindungen, bei denen nicht das gesamte Molekülgerüst als Suchfragment verwendet werden kann, bestehen dann praktisch keine Aussichten mehr auf eine erfolgreiche Strukturlösung mit PATSEE. Basierend auf diesen Ergebnissen, konnten PATSEE-Parameter empfohlen werden, die sowohl für große Fragmente als auch für den Grenzbereich der minimal benötigten Fragmentgröße gute Erfolgsaussichten für die Strukturlösung gewährleisteten. Dabei wichen die empfohlenen Parameter nur in geringem Maße von den für Einkristalldaten optimierten Werten ab. Anhand zweier unbekannter Strukturen konnte die empfohlene Strategie verifiziert werden. Zusätzlich wurde für eine der beiden Strukturen eine Einkristallstrukturbestimmung vorgenommen, welche die aus Pulverdaten gelöste Struktur bestätigte. Auch wenn einerseits die prinzipielle Anwendbarkeit der Fragmentsuche mit PATSEE auf Pulverbeugungsdaten bewiesen werden konnte und andererseits eine allgemeine Strategie zur Vorgehensweise geliefert wurde, sind doch noch nicht alle interessanten Fragestellungen geklärt. Hier sind zum einen die unbefriedigenden Möglichkeiten bei Strukturen mit mehreren Molekülen in der asymmetrischen Einheit zu nennen. Eine sinnvolle Erweiterung der Zahl simultan suchbarer Fragmente in PATSEE könnte diesen Schwachpunkt beheben. Zugleich könnte mit dieser Erweiterung die Anwendbarkeit auf flexiblere Molekülgeometrien ausgedehnt werden, so daß im Endeffekt eine Steigerung der einsetzbaren Fragmentgröße erreicht wird. Diese Erweiterung sollte bei der enormen Rechenleistung moderner Computersysteme kein unüberwindliches Hindernis darstellen, so daß die benötigte Zeit für einen PATSEE-Lauf mit mehreren zu suchenden Fragmenten auf maximal einige wenige Stunden ansteigen würde. Alternativ wäre zu überlegen, ob nicht das Aufheben der strikten Trennung von Rotationssuche und Translationssuche, also eine 6-dimensionale Fragmentsuche, die bisweilen zu beobachtenden Probleme der Rotationssuche beheben würde. Auch bei dieser Änderung der Vorgehensweise in PATSEE könnten moderne Computer sinnvoll eingesetzt werden. Vorteilhaft für die Strukturlösung wäre hier die Kombination der sehr erfolgreichen Diskriminierung der Gütekriterien bei der Translationssuche mit der bisher kritischen Bestimmung der Orientierung. Eine zweite Fragestellung, die im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden konnte, betrifft die Anwendbarkeit auf makromolekulare Verbindungen, die über eine große interne Regelmäßigkeit verfügen, wie beispielsweise kleinere Peptide mit alpha-helikaler Struktur oder einer beta-Faltblattstruktur. Verschiedene Testreihen an derartigen Verbindungen belegen die prinzipielle Machbarkeit, und außerdem konnte bereits in mindestens einem ähnlich gelagerten Fall [17] gezeigt werden, daß derartige Strukturlösungsversuche bei sehr großen Verbindungen durchführbar sind. Insbesondere wegen der erheblichen Schwierigkeiten bei der Kristallisation derartiger Verbindungen und dem großen wissenschaftlichen Interesse an ihrer Struktur könnten erfolgversprechende Ansätze zur Strukturlösung aus Pulverdaten einen wichtigen Beitrag in der Pharmazie, der Pharmakologie, der Biologie und nicht zuletzt in der Medizin leisten.
Die vorliegende Vergleichsstudie untersucht 28 schizoaffektive Patienten (ICD F25) gegenüber 38 bipolar-depressiven Patienten (ICD F31) und 43 Patienten einer orthopädisch erkrankten Kontrollgruppe. Die motivierende Fragestellung war, ob sich durch ein standardisiertes Testverfahren wie den Gießen-Test Merkmale eruieren lassen, die für die Selbst-Objekt-Beziehungen schizoaffektiver Patienten charakteristisch sind. Die soziodemografischen Daten wurden anhand eines halbstandardisierten Interviews erfasst. Der Interviewleitfaden gliedert sich in die Bereiche sozialer, beruflicher und familiärer Status, Krankheitsdaten, Fragen zu Kindheit und Familie sowie Fragen zur aktuellen sozialen Situation. Zur Erfassung der depressiven Symptomatik wurden die Patienten mit der Hamilton-Depressions-Skala zur Fremdbeurteilung überprüft. Mittels Gießen-Test wurde neben der Selbstbeurteilung (aktuelles Selbstbild, Idealbild und normatives Bild) auch die individuelle Fremdbeurteilung der primären Bezugspersonen sowie der gegengeschlechtlichen Partner der jeweiligen Patientengruppe untersucht. Fragekomplex 1: Wie sind Selbstbild und Selbstwertigkeit von schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten beschaffen? Hypothese: Bei schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten bestehen signifikante Unterschiede zwischen den drei Selbstbildern, wohingegen bei der Kontrollgruppe orthopädischer Patienten seltener von signifikanten Unterschieden ausgegangen wird. Die hier gewonnenen Ergebnisse zum Selbstbild zeigen, dass zwischen den drei Selbstbildern schizoaffektiver und bipolar-depressiver Patienten häufiger signifikante Unterschiede bestehen als bei der Kontrollgruppe. Hiermit konnte die Hypothese zum Fragenkomplex 1 bestätigt werden. Fragenkomplex 2: Welche Beziehung besteht zwischen dem Selbstbild der Patienten und dem Bild, das sie von ihren Eltern haben? Hypothese: Bei schizoaffektiven Patienten und bei bipolar-depressiven Patienten ist die Distanz zwischen Selbstbild und Mutterbild geringer als bei der somatischen Kontrollgruppe. Die Distanz zwischen Selbstbild und Vaterbild schizoaffektiver und bipolar-depressiver Patienten wird größer erwartet als bei der Kontrollgruppe. Ein signifikanter Unterschied zwischen schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten wird nicht erwartet. Auffällig ergibt sich aus der vorliegenden Untersuchung das signifikant von der Norm abweichende depressive Selbstbild beider Gruppen in Zusammenhang mit einer ebenfalls depressiv erlebten Mutter. Des Weiteren fällt auf, dass sich die Differenz zwischen Selbstbild und Vaterbild einmal wider Erwarten signifikant zwischen Schizoaffektiven und Bipolar-Depressiven unterscheidet. Ansonsten konnten die Hypothesen zum Fragenkomplex 2 bestätigt werden. Fragenkomplex 3: Unterscheiden sich die interpersonellen Beziehungen von Patienten mit schizoaffektiver Psychose von denjenigen mit bipolar-depressiver Psychose? Hypothese: Es wird erwartet, dass in den Partnerschaften schizoaffektiver und bipolar-depressiver Patienten die Tendenz zu komplementären Beziehungsmustern im Vergleich zur Kontrollgruppe überwiegen. Signifikante Unterschiede der Selbst- und Fremdbilder von schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten werden nicht erwartet. In dieser Studie weisen Partnerschaften schizoaffektiver Patienten eher auf eine Tendenz zu komplementären Beziehungsmustern hin als Partnerschaften bipolar-depressiver Patienten. Sowohl für Schizoaffektive als auch für Bipolar-Depressive findet sich bei der vorliegenden Untersuchung eine weitgehende Übereinstimmung zwischen dem Selbstbild des Patienten und dem Bild, das der Partner vom Patienten hat. Wider Erwarten gab es jedoch wenige signifikante Unterschiede zwischen Selbst- und Fremdbildern von schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten. Die Hypothese zum Fragenkomplex 3 konnte dennoch zum größten Teil bestätigt werden. Die Antwort auf die Frage, ob sich für schizoaffektive Patienten charakteristische Selbst-Objekt-Beziehungsmuster heraus arbeiten lassen, muss nach der hier durchgeführten Untersuchung zunächst offen bleiben. Angesichts der prognostischen Bedeutung psychosozialer Variablen im Langzeitverlauf schizophrener und affektiver Störungen (vgl. Kröber, 1993) empfiehlt sich die Durchführung einer Mehr-Zeitpunkte-Untersuchung an einer größeren Stichprobe schizoaffektiv Erkrankter.
In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, inwieweit sich quantenoptische Zufallsgeneratoren, bei denen die "Welcher-Weg-Entscheidung" einzelner Photonen am Strahlteiler bzw. Faserkoppler zur Zufallsgenerierung verwendet wird, zur Erzeugung von Zufallsbitströmen eignen. Es werden hierbei im wesentlichen vier verschiedene Varianten aufgebaut, die sich durch die eingesetzte Lichtquelle und die Realisierung des optischen Aufbaus unterscheiden, um zu erkennen, welche Detailprobleme sich beim Aufbau solcher Generatoren zeigen. Als Lichtquellen werden eine Einphotonenquelle auf Basis der parametrischen Fluoreszenz und eine Quelle, die stark abgeschwächte, gepulste Poisson-Lichtfelder abstrahlt, eingesetzt. Bei der optischen Realisierung wird jeweils einmal Freistrahl- und einmal Faseroptik für das Zufall generierende Element verwendet. Die Rohdaten-Bitströme der verschiedenen Varianten werden mit Hilfe von statistischen Verfahren untersucht, die für Tests von physikalischen Zufallsgeneratoren geeignet sind. In der Diskussion werden die verschiedenen Testverfahren hinsichtlich ihrer Eignung zum Aufdecken tieferliegender Defekte bewertet. Thermische Einflüsse auf die Rohdaten-Ströme werden dargelegt, Methoden zur Verringerung der Einflüsse angegeben und gezeigt, wie mit Hilfe von mathematischen Regularisierungsverfahren ideale Bitströme aus den Rohdaten erzeugt werden können. Anhand von (mehrstufigen) Autokorrelationskoeffiziententests werden die Auswirkungen von Problemen mit verschiedenen Datenaufnahme-Elektroniken auf die Rohdaten- Ströme analysiert. Die Ursachen der Probleme werden diskutiert, mögliche Lösungen, wie sich die Probleme stark verringern bzw. vermeiden lassen, werden vorgeschlagen und experimentell untersucht. Die Einflüsse der Eigenschaften der verwendeten Photonenquellen im Zusammenspiel mit den verwendeten optischen Komponenten und Detektoren werden analysiert und ihre Auswirkungen auf die Zufallsgenerierung diskutiert. Zur Erhöhung der Ausgangbitrate quantenoptischer Zufallsgeneratoren werden verschiedene Ausführungen von Mehrfachzufallsgeneratoren vorgeschlagen, insbesondere für den quantenoptischen Zufallsgenerator auf Basis der parametrischen Fluoreszenz. Als weitere, interessante Variante eines quantenoptischen Zufallsgenerators wird das theoretische Konzept für den "HOM-Generator" präsentiert, bei dem beide Photonen eines Photonenpaares bei einer gemeinsamen "Welcher-Weg-Entscheidung" zur Zufallsgenerierung verwendet werden. Die vorgeschlagenen Varianten quantenoptischer Zufallsgeneratoren werden hinsichtlich ihrer Eignung für einen praktischen Einsatz diskutiert und bewertet. Für den Dauereinsatz quantenoptischer Zufallsgeneratoren als Komponente in Sicherheitsinfrastrukturen, wie z.B. Trustcentern, werden Optimierungen, Möglichkeiten der Kostenreduzierung und weitere Aufbauvarianten vorgeschlagen. Die Optimierungen werden hinsichtlich ihrer Praxistauglichkeit diskutiert und gewertet. Mögliche Angriffe auf quantenoptische Zufallsgeneratoren werden diskutiert und zur Erkennung von Manipulationen an physikalischen Zufallsgeneratoren werden verschiedene Möglichkeiten vorgestellt, um künstliche Signaturen einzufügen, sie vor Verwendung der Zufallsdaten zu verifizieren und aus dem Zufallsstrom zu entfernen.
Das Thema der vorliegenden Promotion war die Aufklärung von Neutralisationsmechanismen auf Lymphozyten und Makrophagen unterschiedlicher primärer HIV-1-Subtypen im Verlauf der Krankheitsprogression. Ausgangspunkt für die Experimente war die Tatsache, dass humane Seren von HIV-1 infizierten Patienten bereits kurz nach der Serokonversion autologe Virusisolate auf Makrophagen, nicht aber auf Lymphozyten neutralisieren können (Ruppach et al., 2000). Bei Neutralisationsexperimenten mit einem dem V3-loop des gp120 komplementären P1 -Peptids (Subtyp B), sollte der Nachweis von neutralisierenden Antikörpern im Serum erbracht werden. Weiterhin sollte gezeigt werden, inwieweit die Neutralisation auf Makrophagen durch V3-Antikörper begründet ist. Nach erfolgter Neutralisation auf Makrophagen mit und ohne P1-Peptidvorinkubation konnte gezeigt werden, dass es zu keinen Veränderungen im Neutralisationsverhalten durch Vorinkubation mit einem V3-Peptid gekommen war. Daraus ließ sich folgern, dass es nicht die V3-Antikörper sind, die eine Neutralisation auf Makrophagen hervorrufen können. Als nächstes wurde das Neutralisationsverhalten eines frühen lsolates (8 Monate nach der Infektion) und einer späten Folgeprobe (27 Monate nach der Infektion) durch autologes Serum auf Lymphozyten und auf Makrophagen verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl Ursprungs- wie auch Folgeisolat auf Makrophagen eine große Neutralisationsaktivität aufweisen, die auf Lymphozyten fehlt. Um besser eingrenzen zu können, welche Antikörper bei Neutralisationsreaktionen auf Makrophagen eine Rolle spielen, wurden Neutralisationsexperimente mit Serumimmunglobulinen eines frühen Isolates durchgeführt. Als Ergebnis konnte festgehalten werden, dass autologe IgG' s auf Makrophagen eine Neutralisationsreaktion herbeiführen können. Weiterhin stellte sich die Frage, ob autologe Immunglobuline in der Lage sind, heterologe Virusisolate zu neutralisieren. Dabei zeigte sich, dass im Test unterschiedlicher Subtypen, es zu einer hohen Kreuzneutralisationsaktivität gekommen war. Zusammenfassend konnte im Verlauf der Promotion erfolgreich dargestellt werden, dass die Serumimmunglobuline für die Neutralisation auf Makrophagen verantwortlich sind und, dass diese heterologe Eigenschaften besitzen.
Die Verwendung von Fettemulsionen mit ausschließlich langkettigen Triglyceriden (LCT) und dadurch hohem Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren zur parenteralen Ernährung kann zu Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung von Phospholipiden mit entsprechenden Effekten auf die Metaboliten der Arachidonsäure und der Zellmembranen führen. Die Eliminationsgeschwindigkeit mittelkettiger Triglyceride (MCT) soll nach parenteraler Gabe schneller sein als die von langkettigen Triglyceriden. Nach Infusion gleicher Fettmengen an MCT werden niedrigere Triglyceridwerte gemessen als nach LCT-Gabe. In der vorliegenden Arbeit wurden Elimination und Stoffwechseleffekte verschiedener MCT/LCT-Mischemulsionen im Rahmen einer klinischen Prüfung der Phase 1 untersucht. Dazu wurden stoffwechselgesunden männlichen Probanden zwei neu entwickelte 20%ige Fettemulsionen der Firma Laevosan (Lipidol MCT 1/2 mit 50% und Lipidol MCT 1/3 mit 33% MCT-Anteil) in unterschiedlichen Dosierungen infundiert. Es wurden folgende Versuchsansätze verwendet: 10 g Fett als Bolus in 3 Minuten, eine Kurzinfusion von 50 g Fett in 30 Minuten, eine 12 stündige Dauerinfusion mit 0,1 g Fett/kg KG/h und eine hochdosierte Dauerinfusion über 8 Stunden mit 0,25 g Fett/kg KG/h. Die an Versuchspersonen vorgenommenen Untersuchungen wurden durch tierexperimentelle Leberperfusionen ergänzt. Die Umsatzkapazität für die beiden Fettemulsionen mit Zusatz von MCT lag im gleichen Bereich wie die Umsatzkapazität für vergleichbar zusammengesetzte Fettemulsionen. Die Halbwertszeiten für die Elimination der Triglyceride betrugen 15,1 Minuten für MCT 1/2 20% und 27,9 Minuten für MCT 1/3 20% nach Bolusapplikation von 10 g Fett. Nach Kurzinfusion von 50 g Fett lagen die Eliminationshalbwertszeiten bei 46,2 Minuten für MCT 1/2 20% und bei 54.6 Minuten für MCT 1/3 20%. Unter niedrig dosierter Dauerinfusion (0,1 g Fett/kg KG/h) wurde ein Fließgleichgewicht erreicht. Hingegen erwies sich die höhere Dosierung von 0,25 g Fett/kg KG/h als überdosiert, der stetige Anstieg der Triglyceridkonzentration während der 8stündigen Infusion zeigte an, dass mit dieser Dosierung kein Fließgleichgewicht mehr zu erreichen war. Damit war die Eliminationskapazität für die untersuchten Emulsionen bei dieser Dosierung ebenso wie bei Emulsionen mit reinem LCT-Anteil überschritten. Der Zusatz von MCT hat dementsprechend nicht zu einer Erhöhung der Umsatzkapazität für Fettemulsionen geführt. Der erhebliche Anstieg der Fettsäurekonzentrationen während und nach Applikation der Fettemulsionen ist Ausdruck der raschen Hydrolyse der Triglyceride. Die gaschromatographische Differenzierung der Fettsäurekonzentrationen im Serum ergab, dass der Anstieg der Fettsäuren insbesondere auf das Verhalten der mittelkettigen Fettsäuren zurückzuführen war. Sowohl unter hochdosierter Kurzinfusion von 50 g Fett (= 0,625 g-0,667 g Fett/kg Kg bezogen auf das durchschnittliche Probandengewicht) als auch unter hochdosierter Dauerinfusion von 0,25 g Fett/kg KG/h erfolgte dementsprechend mit beiden Fettemulsionen ein Anstieg der Konzentrationen der freien mittelkettigen Fettsäuren (Capryl- und Caprinsäure) auf außerordentlich hohe Werte, wie sie unter physiologischen Bedingungen kaum jemals gemessen werden (5,2 mmol/l mit MCT 1/3 20% und 5,5 mmol/l mit MCT 1/2 20% nach 50 g Fett, 2,4 mmol/l mit MCT 1/3 20% und 3,6 mmol/l mit MCT 1/2 20% unter 0.25 g Fett/kg KG/h). Von einigen der Probanden wurde deutliche Übelkeit als Nebenwirkung der hochdosierten Fettemulsion angegeben. Erwartungsgemäß kam es mit beiden MCT-haltigen Fettinfusionen neben einem Anstieg der Konzentration der freien Fettsäuren auch zu einer deutlichen Erhöhung der Konzentration der Ketonkörper. Der Anstieg war deutlich höher, wenn der Anteil an MCT erhöht war. Außerdem war der Ketonkörperanstieg vor allem unter den beiden hohen Dosierungen bei Verwendung der Emulsion mit dem höheren Anteil an MCT deutlich stärker ausgeprägt als bei der anderen Emulsion mit dem niedrigeren Anteil an MCT. Es wurden dabei nach Kurzinfusion von 50 g Fett Konzentrationen (berechnet als Gesamtsumme an ß-Hydroxybutyrat und Acetoacetat) von lediglich 7,7 mg/dl mit MCT 1/3 20% im Vergleich zu 11,2 mg/dl mit MCT 1/2 20% erreicht. Unter Gabe von 0,25 g Fett/kg KG/h stieg die Gesamtketonkörperkonzentration mit MCT 1/3 20% auf 8,4 mg/dl während es auch hier mit MCT 1/2 20% zu einem höheren Anstieg auf 12,1 mg/dl kam. Auch in der isoliert perfundierten Rattenleber erfolgte ein rascher Umsatz der in den Fettemulsionen enthaltenen Triglyceride. Dabei kam es zu einer extrem schnellen und vor allem nahezu vollständigen Elimination bevorzugt von mittelkettigen Fettsäuren. Dies führte zu erheblichen Anstiegen des ß-Hydroxybutyrats und Acetoacetats, mit beiden Fettemulsionen bis auf Ketonkörperkonzentrationen um 100 mg/dl. Dies entsprach prozentualen Anstiegen von 645,6-750.5 % für ß-Hydroxybutyrat und von 1099,6-1194,8 % für Acetoacetat. Die Glycerin-Konzentration blieb während der Perfusionen niedrig, dies bedeutete, dass das bei der Hydrolyse der Triglyceride gebildete freie Glycerin in der Leber rasch umgesetzt wurde. Bei einer starken Anflutung von freien mittelkettigen Fettsäuren in der Leberzelle zeigte sich, dass es neben der ß-Oxidation vor allein auch zu einer gesteigerten Lipogenese kam. Die in den geprüften Fettemulsionen enthaltenen MCT wurden ebenso wie langkettige Triglyceride rasch hydrolysiert, wie die hohe Konzentration an mittelkettigen Fettsäuren im Serum aufwies. Die Ursache für die hohe Konzentration der mittelkettigen Fettsäuren könnte sein, dass auch die durch Hydrolyse im peripheren Bereich entstandenen mittelkettigen Fettsäuren vorwiegend über die Leber eliminiert werden. Der Anteil der Leber an der Elimination und am Metabolismus der mittelkettigen Fettsäuren ist aus dem Anstieg der Ketonkörper zu erkennen. Diese Beziehung ist bei der Wertung der im Experiment mit der isoliert perfundierten Rattenleber erhobenen Ergebnisse besonders gut zu erkennen. Es konnten keine Anhaltspunkte dafür gefunden werden, dass die Ergänzung von Sojaöl durch MCT in Fettemulsionen zu einer Steigerung des Umsatzes der infundierten Triglyceride führt. Zu beachten wären allerdings die hohen Konzentrationen vor allem an freien mittelkettigen Fettsäuren, die während der Infusion von MCT-haltigen Emulsionen zu messen sind. Da für diese Messung Spezialmethoden erforderlich sind, sind derartige Bestimmungen bei Routineanwendung allerdings nicht möglich.
