Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (311)
- Article (282)
- Preprint (38)
- Contribution to a Periodical (25)
- Book (18)
- Report (2)
Language
- English (521)
- German (154)
- Multiple languages (1)
Has Fulltext
- yes (676) (remove)
Is part of the Bibliography
- no (676)
Keywords
- RNA (12)
- SARS-CoV-2 (10)
- NMR spectroscopy (9)
- inflammation (9)
- photochemistry (9)
- NMR (8)
- Biochemistry (7)
- Cell biology (7)
- E2 enzyme (6)
- TRACT (6)
Institute
- Biochemie, Chemie und Pharmazie (676) (remove)
Infections with the hepatitis B virus (HBV) or the hepatitis C virus (HCV) lead to complications like the development of cirrhosis or hepatocellular carcinoma. These complications end up in 887,000 and 500,000 deaths per year, respectively. Since the development of new direct acting antiviral agents for HCV in the past years a complete cure of an HCV infection can be achieved in the majority of the patients. In contrast, a complete cure of a chronic HBV infection still remains a challenging problem as current treatment regimens mainly suppress the viral replication and cccDNA as well as integrated DNA still persist in these patients. Several viral and host factors were described to impair the efficacy of treatment regimens or influence the course of the infection. Therefore, in this work viral factors as well as host factors were investigated in HBeAg negative chronic HBV infected patients and in chronic HCV infected patients. In the present study, it was demonstrated that mutations and/or deletions in the HBV basal core promoter (BCP), the precore and the preS domain occur in a genotype-specifc pattern in HBeAg negative HBV infected patients. While the BCP double mutation A1762T/G1764A was found with the highest prevalence in genotype E infected patients, the precore mutation G1896A occurred mostly in genotype B infected patients. Variants in the preS domain could be detected with the highest frequency in patients infected with genotype C. In patients, who had to start an antiviral therapy during the course of the disease, mutations in the precore region could be detected with a higher frequency in the samples right before treatment start in comparison to the baseline sample.
While different HBV genotypes and preS mutations were not associated with HBV-DNA serum levels, precore mutations as well as BCP mutations were significantly associated with HBV-DNA levels. Furthermore, precore mutations showed lower and preS mutations higher HBsAg levels. The HBsAg serum levels varied significantly among the different genotypes. Since HBsAg levels < 1000 IU/ml have been described as a prognostic marker in several studies, the prevalence of patients with HBsAg < 1000 IU/ml was analyzed among the genotypes A - E. While most of the patients infected with HBV genotype B had HBsAg < 1000 IU/ml, only a few patients infected HBV genotype E and A had HBsAg < 1000 IU/ml.
Furthermore, HBV genotype A genomes derived from patients harboring a) A1762T/ G1764A (BCP), b) G1896A/G1899A (precore), c) 15 aa deletion in preS1, d) no mutation (reference genome) were cloned and analyzed in vitro. An enhanced expression but reduced secretion of viral genomes was found in the preS-deletion- and the precore-variant. No differences in the HBsAg production and secretion were observed in the cloned precore- or BCP-variant, while the preS-deletion-variant was characterized with an elevated HBsAg release.
Regarding the secretion of viral and subviral particles, a genotype-specifc pattern of the L/M/SHBs ratio was detected in the serum of patients infected with genotypes A - E. This pattern did not change in the serum of patients, who started antiviral treatment. Secreted HBsAg containing particles displayed a higher density as well as a higher filaments/spheres ratio in genotypes B and D compared to genotypes A, C and E. Population-based and deep sequencing revealed large deletions in the preS domain or preS2 start codon mutations in a certain number of the viral genomes. Theoretically, these mutations/deletions should influence the molecular weight of the expressed protein or abolish the expression of the protein at all. In contrast, LHBs/MHBs were detectable and appeared at the same molecular weight in these patient samples in comparison to patient samples without these mutations. Furthermore, in the in vitro analyses comparing the reference genome and the preS1-deletion genome, it was shown that the deletion indeed influenced the molecular weight of LHBs. Therefore, HBsAg might be expressed from a genetically different source than the released viral genomes, meaning the integrated DNA.
Additionally, in the present study the prevalence of resistance associated substitutions (RASs) in the viral genes NS3, NS5A and NS5B of chronic HCV infected patients was analyzed in correlation to single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the interferon-λ4 (IFNL4) gene of the infected patients. No significant correlation was found between IFNL4 SNPs and RASs within NS3/NS5B in the present cohort. In contrast, the frequently detected NS5A RAS Y93H could be significantly associated with beneficial IFNL4 SNPs and a high baseline viral load in HCV genotype 1-infected patients.