In der vorliegenden Untersuchung wurden an 35 gynäkologischen Patientinnen die Unterschiede zwischen Desfluran und Isofluran auf das EEG-Frequenzverhalten, die SEF 95% und die somatosensorisch evozierten Potentiales des N. medianus untersucht. Dabei wurden die Einflüsse steigender Narkosegaskonzentrationen und nocizeptiver Reize sowie die Veränderungen in der Aufwachphase auf die oben genannten Parameter verglichen. Die Untersuchung wurde als prospektive und randomisierte Studie durchgeführt. Es konnte der Nachweis geführt werden, dass es keinen Anhalt für Unterschiede in der Beeinflussung der EEG-Parameter Powerspektrum und SEF 95%, sowie der somatosensorisch evozierten Potentiale zwischen Desfluran und Isofluran gibt. Dies gilt für equipotente Narkosegaskonzentrationen ebenso wie für die Unterdrückung nocizeptiver Reize. Anders stellt sich das Bild in der Aufwachphase dar. Dort führt die langsamere Eliminierung des Isofluran zu einer Aktivierung im EEG mit einer starken Ausprägung der beta-Wellen. Einen Einfluss auf klinische Befunde wie Vigilanz, Schmerzempfindung oder Entlassung aus dem Aufwachraum durch diese EEG-Veränderungen ließ sich bei den von uns untersuchten Patienten nicht nachweisen, jedoch konnte in anderen Studien eine Verbesserung der Wiederkehr kognitiver Funktionen besonders bei älteren Patienten nach Desflurannarkosen im Vergleich zu Isoflurannarkosen beobachtet werden [35]. Diese Beobachtung lässt sich durch die Veränderungen in der EEG-Frequenzanalyse mit einem Frequenzmuster wie unter Sedierung erklären.
In der vorliegenden Arbeit sollten die in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Splice- Varianten des murinen ARVCF (mARVCF) cloniert und charakterisiert werden. Es wurde gezeigt, daß alle 8 putativen Isoformen im gleichen Maße mit den Zelladhäsions-Molekülen M-, E- und N-Cadherin interagieren können und mit diesen an der Plasmamembran bzw. den Zell-Zellkontakten colocalisieren. Dabei nimmt N-Cadherin eine Sonderstellung ein. Zum einen ist die Interaktion mit endogenem N-Cadherin abhängig vom Zellkontext und zum anderen konnte mit Hilfe des MOM recruitment assays gezeigt werden, daß, im Gegensatz zu MOM-M- und MOM-E-Cadherin, eine Assoziation von mARVCF und MOM-N-Cadherin nicht in jeder Zelle stattfindet. Eine mögliche Konkurrenz von mARVCF mit dem nahe verwandten armadillo repeat Protein p120(ctn) um die Bindestelle in N-Cadherin konnte dabei als Ursache ausgeschlossen werden. Als nächstes wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, daß mARVCF eine duale Lokalisation an der Plasmamembran und im Zellkern aufweist. Dabei unterliegt mARVCF einem effektiven Exportmechanismus. Dieser Export kann durch Leptomycin B inhibiert werden, scheint somit also CRM1/exportin1-vermittelt zu sein und wird offenbar durch zwei verschiedene NES (nuclear export signal)-Sequenzen in mARVCF reguliert. Das in der p120(ctn) Subfamilie (zu der auch mARVCF gehört) konservierte NLS (nuclear localisation signal) konnte als für den Protein-Import unwirksam charakterisiert werden. Weiterhin wurde das LIM-only Protein FHL2 als neuer Interaktionspartner von mARVCF identifiziert. Dabei wirkt mARVCF als Mediator zwischen dem Cadherin- Catenin Komplex an der Plasmamembran und dem Interaktionspartner der Integrine FHL2. mARVCF ist in der Lage, FHL2 aus den Fokalkontakten zum Cadherin- Catenin Komplex an der Membran zu translozieren und in den Komplex einzubinden.
In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Ca2 -abhängige NDPase (EC 3.6.1.6) kloniert und funktionell charakterisiert werden. Die mRNA der Ca2 -NDPase wurde in allen untersuchten Geweben der Ratte nachgewiesen. UDP, GDP und IDP, jedoch nicht ATP und ADP waren Substrate der Ca2 -NDPase. Ihre Enzymaktivität war strikt von Calciumionen abhängig und zeigte ein breites pH-Optimum zwischen 6,5 und 7,5. Der Km-Wert für UDP lag bei 216 µM. Die Ca2 -NDPase konnte im ER und in Prä-Golgi-Strukturen lokalisiert werden. Sie ist ein Transmembranprotein, dessen katalytische Domäne im Lumen des ER liegt. Dort ist sie vermutlich ein wichtiger Bestandteil der Qualitätskontrolle neu synthetisierter glycosylierter Proteine, in dem sie das die UDP-Glucose:glycoproteinglucosyltransferase inhibierende UDP zu UMP hydrolysiert. Das resultierende UMP dient als Antiporter um UDP-Glucose, das im Zytosol synthetisierte Substrat der UDP-Glucose:glycoproteinglucosyltransferase, in das ER zu transportieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Oligomerstrukturen der zelloberflächenlokalisierten NTPDase1 und NTPDase2 untersucht. Die Enzyme wurden heterolog in Xenopus laevis-Oocyten exprimiert. Nach metabolischer Markierung sowie Zelloberflächenmarkierung wurden die mittels Hexahistidyl-Epitop markierten Proteine durch Digitonin solubilisiert und die Oligomerenkomplexe wurden über Ni2 -NTA-Chromatographie gereinigt. Die gereinigten Proteinkomplexe wurden mittels Cross-Linking-Experimenten und der Blau-nativen Gelelektrophorese analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die NTPDase1 an der Zelloberfläche als Dimer vorlag. Die Dimerisierung erfolgte nicht über intermolekulare S-S-Brücken. Die Dimere der NTPDase1 erwiesen sich als relativ stabil. Inkubation bei 37°C resultierte mit zunehmender Dauer in einer steigenden, jedoch auch nach zwei Stunden noch nicht vollständigen Dissoziation der Dimere. Inkubation unter reduzierenden Bedingungen führte ebenfalls nicht zur vollständigen Dissoziation. Erst eine Inkubation bei 37°C in Gegenwart von DTT und Coomassie Brilliant Blue G250 vermochte eine vollständige Dissoziation der NTPDase1 zu bewirken. Zur vollständigen Dissoziation der Multimerstruktur der NTPDase1 wurden somit das Reduktionsmittel DTT und die unter diesen Bedingungen denaturierende Wirkung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G250 benötigt. Die NTPDase2 bildete kein distinktes Multimer, sondern lag im nativen Zustand an der Zelloberfläche in Form von nicht intermolekular über S-S-Brücken verknüpften Di-, Tri- und Tetrameren vor. Die Homomultimere der NTPDase2 zeigten im Vergleich zur NTPDase1 eine deutlich höhere Stabilität. Inkubation unter reduzierenden Bedingungen und in Gegenwart von Coomassie Brilliant Blue G250 führte im Gegensatz zur NTPDase1 nur zu einer unwesentlichen Dissoziation der Multimerstrukturen. Die Substratspezifität der NTPDase2 änderte sich mit zunehmender Dauer der heterologen Expression. Die ADPase-Aktivität der NTPDase2 stieg nach sieben Tagen signifikant (p < 0,0001) um das vierfache im Vergleich zum ersten Tag der Expression. Dies erniedrigte das ATP:ADP-Verhältnis von 1 : 0,1 nach 24 h Expression zu 1 : 0,4 nach sieben Tagen. Die Änderung der Substratspezifität der NTPDase2 ging mit einer Änderung des multimeren Verteilungsmusters der NTPDase2 einher. Mit zunehmender Expressionsdauer nahm der relative Anteil an höheren Multimeren zu. Im Gegensatz zur NTPDase2 zeigte die NTPDase1 keine signifikanten Änderungen ihrer Substratspezifität und Multimerstruktur. Die durch unterschiedliche Verteilungsmuster der Multimere bedingte Änderung der Substratspezifität der NTPDase2 eröffnet eine neue Möglichkeit zur Modulation Nukleotid-vermittelter Signalübertragung. Es konnte keine signifikante Tendenz zur Ausbildung von Heteromultimeren aus NTPDase1 und NTPDase2 nachgewiesen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden 10 Typen der Gehölzvegetation und 14 Typen der Krautvegetation für das Untersuchungsgebiet Atakora vorgestellt. Dabei konnten nur Sonderstandorte, wie Galeriewälder und Lateritkrusten, klar abgetrennt werden. Viele Arten besitzen keine eindeutigen ökologischen Präferenzen, was sich gut mit der Einschätzung der lokalen Bevölkerung deckt, die für den Großteil der Arten angaben, dass diese wüchsen wo sie wollten. Dabei fällt auf, dass sich die Typen (vor allem in Gehölzschicht aber auch in Krautschicht) in den einzelnen Dörfern oft nur in Teilen entsprechen. Gründe dafür konnten nur teilweise in den unterschiedlichen ökologischen Gegebenheiten und unterschiedlichen Nutzungspräferenzen einzelner wichtiger Trennarten gegeben werden. Selten findet sich ein hundertprozentiges Zusammentreffen eines Gehölztyps mit einem Krauttyp. Damit bestätigt sich die Annahme unterschiedlicher Entwicklungsbedingungen und teilweise unabhängiger Entwicklung dieser beiden Elemente in der westafrikanischen Savanne. Gesellschaften, in denen eine Krautschicht mit einer Gehölzschicht eng korreliert sind, konnten nur für landwirtschaftlich nicht genutzte Sonderstandorten wie Galeriewälder und Lateritkrusten gebildet werden. Zudem zeigt sich, dass die Vegetation in der dichter besiedelten Ebene klarer strukturiert ist, als in der Bergregion. Dies trifft vor allem auf die Gehölzvegetation zu. Dennoch sind erstaunlich viele Gehölzarten auch in der intensiver genutzten Ebene anzutreffen, was für große Regenerationsfähigkeit und die Anpassung der hauptsächlichen Savannengehölze an das menschliche Wirken spricht. Die geringere Zahl an Gehölzarten in der Ebene ist hauptsächlich Resultat der wesentlich stärker degradierten Galeriewälder. In den Berggebieten sind zudem mehr Gehölzschichttypen und mehr krautige Arten angetroffen worden. Hier zeigt sich, dass Berggebiete auch in dieser Untersuchungsregion als Refugium für Vegetationsformationen und Arten gelten können. Die Nutzung von Wildpflanzen für verschiedene Zwecke wurde dokumentiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Präferenzen für diverse Nutzungen auf ethnischen, teilweise auch auf persönlichen Präferenzen, sowie auf der Verfügbarkeit der Pflanzen basieren. Dabei zeigte sich, dass die Präferenzen von Arten als Bau- und Brennholz eher auf der Verfügbarkeit basieren, während die Präferenzen für Medizinalpflanzen eher auf ethnischnen Vorstellungen von Wirksamkeit und teilweise auch auf kollektiven Erfahrungen basieren. Es erwies sich, dass die traditionelle Nutzung von Wildpflanzen als Brenn- und Bauholz und zu zusätzlichen Ernährung in dem Untersuchungsgebiet einen geringen Einfluß auf die Biodiversität hat, solange diese Pflanzen nicht kommerzialisiert werden. Es gibt genügend Pflanzenarten, die leicht zu finden sind und gute Eigenschaften für die eingesetzten Zwecke aufweisen, so dass man meist auf die jeweiligen in einem Dorfgebiet häufig anzutreffenden Arten ausweichen kann. Für diese geringe Auswirkung der traditionellen Nutzung von Gehölzpflanzen auf die Biodiversität sprechen auch die Aussagen der Bevölkerung über die geringere Verfügbarkeit von Gehölzpflanzen zu bestimmten Nutzungen. Dabei ergab sich eine Reihung von Nennungen, die von weniger Bauholz über weniger Brennholz zu weniger Gehölzpflanzen für die traditionelle Medizin abnahmen. Zudem wurde in allen Befragungen verneint, dass eine Art aus dem Dorfgebiet verschwunden wäre. Daraus läßt sich schließen, dass ein Großteil der wichtigen Gehölzpflanzen in dem Untersuchungsgebiet noch vorhanden ist, aber auf Grund der intensivierten Landwirtschaft nicht mehr in der Lage ist, sich zu richtigen Bäumen zu entwickeln. Da sich dadurch einige Gehölzpflanzen nur noch vegetativ vermehren können, kann eine genetische Verarmung von Populationen bestimmter Arten angenommen werden. Dies wäre ein interessanter Ansatzpunkt für zukünftige Forschungen. Ein negativer Einfluß auf die Biodiversität durch traditionelle Nutzungen ist bei der Nutzung von Gehölzpflanzen für die traditionellen Medizin größer, vor allem wenn Wurzeln verwendet werden. Dennoch lässt sich erkennen, dass der Einfluß der traditionellen Nutzungen von Wildpflanzen im Vergleich zu der landwirtschaftlichen Nutzung der Flächen einen marginalen Effekt auf die Vegetation hat. Im Rahmen der ethnobotanischen Befragungen wurden Pflanzennamen, Umweltwahrnehmung und die Vorstellungen von Krankheit der Bétamaribè und Wama dokumentiert. Diese weisen im Gegensatz zu den Vorstellungen anderer afrikanischer Völker kaum Differenzen auf. Die Vorstellungen von Krankheit sind dabei von einem starken Wandel betroffen, da man sich immer stärker auf westliche Konzepte und Medikamente verläßt. Ein positiver Effekt hiervon auf die Phytodiversität ist jedoch nicht zu erwarten, da die Medikamentkosten eine Intensivierung der Landwirtschaft erfordern. Über 240 traditionelle Heilrezepte wurden gesammelt. Die wichtigste Rolle spielen dabei Gehölzpflanzen. Dabei zeigt sich, dass sich die Präferenzen zwischen den einzelnen Dörfern stärker unterscheiden als bei der Nutzung von Pflanzen zu Brenn- und Bauholzzwecken. Auch erweisen sich große Unterschiede zu Verwendungen von Medizinalpflanzen in anderen Untersuchungsgebieten. Dies liegt an unterschiedlichen Vorstellungen und Erfahrungen zur Wirksamkeit von Pflanzen vor allem bei Krankheiten, die auch von alleine wieder vergehen wie Magen-Darm-Erkrankungen. Das Wissen über Heilpflanzen ist in der Ebene geringer ausgeprägt, als in den beiden Bergdörfern. Gründe hierfür können jedoch nicht alleine in den geringeren pflanzlichen Ressourcen gesehen werden. Ein Wandel in der Landwirtschaft bezieht sich hauptsächlich auf die Anbauprodukte. Während traditionelle angepaßte Cerealien seltener angebaut werden, baut man viele Produkte für den Verkauf an. Die herausragende Stellung darunter nimmt die anspruchsvolle und arbeitsintensive Baumwolle ein. Die Auszahlungsmodalitäten der halbstaatlichen Baumwollgesellschaft kommen dabei den bäuerlichen Bedürfnissen am ehesten entgegen. Um den finanziellen Ansprüchen der Verwandtschaft zu entgehen werden kurzfristige Strategien zur Geldbeschaffung angenommen. Es zeigt sich also, dass die Ursachen von Degradation eher in dem Kulturwandel und einer zunehmenden Abhängigkeit der Bauern von Bareinkünften zu sehen ist als in der oft pauschal genannten Überbevölkerung. Zukünftige Forschungen über Biodiversität und Vegetationswandel sollten auch den Kulturwandel stärker berücksichtigen. Die Degradation zeigt sich in dem Untersuchungsgebiet mehr in der Verarmung der Böden als in einem Rückgang der Biodiversität. Obwohl schon historische Vegetationsbeschreibungen von einer starken Beeinträchtigung der vermuteten natürlichen Wälder sprechen, ist nicht davon auszugehen, dass sich die Vegetation in dem Untersuchungsgebiet die letzten 50 Jahre stark verändert hat. Das in nördlicheren Gebieten von der lokalen Bevölkerung beobachtete Verschwinden von Arten wird kategorisch verneint. Bei den genannten zurückgehenden Arten handelt es sich hauptsächlich um wichtige Nutzarten. Da hierzu historische Daten fehlen, kann es sich auch um selektive Wahrnehmung der Bauern handeln. Dennoch ist anzunehmen, dass sich in Zukunft die Degradationsphänomene verschlimmern werden. Da die Bargeldbedürfnisse der Bauern nicht mehr zurückzuschrauben sind und zudem die Experimentiefreudigkeit in der recht unsicheren Umweltsituation gering ist, muss auf bestehende Produkte zurückgegriffen werden, um sowohl diese Bargeldbedürfnisse zu befriedigen, als auch die Umwelt zu schonen. Eine Chance hierfür könnte eine Vermarktung von Fonio, wie bereits in Mali geschehen, darstellen. Dieses anspruchslose, noch auf sehr ausgelaugten Böden wachsende und zudem sehr nahrhafte und wohlschmeckende Getreide sollte wieder vermehrt angebaut werden und auf lange Sicht die anspruchsvolle und Boden auslaugende Baumwolle ersetzten. Dies ist jedoch nur möglich, wenn Fonio über internationale Strukturen auch in Europa und Amerika vermarktet wird. Eine weitere finanziell nicht ausgeschöpfte Ressource bieten die Mangobäume. In der Hochzeit der Mangoernte werden die Bäume vielfach nicht mehr abgeerntet, weil die Preise für die Früchte stark sinken. Die Früchte fallen dann meist Flughunden und Vögeln zum Opfer. Wie das Beispiel Burkina Faso zeigt, könnten diese Früchte getrocknet, zu Marmelade oder Saft verarbeitet werden und selbst in Europa in dieser haltbaren Form verkauft werden. Leider sind bislang die entsprechenden Initiativen und Strukturen dazu in Benin noch nicht geschaffen. Eine weitere, wenn auch langfristigere Möglichkeit wäre die Ersetzung der Baumwollfelder durch Cashjew-Pflanzungen. Diese werden von der Bevölkerung immer mehr angenommen. Dabei könnten neue Gehölzresourcen geschaffen und die Bodenfruchtbarkeit erhöht werden. Einige Initiativen von kleinen NGO's, die das Pflanzen von Bäumen befürworten, finden großen Anklang. Es muß nur eine Möglichkeit gefunden werden, solche Produkte auch international zu kommerzialisieren, um die Böden stark belastende und zudem arbeitsaufwendige Baumwolle zu ersetzten. Zudem sind Initiativen von einzelnen Dörfern in der Atakoraregion, Teile des Dorfgebietes unter Schutz zu stellen und damit Ressourcen und Wissen vor allem für die traditionelle Medizin zu sichern, ermutigend. Es zeigt, dass die lokale Bevölkerung Bedrohungen ihrer Umwelt ernst nimmt und versucht mit Hilfe von NGO's Gegenmaßnahmen zu schaffen. In diesem Hinblick wäre es wichtig, dass sich zukünftige Forschungen mehr den pharmazeutischen Inhaltsstoffen von Heilpflanzen widmen, so wie dies in Südamerika bereits geschieht. Dabei sollten jedoch die Rechte der autochtonen Bevölkerung gewahrt werden. Zudem wäre es wichtig, mehr über die Ökologie einzelner Gehölzpflanzen unter Berücksichtigung der jeweiligen Nutzungsverhältnisse zu kennen. Hierbei wäre es auch interessant über die Naturverjüngung ausgewählter Arten zu arbeiten. Zudem sollten Forscher, die über Degradationsprobleme arbeiten, vor allem in angewandten Bereichen, mehr auf die Erfahrungen der lokalen Bevölkerung hören und weniger scheinbar offensichtliche und populäre Theorien wie Überbevölkerung strapazieren. Dabei sollten auch vermehrt historische Quellen zu Rate gezogen werden, da es scheint, dass die westafrikanische Savanne nicht so degradiert ist, wie es oft behauptet wird und noch große Potentiale besitzt, wenn diese richtig genutzt werden. Abschließend sei bemerkt, dass, wenn man Berichte aus anderen afrikanischen Regionen hört und sieht, der Norden Benins als "Insel der Glückseeligen" betrachtet werden kann. Die politische Lage ist stabil, die Bevölkerung aufgeschlossen und freundlich, es gibt kaum Kriminalität, große Krankheitsepedemien sind in den letzten Jahren ausgeblieben, Hunger wird selten erlitten und auch die Umweltdegradation hält sich in Grenzen. Möge die hier vorliegende Arbeit dazu beitragen, diese Region und die Bétamaribè ein wenig mehr ins Bewußtsein der Öffentlichkeit bringen und ein wenig dazu beitragen, dass die Situation der Region und ihrer Bevölkerung sich nicht verschlechtert.
Die Mismatch-Reparatur (MMR) ist ein hochkonserviertes Kontroll- und Korrektursystem für die Erbinformation. Ihre Hauptaufgabe liegt in der Behebung von Kopierfehlern unmittelbar nach der Replikation (postreplikative Reparatur). Mutationen in Genen der Mismatch-Reparatur (vor allem in hMLH1 und hMSH2) führen beim Menschen zum "Erblichen nicht-polypösen kolorektalen Karzinom", HNPCC (Hereditary non-polyposis colorectal cancer). Diese Erbkrankheit geht mit einem gesteigerten Risiko einher, an verschiedenen Karzinomen, vor allem des Kolons, zu erkranken. Obwohl zumindest in Escherichia coli alle an der Mismatch-Reparatur beteiligten Proteine bekannt sind, ist ihr biochemischer Mechanismus nach wie vor ungeklärt. Es existieren drei verschiedene Modellvorstellungen zum Reparaturablauf: das Translocation model, das Sliding clamp model und das DNA bending model. Um einer Klärung des Reparaturmechanismus näherzukommen, sollten in dieser Arbeit die Bindungen der humanen Mismatch-Reparaturproteine an DNA und ihre Interaktionen untereinander näher untersucht werden. Im Zentrum stand dabei die Interaktion der heterodimeren ATPase hMutSa (hMSH2-hMSH6) mit den ebenfalls heterodimeren ATPasen hMutLa (hMLH1-hPMS2) und hMutLß (hMLH1-hPMS1). Die Hauptfunktion von hMutSa ist bekannt: das Dimer ist in der Lage, DNA-Paarungsfehler zu erkennen und an sie zu binden. Die Funktion von hMutLa liegt wahrscheinlich in der Weiterleitung des Signals "Fehler erkannt" von hMutSa an die Reparaturmaschinerie. Somit kommt der Interaktion von hMutSa mit hMutLa eine wesentliche Bedeutung in der Initiation der Reparatur zu. Die Funktion von hMutLß ist noch unbekannt. Zur Analyse der hMutSa-hMutL-Interaktion wurde eine neue Methodik entwickelt, bei der DNA-Substrate an magnetische Partikel gebunden, diese mit Proteinlösungen inkubiert und die gebundenen Proteine anschließend mit Salzlösungen eluiert wurden. Hierdurch konnten die Bindungsstärken anhand der Salzresistenz differenziert werden und die Bindungsreaktionen nach ATP-Zugabe bei verschiedenen DNA-Substraten verfolgt werden. Es konnte gezeigt werden, daß hMutSa zwar nicht quantitativ mehr, aber fester an DNA-Paarungsfehler band als an fehlerfreie DNA-Oligoduplices. Die Bindung reagierte empfindlich auf die Zugabe von ATP: auf Homoduplex-DNA bewirkte ATP unter geeigneten Bedingungen einen vollständigen Bindungsverlust von hMutSa, während es an Heteroduplex-DNA auch in Gegenwart des Nukleotidtriphosphates gebunden blieb. Eine weitere Wirkung von ATP bestand darin, daß hMutSa hMutLa und hMutLß rekrutierte. Dies geschah allerdings nur, wenn ausreichend lange DNA-Substrate (>= 81 Basenpaare) verwendet wurden. Für hMutLa konnte außerdem eine eigene DNA-Bindungsfähigkeit, und zwar vorzugsweise an Einzelstrang-DNA, nachgewiesen werden. Beide Ergebnisse zusammen genommen legen nahe, daß hMutSa und hMutLa nur interagieren können, wenn beide gleichzeitig an DNA gebunden sind. Obwohl nach bisherigen Erkenntnissen hMutLa, aber nicht hMutLß die Mismatch-Reparatur unterstützen kann, interagierte hMutLß ebensogut mit hMutSa. Dies läßt im Zusammenhang mit weiteren Ergebnissen vermuten, daß hMutLß eine modulierende Funktion in der MMR besitzen könnte. Alternativ könnte die hMutSa-hMutLß-Interaktion bei noch nicht charakterisierten anderen Prozessen von Bedeutung sein. Die weitere Untersuchung der Interaktion ergab, daß diese wahrscheinlich nicht von der ATP-Hydrolyse abhängt, sondern allein durch die Bindung des Nukleotidtriphosphates zustande kommt. Darüber hinaus spielen die ATPasen von hMutLa keine Rolle bei der Interaktion, da das Protein auch dann noch die Bindung einging, wenn seine Nukleotidbindungsstellen gezielt mutiert worden waren. Die Untersuchung zeigte außerdem, daß nur die hMutL-Untereinheiten hMLH1 und (in geringem Ausmaß) hPMS1 ATP-abhängig mit hMutSa interagierten, während hPMS2 alleine keine Bindung zeigte. Die sich daran anschließende Untersuchung von Fragmenten des hMLH1-Proteins erlaubte die Eingrenzung der Interaktionszone. hMutLa kontaktiert hMutSa demzufolge mit einem Proteinbereich, der innerhalb des N-Terminus von hMLH1 liegt. Zusammenfassend wird aufgrund der vorliegenden Ergebnisse für das DNA bending model der Mismatch-Reparatur plädiert. Dessen Reparaturablauf wird abschließend unter Berücksichtigung der vorliegenden Daten geschildert. In einem separaten Kapitel der Arbeit wird über die Identifizierung und Charakterisierung einer neuen Spleißmutation des humanen PTEN-Gens berichtet. Diese Mutation wurde bei einer Patientin mit dem Cowden-Syndrom, einem weiteren erblichen Krebssyndrom, nachgewiesen.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein kurzlebiges Gas, welches in biologischen Systemen verschiedene Funktionen übernehmen kann. Abhängig von der Konzentration ist NO ein zweischneidiges Schwert bezüglich seiner biologischen Effekte, da es in hohen Dosen proapoptotisch und in physiologischen Dosen anti-apoptotisch wirkt. Das von der eNOS in Endothelzellen gebildete NO ist ein wichtiger Faktor für die Gefäßrelaxation, ein antiinflammatorisches Molekül, ein zentraler Faktor für die Angiogenese und es inhibiert die Apoptose. Die reversible Modifikationen der Funktion von Zielproteinen durch S-Nitrosylierung ist ein Mechanismus, wie NO seine Effekte mediert. In den letzten Jahren sind eine Vielzahl von Zielproteinen entdeckt worden, deren Funktion durch S-Nitrosylierung modifiziert werden, die deutlich machen, dass S-Nitrosylierung die Funktion eines Signaltransduktionsmechanismus übernimmt. Da in humanen T-Zellen zum erstenmal auch eine Denitrosylierung beobachtet werden konnte, sollten in dieser Arbeit Mechanismen, die der Balance zwischen S-Nitrosylierung und Denitrosylierung zu Grunde liegen, untersucht werden. Dafür wurden zunächst Methoden zum Nachweis der S-Nitrosylierung etabliert. Zum einen zur Quantifizierung der S-Nitrosylierung in Endothelzellen der modifizierte Saville- Griess Assay und der DAN-Assay und zum anderen zur qualitativen Analyse der S-Nitrosylierung die biotin switch method. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch Stimulation der NO-Freisetzung mittels Applikation von laminarer Schubspannung der Gehalt an S-Nitrosylierung in HUVEC erhöht wird und auch die katalytische Untereinheit der Caspase-3 p17, ein bekanntes Zielprotein, verstärkt S-nitrosyliert wird. In einem in vitro Modell des Alterns konnte gezeigt werden, dass einhergehend mit der Reduktion der Proteinexpression der eNOS auch der Gehalt an S-Nitrosylierung, und damit die Bioverfügbarkeit von NO, reduziert ist. Nach Inkubation mit dem pro-apoptotischen TNFa und dem pro-atherogenen oxLDL konnte eine drastische Zunahme der Apoptosesensitivität von alternden HUVEC gegenüber diesen Stimuli beobachtet werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die zentrale Rolle der Bioverfügbarkeit von NO für das Überleben der Endothelzelle. Zusätzlich konnte eine Denitrosylierung nach Inkubation von Endothelzellen mit TNFa oder oxLDL nach 18 h nachgewiesen werden. Durch Analyse mittels der biotin switch method wurde deutlich, dass dabei nicht nur der Gesamtgehalt an S-nitrosylierten Molekülen reduziert wird, sondern auch spezifische Zielproteine in unterschiedlicher Stärke denitrosyliert werden. Diese Daten machen deutlich, dass es sich bei der S-Nitrosylierung um einen differentiell regulierten Signaltransduktionsmechanismus handelt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Strategie zur Identifizierung einer potentiellen Nitrosylase entwickelt, bei dem ein synthetisches, in vitro S-nitrosyliertes Peptid als Substrat verwendet wird. Weiterhin sollten neue Zielproteine für die S-Nitrosylierung identifiziert werden. Tatsächlich konnte ein neues Zielprotein für die S-Nitrosylierung, die Oxidoreduktase Thioredoxin identifiziert werden. Thioredoxin wird ubiquitär in Säugetierzellen exprimiert und ist ein essentieller Faktor für die Aufrechterhaltung des intrazellulären Redox-Status. Mit den Cysteinen an Position 32 und 35 besitzt Thioredoxin eine redox-regulatorische Domäne, die essentiell für seine Funktion als Oxidoreduktase ist. Neben seiner Funktion als Redox- Regulator, kann Thioredoxin Transkriptionsfaktoren wie z.B. NfK-B aktivieren und über die redox-regulatorische Domäne die pro-apoptotische Kinase ASK-1 binden und inhibieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Thioredoxin an Cystein 69 S-nitrosyliert wird und dass der Gehalt an S-nitrosylierten Molekülen von der Proteinexpression des Thioredoxin abhängt. Desweiteren ist die S-Nitrosylierung von Thioredoxin in Endothelzellen wichtig für die Entfaltung seiner vollständigen Reduktaseaktivität. Für die zum erstenmal in Endothelzellen gezeigte anti-apoptotische Funktion von Thioredoxin wird sowohl die S-Nitrosylierung an Cystein 69 als auch die redox-regulatorische Domäne benötigt. Durch diese Experimente konnte eine neue wichtige Funktion von Thioredoxin für NOproduzierende Zellen beschrieben werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die S-Nitrosylierung in Endothelzellen ein Signaltransduktionsmechanismus ist, der sowohl durch protektive, als auch durch pathophysiologische Stimuli spezifisch reguliert wird. Die weitere Charakterisierung dieser Vorgänge könnte einen tieferen Einblick in die Biologie und Funktion der Endothelzelle geben. Zusätzlich konnte durch das neue Zielprotein Thioredoxin die direkte Verknüpfung von NO mit dem Redox-Status der Zelle und die zentrale Rolle von Thioredoxin für den Gehalt an S-Nitrosylierung in Endothelzellen gezeigt werden. Identifizierung weiterer Regulationsmechanismen für die S-Nitrosylierung könnte ein genaueres Verständnis dieses Wirkmechanismus von NO und somit eine bessere Protektion des Endothelzellmonolayers in den Gefäßen ermöglichen.
Wolinella succinogenes reduziert Fumarat mit H2 oder Formiat als Elektronendonor. Der Elektronentransport wird von der membranständigen Hydrogenase oder Formiat-Dehydrogenase und der Fumarat-Reduktase katalysiert. Redoxmediator zwischen beiden Enzymen ist Menachinon. Der Elektronentransport ist mit der Erzeugung eines elektro-chemischen Protonenpotentials (Dp) gekoppelt. Ziel dieser Arbeit war, den Mechanismus der Dp-Entstehung durch Rekonstitution der gekoppelten Fumarat-Atmung in Liposomen aufzuklären. Aus Wolinella succinogenes isolierte Hydrogenase und Fumarat-Reduktase wurden in Liposomen eingebaut, die Menachinon enthielten. Die resultierenden Proteoliposomen kataly-sierten die Reduktion von Fumarat mit H2. Die Wechselzahl der Enzyme im Elektronentrans-port von H2 zu Fumarat war etwa 10 % von der in Bakterien. In den Proteoliposomen waren sowohl Hydrogenase als auch Fumarat-Reduktase ausschließlich nach außen orientiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Proteoliposomen sphärische Vesikel mit einem mittleren Außendurchmesser von 88 nm waren. Die Proteoliposomen enthielten statistisch 8,4 Hydrogenasemoleküle und 72 Fumarat-Reduktasemoleküle. Alle aktiven Enzymmoleküle waren in der Proteoliposomenmembran zufällig verteilt eingebaut und nahmen am Elektronentransport von H2 zu Fumarat teil. Der aus dem Protonenpermeabilitätskoeffizienten (PH = 8,1·10-3 cm·s-1) berechnete unspezifische Protonenfluß über die Proteoliposomenmembran war etwa 20mal langsamer als der durch den Elektronentransport von H2 zu Fumarat katalysierte Protonenfluß. Während der Fumarat-Reduktion mit H2 entstand ein elektrisches Protonenpotential über der Proteoliposomenmembran (Dø = -0,19 V; innen negativ), das die gleiche Richtung und Größe hatte wie das Dø während der Fumarat-Atmung in Zellen von W. succinogenes. Der H /e--Quotient für die Fumarat-Reduktion mit H2 war in Proteoliposomen in Gegenwart von Valinomycin und externem K etwa 1. Das gleiche Dø und der gleiche H /e--Quotient waren mit der Reduktion von 2,3-Dimethyl-1,4-naphthochinon (DMN) durch H2 verbunden, wenn die Proteoliposomen Menachinon und Hydrogenase mit oder ohne Fumarat-Reduktase enthielten. Proteoliposomen, die Menachinon und Fumarat-Reduktase mit oder ohne Hydrogenase enthielten, katalysierten die Reduktion von Fumarat durch DMNH2, die aber nicht mit der Entstehung von Dp gekoppelt war. Proteoliposomen, die Formiat-Dehydrogenase, Menachinon und Fumarat-Reduktase enthielten, katalysierten die Reduktion von Fumarat oder DMN durch Formiat. Beide Reaktionen erzeugten über der Proteoliposomenmembran ein Dø von -0,13 V (innen negativ). Der H /e--Quotient der Formiat-Oxidation durch Menachinon oder DMN war nahezu 1. Die Entstehung von Dø war von der Art des in die Proteoliposomen eingebauten Chinons abhängig. Während der Reduktion von DMN durch H2 entstand ein Dø, wenn die Proteoliposomenmembran Menachinon, Vitamin K2 oder das aus W. succinogenes isolierte Methylmenachinon enthielt. Proteoliposomen ohne Chinon oder mit Vitamin K1 erzeugten kein Dø während der DMN-Reduktion mit H2. Die Fumarat-Atmung mit H2 war nur in Gegenwart von Menachinon oder Vitamin K2 mit der Entstehung von Dø gekoppelt. In dieser Arbeit wurde erstmals die gekoppelte Fumarat-Atmung mit aus W. succinongenes isolierten Elektronentransportenzymen in Lipsomen rekonstituiert. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass das durch die Fumarat-Atmung erzeugt Dp ausschließlich durch die Menachinon-Reduktion mit H2 oder Formiat entsteht, während die Menachinol-Oxidation mit Fumarat ein elektroneutraler Prozeß ist.
Der weltweiten Ausbreitung des humanen Immundefizienzvirus versucht man neben der Entwicklung eines präventiven HIV-Impfstoffes auch durch die Verbesserung der chemotherapeutischen Behandlung HIV-Infizierter entgegen zu wirken. Die hochwirksame antiretrovirale Kombinationsstherapie (HAART) hat neben der Anzahl der opportunistischen Infektionen und AIDS-bedingten Todesfälle auch die Viruslast in vielen HIV-Infizierten über einen langen Zeitraum unterhalb der Detektionsgrenze senken können. Es sind daher neben den klassischen Verlaufsmarkern wie der Viruslast und der Anzahl der CD4 T-Zellen neue Surrogatmarker zur Beurteilung der Effizienz der antiretroviralen Therapie notwendig. Der Einfluss der Viruslast auf den CD8 T-Zellaktivierungsstatus während der antiretroviralen Therapie zeigte sich durch den Vergleich von HAART-Respondern und den durch eine hohe Viruslast infolge eines Therapie-Versagens gekennzeichneten HAART-Non-Respondern. Die Beobachtung einer signifikant erhöhten Anzahl an basal, d.h. ohne vorangegangene in vitro Stimulation, aktivierten CD8 CD69 T-Zellen bei HAART-Non-Respondern (p = 0,0049) konnte die Rolle des T-Zell-Aktivierungsstatus als Marker der verbleibenden Viruslast unter HAART nachweisen. Um das Potential der von CD8 T-Zellen sezernierten HIVsupprimierenden ß-Chemokinen und IL-16 als HAART-begleitende Surrogatmarker zu untersuchen, wurde die Expression von MIP-1a, MIP-1ß und RANTES sowie des Lymphokins IL-16 im Serum und im Zellkulturüberstand aktivierter CD8 T-Zellen untersucht. Für HAART-Non-Responder konnte im Zellkulturüberstand von in vitro stimulierten CD8 TZellen eine signifikante Erhöhung der IL-16-Expression (p = 0,0077) und eine erhöhte Expression von MIP-1a im Vergleich zu HAART-Respondern gezeigt werden. Darüber hinaus wurde eine signifikant erhöhte MIP-1ß-Serumkonzentration bei HAART-Non- Respondern (p = 0,0175) nachgewiesen, die mit einer erhöhten Anzahl aktivierter CD8 CD69 T-Zellen assoziiert war. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte somit gezeigt werden, dass neben MIP-1a, vor allem das ß-Chemokin MIP-1ß und das Lymphokin IL-16 vielversprechende Surrogatmarker zur Beurteilung der Effizienz der antiretroviralen Therapie darstellen, die als sensitive therapiebegleitende Marker die rechtzeitige therapeutische Intervention vor einem signifikanten Anstieg der Viruslast ermöglichen könnten. Da trotz der intensiven Entwicklung und Verbesserung antiretroviral wirkender Therapeutika die vollständige Elimination des HI-Virus bislang nicht möglich ist, wurde in den vergangenen Jahren konzentriert an der Entwicklung neuer Impfstoffstrategien gearbeitet. Eine durch einen Impfstoff induzierte protektive Immunantwort gegen HIV sollte vor allem gegen Strukturproteine, sowie gegen die regulatorischen Proteine Tat und Rev gerichtet sein. Mit einem MLV-abgeleiteten Transfervektor für die SHIV-Gene tat, rev und env wurde in dieser Arbeit das immunogene Potential zur Induktion einer humoralen und zellulären Immunantwort im Rhesusaffen-Tiermodell untersucht. Durch die Etablierung einer stabilen Verpackungszellinie für den Transfervektor pMgDenv/tat/rev/Dlngfr konnte der effiziente Gentransfer in CD4 T-Zellen mittels [MLV(SHIV)]-Pseudotypvektoren gezeigt werden. Durch Optimierung der Transduktionsbedingungen konnte ein Transduktionstiter von 1-2 x 107 i.E./ml in primäre Rhesus-Lymphozyten erreicht werden. Um das immunogene Potential dieser HIV-Antigen-exprimierenden Zellen in vivo zu untersuchen, wurden in einer Immunisierungsstudie 0,7 - 3,4 x 107 Transfergen-positive PBMC in 3 aufeinander folgenden Transplantationen in einen Rhesusaffen reinfundiert. Die transplantierten Zellen waren nach der 3. Applikation bis zu 7 Tage nach Transplantation in vivo mittels PCR detektierbar. Eine HIV-gp120-spezifische Antikörperantwort konnte fünf Wochen nach der ersten bzw. zwei Wochen nach der letzten Immunisierung nachgewiesen werden. In einem ELIspot-Assay konnte erfolgreich die Induktion einer HIV-1-Env- und Rev-spezifischen CTL-Antwort in den nach 7,5 bzw. 10 Wochen nach der letzten Immunisierung entnommenen PBMCs nachgewiesen werden. Interessanterweise zeigten Sequenzanalysen, dass die induzierte CTL-Aktivität gegen die für einen effizienten Schutz bedeutenden Determinanten des HIV-1- Hüllproteins, gegen die variable Domäne des gp120 als auch gegen die CD4- Bindungsregion gerichtet war. In dieser Immunisierungsstudie war es somit erstmals möglich, durch die Transplantation autologer HIV-Antigen-exprimierender CD4 T-Zellen eine spezifische humorale wie auch zelluläre Immunantwort in vivo zu induzieren.