Taken together, the present study demonstrated that viral genome mutations as well as the morphology of secreted particles occur in a genotype-dependent pattern in HBeAg negative HBV infected patients with no need of antiviral therapy. As the amount of serum qHBsAg levels varied among the different genotypes, the HBsAg cut-off < 1000 IU/ml should be adapted individually among the various genotypes. Because the composition of the secreted subviral particles varied between the different genotypes, a genotype-specific immune-response might be induced in these patients. Additionally, the results of the present study indicate that in HBeAg negative HBV infected patients with mutations or deletions in the preS domain MHBs and LHBs might be expressed from the integrated DNA and therefore from a genetically different source than the released viral genomes.
Aside from that, the finding of a significant association of the NS5A RAS Y93H with beneficial IFNL4 SNPs in chronic HCV infected patients may explain a lack of a correlation or an inverse correlation of treatment response with the IFNL4 genotype in some NS5A inhibitor-containing IFN-free regimens.
Photolabile Schutzgruppen haben sich im Laufe der letzten Jahre als wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung und Regulation biologischer Prozesse etabliert. Dabei wird die photolabile Schutzgruppe auf geeignete Weise mit Biomolekülen verknüpft, sodass deren Funktion temporär deaktiviert wird. Durch Bestrahlen mit Licht geeigneter Wellenlängen wird die photolabile Schutzgruppe entfernt und die Aktivität des Biomoleküls bzw. des zu beobachtenden Prozesses wiederhergestellt. Die Grundlagen der Verwendung photolabiler Schutzgruppen im biologischen Kontext wurden in zwei Pionierarbeiten 1977 von J.W. ENGELS und 1978 von J.F. HOFFMAN gelegt. Davon ausgehend haben sich zahlreiche Anwendungen photolabiler Schutzgruppen für biologisch interessante Molekülklassen entwickelt. Auf dem speziellen Gebiet der Nukleinsäuren wurden in den letzten Jahren einige fundamentale Mechanismen entdeckt und aufgeklärt, die nicht zuletzt auch therapeutisch interessante Anwendungsmöglichkeiten für photolabile Schutzgruppen bieten. Hierbei stellt das An-/Aus-Schaltverhalten von Nukleinsäuren jedoch ein nicht-triviales Problem dar. Selbst der gezielte Einbau einer einzelnen photolabilen Schutzgruppe in ein multifunktionales Oligonukleotid führt in der Regel nämlich nicht zu einer vollständigen Deaktivierung dessen. Ein multipler Einbau photolabiler Schutzgruppen entlang der Sequenz eines funktionellen Oligonukleotids schaltet die Hintergrundaktivität im deaktivierten Zustand zwar vollständig aus, allerdings müssen in diesem Fall hohe Bestrahlungsintensitäten bzw. –dauern für das Entfernen aller photolabilen Modifikationen angewendet werden. Dadurch geht zum einen die Zeitauflösung der lichtgeschalteten Prozesse verloren, nicht zuletzt erhöht sich dabei aber auch das Risiko von lichtinduzierten Schäden am biologischen System. Das Kernthema der vorliegenden Dissertation war es daher, neue Architekturen für den Aufbau photoaktivierbarer Oligonukleotide zu entwickeln.
Das erste große Projekt basierte auf der Annahme, dass sich Duplexstrukturen, die für die Funktion vieler Nukleinsäuremechanismen fundamental sind, durch Zyklisierung von Oligonukleotiden global destabilisieren und damit effizienter photoaktivieren lassen, als durch lokalen Einbau einzelner photolabiler Schutzgruppen in Oligonukleotide. Hierzu wurden geeignete Alkin-Modifikationen an photolabile Nitrobenzyl- und Cumarin-Schutzgruppen angebracht und diese an die Nukleobasen verschiedener DNA-Bausteine geknüpft. Es ist daraufhin gelungen, Oligonukleotide mit je zwei photolabilen Alkin-Modifikationen herzustellen und diese intrasequentiell über eine Cu(I)-katalysierte Click-Reaktion mit einem Bisazid-Linker zu zyklisieren. Die so erhaltenen Oligonukleotide wiesen dramatisch erniedrigte Schmelzpunkte gegenüber den nativen Duplexen, sowie gegenüber den zweifach photolabil geschützten Oligonukleotiden auf. Dabei wurde außerdem festgestellt, dass Zyklisierungsparameter wie die Linkerlänge, -polarität und –flexibilität und die Wahl der photolabilen Schutzgruppe keinen signifikanten Einfluss auf die Duplexstabilität hat. Über einen Bereich von Ringgrößen zwischen ca. 11-21 Nukleotiden wurden die niedrigsten Duplexstabilitäten beobachtet. Sehr kleine, sowie große Ringe ab 30 Nukleotiden wiesen dagegen höhere Stabilität auf.