Die analytische Ultrazentrifuge ist ein unverzichtbares Instrument zur Charakterisierung von schwachen Protein-Protein-Wechselwirkungen und deren funktioneller oder regulatorischer Bedeutung. Eine besondere Gruppe von Untersuchungsobjekten bilden die integralen Membranproteine, die für eine Ultrazentrifugenanalyse solubilisiert, d.h. aus ihrer natürlichen, hydrophoben Umgebung in wäßriges Milieu überführt werden müssen. Diese Aufgabe wird vom Standpunkt der Erhaltung des natürlichen Proteinzustands am besten von nichtionischen Detergenzien erfüllt, wobei das biochemisch optimale Detergens von Protein zu Protein i.A. verschieden ist. Die notwendige Anwesenheit von Detergens während der Zentrifugenanalyse belastet diese andererseits, da freies wie proteingebundenes Detergens zusätzliche unbekannte Größen darstellen. Diese Unbekannten können durch experimentelle Gleichsetzung von Detergensdichte und Lösungsdichte eliminiert werden (Dichtekompensation). Die Möglichkeiten der etablierten Dichtekompensationsverfahren sind allerdings beschränkt, insbesondere Detergenzien mit hoher Dichte sind damit nicht erfaßbar - ein Mangel, der manche Untersuchung be- oder verhindert. Aus diesem Grund wurden neue Dichtekompensationsverfahren entwickelt und bestehende verbessert bzw. erweitert: zum einen die Erhöhung der Lösungsdichte durch Zusatz von Saccharose, Glyzerin oder einer Saccharose-D2O-Kombination, zum anderen die Anpassung der Detergensdichte durch Mischen von Detergenzien mit niedriger und mit hoher Dichte. Die neuen Verfahren wurden überprüft, indem ein integrales Membranprotein mit bekannten Eigenschaften, Cytochrom c-Oxidase von Paracoccus denitrificans, unter Anwendung sowohl der neuen Verfahren als auch der etablierten D2O-Methode im Sedimentationsgleichgewicht analysiert wurde. Der Vergleich der Ergebnisse zeigte zum einen die Äquivalenz der verschiedenen Methoden im Falle der Kompensation von Detergensdichten, die auf herkömmliche Weise kompensierbar sind, zum andern, daß nach Kompensation deutlich höherer Dichten das partialspezifische Volumen des Proteins zu korrigieren ist. Eine derartige Korrektur wurde nötig beim Vorhaben, den oligomeren Zustand des Cytochrom bc1-Komplexes von Paracoccus denitrificans zu bestimmen, da dieses Atmungskettenenzym nur in Gegenwart von DDM, einem Detergens mit hoher Dichte, stabil war. Die Unsicherheit, die sich aus der via Vergleich mit Cytochrom c-Oxidase durchgeführten Korrektur ergab, war nicht relevant, da sich der intakte bc1-Komplex in DDM-Lösung als einheitliche Substanz erwies und er damit ein "einfaches" Problem darstellte. Die Sedimentationsgleichgewichtsuntersuchung des Proteins unter der Bedingung der Dichtekompensation ergab nach Berücksichtigung des Korrekturterms, daß der solubilisierte, enzymatisch aktive bc1-Komplex als Dimer vorliegt. Dieses Ergebnis korreliert mit der aktuellen Vorstellung von der Funktionsweise des Enzyms, derzufolge die dimere Form für den Elektronentransfer notwendig ist. Komplizierter als der oligomere Zustand des bc1-Komplexes ist offenbar das Selbstassoziationsverhalten des Bande 3-Proteins, des Anionenaustauschers aus der menschlichen Erythrozytenmembran: Entgegen der vorherrschenden Meinung, eine in Detergenslösung vorliegende intakte Bande 3 bilde stabile Dimere, weisen die vorliegenden Ergebnisse darauf hin, daß das solubilisierte Protein aus mehreren Oligomeren besteht. So zeigen die vorhandenen Daten neben dimerer Bande 3 die Existenz von monomerem und tetramerem Protein, letztere Form vermutlich in unterschiedlichen Zuständen, und verweisen auf ein Assoziationsgleichgewicht zwischen den Oligomeren, vermutlich überlagert durch stabiles Dimer. Letzteres erscheint als "Grenzfall" eines Bande 3-Präparats, der nach langer Lagerung und/ oder nach suboptimaler Behandlung eintritt. Wegen der Komplexität des Bande 3-Verhaltens konnten die Zentrifugenuntersuchungen nur in Gegenwart von Detergenzien durchgeführt werden, deren Dichte eine Kompensation ohne Korrekturbedarf zuläßt. Darüber hinaus kamen wegen der offensichtlichen Empfindlichkeit der Bande 3 nur sehr milde Detergenzien zum Einsatz: C12E9 und Triton X-100 (reduzierte Form). Aus selbigem Grund wurde die Detergensdichte bevorzugt mit Saccharose oder Glyzerin kompensiert, deren proteinstabilisierende Wirkung bekannt ist.
Für viele pädiatrische Patienten mit Leukämie ist die Durchführung einer Hoch-Dosis- Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation oft die einzige Möglichkeit die Heilungsrate zu verbessern. Die Eliminierung der residualen leukämischen Blasten basiert einerseits auf der Konditionierung mit hoch-aggressiver Chemotherapie. Andererseits ist sie auf immunologische Reaktionen zwischen immunkompetenten Zellen, die entweder in dem Transplantat enthalten sind, oder aus diesem neu entstehen und den verbliebenen leukämischen Blasten zurückzuführen. Diese immunologische Interaktion wird auch als Graftversus- Leukämie-Reaktion (GVL) bezeichnet und hauptsächlich von T-und NK-Zellen vermittelt. Trotz zunächst erfolgreicher allogener Transplantation erleidet ein beträchtlicher Anteil der Patienten ein Rezidiv. Während ein offenes Rezidiv oft nicht mehr behandelbar ist, können Patienten mit drohendem Rezidiv oder minimaler Resterkrankung (MRD) durch Infusion immunkompetenter Zellen des Spenders, sogenannte Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI), teilweise erfolgreich behandelt werden. Die Behandlung mit DLI ist limitiert durch die Graft-versus-host-disease (GVHD), eine mit zum Teil schweren Komplikationen verbundene Reaktion, die potentiell tödlich verlaufen kann. Die gentechnische Veränderung der alloreaktiven Zellen mit einem Suizidgen ermöglicht eine kontrollierte, spezifische Eliminierung dieser Zellen im Falle einer GVHD Entwicklung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene retrovirale Selektions/Suizid- Fusionsvektoren für die Transduktion von Spender T-Zellen im Kontext einer DLI entwickelt. Beide Selektions/Suizid-Fusionselemente wurden in einem für die Transduktion in T-Zellen optimierten retroviralen Vektor generiert. Die Selektionsmarker waren so gewählt, dass eine Anreicherung der Transgen-positiven Zellen über eine immunomagnetische Selektion möglich war. Ein Vektor kodierte für ein Fusionsmolekül aus dem zytoplasmatisch trunkierten humanen CD34-Oberflächenmarker (tCD34) und der Zellzyklus-abhängigen GCV-hypersensitiven HSVtk39 (Herpes-simplex Virus I Thymidin Kinase) Mutante. Durch GCV-Applikation konnte in den transduzierten, tCD34/HSV-tk39 exprimierenden Zellen spezifisch die Apoptose induziert werden. Der zweite Vektor wurde so konstruiert, dass ein Fusionsprotein aus dem humanen DLNGFR-Oberflächenmarker und der Zellzyklus-unabhängigen death-effector-domain (DED) des humanen FADD (Fas-associated-protein with death domain) Moleküls entstand. Über zwei zwischengeschaltete FKBP (FK506-binding protein) Domänen wurden die beiden Elemente miteinander fusioniert. In DLNGFR/Fv'Fv/DED-exprimierenden Zellen konnte die Apoptose durch die Applikation eines spezifisch an die beiden FKBP-Domänen bindenden synthetischen Substrats (AP20187), das die Dimerisierung des DED-Moleküls induzierte, ausgelöst werden. Durchflusszytometrische Analysen von transduzierten und selektierten humanen primären TZellen zeigten, dass beide Fusions-Transgene korrekt in den Zielzellen exprimiert wurden. Die spezifische Induktion der Apoptose durch Aktivierung des jeweiligen Suizidmoleküls wurde in Funktionalitätstestungen nachgewiesen. Beide Fusionsmoleküle vermittelten eine effiziente Eliminierung der transduzierten Zellen (90 %-98 %). In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die beiden Suizidmechanismen einer unterschiedlichen Kinetik unterlagen. Während die DED-induzierte Apoptose sehr schnell auf die Applikation des Suizidaktivators folgte, vermittelte der HSV-tk39 Mechanismus eine deutlich langsamere aber etwas effizientere Eliminierung der Zellen. Erste Untersuchungen einer Kombination beider Fusionsmoleküle deuten auf einen additiven/synergistischen Effekt hin, der zu einer schnellen und effizienten Eliminierung der Zellen führt (>=99 %). Zur Zeit stellt die Strategie der Suizidgen-transduzierten T-Zellen die am vielversprechendste Methode zur Kontrolle einer GVHD-Reaktion dar. Die hier entwickelten Vektoren ermöglichen eine effiziente, kontrollierte Eliminierung der Zellen und bieten Potential zur Weiterentwicklung einer optimierten Strategie.
An der chemischen Synapse des Nervensystems führt ein präsynaptisches Aktionspotential zur Freisetzung eines Neurotransmitters, der über den synaptischen Spalt diffundiert und an die Rezeptoren der postsynaptischen Membran bindet. Die ionotropen Rezeptoren sind an dieser Membran zu Clustern aggregiert. Entstehung und Dynamik dieser Rezeptoraggregate sind für Funktion und Plastizität der Synapse essentiell. Für die Aggregation der inhibitorischen Glyzin- und der meisten Subtypen der GABAA-Rezeptoren ist das periphere Membranprotein Gephyrin notwendig. Es ist ein Schlüsselfaktor für die Genese und Aufrechterhaltung der glyzinergen postsynaptischen Membran. Dabei bindet es direkt an den GlyR und verbindet diesen über die Bindung von Mikrotubulie an das Zytoskelett. Auch andere Bindungspartner wurden nachgewiesen. Gephyrin ist in einer zweiten Funktion in die Synthese des Molybdän-Cofaktors involviert und weist Sequnezhomologien zu Proteinen anderer Spezies auf, die in diesen Syntheseweg eingebunden sind. Gephyrin ist ubiquitär exprimiert und wird alternativ gespleißt. Möglicherweise existieren verschiedene Varianten mit unterschiedlichen Funktionen. Die Untersuchung der Domänen und Bindungseigenschaften Gephyrins ist daher für das weitere Verständnis über Aufbau und Funktion der Synapse unerlässlich. In dieser Arbeit wurde ein Testsystem etabliert, mit dem sowohl heterolog exprimiertes als auch natives Gephyrin über die hoch-affine Bindung an den GlyR aufgereinigt werden konnte. Mit diesem System konnten erstmals unterschiedliche Varianten Gephyrins nachgewiesen werden. In verschiedenen Organen der adulten Ratte wurden dabei Gephyrinmoleküle mit Molekulargewichten zwischen 52 und den bekannten 93 kDA identifiziert. Auch Bestandteile des GlyR-Komplexes lassen sich mit dieser Methode anreichern. So wurde gezeigt, daß Gephyrin und Collybistin in einem trimeren Komplex mit dem GlyR vorliegen können. Hiermit ist es künftig möglich, in einem proteomischen Ansatz weitere aus dem GlyR-Konmplex anzureichern und zu identifizieren. Mit dem gleichen System wurde auch die Bindungsregion Gephyrins für den GlyR gefunden. Diese diskontinuierliche Bindungsstelle wird aus einer a-Helix der Aminosäuren 164 bis 184, sowie aus hydrophoben Resten gebildet, die von Aminosäure 15 bis 163 unregelmäßig über den gesamten N-Terminus Gephyrins verteilt sind. Zur Bindung an den GlyR werden beide Elemente benötigt. Das kleinste GlyR-bindende Gephyrinfragment erstreckt sich somit über die Aminosäuren 1-184. Mit einem Kosedimentationsassay wurde die Bindung Gephyrins an Mikrotubuli untersucht. Es stellte sich heraus, daß die vermutete Bindungsstelle nicht zur Bindung an Mikrotubuli benötigt wird. Vielmehr ist der C-terminale Abschnitt Gephyrins hierzu ausreichend. Um Regionen Gephyrins zu finden, die die Autoaggregation vermitteln, wurden Bindungsstudien mit dem Zwei-Hybrid-System und ein heterologes Expressionssystem in Zellkulturen durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß sowohl die N- als auch der C-terminal gelegene Bereich in der Lage sind, mit Gephyrin zu aggregieren. Im C-Terminus wurde die Domäne auf 62 Aminosäuren eingegrenzt. Zur Erfüllung der verschiedenen Funktionen Gephyrins sind die hierfür notwendigen Domänen offensichtlich in modularer Art organisiert. So lässt sich durch alternatives Spleißen eine Variante exprimieren, die den speziellen Erfordernissen der Zelle gerecht wird. In dieser Arbeit wurden mehrere Domänen und Regionen Gephyrins eingegrenzt, deren Aufgaben von der GlyR-Bindung über die Autoaggregation zur Bildung glyzinerger Proteinkomplexe und der Verknüpfung mit dem Zytoskelett reichen. Somit konnte ein Beitrag zum weiteren Verständnis über die glyzinerge Synapse geleistet werden.
Fourier-Transform Infrarot Differenz Spektroskopie ist eine Methode. die es erlaubt, selbst kleinste konformelle Änderungen in der Umgebung der katalytischen Zentren in Enzymen selektiv und mit hoher Zeitauflösung zu messen. Diese Technik wurde an Oxidasen von Paracoccus denitrificans, Thermus thermophilus und Escherichia coli angewandt, um einen Einblick in strukturelle und molekulare Prozesse der Bindung und Dynamik von Liganden am binuklearen Zentrum zu erhalten. Die pH- und Temperatur-Abhängigkeit von CO Schwingungsmoden sowie deren Verhalten nach der Photolyse konnten zeitaufgelöst untersucht und miteinander verglichen werden. Bei Temperaturen >180K war die Bestimmung von thermodynamischen Parametern wie Enthalpie-Barrieren und Arrhenius-Vorfaktoren möglich. Aus dem Verlauf der Rückbindungskinetiken ließen sich ferner Rückschlüsse über die konformelle Heterogenität der Bindung ziehen. Für Temperaturen um 140K konnte das Protein im "quasistationären" Zustand vermessen werden, da Rückreaktionen des Liganden an die Bindungsstelle des Häm a3 unterbunden waren. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit und analoger Funktion zeigten diese typischen Oxidasen große Unterschiede sowohl im Reaktionszentrum als auch im kinetischen Verhalten des Liganden. Die kinetischen Parameter für alle untersuchten Oxidasen weichen deutlich voneinander ab und spiegeln unter anderem die Stärke der Bindung am CUB wider. Die Temperaturabhängigkeit der Populationen der CO-Konformere und die äquivalente Rückbindungs-Kinetik der unterschiedlichen Konformere in den Oxidasen aus dem thermophilen System weisen auf ein strukturelles Merkmal in der Nähe des binuklearen Zentrums hin, das den Populations-Austausch in anderen Oxidasen unterbindet. Aufgrund der pH-Abhängigkeit der entsprechenden Oxidasen kann man schließen, daß diese Eigenschaft durch eine oder mehrere protonierbare Gruppen bewirkt wird, die die unterschiedlichen Konformere in bestimmten Positionen fixiert hält. Die Rückbindungsraten des Liganden zeigen für die T. thermophilus Oxidasen eine Rückbindung erster Ordnung. was auf eine homogene Verteilung der zwei Konformer-Populationen im Enzym deutet. Hingegen zeigte die Oxidase aus P. denitrificans für die Rückbindung eine Verteilung der Reaktionsraten. Ursache dafür ist ein sehr heterogenes Ensemble an Proteinen, das minimale strukturelle Unterschiede im Konformationsraum des Reaktionszentrums aufweist. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war die Beobachtung von Absorptionsbanden der Hämpropionate an Cytochrome c Oxidase von Paracoccus denitrificans nach CO Rückbindung. Sowohl über 13C-isotopenmarkierte Hämpropionate als auch über ortsgerichtete Mutagenese in deren unmittelbarer Umgebung konnten definierte Banden-Zuordnungen im IR-Differenzspektrum erhalten werden. Experimente am Enzym mit Mutationen an der Stelle Asp 399 zeigten, daß die strukturellen Eigenschaften des Häm a3-CuB Zentrums im wesentlichen von dieser Veränderung nicht beeinflußt werden. Jedoch war die pH-Abhängigkeit der CO Konformere hier unterbunden, was auf deren Einfluß auf eine Protonierbarkeit im Wildtyp-Enzym hinweist. Rückschlüsse anhand der Mutante Asp399Asn zeigten (über den Verlust der pH-Abhängigkeit) ganz klar, daß alle unterschiedlichen CO-Konformere funktionell intakt sind. FT-IR Messungen an einem weiteren Enzym, der isolierten Cytochrom bd Oxidase aus E. coli, zeigten bei einer Untersuchung der CO Rückbindungs-Eigenschaften bei 84K die ausschließliche Rückbindung an das Häm d. der möglichen Sauerstoff-Bindungsstelle. Die Bindungsstelle an Häm b, die zu ca. 5% ebenfalls CO bindet, kann bei diesen Temperaturen nicht wiederbesetzt werden. Im typischen Spektralbereich von 1680 bis 1760 cm hoch minus 1 konnten eindeutig die Absorptionsbanden von Asparagin- oder Glutaminsäure-Seitenketten identifiziert werden. Über einen direkten Vergleich der Spektren, die über Redox-Reaktion und CO Rückbindung erhalten wurden, konnten diese Signale als klar in der direkten Umgebung des binuklearen Zentrums lokalisiert zugeordnet werden. Eine Rolle als vorübergehender Protonen-Akzeptor/Donor auf dem Weg zur Sauerstoff-Bindungsstelle ist naheliegend.
Optoelektronische THz-Systeme finden seit 1995 Anwendung in der Bildgebung. Alle bisherigen Systeme basieren dabei auf gepulsten Femtosekunden-Laserquellen und emittieren gepulste, breitbandige THz-Strahlung. In dieser Arbeit wird erstmals ein bildgebendes optoelektronisches Dauerstrich-THz-Svstem auf Basis von Photomischern als Emitter und Detektor vorgestellt. Zur Optimierung des Systems wurden im Rahmen dieser Arbeit die einzelnen Komponenten detailliert untersucht und insbesondere ihre Wechselwirkung im Rahmen einer Systembetrachtung analysiert. Für den Laborbetrieb wurde ein Zweifarben-Ti:Saphir-Laser entwickelt, der es ermöglicht, die beiden zu mischenden nah-infraroten Frequenzen in einem Verstärkermedium zu generieren. Für das bildgebende System wurde der Laser in unidirektionaler Ringkonfiguration mit zwei sich im Laserkristall kreuzenden Resonatoren verwendet. Zur Optimierung der als THz-Emitter verwendeten Photomischer wurde die generierte THz-Leistung von schnellen Photoschaltern basierend auf bei unterschiedlichen Temperaturen gewachsenem LT-GaAs gemessen. Es zeigt sich, dass neben der Ladungsträgereinfangzeit auch die effektive Ladungsträgermobilität mit der Wachstumstemperatur variiert. Sie nimmt zu höheren Wachstumstemperaturen hin ab. Für eine gegebene THz-Zielfrequenz muss das LT-GaAs Material so gewählt werden, dass es eine optimale elektrische Effizienz aufweist. Die so optimierten Photoschalter müssen in eine resonante Antennenstruktur eingebettet werden, um eine optimale THz-Abstrahlung zu ermöglichen. Je nach Anwendung kann die Antennenstruktur entweder breitbandig (d.h. breiter Abstimmbereich) mit vergleichsweise niedriger Abstrahlungseffizienz oder schmalbandig mit hoher Abstrahlungseffizienz gewählt werden. Das Schlüsselproblem beim Entwurf effizienter Photomischer ist jedoch die Fehlanpassung zwischen der Impedanz des Photoschalters und der Eingangsimpedanz der Antenne, die nur durch die Wahl einer geeigneten Antenne verbessert werden kann. Eine der ungeklärten Fragen bei der Entwicklung von leistungsfähigen Photomischern auf LT-GaAs-Basis für Dauerstrich- und hochrepetierlichen Pulsbetrieb war bisher der Einfluss der Feldabschirmung im Photoschalter. Zur Untersuchung des lokalen Feldes und seiner Abschirmung wurde ein zeitaufgelöstes Doppelpulsexperiment durchgeführt. Das beobachtete Abschirmverhalten ist, entgegen allen bisherigen Aussagen, nicht auf die Abschirmung durch Raumladungen. sondern auf die Abschirmung durch das elektrische THz-Strahlungsfeld (Nahfeld) zurückzuführen.
Das Adenokarzinom des Pankreas ist das fünfthäufigste Malignom der westlichen Länder mit einer sehr schlechten Prognose. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ist das Pankreaskarzinom wegen der frühen lokalen Infiltration und Metastasierung meist nicht mehr kurativ behandelbar. 80 % aller Pankreaskarzinome werden in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium diagnostiziert. Die Therapie des fortgeschrittenen Pankreaskarzinoms gestaltet sich problematisch. Bislang führten systemische chemotherapeutische Ansätze nicht zur erhofften Verlängerung der Lebenszeit. In der vorliegenden Phase II Studie wurden in der Abteilung für Allgemein- und Gefäßchirurgie der Universitätsklinik Frankfurt am Main 17 Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem Pankreaskarzinom mit einer regional/systemischen Kombinationschemotherapie behandelt. Ein Therapiezyklus bestand aus einer 3ominütigen intraarteriellen Infusion von 8,5 mg/m2 Mitomycin C und aus einer 60minütigen intraarteriellen Infusion von 500 mg/m² Gemcitabine über einen transfemoralen Truncuskatheter an den Tagen 1 und 22, gefolgt von einer systemischen lnfusion von 500 mg/rn² Gemcitabine über 30 Minuten an den Tagen 8, 15, 29 und 36. Die Komhinationschemotherapie war nebenwirkungs- und komplikationsarm. Schwere Nebenwirkungen im NCI-Stadium III/IV wurden im Verlauf von 37 Therapiezyklen mit 74 regionalen Applikationen und 148 systemischen Applikationen in 9 % der Applikationen als Beeinträchtigung der Knochenmarksfunktion (Leukopenie, Thrombopenie und Hämoglobinabfall) und in 15 % der Applikationen als Leberfunktionsstörungen (Erhöhung von Transaminasen, alkalischer Phosphatase und Bilirubin) beobachtet. Die Nebenwirkungen nach regionalen Therapien waren mit den Nebenwirkungen nach venösen Therapien vergleichbar. Kein Patient verstarb an den Folgen einer Nebenwirkung. Ein Patient erlitt nach einer regionalen Chemotherapie einen kompletten Verschluß der Arteria iliaca externa sinistra. Der Therapieerfolg wurde anhand von Computertomographien (CT) und Tumormarker CA 19-9 Bestimmungen nach jedem Chemotherapiezyklus beobachtet und gemäß den WHO-Kriterien beurteilt. Nach CT-Kriterien zeigten vier Patienten eine Regression. Eine komplette Remission wurde bei einer Patientin, eine partielle Remission bei drei Patienten beobachtet. Eine radiologische Remissionsrate von 24 % konnte errechnet werden. Bei fünf Patienten ließ sich unter Therapie keine Größenzunahme des Tumors erkennen (Stable disease). Das Tumorwachstum war bei neun Patienten progredient. Bei sieben Patienten konnte unter Therapie ein Tumormarkerrückgang von mehr als 50 % evaluiert werden (Remissionsrate 41%). Insgesamt zeigten sich zwei komplette Remissionen mit Sinken des Tumormarkers CA 19-9 in den Referenzbereich, d.h. unter 37 µg/ml, und fünf partielle Remissionen. Bei fünf Patienten war der Verlauf des Tumormarkers CA 19-9 unter Therapie stabil (Stable disease). Der Tumormarker CA 19-9 stieg progredient bei fünf Patienten. Das mediane Überleben nach der Kombinationschemotherapie betrug 9,1 Monate (95 % CI: 6-12 Monate). Das mediane Überleben war für Patienten ohne Fernmetastasen (n = 7) mit 15 Monaten (95 % CI: 3-23 Monate) signifikant (p = 0,037) länger als für Patienten mit Fernmetastasen (n = 10) mit 6,3 Monaten (95 % CI: 4,6-12 Monate). Die mediane progressionsfreie Zeit während der Kombinationschemotherapie betrug 4,6 Monate (95 % CI: 2,1-8,7 Monate). Das radiologische Ansprechen (24 %) und die mediane Überlebenszeit (9,1 Monate) dieser regional/systemischen Kombinationschemotherapie waren im Vergleich zu systemischen Standardchemotherapien mit Gemcitabine, die radiologische Remissionsraten von 6,3 % bis 12 % und mediane Überlebenszeiten von 4,8 bis 6,6 Monaten zeigten, erhöht. Die Studie wird aufgrund ihres hohen klinischen Nutzens weiter fortgesetzt. Eine randomisierte Phase III Studie, die die vorliegende regional/systemische Kombinationschemotherapie (Mitomycin C 8,5 mg/m2 Gemcitabine 500 mg/m2) mit dem systemischen Standardverfahren (Gemcitabine 1000 mg/m2) vergleicht, wird angestrebt.