Da mit dem entwickelten Zyklisierungskonzept auch mehrere Ringstrukturen innerhalb einer Oligonukleotidsequenz aufgebaut werden können, wurde im nächsten Schritt eine photoaktivierbare Variante des C10-Aptamers hergestellt, welches selektiv gegen Burkitt’s Lymphomzellen bindet. Dieses 90-mer DNA-Oligonukleotid wurde an drei Stellen photolabil Alkin-modifiziert und infolge mit einem Trisazid-Linker zu einer bizyklisierten Struktur verknotet. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten konnte demonstriert werden, dass das durch eine solche „Photo-Klammer“ deaktivierte C10-Aptamer keine Bindungsaffinität gegenüber Burkitt’s Lymphomzellen aufweist, die Bindungsaktivität jedoch nach Belichten wiederhergestellt werden kann. Mit Atomkraftmikroskopie-Experimenten ist es darüber hinaus gelungen, die Photoaktivierung des verknäuelten C10-Aptamers mit molekularer Auflösung abzubilden. Mit diesem Ergebnis können nun lange funktionelle Oligonukleotide auf definierte Weise photoaktivierbar gestaltet werden, insbesondere auch dann, wenn keine (Informationen über) funktionelle Sekundärstrukturen existieren.
...
The enzyme acetyl-CoA carboxylase (ACC) plays a fundamental role in the fatty acid metabolism. It regulates the first and rate limiting step in the biosynthesis of fatty acids by catalyzing the carboxylation of acetyl-CoA to malonyl-CoA and exists as two different isoforms, ACC1 and ACC2. In the last few years, ACC has been reported as an attractive drug target for treating different diseases, such as insulin resistance, hepatic steatosis, dyslipidemia, obesity, metabolic syndrome and nonalcoholic fatty liver disease. An altered fatty acid metabolism is also associated with cancer cell proliferation. In general, the inhibition of ACC provides two possibilities to regulate the fatty acid metabolism: It blocks the de novo lipogenesis in lipogenic tissues and stimulates the mitochondrial fatty acid β-oxidation. Surprisingly, the role of ACC in human vascular endothelial cells has been neglected so far. This work aimed to investigate the role of the ACC/fatty acid metabolism in regulating important endothelial cell functions like proliferation, migration and tube formation.
To investigate the function of ACC, the ACC-inhibitor soraphen A as well as an siRNA-based approach were used. This study revealed that ACC1 is the predominant isoform both in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and in human dermal microvascular endothelial cells (HMECs). Inhibition of ACC via soraphen A resulted in decreased levels of malonyl-CoA and shifted the lipid composition of endothelial cell membranes. Consequently, membrane fluidity, filopodia formation and the migratory capacity were attenuated. Increasing amounts of longer acyl chains within the phospholipid subgroup phosphatidylcholine (PC) were suggested to overcompensate the shift towards shorter acyl chains within phosphatidylglycerol (PG), which resulted in a dominating effect on regulating the membrane fluidity. Most importantly, this work provided a link between changes in the phospholipid composition and altered endothelial cell migration. The antimigratory effect of soraphen A was linked to a reduced amount of PG and to an increased amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) within the phospholipid cell membrane. This link was unknown in the literature so far. Interestingly, a reduced filopodia formation was observed upon ACC inhibition via soraphen A, which presumably caused the impaired migratory capacity.
This work revealed a relationship between ACC/fatty acid metabolism, membrane lipid composition and endothelial cell migration. The natural compound soraphen A emerged as a valuable chemical tool to analyze the role of ACC/fatty acid metabolism in regulating important endothelial cell functions. Furthermore, regulating endothelial cell migration via ACC inhibition promises beneficial therapeutic perspectives for the treatment of cell migration-related disorders, such as ischemia reperfusion injury, diabetic angiopathy, macular degeneration, rheumatoid arthritis, wound healing defects and cancer.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die Untersuchungen lichtgesteuerter Reaktionen der zwei Retinalproteine Channelrhodopsin-2 (ChR-2) und Proteorhodopsin (PR) mit Hilfe zeitaufgelöster Laserspektroskopie.
Da der Mechanismus der Kanalöffnung des ChR-2 bis heute nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, beschäftigt sich diese Arbeit insbesondere mit den Prozessen, die direkt nach der Photoanregung des Retinals stattfinden und die Kanalöffnung vorbereiten. Es wurde dabei gezielt auf für die Funktion des Proteins wichtige Faktoren wie strukturelle Besonderheiten des Chromophors und seiner Umgebung eingegangen und deren Auswirkung auf die Dynamik der Photoreaktionen sowie die Veränderungen im Protein nach der Anregung untersucht.