Optimierte Labordiagnostik zum Nachweis einer Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) Typ II
(2002)
Es ist bekannt, dass nicht alle Patienten, die sich unter einer Heparintherapie nachweislich gegen Heparin/PF4-Komplex immunisieren, das klinische Bild einer Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) Typ II entwickeln, wenngleich Heparin/PF4-Antikörper ursächlich für diese schwerwiegende Nebenwirkung angeschuldigt werden. Es ist davon auszugehen, dass in Abhängigkeit von der Grunderkrankung der Anteil der Patienten mit Heparin/PF4-Antikörpern, der keine Klinik entwickelt, relativ groß ist. Da die bisher entwickelten Testsysteme auf dem Nachweis von Heparin/PF4-Antikörpern beruhen, wirkt sich dieses Phänomen nachteilig auf die Testspezifität aus. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche der Immunglobulinklassen der HITspezifischen Antikörper für die Auslösung einer HIT Typ II von Bedeutung sind, und inwieweit die isolierte Bestimmung einer der Immunglobulinklassen IgG, IgM und IgA in der Lage ist, die Aussagekraft eines immunologischen Testsystems zu verbessern. Hierzu wurden Patienten, bei denen Heparin/PF4-Antikörper nachweisbar waren, nach klinischen Kriterien in drei verschiedene Gruppen unterteilt und bezüglich der Immunglobulinklassen verglichen. In Gruppe I wurden Patienten zusammengefasst, bei denen sich der klinische Verdacht einer HIT Typ II labordiagnostisch durch Heparin/PF4-Antikörpernachweis bestätigte, und die als besonderes Kriterium thromboembolische Komplikationen entwickelten. Patienten mit einer isolierten Heparin-induzierten Thrombozytopenie und positivem Antikörpernachweis aber ohne thromboembolische Komplikationen wurden als Gruppe II unterschieden. Durch die getrennte Beobachtung dieser beiden Patientengruppen sollte der prädiktive Wert der Immunglobulinklassen für die Entwicklung von Thrombosen unter HIT Typ II untersucht werden. Verglichen wurden diese beiden Gruppen mit einer dritten Gruppe von selektierten Patienten aus einer prospektiven Studie. Die eingeschlossenen gefäßchirurgischen Patienten aus dieser Studie mussten die Kriterien "positiver Heparin/PF4-Antikörpernachweis während Heparintherapie" und "keine klinischen Zeichen einer Heparin-induzierten Thrombozytopenie Typ II" erfüllen. In dieser Arbeit wurde weiter untersucht, welche der Immunglobulinklasse IgG, IgM und IgA am besten zwischen Patienten mit positiven Heparin/PF4-Antikörpern mit und ohne typischer "HIT-Klinik" unterscheiden kann. Die Bestimmung der Immunglobulinklassen erfolgte zum Zeitpunkt des akuten thrombozytopenischen Geschehens, bzw. bei den asymptomatischen Patienten in einem Zeitfenster von 5 bis 20 Tagen nach Therapiebeginn mit einer ELISA-Methode nach Amiral et al. (1991). Parallel zu den immunologischen Untersuchungen wurde ein etablierter, funktioneller Test, der Heparin-induzierte Plättchenaktivierungstest (HIPA) von Greinacher et al. (1991) bei allen Patienten angewandt. Es kam zu folgenden Ergebnissen im Vergleich der Gruppen: Die Patienten mit einer HIT Typ II mit thromboembolischen Komplikationen ließen sich durch keine der untersuchten Immunglobulinklasse oder den Heparin-induzierten Plättchenaktivierungstest (HIPA-Test) signifikant von den Patienten mit HIT ohne thromboembolische Ereignisse unterscheiden. Die asymptomatischen Patienten mit positivem Heparin/PF4-Antikörpernachweis waren signifikant (p < 0,05) von den Patienten mit einer klinisch wahrscheinlichen und laborchemisch nachgewiesenen HIT Typ II zu unterscheiden durch die Immunglobulinklasse IgG und den Heparin-induzierten Plättchenaktivierungstest (HIPA-Test), nicht aber durch die Immunglobulinklassen IgM und IgA. Dementsprechend zeigte IgG in der Diskriminanzanalyse zwischen Patienten mit klinisch eindeutigem HIT Typ II und asymptomatischen Patienten mit positivem Heparin/PF4- Antikörpernachweis mit 20 % eine um 9 % niedrigere Fehlklassifikationsrate als die Mischung aus IgG, IgM und IgA. Der durch die Diskriminanzanalyse optimierte Cut-Off konnte zwar für die Mischung aus IgG, IgM und IgA eine Spezifitätssteigerung von 0 auf 66,6 % erzielen, dies verursachte jedoch einen Verlust an Sensitivität von 91 % auf 76 %. Der Verlust an Sensitivität ist bei der Immunglobulinklasse IgG mit 2 % deutlich günstiger, während die Spezifität zusätzlich durch die Cut-Off Optimierung von 62,5 auf 70,8 % gesteigert werden konnte. Damit ist der Heparin/PF4-Antikörper-EIA mit der isolierten Bestimmung der Immunglobulinklasse IgG bei vergleichbarer Sensitivität spezifischer als der funktionelle HIPA-Test. Aus diesen Ergebnissen lässt sich bestätigen, dass die Immunglobulinklasse IgG eine zentrale Rolle in der Pathogenese spielt, während die Klassen IgM und IgA keinen Einfluß auf die Klinik der HIT Typ II zu haben scheinen. Da nicht alle Patienten mit Heparin/PF4-Antikörpern der Klasse IgG eine HIT Typ II entwickeln, müssen weitere Faktoren am Zustandekommen der klinischen Symptomatik beteiligt sein. Weiter lässt sich schlussfolgern, dass der Heparin/PF4-Antikörper-EIA (HPIA), sofern man nur die relevante Immunglobulinklasse IgG misst, ein brauchbares Instrument zur Diagnostik der HIT Typ II darstellt, und daher von weniger spezialisierten Labors wegen seiner besseren Praktikabilität einem funktionellen Test wie dem HIPA-Test vorgezogen werden sollte. Zwischen Immunglobulinklassen und dem Risiko, ein thromboembolisches Ereignis während einer HIT Typ II zu entwickeln, konnte kein Zusammenhang festgestellt werden. Es ist zu vermuten, dass der überwiegende Teil der Patienten mit initial isolierter Thrombozytopenie bei fortlaufender Therapiedauer auch Thrombosen entwickelt hätte und sich die beiden Patientengruppen I und II nur hinsichtlich der Dauer der Heparintherapie unterscheiden.
Diese Arbeit beschreibt die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung von zwei neuen humanen S1P-Rezeptoren. Damit wird die Familie der S1P-Rezeptoren um einen hochaffinen und einen niedrig affinen Rezeptor erweitert. Die Untersuchungen der Expressionsprofile aller humanen S1P/LPA-Rezeptoren sowohl in Herz-Kreislauf-relevanten Geweben als auch in Endothelzellen und glatten Muskelzellen erfolgten bisher nicht im Sinne der hier dargestellten familienübergreifenden Betrachtung. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit erstmalig auch der hS1P5-Rezeptor mit eingeschlossen. Wir konnten zeigen, dass zur Beurteilung der S1P- und LPA-Effekte in den untersuchten Gewebe- und Zellarten neben den bisher bekannten sieben Rezeptoren auch der hS1P5-Rezeptor betrachtet werden muss. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da in bisherigen Untersuchungen insbesondere bei der Interpretation der S1P-Wirkungen nur die Rezeptoren S1P1-3 berücksichtigt wurden. In dieser Arbeit wurde außerdem zum ersten Mal eine große Anzahl potentieller Lipidliganden an den S1P-Rezeptoren S1P1-3 und 5 sowie am hGPR63 getestet. Auch wenn hierbei keine neuen Liganden identifiziert werden konnten, grenzen unsere Untersuchungen die Zahl potentieller zusätzlicher Liganden ein. Außerdem konnten wir zeigen, dass Suramin nicht - wie bisher vermutet - ein spezifischer Antagonist des S1P3-Rezeptors ist, sondern auch S1P5-Rezeptor-vermittelte Effekte blockieren kann. Hierdurch kann eine Fehlinterpretation von durch Suramin-hemmbaren Effekten verhindert werden. Ein wichtiger Befund dieser Arbeit, insbesondere für die pharmazeutische Industrie, ist die speziespezifische Expression des S1P5-Rezeptors. Während in der Ratte hauptsächlich eine Verteilung des Rezeptors im ZNS zu beobachten ist, findet sich das humane Homologe hauptsächlich in peripheren und hier insbesondere Herz-Kreislauf-relevanten Geweben. Der Einsatz von Tiermodellen, bei denen es sich in der Regel um Nager handelt, zur Untersuchung der S1P-Effekte muss daher kritisch überdacht werden, da in diesem Fall ein im Menschen potentiell relevanter Rezeptor nicht in den peripheren Geweben der Ratte vorhanden und somit nicht an den S1P-Wirkungen beteiligt ist. Zudem konnten wir auch funktionelle Unterschiede zwischen den beiden Rezeptoren unterschiedlicher Spezies beobachten, was zusätzlich gegen die Verwendung von Tiermodellen zumindest bei Untersuchungen des S1P5-Rezeptors spricht. Neben der erstmaligen Charakterisierung der Signaltransduktionswege des S1P5-Rezeptors konnte im Laufe dieser Arbeiten eine weitere neue Eigenschaft des S1P5-Rezeptors festgestellt werden: Dieser ist in der Lage, ligand-unabhängige Effekte hervorzurufen. Dies ist von Bedeutung, da häufig Rezeptoren, die aufgrund von Mutationen konstitutiv aktiv sind, für die Ausbildung von Krankheiten verantwortlich sind. Wir konnten darüberhinaus zeigen, dass der zweite in dieser Arbeit identifizierte S1P-Rezeptor, der orphan-hGPR63, von relativ hohen Konzentrationen an S1P sowie von doPA angeschaltet wird. Wenngleich die Affinität des hGPR63 zu doPA niedrig ist, ist dies jedoch der erste Rezeptor, der auf dieses Lipid reagiert. Welche physiologische Bedeutung diesem Rezeptor zukommt, ist noch völlig offen, die primäre Expression im Hirn weist jedoch auf eine zumindest partielle zentrale Wirkung hin. Zusätzlich zu den molekularbiologischen Befunden können aus dieser Arbeit wichtige Informationen für das Screenen von GPCRs und hier insbesondere von Lipid-GPCRs abgeleitet werden. Allgemein gilt, dass der Auswahl des richtigen Versuchssytems im Hinblick auf die Fragestellung und das zu untersuchende Protein eine entscheidende Bedeutung zukommt. Während bei Rezeptoren mit einer restriktiven Gewebeverteilung die Suche nach einem geeigneten Zellsystem keine Schwierigkeiten bereitet, stellt dies das Hauptproblem in der Lipidforschung dar. Da es keine Säugerzellen gibt, die nicht auf S1P reagieren, muss jedes Versuchssystem erneut auf Eignung und optimale Zellart untersucht werden. So konnten in transient transfizierten CHO-K1-Zellen hintergrundfreie S1P-Signale im FLIPR-Versuch gemessen werden, während in den MAP-Kinase-Versuchen in CHO-K1-Zellen der hohe endogene Hintergrund das Versuchsfenster auf ein Minimum reduzierte. Während die Messung von LPA-Effekten in CHO-K1-Zellen mit der FLIPR-Technologie aufgrund der endogenen Signale nicht möglich ist, können LPA-Effekte in McARH7777-Zellen ohne störenden Hintergrund gemessen werden. In diesem Zellsystem ist wiederum die Messung von S1P nicht oder nur begrenzt möglich. Auch wenn diese Beispiele spezifisch für Lipidrezeptoren sind, lässt sich doch aus dieser Arbeit die Notwendigkeit ableiten, neben der richtigen Substanz-Bibliothek besonders bei der Suche nach Liganden für orphan-GPCRs das richtige zelluläre System einzusetzen.
Der STAR Level-3 Trigger
(2002)
Schwerionen-Collider-Experimente, wie das STAR-Experiment am RHIC (BNL) oder das geplante ALICE-Experiment am LHC (CERN) untersuchen Schwerionenkollisionen bei Schwerpunktsenergien von Wurzel aus SNN = 200 GeV (RHIC), bzw. Wurzel aus sNN = 5, 5 TeV (ALICE). In diesen Kollisionen werden mehrere tausend geladene Teilchen produziert, die in STAR und ALICE in großvolumigen TPCs gemessen werden. Das Datenvolumen erreicht dabei bis zu 10 MB (STAR) und 60 MB (ALICE) pro Ereignis. Aufgrund der hohen Luminosität der Collider könnten die Experimente zentrale Schwerionenkollisionen mit einer Rate bis zu 100 Hz bzw. 200 Hz (ALICE) untersuchen. Die dabei entstehenden Datenraten im Bereich mehrerer GB/s sind mit heutiger Technologie jedoch nicht mehr einfach zu speichern. Deshalb kann nur ein Bruchteil der zur Verfügung stehenden Ereignisse aufgezeichnet werden. Aufgrund der exponentiellen Entwicklung der CPU-Leistung wird es jedoch möglich, die Rekonstruktion von Ereignissen während der Datennahme in Echtzeit durchzuführen. Basierend auf den rekonstruierten Spuren in den Detektoren kann die Entscheidung getroffen werden, ob ein Ereignis gespeichert werden soll. Dies bedeutet, dass die begrenzte Speicherbandbreite gezielt mit Ereignissen, die eine interessierende physikalische Observable beinhalten, angereichert werden kann. Ein solches System zur Ereignisselektion wird als Level-3-Trigger oder allgemeiner als High Level Trigger bezeichnet. Am STAR-Experiment wurde erstmals in einem Schwerionenexperiment solch ein Level-3-Triggersystem aufgebaut. Es besteht aus 432 i960-CPUs, auf speziell gefertigten Receiver Boards für die paralelle Clusterrekonstruktion in der STARTPC. 52 Standard-Computer mit ALPHA- bzw. Pentium-CPUs rekonstruieren die Spuren geladener Teilchen und tre.en eine Triggerentscheidung. Dieses System ermöglicht die Echtzeit-Rekonstruktion zentraler Au-plus-Au-Kollisionen mit anschliessender Analyse durch einen Trigger-Algorithmus mit einer Rate von 40-50 Hz. Die Qualität, die mit dieser schnellen Analyse erreicht wird, kann mit der Qualität der STAR-Offline-Rekonstruktion verglichen werden. Der Level-3-Clusterfinder erreicht in Bezug auf Ortsauflösung und Rekonstruktionseffizienz dieselbe Qualität wie der Offline-Clusterfinder. Der Level-3-Trackfinder erreicht bei Rekonstruktionseffizienz und Impulsauflösung 10-20% schlechtere Werte als der Offline- Trackfinder. Die Anwendung eines Level-3-Triggers besteht in der Messung von seltenen Observablen ("rare Probes"), die ohne eine Anreicherung nicht, oder nur schwer, meßbar wären. In den Jahren 2000 und 2001 wurden erste Triggeranwendungen für das STARLevel- 3-System erprobt. In ultraperipheren Au-plus-Au-Kollisionen wurden po-Kandidaten schon im Jahr 2000 selektiert. Während der Strahlzeit des Jahres 2001 wurde das Level-3-System erstmals zum Triggern in zentralen Au-plus-Au-Kollisionen eingesetzt. Die Triggeralgorithmen beinhalteten einen Õ-Trigger, einen 3He-Trigger und einen Algorithmus zur Anreicherung von Spuren hohen Impulses in der Akzeptanz des RICH-Detektors. Das STAR Level-3-System ist in der Lage zehnmal mehr Ereignisse zu analysieren, als gespeichert werden können. Aufgrund der begrenzten Luminosität des RHIC-Beschleunigers, konnten die Level-3 Trigger erst zum Ende der Strahlzeit eingesetzt werden. Den genannten Algorithmen standen zusätzlich zu den 3 · 10 hoch 6 gespeicherten zentralen Ereignissen, 6 · 10 hoch 5 zentrale Ereignisse zur Analyse zur Verfügung. Mit diesem begrenzten Anreicherungsfaktor von 20% blieb das System hinter seinen Möglichkeiten zurück. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass das STAR Level-3-System in der erwarteten Qualität und Stabilität funktioniert.
Der Ein-Elektron Transporter Adrenodoxin spielt in der Steroidhormonbiosynthese eine entscheidende Rolle. Bislang konnte der Elektronentransportmechanismus zwischen der Adrenodoxin-Reduktase und dem Cytochrom P450 mittels Adrenodoxin nicht eindeutig nachgewiesen werden. Um die molekularen Wechselwirkungen besser verstehen zu können wurden in der vorliegenden Arbeit strukturelle Untersuchungen am Rinderadrenodoxin durchgeführt. Nachdem es bereits 1998 gelang die Struktur des oxidierten Zustands des Adrenodoxins aufzuklären [Müller et al. 1998], sollte die Struktur des reduzierten Zustands Aufschluss über mögliche redoxbedingte konformationelle Änderungen geben. Die Strukturaufklärung mittels NMR erfordert hohe Expressionsausbeuten und effektive Aufreinigungsstrategien des rekombinant hergestellten Proteins. Deshalb wurde zunächst eine Steigerung der Expression von löslichem Adrenodoxin in E.coli angestrebt. In Minimalmedium lieferte die Expression unter Zusatz von 2,5g Glycerin und 1g Glucose optimale Ergebnisse. So konnte nach Optimierung der Aufreinigungsabfolge aus einem Liter M9-Medium bis zu 50 mg homogenes Protein isoliert werden. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen und der Aufreinigungsstrategie konnte das Adrenodoxin mit den NMR aktiven Isotopen 15N sowie 13C angereichert werden. Die Reduktion des Adrenodoxins erfolgte durch Zusatz von Natriumdithionit unter strikt anaeroben Bedingungen. Die strukturelle Untersuchung mittels NMR setzt eine Zuordnung der Proteinresonanzen voraus. Diese erfolgte unter Verwendung verschiedener Tripleresonanzexperimente. Eine Zuordnung war aufgrund des stark ausgeprägten Paramagnetismus nur für solche Reste möglich, die sich mindestens 8 Å vom [2Fe-2S]-Cluster des Adrenodoxins entfernt befinden. Trotzdem konnten wichtige Regionen, die sich außerhalb des Einflussbereichs des [2Fe-2S]- Clusters befinden, zugeordnet und mit dem oxidierten Zustand verglichen werden. Aus den 15N-NOESY-HSQC und 13C-NOESY-HSQC-Spektren wurden für den reduzierten Zustand unter Zuhilfenahme des Programms NMR2st 1300 effektiv abstandsbeschränkende NOESignale eindeutig zugeordnet. Nach Minimierung der Zielfunktion wurden im letzten Schritt 50 Strukturen mit dem Strukturkalkulationsprogramm DYANA berechnet. Die 20 Strukturen mit den besten Targetfunkionen wurden als Strukturensemble dargestellt. Für das Proteinrückrat beträgt der RMSD 2,34 Å. Anhand der chemischen Verschiebungsänderungen konnten erste Unterschiede zwischen oxidierten und reduzierten Zustand des Adrenodoxins festgestellt werden. Besonders markant sind diese Veränderungen im Bereich des C-Terminus und des Loops 80-86. Änderungen konnten auch im "Chemical Shift Index" und beim Vergleich der NOE-Konnektivitäten beider Redoxzustände beobachtet werden. Gerade für die Aminosäurereste Asp76 und Asp79, die für die Wechselwirkung zu den Redoxpartnern essentiell sind, konnten Veränderungen im Aufspaltungsmuster der "NOE-Pattern" nachgewiesen werden, was auf konformationelle Änderungen im Bereich der Wechselwirkungsdomäne hindeutet. Der Vergleich der beiden Tertiärstrukturen lieferte weitere Indizien dafür, dass der C-Terminus redoxbedingte konformationelle Änderungen erfährt. Während des Erstellens dieser Arbeit konnte eine US-amerikanische Gruppe durch Zufall die Existenz eines Adrenodoxin (oxidiert) Dimers bei physiologisch relevanten Konzentrationen nachweisen [Pikuleva et al. 2000]. Bei der Dimerisierung spielt der C-Terminus eine entscheidende Rolle. Zwei intermolekulare Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen CTerminus und Protein des jeweils anderen Partners aus. Redoxbedingte konformationelle Änderungen im Bereich des C-Terminus sollten die Auflösung des Dimers begünstigen. Um diese Vermutung zu bestätigen wurden Cross-Linking Experimente mit dem reduzierten und oxidierten Zustand des Adrenodoxins durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass sich das Adrenodoxin Dimer nach Reduktion auflöst. Außerdem konnte anhand der voll funktionsfähigen C-terminal verkürzten Mutante Adx(4-108) die tragende Rolle des CTerminus bei der Dimerbildung bewiesen werden. Aus den experimentell erhaltenen Daten wurde ein neuer Elektronentransportmechanismus postuliert, der sowohl Adrenodoxin Dimere als auch Adrenodoxin Monomere als Elektronentransporter annimmt [Beilke et al. 2002]. Die streng kontrollierte Steroidhormonbiosynthese wird durch den Einsatz von Adrenodoxin Dimeren beschleunigt und durch die redoxbedingte Auflösung der Dimere optimert. Die redoxbedingte Auflösung eines Dimers ist in der Biochemie einzigartig und kann zum Verständnis molekularer Wechselwirkungen beitragen. Für die gesamte Gruppe der vertebraten Ferredoxine sind aufgrund der Struktur- und Sequenzhomologie ähnliche Ergebnisse zu erwarten. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Ferredoxin-NADP -Reduktase (FNR) für strukturelle Untersuchungen mittels NMR zugänglich gemacht werden. Durch Verwendung von bakteriellen Expressionssystemen, insbesondere dem pQE30-Expressionssystem, konnte der Anteil an löslichem Protein im Vergleich zum Ursprungssystem um den Faktor 12 erhöht werden. Dabei führten möglichst niedrige Expressionstemperaturen und IPTG Konzentrationen zu den höchsten Proteinausbeuten. Ein verbessertes Isolationsverfahren wurde etabliert und ermöglicht die Darstellung von bis zu 90 mg FNR aus einem Liter LB-Medium. Eine Verlängerung der Expressionsdauer, hervorgerufen durch das Wachstum in M9-Medium und in D2O, verringerte den Anteil an vollständig intaktem Protein, weshalb auf eine kostspielige Proteinpräparation in dreifach angereicherten Minimalmedium verzichtet wurde.
Rezeptortyrosinkinasen der Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) sind in vielen Krebsarten dereguliert und ursächlich an der malignen Transformation beteiligt. Da die Aktivierung vom Rezeptor ausgehender Signaltransduktionskaskaden auf spezifischen Protein-Protein-Interaktionen basiert, kann durch gezielte Interferenz mit diesen Interaktionen das proliferative Signal ausgeschaltet und das Tumorwachstum angehalten werden. Für diese gezielte Interferenz wurde in der vorliegenden Arbeit das Peptid-Aptamer-System eingesetzt, mittels dem Peptide, die in ein Gerüstprotein inseriert sind, aufgrund ihrer Affinität zu einem Zielprotein selektiert werden können. Drei Peptid-Aptamere (KDI1, KDI3, KDI4), die spezifisch mit dem EGF-Rezeptor interagieren, konnten isoliert werden. lntrazelluläre Expression von Peptid-Aptamer KDI1 oder Einbringung des bakteriell exprimierten Peptid-Aptamers KDI1 mittels einer Proteintransduktionsdomäne führte zu reduzierter EGF-abhängiger Proliferation und Transformation. Durch Interferenz des Aptamers mit dem EGF-Rezeptor war die EGF-induzierte Phosphorylierung von Tyrosin 845, 1068 und 1148, sowie die Aktivierung von p46 Shc und STAT3 reduziert. Daher wurde gefolgert, dass das Peptid-Aptamer die EGF-abhängige Rekrutierung der zytoplasmatischen Kinase c-Src an den Rezeptor inhibiert. Durch Fusion einer zusätzlichen Domäne wie der SOCS-Box-Domäne konnte den Peptid-Aptameren eine zusätzliche inhibitorische Funktion gegeben werden. Hierbei handelt es sich um eine Domäne, die spezifisch Kontakt mit E3-Ubiquitin-Ligasen aufbauen kann. Es konnte gezeigt werden, dass durch Transduktion eines solchen Peptid-Aptamers der Rezeptor spezifisch ubiquitinyliert und damit degradiert wird. Das Peptid-Aptamer-System eignet sich somit dazu, Inhibitoren für vorgegebene Zielmoleküle zu isolieren, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Tumortherapie Anwendung finden können.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wichtigste NO-produzierende Enzym im kardiovaskulären System ist die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und Acylierung, durch Interaktionen mit regulatorischen Proteinen wie Ca2 /Calmodulin und Caveolin sowie durch differentielle subzelluläre Lokalisation reguliert wird. Dabei sind die Faktoren, welche die (Trans-)Lokation der eNOS zwischen subzellulären Kompartimenten wie den Caveolae der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat dirigieren, weitgehend unbekannt. Zur Identifizierung neuer Interaktionspartner wurde humane eNOS im "yeast two-hybrid"-System als "Köderprotein" eingesetzt und dabei das Fragment eines neuen humanen Proteins identifiziert, das vorläufig NOSTRIN (für: eNOS traffic inducer) genannt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang nun die Klonierung der kompletten NOSTRIN-cDNA, der Nachweis einer spezifischen Interaktion von eNOS und NOSTRIN in Säugerzellen sowie die Charakterisierung von NOSTRIN als Modulator der subzellulären Lokalisation und Aktivität von eNOS. Nach der kompletten Klonierung der NOSTRIN-cDNA mit Hilfe einer 5'-RACE resultierte ein offenes Leseraster von 506 Aminosäuren entsprechend einer Größe von ca. 58 kDa für NOSTRIN. Eine Datenbankrecherche zum Vergleich der NOSTRIN-Sequenz mit Sequenzen bekannter Proteinmotive ergab die Vorhersage einer N-terminalen Cdc15-Domäne sowie einer C-terminalen SH3-Domäne. Die direkte Interaktion zwischen eNOS und NOSTRIN konnte durch Copräzipitation in vivo und in vitro bestätigt werden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die SH3-Domäne von NOSTRIN essentiell für die Bindung an eNOS ist. Zur Untersuchung des Einflusses von NOSTRIN auf die eNOS-Lokalisation wurden stabil transfizierte CHO-Zellen, die eNOS überexprimierten ("CHO-eNOS") eingesetzt. In der Immunofluoreszenz war eNOS vornehmlich in Assoziation mit der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat zu sehen. Mit Hilfe des Semliki-Forest-Virussystems (SFV) wurde nun NOSTRIN transient überexprimiert; dabei zeigte sich für NOSTRIN eine vesikelartige Verteilung im Cytoplasma. Die NOSTRIN-Überexpression führte zu einer drastischen Umverteilung von eNOS, die nun in charakteristischen vesikelartigen Strukturen mit NOSTRIN colokalisierte. Die Verwendung von NOSTRIN-Konstukten, bei denen die SH3- Domäne deletiert war ("NOSTRIN.SH3"), veränderte zwar die typische NOSTRIN-Lokalisation nicht, ließ aber auch die subzelluläre Verteilung von eNOS unverändert, so dass NOSTRIN.SH3 und eNOS in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert waren. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte ebenfalls eine Colokalisation von NOSTRIN und Caveolin-1, einem inhibitorisch wirkenden Interaktionspartner von eNOS, nachgewiesen werden. Die Analyse von Copräzipitationen mit NOSTRIN bzw. NOSTRIN.SH3 zeigte, dass Caveolin-1 in eNOS-unabhängiger Weise an NOSTRIN bindet, so dass ein ternärer Komplex aus NOSTRIN, eNOS und Caveolin-1 resultiert. Zur Klärung der Frage, ob NOSTRIN neben der subzellulären Lokalisation auch die Aktivität von eNOS beeinflusst, wurde die NO-Freisetzung von CHO-eNOS-Zellen analysiert. Dabei ergab sich, dass die transiente Überexpression von NOSTRIN in CHO-eNOS-Zellen die eNOS-Aktivität um 62 % im Vergleich zu Kontrollzellen reduzierte. In humanen primären Endothelzellen konnte mittels Immunoblotting und Immunofluoreszenzmikroskopie das Vorkommen von endogenem NOSTRIN sowie dessen Colokalisation mit endogener eNOS an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation führen zur Hypothese, dass NOSTRIN als "molekulare Klammer" zwischen eNOS und Caveolin-1 dient, eine dynamische Umverteilung von eNOS innerhalb der Zelle vermittelt und damit das Enzym - direkt und/oder indirekt - inhibiert. Somit dürfte NOSTRIN als Modulator der Aktivität und Lokalisation von eNOS eine wichtige Rolle bei der Regulation der endothelialen NO-Produktion spielen.
Die auf dem ACDM-Modell beruhenden numerischen Simulationen der gravitativen Strukturbildung sind auf Skalen M >> 10 hoch 10 M sehr erfolgreich, insbesondere konvergieren die Verfahren hinsichtlich des vorhergesagten Masseanteils der Halos an der Gesamtmasse von Galaxien. Jedoch konvergieren die Simulationen nicht bezüglich der lokalen Überdichten von CDM in den Halos, vielmehr setzt sich gravitative Strukturbildung auf immer kleinere Skalen fort. Numerisch kann keine Massen-Schwelle berechnet werden, unterhalb derer keine CDM-Strukturen mehr gravitativ gebildet werden. Die Kenntnis der lokalen Überdichten in den CDM-Wolken und die Verteilung der CDM-Wolken ist jedoch für Experimente zum direkten und indirekten Nachweis von CDM-Teilchen essentiell. Aus den lokalen Überdichten folgen für Experimente zum direkten Nachweis die einfallende Stromdichten der CDM-Teilchen und für Experimente zum indirekten Nachweis die Stromdichte der Annihilationsprodukte. Außerdem können die lokalen Überdichten als Gravitationslinsen wirken. In dieser Arbeit werden Massen Schwellen analytisch berechnet, unterhalb derer akustische Störungen in CDM nicht mehr zur gravitativen Strukturbildung beitragen können. Das Massen-Spektrum von lokalen Überdichten ist nach unten durch zwei unterschiedliche Mechanismen beschränkt: (1) Während der kinetischen Entkopplung formieren sich Nichtgleichgewichtsprozesse, die sich kollektiv als Reihungsphänomene konstituieren. Im lineare Regime sind dies die Volumenviskosität, die Scherungsviskosität und die Wärmeleitung. Die dissipativen Prozesse deponieren Energie und Impuls der akustischen Störungen in die Ebene senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Störungen und schmieren diese so aus. (II) Nach dem kinetischen Entkopplungsprozeß strömt CDM frei auf Geodäten. Dies ermöglicht einen Strom von Teilchen von überdichten in unterdichte Regionen, so daß die Amplituden der lokalen Überdichten weiter gedämpft werden. Die lokalen Transportkoeffizienten in (1) werden durch einen legitimen Vergleich von hydrodynamischer und kinetischer Beschreibung schwach dissipativer Prozesse gewonnen. Dissipative Prozesse induzieren eine Dämpfungsmasse Mc ungefähr gleich 10 hoch minus 9 M in SUSY-CDM und beschränken damit das Spektrum akustischer Störungen in SUSY-CDM. Freies Strömen (II) von CDM-Teilchen auf Geodäten induziert eine weitere Dämpfungsmasse M fs ungefähr gleich 10 hoch minus 6 M in SUSY-CDM, wobei das berechnete M d als Anfangswert dient. Die berechneten Schwellen liefern konsistente Schranken für numerische Simulationen, die weit unterhalb des momentanen numerischen Auflösungsvermögens liegen. Weiterhin folgt aus den Schwellen die Masse der ersten rein gravitativ gebundenen CDM-Wolken. Aus diesen bilden sich im Rahmen der hierarchischen Strukturbildung größere Substrukturen bis hin zu den heute vorhandenen CDM-Halos.
Das R( )-Enantiomer der rac-a-Liponsäure ist als Coenzym wichtiger Multienzymkomplexe (Pyruvatund a-Ketoglutarat-Dehydrogenase) essentiell für die Zell- und Stoffwechselfunktion. Gerade in den wichtigen Prozessen der Zelle, die Substrate für die Atmungskette bereitstellen (Glykolyse, Citratcyclus), spielt die R( )-a-Liponsäure eine entscheidende Rolle. Zusätzlich besitzt dieser Wirkstoff die Eigenschaft als Chelatkomplex-Bildner, Radikalfänger und Antioxidans zu wirken, und er kann damit den Organismus vor "oxidativem Stress" schützen. Klinische und präklinische Studien geben Hinweise, daß R( )-a- Liponsäure einen positiven Effekt auf die Insulinsensitivität, die Insulin stimulierte Glukoseaufnahme und die Glukoseoxidation hat, weiterhin die Glukoneogenese hemmt und damit eine positive Wirkung auf den Krankheitsverlauf des Typ II - Diabetes hat. Das Ziel dieser Arbeit war es, die in der Literatur beschriebenen lang anhaltenden Wirkungen (Pharmakodynamik) der R( )-a-Liponsäure (12 - 24 h nach Gabe des Wirkstoffes) mit meßbaren Konzentrationen dieser Substanz im Organismus in Zusammenhang zu bringen, um erste Ansätze für die Korrelation zwischen Pharmakokinetik und Pharmakodynamik, also für die Konzentrations-(Dosis)- Wirkungsbeziehung, zu geben. Außerdem sollte geklärt werden, weshalb die Mehrfachgabe zu einer deutlichen Absenkung der nach Einfachgabe wirksamen Dosis führte. Eine wichtige Grundlage dazu ist die genaue Kenntnis der Pharmakokinetik der Wirksubstanz und ihrer wichtigsten Stoffwechselprodukte. Bisher ist nur die Pharmakokinetik der R( )- und S(-)-a-Liponsäure nach Gabe der razemischen a-Liponsäure untersucht worden. Da noch keine Erkenntnisse über die Pharmakokinetik der Metaboliten oder der R( )-a-Liponsäure nach Gabe des reinen R-Enantiomers bestanden, lag der Schwerpunkt der Arbeit auf den Untersuchungen der Pharmakokinetik des R( )- Enantiomers und der Metaboliten nach Gabe von R( )-a-Liponsäure als Trometamolsalz (Dexlipotam) und rac-a-Liponsäure am Tier (Einfach- und Mehrfachgabe) und am Menschen (Einfachgabe). Untersuchungsmodell Ratte: Erster Ausgangspunkt der kinetischen Untersuchungen war das zentrale Kompartiment, abgebildet durch den Blutkreislauf. Die resultierende Plasmakonzentrations-Zeitkurve nach oraler (p.o.), intravenöser (i.v.) oder intraperitonealer (i.p.) Gabe von Dexlipotam konnte mathematisch, basierend auf einem Zwei-Kompartiment-Modell, beschrieben werden. Charakteristisch für die Pharmakokinetik der R( )-a-Liponsäure war die kurze terminale Halbwertszeit (0,6 - 1,6 h) und die hohe, mit dem hepatischen Blutfluß vergleichbare, totale Plasma-Clearance. Diese Eigenschaften führten zu einem schnellen Absinken der Plasmakonzentration auf Werte unterhalb der Nachweisgrenze (6 h nach Gabe des Wirkstoffes). Mit Hilfe der Mikrodialyse wurde nach 1-stündiger Infusion von Dexlipotam die freie ungebundene R( )-a-Liponsäure-Konzentration im Interstitium des Muskels bestimmt. Der zeitliche Verlauf der Gewebekonzentration konnte basierend auf der physiologischen Grundlage eines peripheren Kompartiments (Zwei-Kompartiment-Modell) beschrieben werden. Es zeigte sich, daß nur der freie ungebundene Anteil der im Plasma vorliegenden Konzentration (20 %) für die Distribution in das Gewebe zur Verfügung steht. Die ermittelten Halbwertszeiten der Muttersubstanz im Plasma und im Muskel lagen in vergleichbarer Größenordnung und gaben keinen Hinweis auf eine unterschiedliche Kinetik im Plasma und im Gewebe. Sowohl nach p.o. als auch nach einmal täglicher i.v. Mehrfachgabe über 3 - 4 Wochen konnte keine Anreicherung im Plasma bestimmt werden. Dieser Befund erklärte somit nicht die nach Mehrfachgabe erforderliche Dosisreduktion. Die in weiteren Untersuchungen bestimmten Gewebekonzentrationen in der Leber, in der Niere, im Muskel und im Herzen, die sich aus dem freien ungebundenen und dem reversibel gebundenen Anteil der extrazellulären und intrazellulären Konzentration zusammensetzten, zeigten einen zur Plasmakinetik korrespondierenden Zeitverlauf. Nur einzelne spezifische Geweberegionen zeigten nach p.o. (Aorta) und nach i.v. (Nerven) Mehrfachgabe eine Anreicherung des Wirkstoffes. In in-vitro Testmodellen wurde weiterhin die Pharmakokinetik auf zelluläre Ebene untersucht. Es zeigte sich, daß Hepatozyten in der Lage sind, R( )-a-Liponsäure aufzunehmen und die durch b-Oxidation entstandenen Metaboliten Bisnorliponsäure (BNLA) und Tetranorliponsäure (TNLA) zu bilden und aus der Zelle heraus zu transportieren. Im Hinblick auf die Konzentrations-Wirkungsbeziehung rückten die Metaboliten Tetranorliponsäure und Bisnorliponsäure in das Interesse, da diese Stoffwechselprodukte wie die Muttersubstanz über einen aktiven Dithiolan-Ring verfügen, der möglicherweise das für die Wirkung verantwortliche Strukturelement darstellt. Im Interstitium des Muskels wurde der Metabolit TNLA in vergleichbaren Konzentrationen wie die Muttersubstanz gemessen, der Metabolit BNLA war dort nur in Spuren meßbar. Im Plasma hingegen waren die maximalen TNLA-Konzentrationen um den Faktor 3 geringer als die Muttersubstanz- Konzentrationen. Der Metabolit BNLA war im Plasma nur in geringem Ausmaß, um den Faktor 15 geringer als die Muttersubstanz, meßbar. Untersuchungsmodell Mensch: Im Menschen wurden die Metaboliten TNLA, BNLA, 6,8-Bis(methylmercapto)octansäure (BMOA), 4,6- Bis(methylmercapto)hexansäure (BMHA) und 2,4-Bis(methylmercapto)butansäure (BMBA) im Plasma und im Urin pharmakokinetisch untersucht. Die Metaboliten BMOA, TNLA und BNLA zeigten Halbwertszeiten in vergleichbarer Größenordnung wie die Muttersubstanz (0,5 - 0,9 h). Für die Metaboliten BMBA und BMHA wurden höhere terminale Halbwertszeiten (2 h) ermittelt. Aufgrund der insgesamt kurzen Halbwertszeiten konnte eine Kumulation der Metaboliten nach Mehrfachgabe ausgeschlossen werden. Mit Hilfe eines pharmakokinetischen Modells (Zwei-Kompartiment-Modell) war es möglich, die Bildung der Stoffwechselprodukte BNLA, TNLA, BMOA, BMHA und BMBA im Plasma zeitlich simultan zu beschreiben. Dadurch konnte der Metabolisierungsweg der a-Liponsäure im Organismus genauer erklärt und die resultierenden Konzentrationen der Metaboliten auf Basis der Muttersubstanz-Konzentrationen errechnet werden. Es war nicht möglich, die gemessenen Konzentrationen, weder von der Muttersubstanz noch von den möglichen wirksamen Metaboliten, in den verschiedenen Kompartimenten (Blutkreislauf, Gewebe oder Zelle) mit der lang anhaltenden Wirkung in einen zeitlichen Zusammenhang zu bringen. Weitere Untersuchungen mit empfindlicheren Meßmethoden und weitergehende zusätzliche Konzentrationsbestimmungen in den Kompartimenten in der Zelle (z.B. Mitochondrien) sind erforderlich, um die Korrelation zwischen der Pharmakokinetik und der Pharmakodynamik der R( )-a-Liponsäure oder möglicher wirksamer Metaboliten zu beschreiben.
Das Genom des Archaeons Halobacterium salinarum kodiert vier Proteine der SMC Protein Superfamilie. Zwei Proteine bilden dabei eine neue Gruppe und werden "SMC-artige Proteine von H. salinarum" (Sph1 und Sph2) genannt. Eine Transkriptanalyse ergab, dass sph1 und das 114 bp stromabwärts gelegene hp24 Gen ausschließlich in exponentiell wachsenden Zellen transkribiert werden. In Zellen der stationären Wachstumsphase ist keines der beiden Transkripte nachweisbar. Die Funktion von Sph1 wurde durch Versuche mit Überproduktions- und Depletionsstämmen von H. salinarum untersucht. Die konditionale Überproduktion von Sph1 inhibiert die weitere Zellteilung und führt zu einer Längenzunahme der Zellen. Erstmals wurde durch ein antisense-mRNA-System in einem Archaeon ein Protein, Sph1, depletiert. Die Depletion führt ebenfalls zur Inhibition der weiteren Zellteilungsereignisse. Beide Phänotypen zeigen, dass Sph1 eine essentielle Rolle im Verlauf des Zellzyklusses einnimmt. Um Zellzyklus spezifische Ereignisse zu analysieren wurde eine Synchronisationsprozedur für H. salinarum entwickelt. Dazu wurde der Effekt von sechs eukaryalen Zellzyklusinhibitoren auf den Zellzyklus von H. salinarum untersucht. Bei geeigneter Konzentration verursacht der effizienten DNA Polymerase Inhibitor Aphidicolin eine schnelle und reversible Zellzyklusblockade, während andere zelluläre Prozesse nicht beeinflusst werden. Durch Ermittlung der Zelldichte, der mittleren Zelllänge und des Anteils an Septum bildenden Zellen wurde festgestellt, dass nach Entfernen des Inhibitors ca. 70 % der in der Kultur vorhandenen Zellen den Zellzyklus synchron durchlaufen. Diese Prozedur erlaubt erstmals die Untersuchung der Zellzyklus abhängigen Regulation der Transkription, Proteinakkumulation sowie der intrazellulären DNA-Lokalisation in einem Archaeon. Transkriptionsstudien mit synchron wachsenden H. salinarum-Kulturen ergaben, dass das sph1 Transkript eindeutig Zellzyklus abhängig reguliert ist. Die maximale Transkriptmenge ist dabei zum Zeitpunkt der Septumbildung nachweisbar. Die Expression des hp24 Gens beginnt etwa eine Stunde vor der Expression des sph1 Gens. Bevor die sph1 Transkriptmenge ihr Maximum erreicht, nimmt die hp24 Expression wieder ab. Das cdcH Gen, das für ein Protein der Cdc48 Familie kodiert, ist wie das sph1 Gen um den Zeitpunkt der Septumbildung stark induziert, während ein ftsZ Allel nicht in Zellzyklus abhängiger Weise reguliert ist. Die Transkriptionsmuster zeigen, dass die Transkription verschiedener Gene im Verlauf des haloarchaealen Zellzyklusses präzise reguliert wird. Die Sph1 Proteinmenge ist ebenfalls während des Zellzyklusses reguliert; sie ist erhöht, wenn die Segregation der neuen Chromosomen nahezu abgeschlossen ist. Folglich hat Sph1 vermutlich eine Funktion in der späten Phase der Replikation, z.B. in der DNA-Reparatur wie auch die eukaryalen Rad18 Proteine. Im Gegensatz zum sph1 Transkript ist das Protein während des gesamten Zellzyklusses in H. salinarum nachweisbar. Es ist daher nicht auszuschließen, dass Sph1 eine weitere Funktion ausübt, die eine Präsenz während des gesamten Zellzyklusses benötigt. Ein Färbeprotokoll mit einem DNA spezifischen Fluoreszenzfarbstoff wurde entwickelt, um die intrazelluläre Lokalisation des Nukleoids in H. salinarum zu bestimmen und seine differenzierte Positionierung im Verlauf des Zellzyklusses in synchronisierten Zellen zu verfolgen. Synchronisierte Kulturen wurden mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass das haloarchaeale Nukleoid nach einer anfänglichen Verteilung auf die gesamte Zelle in der Zellteilungsebene kondensiert. Im weiteren Verlauf wird die DNA zügig an die 1/4 und 3/4 Positionen transportiert. Alle DNA-Strukturen wurden auch in unbehandelten Zellen beobachtet, so dass Synchronisationsartefakte ausgeschlossen werden können. Diese Daten beweisen, dass die DNA in Haloarchaea aktiv zu spezifischen intrazellulären Regionen transportiert wird und legen nahe, dass die Replikation in der Zellteilungsebene erfolgt, wie es in den letzten Jahren für einige bakterielle Arten nachgewiesen wurde. Die Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen molekularer Details des archaealen Zellzyklusses.
In der vorliegenden Dissertation wurden Antikörperfragmente, um sie zu oligomerisieren, an alpha-Helixbündel rekombinant fusioniert und die Fusionsproteine sowie deren Produktion untersucht. Dabei wurde durch Fusion eines Fv-Antikörperfragmentes an das trimere alpha-Helixbündel "Coil-Ser" das Fusionsprotein "Fv7E2-CS" entwickelt. Wegen der Fusion an Coil-Ser liegt das Ev-Fragment selbst in trimerem Zustand vor und kann auch sein Antigen, eine Cytochrom-c-Oxidase aus Paracoccus denitri/icans, binden und dadurch trimersieren. Antikörper gehören zur Immunabwehr der Wirbeltiere und sind Proteine, die in den Organismus eingedrungene, fremde Moleküle als "Antigene" spezifisch binden. Im momentan stark expandierenden Forschungsgebiet des "Antikörper-Designs" werden Antikörper und ihre Fragmente modifiziert, was besonders für die Entwicklung medizinischer Diagnostiken und Therapien vielversprechend ist. Eines der vielen Ziele ist die Steigerung der Bindungsaffinitäten, was unter anderem über die Vervielfältigung der natürlichen Bindestellen innerhalb eines künstlichen Antikörpermoleküls erreicht werden kann. Weiterhin möchte man Bindestellen gegen unterschiedliche Antigene in einem einzigen Antikörpermolekül vereinen, um dem Antikörper komplexere Funktionsfähigkeiten zu verleihen. Beide Ziele können durch Oligomerisierung der bindenden Antikörperfragmente verwirklicht werden. Zur künstlichen Oligomerisierung von Antikörperfragmenten wurde, neben anderen Strategien, die rekombinante Fusion an alpha-Helixbündel bereits einige Male erfolgreich angewandt. alpha-Helixbündel bestehen aus zwei bis etwa acht alpha-helikalen, längsseitig miteinander oligomerisierenden Peptidketten und können auch in natürlichen Proteinen als Oligomerisierungseinheiten fungieren. In der vorliegenden Dissertation wurden drei Fv-Antikörperfragmente und ein SchwerkettenAntikörperfragment mit drei verschiedenen alpha-Helixbündeln in unterschiedlichen Kombinationen rekombinant fusioniert und anschließend ihre Produktion und Funktion untersucht. Als Helixbündel zum Einsatz kamen das heterotetramere alpha-Helixbündel des neuronalen "SNARE"-Komplexes, die homo- als auch mit "Fos" heterodimerisierende Helix des AP-1-Transkriptionsfaktors ".Jun" und das synthetische, antiparallel homotrimerisierende Peptid "Coil-Ser". Die Expressionsprodukte vieler Fusionen konnten in Zellaufschlüssen mit Western Blots gefunden werden, nur einige aber ließen sich mit Affinitäts-Chromatographie in geringen Mengen (<0,1 mg/L Kultur) anreichern. Andere Produkte, bzw. bei einigen Fv-Fragmenten die Untereinheiten mit Peptid, waren durch die Fusion in ihrer Produktion deutlich gestört bis gar nicht vorhanden. Alle drei an Coil-Ser fusionierten Ev-Fragmente ließen sich in Mengen bis 0,5 mg/L Kultur anreichern. In der Gelfiltration zeigten sie sich mit vollständig assoziierten Untereinheiten, als auch mit vergrößerter, apparenter Molmasse im Vergleich zu den Fv-Fragmenten ohne fusioniertes Peptid. Von zweien der Coil-Ser-Fv-Fragmente konnte Antigenbindung beobachtet werden und davon bei Fv7E2-CS die Entstehung eines Fv-Antigen-Komplexes mit einer gegenüber dem ursprünglichen Antigen-Komplex sehr stark vergrößerten apparenten Molmasse. Mit analytischer Ultrazentrifugation wurde die Oligomerisierungsfähigkeit von Fv7E2-CS näher untersucht und für das ungebundene Fv-Fragment sowie für seinen Antigen-Komplex eine Massenkomponente mit im Vergleich zum jeweiligen Monomer dreifacher Molmasse gefunden. Für die Probe des Fv7E2-CS alleine wurde dabei ein Anteil an Komponenten trimerer Größenordnung von gut 95% ermittelt, also nahezu Homogenität, und in der Probe des Antigen-Komplexes zu 35 - 50 % Komponenten trimerer, sonst monomerer Größenordnung. Die Ursache für den niedrigeren Anteil an trimeren Komponenten in der Probe des Komplexes könnte hauptsächlich das hier vorhandene Detergenz sein, welches für das als Antigen fungierende Membranprotein Cytochrom-c-Oxidase nötig ist. Denn schon für das Fv7E2-CS alleine wurde in Kontrollen mit Detergenz eine Verringerung des Anteils an trimerer Komponente bzw. seiner mittleren Molmasse festgestellt. Das Fv-Fragment Fv7E2 ohne Peptid als auch dessen Antigen-Komplex zeigten in der Ultrazentrifuge keine bzw. nur unbedeutende Anteile an trimeren Massenkomponenten. Die Experimente deuten somit daraufhin, daß durch die Fusion des trimerisierenden Peptides Coil-Ser an Fv7E2 sowohl die Trimerisierung des Fv-Fragmentes, als auch bei Bindung des Antigens dessen Trimerisierung bewirkt wird. Das alpha-Helixbündel Coil-Ser ist folglich potentiell in der Lage, als Oligomerisierungseinheit für Fv-Antikörperfragmente eingesetzt zu werden. Wegen der aus Röntgenstrukturanalysen bekannten und für in Lösung prognostizierten Antiparallelität der Peptide im Coil-Ser-Bündel werden für die drei Fv-Fragmente bzw. die drei Bindestellen im Coil-Ser-Fusionsprotein einander entgegen-gesetzte Orientierungen vermutet, was für spätere Anwendungen von Bedeutung ist.
Das Ziel dieser Arbeit wurde eingangs über den Begriff der erweiterten Schließung der optischen und mikrophysikalischen Eigenschaften der Partikel definiert. Hierunter versteht man das Zusammenfügen von verschiedenen Messungen zu einem konsistenten Bild der betrachteten Partikeleigenschaften. Darüber hinaus sollen die Messungen auch in anderen Teilgebieten der Aerosolphysik verwendbar sein, um so das konsistente Bild zu erweitern. Dieses so umschriebene Ziel konnte für die mikrophysikalischen und optischen Messergebnisse, die während des LACE 98 Experimentes, einem vom Bundesministerium für Forschung und Bildung (Bmb f) geförderten Schließungsexperiment, in Lindenberg (Brandenburg) rund 50 km südöstlich von Berlin im Juli und August 1998 erfasst wurden, erreicht werden. Die Messungen wurden erfolgreich zu einem konsistenten Datensatz und einem "Bild" der Partikeleigenschaften zusammengefügt. Unter dem Begriff "Bild" subsummiert sich hierbei nicht nur eine Charakterisierung der Variabilität und Abhängigkeit der Partikeleigenschaften, z.B. von der rel. Luftfeuchte, sondern darüber hinaus auch eine Charakterisierung der Beeinflussung verschiedener von den Eigenschaften der Partikel abhängiger Größen. Hierzu zählen Strahlungshaushaltsgrößen (Erwärmungsrate der Luft durch Absorption solarer Strahlung und die Volumenabsorption solarer Strahlung durch Partikel), wolkenphysikalische Größen (maximale Übersättigung der Wolkenluft während der Wolkenentstehung und Anzahlkonzentration der wachsenden Wolkentropfen), die massengewichtete mittlere Sedimentationsgeschwindigkeit von Partikeln und nicht zuletzt gesundheitsrelevante Größen, wie z.B. die vom Menschen beim Atmen aufgenommene und eingelagerte Partikelmasse. Nachfolgende Zusammenstellung soll nochmals die erzielten Ergebnisse zusammenfassen. Für eine detaillierte Darstellung der in den einzelnen Kapiteln erzielten Ergebnisse soll hier nur auf die jeweiligen Zusammenfassungen der einzelnen Kapitel verwiesen werden. . Im Rahmen der direkten Schließung, wurden unterschiedliche Verfahren zur Bestimmung der optischen Eigenschaften der Partikel erfolgreich miteinander verglichen. Beteiligt waren bei diesem Vergleich folgende Methoden: Partikel im trockenen Zustand: -- Aerosolphotometer (alle optischen Eigenschaften, ) -- Nephelometer (Streukoeffizient) -- PSAP (Absorptionskoeffizient) -- IPMethode (Absorptionskoeffizient) -- Telephotometer (Extinktionskoeffizient) Partikel bei Umgebungsfeuchte: -- Telephotometer (Extinktionskoeffizient) -- horizontales Lidar (Extinktionskoeffizient) Es zeigte sich, dass sich das Aerosolphotometer mit seinem schon aus der Theorie des Messverfahrens her begründeten konsistenten Satz aller optischen Eigenschaften als Referenzmethode während LACE 98 bewährte. Mit seiner Hilfe konnte nun auch die Gültigkeit einer empirischen Korrektur des PSAP nach Bond et al. [1999] für natürliche Aerosolpartikel bestätigt werden. Dem Anwender dieses Gerätes, das mit einer hervorragenden zeitlichen Auflösung von wenigen Minuten den Absorptionskoeffizienten bestimmt, stehen somit zwei unabhängig voneinander gewonnene Kalibrierungsfunktionen zur Verfügung, die innerhalb der Fehlergrenzen auch mit einander im Einklang stehen. . Im Rahmen der indirekten Schließung wurde ein Modell entwickelt, mit dem auf Basis eines Kugelschalenmodells der Partikel aus Messungen der mikrophysikalischen Eigenschaften der Partikel den Extinktions, den Streu- und den Absorptionskoeffizienten sowie die Single Scattering Albedo berechnet wurden. Mit Hilfe dieses Modells wurde der Feuchteeffekt der oben genannten optischen Eigenschaften berechnet. Mit diesen Ergebnissen konnten dann die Messwerte des Telephotometers feuchtekorrigiert, und mit den Messungen des Aerosolphotometers verglichen werden, wo bei eine gute Übereinstimmung der Messreihen festgestellt werden konnte. Die beobachteten Unterschiede konnten auf Ernteaktivitäten, die nur die Messungen des Telephotometers beeinflussten, zurückgeführt werden. Ein Vergleich der mit Hilfe des Modells auch direkt berechenbaren optischen Eigenschaften mit den direkten Messwerten der beteiligten Verfahren fiel ebenfalls positiv aus. Anhand aller Modellrechnungen wurde eine physikalisch motivierte Näherungsfunktion für den Feuchteeffekt des Extinktions- und des Streukoeffizienten als Funktion des Aktivierungsparameters bereit gestellt. In Klimamodellen kann mit Hilfe der vorgestellten Näherungsfunktionen der Feuchteeffekt auf einfache Weise parametrisiert werden. Wenn man allerdings konkrete Messergebnisse miteinander vergleichen möchte, ist man auf eine vollständige Erfassung der mikrophysikalischen Eigenschaften der Partikel angewiesen. . Im Teil IV der Arbeit wurden auf der Basis des zuvor vorgestellten Datensatzes und der hierfür entwickelten Verfahren (Algorithmen) weitere Auswertungen zu unterschiedlichen, für die Meteorologie interessanten Themengebieten, vorgestellt und ihre Ergebnisse charakterisiert. . In Kapitel 6.1 wurde mit Hilfe von Auswertegleichungen aus den in dieser Arbeit erstellten Messungen des Sieben-Sensor-Bilanzphotometers und den Messungen des Aerosolphotometers die Volumenabsorptionsrate solarer Strahlung der bodennahen Partikel und die daraus resultierende Erwärmungsrate der Luft berechnet. Die Ergebnisse wurden mit Literaturwerten anderer Messkampagnen verglichen. Insbesondere konnte ein interessantes Ergebnis von Hänel
Die Chemie und der Strahlungshaushalt der Erdatmosphäre werden durch die nur in relativ geringen Konzentrationen vorhandenen Spurengase und Aerosolpartikel beherrscht. Mit den zunehmenden anthropogenen Emissionen von atmosphärischen Spurengasen, verursacht durch die wachsende Weltbevölkerung und die zunehmende Industrialisierung, wurde in den letzten Dekaden ein globaler Wandel bei der Zusammensetzung der Erdatmosphäre festgestellt: Konzentrationen von atmosphärischen Spurenstoffen verändern sich nicht mehr auf vergleichsweise langsamen geologischen Zeitskalen, sondern mit viel höheren Geschwindigkeiten, in einzelnen Fällen von bis zu einem Prozent pro Jahr. Die wohl bekanntesten Folgen dieser Veränderungen sind die globale Erwärmung durch die ansteigenden Emissionen von Treibhausgasen und der mit dem antarktischen 'Ozonloch" entdeckte drastische Ozonverlust in der Stratosphäre durch anthropogene Fluor-Chlor-Kohlenwasserstoffe (FCKW). Die Verteilung der für Ozonchemie und Klima relevanten Spurengase in der Atmosphäre hängt dabei nicht nur von der Verteilung ihrer Quellen und Senken ab, sondern wird maßgeblich durch verschiedene Transportprozesse beeinflußt. Der Austausch zwischen der mit anthropogenen Emissionen belasteten Troposphäre und den höheren Atmosphärenschichten Stratosphäre und Mesosphäre spielt dabei eine zentrale Rolle. Im Rahmen der Dissertation wurde zum besseren Verständnis von Stratosphären-Troposphären-Austauschprozessen die Verteilung von langlebigen Spurengasen in den beiden atmosphärischen Kompartimenten Troposphäre und Stratosphäre untersucht. Dazu wurde bei einer Meßkampagne im Sommer 1998 im Rahmen des von der Europäischen Union geförderten Forschungsprojektes STREAM 98 der flugzeuggetragene Gaschromatograph GhOST (Gas chromatograph for the Observation of Stratospheric Tracers) an Bord einer Cessna Citation II der TU Delft in Höhen bis 13 km eingesetzt. Dabei konnten bei zwanzig Meß- und Transferflügen über Kanada, dem Atlantik und Westeuropa umfangreiche Messungen der langlebigen Spurengase N20, F11 und F12 in der oberen Troposphäre und der Untersten Stratosphäre durchgeführt werden. Unter Flugbedingungen wurde mit GhOST während der Kampagne eine Reproduzierbarkeit (1 o) von besser als 0,6 % und eine absolute Genauigkeit von besser als 2 % für alle nachgewiesenen Spurengase erreicht. Diese hohe Meßpräzision konnte durch zahlreiche Vergleichsmessungen mit anderen Meßgeräten und Meßverfahren - im Flugbetrieb und im Labor sichergestellt werden; die Linearität des Geräts wurde zudem mit Hilfe einer barometrisch hergestellten Verdünnungsreihe untersucht. Die mit GhOST bei STREAM 98 gewonnenen Meßwerte wurden zusammen mit Messungen und Modelldaten der am Projekt beteiligten Arbeitsgruppen zur Untersuchung von Spurengasverteilungen und Stratosphären-Troposphären-Austauschprozessen herangezogen. Untersucht wurden dabei unter anderem die Verteilung und Variabilität von N20, F11 und F12 in der Troposphäre und in der Untersten Stratosphäre der mittleren Breiten, Austausch- und Mischungsprozesse in der Tropopausenregion und die Variabilität von Tracer/Tracer-Korrelationen in der Untersten Stratosphäre. Aufbauend auf den Erfahrungen bei STREAM 98 wurde für das vom BMBF geförderte Projekt SPURT im Rahmen dieser Doktorarbeit der in-situ-Gaschromatograph GhOST II entwickelt. Unter Beibehaltung der gaschromatographischen Komponenten von GhOST wurden zur Messung der Spurengase SF6 und CO zwei zusätzliche Detektoren integriert und zahlreiche technische Verbesserungen durchgeführt. Für die vollautomatische rechnergestützte Elektronik zur Steuerung des neuen Gerätes wurden zusammen mit der institutseigenen Elektronikwerkstatt verschiedene Baugruppen zur Signalführung und -verarbeitung, zur Temperaturmessung und zur Ansteuerung von Leistungskomponenten entwickelt. Während einer Testkampagne im April 2001 wurde GhOST II erfolgreich mechanisch und elektrisch auf einem Learjet 35A integriert und kam bei zwei Meßflügen der Meßkampagne SPURT 1 im November 2001 zum Einsatz.
Das Angiotensin konvertierende Enzym (ACE) ist als eine der zentralen Komponenten des ReninAngiotensin-Systems entscheidend an der Regulation der vaskulären Funktion und Homöostase sowie an der Regulation des Flüssigkeits- und Elektrolythaushaltes beteiligt. Dabei katalysiert die Zinkmetallopeptidase ACE vor allem die Bildung des vasokonstriktorisch wirkenden Angiotensins II und die Degradation des vasodilatorisch wirkenden Bradykinins. Die Hemmung des ACE zur antihypertensiven Therapie ist klinisch weit verbreitet, wobei die zahlreichen protektiven Eigenschaften der eingesetzten, hochpotenten ACE-lnhibitoren nicht allein durch die Beeinflussung des Metabolismus der zwei beschriebenen vasoaktiven Peptide zu erklären sind. Vielmehr wird seit einiger Zeit angenommen, dass ACE beispielsweise durch eine Interaktion mit dem Bradykinin-B2-Rezeptor aktiv an der Regulation intrazellulärer Signaltransduktionsprozesse beteiligt ist. Da ACE als plasmamembranäres Ektoenzym in seiner kurzen cytoplasmatischen Sequenz fünf potentiell phosphorylierbare Serinreste besitzt, deren posttranslationale Modifikation durch Phosphorylierung möglicherweise intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden beeinflussen könnte, wurde die potentielle Phosphorylierung von ACE sowie die Assoziation von ACE mit intrazellulären Proteinen analysiert. Mittels 32P-Markierung humaner Endothelzellen und ACE-überexprimierender Schweineaortenendothelzellen konnte erstmals die Phosphorylierung des ACE gezeigt werden, sowie unter Verwendung spezifischer Kinaseinhibitoren und anhand von in vitro Phosphorylierungsexperimenten die Proteinkinase CK2 als ACE-phosphorylierende Kinase identifiziert werden. Dies wurde zudem durch die Assoziation der CK2 sowohl mit ACE, als auch mit einem dem cytoplasmatischen Anteil von ACE entsprechenden Peptid bestätigt. Drei der intrazellulären Serinreste des ACE liegen innerhalb Konsensusse1uenzen bekannter Proteinkinasen, wobei nach Punktmutation der Serinreste Ser1253, Ser1263 oder Ser1270, entsprechend in Konsensussequenzmotiven für die PKC, PKA oder CK2 lokalisiert, der Ser1270-Rest als Hauptphosphorylierungsstelle des ACE identifiziert werden konnte. Die Reduktion der ACE-Phosphorylierung nach Mutation des Ser1270 zu Alanin sowie nach Hemmung der CK2 durch Einsatz des spezifischen lnhibitors 5,6-Dichloro-1-ß-D-ribofuranosylbenzimidazol (DRB) resultierte in einer verstärkten proteolytischen Spaltung des ACE, weiche extrazellulär in der juxtamembranär gelegenen "Stalk"-Region des Enzyms erfolgt, so dass vermehrt sekretiertes lösliches ACE in den Zellkulturüberständen der untersuchten Zellen zu finden war. Neben der CK2 fanden sich auch die schwere Kette nicht-muskulären Myosins (NMMHC), ß-Aktin, Annexin 2, die c-Jun NH2-terminalen Kinase (JNk) und die Proteinphosphatase PP1 assoziiert mit ACE oder einem dem intrazellulären Anteil von ACE entsprechenden Peptid. Da die an ACE gebundenen Proteine mehr oder minder in die Regulation intrazellulärer Signaltransduktionskakaden involviert sind, wurde überprüft, inwiefern die Aktivität oder Phosphorylierung dieser Proteine durch die Hemmung des ACE beeinflusst werden kann. Die Behandlung P-markierter Endothelzellen mit dem ACE-lnhibitor Ramiprilat resultierte deutlich nicht nur in einer transient gesteigerten Phosphorylierung des ACE selbst, sondern auch in einer verstärkten Phosphorylierung des ACE-gebundenen NMMHC. Dabei werden beide Proteine durch die ACE-assoziierte CK2 phosphoryliert, deren Aktivität deutlich nach Hemmung des ACE zunahm. Die Identität des ACE als aktives Signaltransduktionsmoleküi wurde zudem sehr überzeugend durch die Messung der JNK-Aktivität bestätigt, da die Stimulation mit Ramiprilat nur in Wildtyp-ACE exprimierenden Endothelzelien in einer Aktivierun dieser Kinase resultierte, wohingegen nach Mutation der ACE-Phosphorylierungsstelle (Ser1270) keine durch Ramiprilat gesteigerte JNK-Aktivität zu verzeichnen war. Ebenso führte neben der Hemmung des ACE die Stimulation mit dem ACE-Substrat Bradykinin zur lnitiation der beschriebenen Prozesse. Die durch ACE-lnhibitoren induzierte Signaltransduktion scheint auch an der Potenzierung und Reaktivierung der durch Bradykinin vermittelten Zellaktivierung beteiligt zu sein, da nur in ACE-exprimierenden Zellen die Hemmung der CK2 in einer verminderten Bradykinin-induzierten Endothelzellaktivierung resultierte und der ACE-lnhibitor diese Reduktion vollständig umkehrte. Die Entdeckung der posttranslationalen Modifikation des ACE durch Phosphorylierung zur Regulation der Sekretion des Enzyms sowie zur lnitiation intrazellulärer Signalkaskaden eröffnet eine neue molekulare Basis für das Verständnis und die Charakterisierung der zahlreichen protektiven Eigenschaften der ACE-lnhibitoren. Zudem liefert die Identifizierung des ACE als aktives Signaitransduktionsmolekül mit der Fähigkeit zum "Outside-In-Signaling" möglicherweise neue Ansatzpunkte für die Entwicklung antihypertensiver Therapien.
Enzyme der Cytochrom P450 (CYP) 2C Familie werden extrahepatisch vor allem in Endothelzellen exprimiert und liefern durch Metabolisierung der Arachidonsäure zu Epoxyeicosatriensäuren (EET) einen den Gefäßtonus modulierenden Faktor, den sogenannten endothelialen hyperpolarisierenden Faktor (EDHF), der zur Relaxation des glatten Gefäßmuskels führt. Neben dieser wichtigen Funktion als EDHF-Synthase beeinflussen diese Enzyme (CYP-Epoxygenasen) weitere zentrale Signalwege der Endothelzellen und tragen so zur vaskulären Homöostase bei. So wurde beschrieben, dass EET u.a. antiinflammatorische und fibrinolytische Eigenschaften besitzen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung weiterer Funktionen der CYP Epoxygenasen in Endothelzellen. Zunächst wurden physiologisch und pharmakologisch relevante Einflüsse auf die Expression der endothelialen CYP 2C lsoformen untersucht. Im Gegensatz zu der deutlichen CYP 2C Expression in nativen Endothelzellen, ist die Expression in kultivierten Endothelzellen drastisch reduziert. Es wurde gezeigt, dass kultivierte Endothelzellen, die einer kontinuierlichen, rhythmischen Dehnung (18 Stunden) ausgesetzt waren, eine signifikant höhere CYP 2C Expression verglichen mit unter statischen Bedingungen kultivierten Endothelzellen aufweisen. Ebenso bewirkte zyklische Dehnung (sechs Stunden) von endothelintakten Koronarsegmenten eine Induktion der endothelialen CYP 2C Expression. Diese Befunde zeigen, dass pulsatile Dehnung von Endothelzellen, ein kontinuierlicher hämodynamischer Stimulus in vivo, wesentlich zu dem physiologischen Expressionsniveau von CYP Epoxygenasen beiträgt. Auch eine Reihe kardiovaskulärer Pharmaka beeinflussen die Expression von CYP Epoxygenasen. Inkubation kultivierter Endothelzellen bzw. endothelintakter Gefäßsegmente mit dem lnsulinsensitizer Troglitazon und den Statinen Cerivastatin und Fluvastatin ergab eine deutliche Expressionserhöhung der endothelialen CYP 2C Isoformen. Die physiologische Bedeutung der verstärkten Expression konnte mit der einhergehenden, verbesserten EDHF-vermittelten glattmuskulären Relaxation demonstriert werden. Der Effekt endothelialer CYP 2C9 Expression auf die Proliferation wurde in weiteren Experimenten untersucht. Hierzu wurden kultivierte Endothelzellen eingesetzt, die mit CYP 2C9 Expressionsvektoren (adenovirale Infektion bzw. liposomale Transfektion) transfiziert wurden. In diesen CYP 2C9 überexprimierenden Endothelzellen konnte der proliferative Effekt des Enzyms demonstriert werden, da sie sowohl eine verstärkte DNA-Synthese als auch eine erhöhte Zellzahl im Vergleich zu Kontrollvektor-behandelten Zellen zeigten. Als weiteren Marker einer Proliferation ließ sich eine erhöhte Expression des zellzyklusregulierenden Proteins Cyclin Dl nachweisen. Eine verstärkte Phosphorylierung und Aktivierung des EGF Rezeptors in CYP 2C9 überexprimierenden bzw. EET behandelten Zellen gab einen deutlichen Hinweis auf die Beteiligung des EGF Rezeptor-Signalweges an diesem proliferativen Prozess. Diese Hypothese wurde durch den Befund belegt, dass lnkubation mit dem EGF Rezeptor lnhibitor AG 1478 zur Hemmung der CYP 2C9-induzierten Proliferation führte. Die Aktivierung des EGF Rezeptors bewirkte des weiteren die verstärkte Phosphorylierung der Proteinkinase B/Akt. Neben dem proliferativen Effekt konnte sowohl für CYP 2C9 als auch für EET ein angiogenetischer Effekt demonstriert werden. Im in vitro Angiogenese-Assay führten CYP 2C9-Uberexpression und exogene Stimulation mit 11,12-EET zur Ausbildung kapillarartiger Strukturen, die bei Kontrollzellen nicht zu finden waren. Ebenso bewirkten 11,12-EET in vivo (chick chorioallantoic membrane-assay) eine signifikant verstärkte Gefäßneubildung, die sich, wie die induzierte Endothelzellproliferation, als EGF Rezeptor-vermittelt erwies. In weiteren Experimenten wurde die Rolle des CYP 2C9 als endotheliale Quelle physiologisch relevanter Mengen reaktiver Sauerstoffspezies analysiert. Mit unterschiedlichen Methoden konnte in kultivierten Endothelzellen sowie in endothelintakten Koronarsegmenten gezeigt werden, dass CYP 2C9 nicht nur EET, sondern auch Sauerstoffradikale bildet. Diese Erhöhung des oxidativen Stress führte in Endothelzellen zur Aktivierung des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors NF-KB und zur verstärkten Expression des Adhäsionsmoleküls VCAM-1. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Expression von CYP 2C9 in Endothelzellen relevante, physiologische Funktionen wie Induktion von Proliferation und Angiogenese sowie Modulation der Aktivität von Transkriptionsfaktoren bedingt. Da EET über die Hemmung der NF-KB Aktivierung antiinflammatorische Effekte ausüben, die CYP 2C9-abhängige Bildung von O2- durch Aktivierung von NF-KB jedoch proinflammatorisch wirkt, sind grundsätzlich gegenläufige, CYP 2C9-induzierte Effekte möglich. Unter welchen Bedingungen EET oder Sauerstoffradikale eine funktionelle Dominanz ausüben, müssen weitere Studien klären.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der Variation des Oxidationspotentials und der Elektronenkonfiguration ( * gegen n *) auf die zur Löschung von angeregten Triplettzuständen durch O2 führenden Prozesse untersucht. Bei ausreichender Triplettenergie werden neben dem Grundzustand des ursprünglich angeregten Sensibilisators in Konkurrenz O2(1 g ) und O2(1 g) Singulettsauerstoff sowie O2(3 g -) Grundzustandssauerstoff gebildet. Frühere Untersuchungen in diesem Arbeitskreis hatten gezeigt, daß es für * Triplettzustände zwei Desaktivierungskanäle gibt, die beide zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führen. Der eine geht von den bei der Löschung zunächst gebildeten 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen ohne Charge Transfer Stabilisierung aus (nCT). Diese befinden sich in einem vollständig eingestellten spinstatistischen Gleichgewicht, aus dem durch innere Konversion in niedrigere Komplexzustände die Desaktivierung erfolgt. Ein gemeinsames Energielückengesetzt f( E) und damit letztlich die Triplettenergie des Sensibilisators bestimmt die Größe der Geschwindigkeitskonstanten der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse in diesem nCT Kanal. Für Sensibilisatoren mit hohem Oxidationspotential und vernachlässigbaren Charge Transfer Wechselwirkungen ist dies der einzige Desaktivierungsprozeß. Mit zunehmender Charge Transfer Wechselwirkung, also mit abnehmendem Oxidationspotential und/oder zunehmender Triplettenergie, wird ein zweiter Desaktivierungskanal geöffnet, der über 1,3(T1 3 ) Komplexe mit Charge Transfer Stabilisierung (pCT) also über Exciplexe führt. Die Exciplexbildung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im pCT Kanal. Zur Verbreitung der Datenbasis den T1( *) Sensibilisatoren wurde in dieser Arbeit eine Reihe von mit elektronenziehenden bzw. elektronenschiebenden Gruppen substituierten Fluorenen studiert, bei denen im wesentlichen nur das Oxidationspotential variiert, während die Triplettenergien weitgehend konstant bleiben. Die mit den Fluorenen erhaltener Ergebnisse bestätigen das bisher erarbeitet Zweikanal-Desaktivierungsmodell. Insbesondere wird auch das spinstatistische Gewicht von 1:3 für die Bildung von Singulett zu Triplettsauerstoff im Exciplex Kanal gefunden, das nur mit einem relativ langsamen 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) isc Gleichgewicht konsistent ist. Dieses Ergebnis widerspricht der früheren Annahme, wonach ein effizientes isc Gleichgewicht nur zwischen 1,3(T1 3 ) Exciplexen, nicht aber zwischen 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen existieren soll. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell für die 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) angeregten Komplexe vorgeschlagen, das in einfacher Weise erklärt, warum das isc zwischen Encounter Komplexen von Sensibilisator und O2 schneller ist, als das zwischen den entsprechenden Exciplexen. Die weitere Analyse der Fluoren Daten zeigt, daß neben dem Oxidationspotential und der Triplettenergie des Sensibilisators auch dessen Struktur die Geschwindigkeitskonstanten beeinflussen kann, allerdings weitaus schwächer als die beiden ersten Einflußgrößen. Mit den Messungen der Geschwindigkeitskonstanten kT 1 , kT 1 und für kT 3 der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse für die unterschiedlich substituierten Benzophenonderivate wurde erstmals eine quantitative Untersuchung der Löschung von n * angeregten Triplettzuständen durch O2 durchgeführt. Obwohl für die Benzophenone eine stärkere Variation des Oxidationspotentials bei nahezu konstanter Triplettenergie erreicht werden konnte, wurde im Vergleich zu den * Triplettsensibilisatoren eine wesentlich schwächere Variation von kT 1 , kT 1 und für kT 3 beobachtet. Gleichzeitig liegen die Werte von kT 1 , kT 1 und für kT 3 der Benzophenone mit vernachlässigbarer Charge Transfer Wechselwirkung weit von der für * Triplettsensibilisatoren gefundenen Energielückenbeziehung f( E). Offenbar gilt für n * Triplettsensibilisatoren eine andere Energielückenbeziehung f( E), die viel schwächer von E abhängt. Es konnte gezeigt werden, daß die schwächere Überschußenergieabhängigkeit mit der unterschiedlichen Struktur der 1,3(T1.3 ) Komplexe zusammenhängt. Für 1,3(T1(n *) 3 ) ist eine Vierzentren Struktur, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls parallel und benachbart zu den beiden Atomen der angeregten Carbonyl Gruppe liegen, sehr wahrscheinlich. Bei der Desaktivierung der Carbonyleinheit ändern sich die Bindungslängen der Vierzentrenstruktur stark, was einem Übergang zwischen versetzten Potentialkurven mit schwacher Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren entspricht. Für 1,3(T1( *) 3 ) Komplexe ist eine supra-supra Struktur anzunehmen, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls mit gegenüberliegenden Kohlenstoffatomen eines angeregten aromatischen Rings wechselwirken. Bei der Desaktivierung des aromatischen Rings ändern sich die Bindungslängen nur wenig, so daß man von einem Übergang zwischen übereinander liegenden Potentialkurven mit stärkerer Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren sprechen kann. Dies ist der eigentliche Grund für die verschiedenen Energielückenbeziehungen f( E) und f( E) bei der Löschung von * und n * Triplettsensibilsatoren durch O2. Die Variation des Oxidationspotentials und damit der Stärke der Charge Transfer Wechselwirkungen in den 1,3(T1 3 ) Komplexen wird durch unterschiedliche Substitution von aromatischen Ringen mit elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Gruppen bewirkt. Da die aromatischen Ringe bei den n * Triplettsensibilisatoren im Gegensatz zu den * Triplettsensibilisatoren nicht Bestandteil des elektronisch angeregten Zentrum sind, fallen die Charge Transfer Effekte bei den n * Triplettsensibilisatoren deutlich schwächer aus als bei den * Triplettsensibilisatoren. Damit konnte in der vorliegende Arbeit erstmals eine konsistente Begründung für das unterschiedliche Verhalten von n * und * Triplettsensibilisatoren bei der Löschung durch O2 gegeben werden.
In dieser Arbeit wurde das Potential des rekombinant in E. coli hergestellten und unter Hochsalzbedingungen in-vitro assemblierten, murinen VP1-Kapsoids als Antisense-Oligonukleotid-Transfersystem in humane Brustkrebszellen untersucht. Die verwendeten Antisense-Oligonukleotide sind gegen den in 25-30 % aller Brustkrebsfälle überexprimierten Wachstumsfaktorrezeptor Pl85erbB-2 gerichtet, der zu einer verschlechterten Prognose in Bezug auf die Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit und das Wiederauftreten des Carcinoms führt. Die Charakterisierung der VP1-Kapsoide als Oligonukleotid-Transfersystem wurde zum einen in Bezug auf den Zelltransfer des Trägers und die mit ihm transportierten Antisense-Oligonukleotide durchgeführt. Zum anderen erfolgte die Überprüfung der resultierenden Antisense-Wirkung der Oligonukleotide sowohl in einem unspezifischen Proliferations- als auch in einem Antisense-Assay, das zwischen sequenzspezifischen und sequenzunspezifischen Oligonukleotid-Wirkungen differenzieren kann. Für die VP1-Kapsoide wurde in den untersuchten humanen Brustkrebszelllinien eine identische Lokalisierung detektiert wie sie für die murinen Targetzellen beschrieben ist. Es kommt zu einer cytosolischen Anreicherung mit perinukleären. vesikulären Strukturen ohne nachweisbare nukleäre Lokalisierung. Die durch VP1-Kapsoide transportierten Oligonukleotide dissoziieren intrazellulär in einem Zeitraum von 3 h nahezu vollständig vom Transfersystem und reichem sich cytosolisch und nukleär an. Zur Testung der biologischen Aktivität der Antisense-Oligonukleotide wurden liposomaltransportierte Oligonukleotide verwendet, da die Beladungsrate der VP1-Kapsoide unter Mediumbedingungen zu gering ist. Im Proliferationsassay wird die Oligonukleotid-Wirkung anhand der resultierenden Proteinreduktion charakterisiert. Die geringe Spezifität dieses Assays wurde durch die Einführung von einer Kontrollzelllinie und Kontroll-Oligonukleotid-Modifikationen verbessert. Die im Proliferationsassay mit Antisense-Oligonukleotiden detektierten Oligonukleotid-Wirkungen beweisen noch nicht, ob eine sequenzspezifische Antisense-Wirkung vorliegt. Deshalb wurde die Sequenzspezifität der verwendeten Antisense-Sequenzen zusätzlich im Antisense-Assay bestätigt. Die etablierten Testsysteme stellen alle Optionen zur umfassenden Charakterisierung eines innovativen Transfersystems zur Verfügung. Die Transfer-Assays untersuchen den verbesserten Zelltransfer des Trägers gegenüber freien Oligonukleotiden und alternativen Trägern. Das Proliferationsassay ermöglicht ein Vorscreening auf Antisense-Wirkungen und reduziert somit die Probenanzahl für das letztendlich notwendige Antisense-Assay.
In dieser retrospektiven Studie wurde die Ergebnisqualität des Rettungsdienstbereiches Frankfurt am Main bei präklinischen Reanimationen untersucht. Das untersuchte System versorgt etwa 650.000 Einwohner auf einer Fläche von 248,36 km 2 . In ei nem gestaffelten System waren 12 Rettungs (RTW) und 4 Notarztwagen (NAW) rund um die Uhr an der Notfallrettung beteiligt. Weitere W und KTW waren zu bestimmten Tageszeiten im Einsatz. Im Erfassungszeitraum wurden insgesamt 506 Reanimationen registriert, an dem der Rettungsdienst beteiligt war, von denen 447 die Einschlusskriterien (kardial bedingter Herzkreislaufstillstand, Alter >= 15 Jahre) erfüllten. 160 Patienten wurden nach Herzkreislaufstillstand (35,8%) in ein Krankenhaus transportiert, 112 Patienten (25,1%) hatten dabei nachweislich einen Spontankreislauf. 35 Patienten (7,8% von n=447) wurden aus dem Krankenhaus entlassen. Der primäre Reanimationserfolg war signifikant abhängig vom Alter der Patienten, dem EKG-Befund bei Reanimationsbeginn, dem Notfallort und der Tageszeit. Signifikant in Bezug auf das sekundäre Überleben erwiesen sich nur der initiale EKG-Befund und der Notfallort. Patienten mit Kammerflimmern und Patienten, die in der Öffentlichkeit einen Herzkreislaufstillstand erlitten, hatten eine signifikant höhere Überlebenschance. Das Geschlecht der Patienten und der Beginn einer Reanimation durch Anwesende hatten keinen signifikanten Einfluss auf primärem und sekundärem Reanimationserfolg. Die Zeit bis zum Eintreffen des ersten Rettungsmittels betrug im Median 6 Minuten. Ein Notarzt traf im Median nach 10 Minuten ein. Die Frankfurter Erfolge sind im Vergleich zur Literatur bezogen auf den sekundären Reanimationserfolg signifikant niedriger. Mögliche Gründe dafür sind: . der hohe Anteil von Patienten mit Asystolie . keine Frühdefibrillation durch RTW im Studienzeitraum . geringer Anteil von Anwesendenreanimationen . Infrastruktur der Großstadt Frankfurt Folgende Veränderungen könnten Schwachstellen ausgleichen und die Effektivität des Rettungssystems verbessern: - Umstellung von stationärem Notarztsystem (NAW) auf Rendezvoussystem (NEF) - Frühdefibrillation mit AED - ''First responder" - ''Public access defibrillation" - strengere Indikationsstellung zur Reanimation - bessere und intensivierte Breitenausbildung in Wiederbelebungsmaßnahmen - Anleitung zur Telefonreanimation durch Rettungsleitstelle