Zunächst wurden die Ergebnisse der vis-pump-IR-probe-Experimente an ChR-2 im Bereich der Carbonylschwingungsbanden protonierter Glutamat- und Aspartat-Reste dargestellt. Dabei wurde insbesondere die Bildungsdynamik der Differenzbanden in diesem Spektralbereich untersucht und in Anlehnung an die vorhandene Literatur eine Bandenzuordnung der für die Funktion des Proteins wichtigen Aminosäurereste vorgenommen. Aus den Messergebnissen konnte geschlossen werden, dass die mit der Kanalöffnung einhergehenden Konformationsänderungen in ChR-2 durch eine effektive Aufnahme der Überschussenergie durch das Protein auf einer sub-Pikosekunden-Zeitskala vorbereitet werden.
Des Weiteren wurden spektroskopische Untersuchungen an der R120H-Mutante des ChR-2 vorgestellt. Da diese Mutante bei elektrophysiologischen Messungen keine Kanalaktivität zeigte, sollte zunächst geklärt werden, ob die Mutation einen Einfluss auf die Retinalisomerisierung und den nachfolgenden Photozyklus hat. Dabei stellte sich heraus, dass die Retinalisomerisierung bei der R120H-Mutante zwar im Vergleich zum Wildtyp etwas verzögert stattfindet, der Einfluss der Punktmutation auf den weiteren Photozyklus jedoch insgesamt gering ist. Mit Hilfe der Kurzzeit-IR-Spektroskopie im Bereich der Amid I-Schwingung des Proteinrückgrats konnten für die Mutante allerdings signifikante Veränderungen der Bildungsdynamik sowie eine deutliche Abnahme der Amplitude des Amid I-Signals detektiert werden. Anhand weiterer Experimente an den Mutanten E123T und D253N in diesem Spektralbereich konnte anschließend ein Zusammenhang zwischen der Intensität der Amid I-Bande und der Kanalaktivität von ChR-2 festgestellt werden. Diese Ergebnisse ließen somit die Schlussfolgerung zu, dass die Aminosäurereste R120 und D253 eine entscheidende Rolle beim schnellen Transfer der Überschussenergie an das Protein nach der Retinalanregung und der so initiierten Kanalöffnung spielen.
Zusätzlich wurde der Frage nachgegangen, inwieweit Veränderungen am Chromophor die Isomerisierungsreaktion, den nachfolgenden Photozyklus sowie die Funktion des ChR-2 als Ionenkanal beeinflussen können. Zu diesem Zweck wurden spektroskopische Untersuchungen an einem mit 9-12-Phenylretinal (PheRet) rekonstituierten ChR-2 vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung des PheRet zu seiner 13-cis-Form in ChR-2 stark verlangsamt ist und verglichen mit dem nicht modifizierten Chromophor deutlich ineffizienter abläuft. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Veränderungen am Retinal zu deutlichen Beeinträchtigungen des Photozyklus führen. Zum einen wurde ein sehr schneller Zerfall des ersten Photoprodukts sowie die Bildung eines zusätzlichen, blauverschobenen Px-Zustands detektiert. Außerdem wurde festgestellt, dass nach der Deprotonierung des isomerisierten PheRet der Großteil der modifizierten Retinale in den Ausgangszustand zurückkehrt und der P3-Zustand nur in geringen Mengen gebildet wird. Die Messergebnisse führten somit zu der Schlussfolgerung, dass die all-trans-Konformation des PheRet in ChR-2 deutlich bevorzugt wird. Da elektrophysiologische Untersuchungen des Retinal-Analogons jodach keine signifikanten Verminderungen der Photoströme im Vergleich zum ATR in ChR-2 zeigten, ließ sich schließlich festhalten, dass die vorgenommenen Veränderungen am Chromophor, die zu einer deutlichen Hemmung der Isomerisierungsreaktion führen und einen starken Einfluss auf den nachfolgenden Photozyklus haben, nicht ausreichend sind, um die Kanalaktivität von ChR-2 komplett zu blockieren, solange noch ein kleiner Anteil der Retinale isomerisieren kann.
Der abschließende Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Absorption des UV-Lichts durch das Retinal mit deprotonierter Schiff-Base im grünabsorbierenden Proteorhodopsin, welches in einem alkalischen Medium im Dunkelzustand akkumuliert werden kann. Die Untersuchungen der Primärreaktion zeigten einen langsamen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands der UV-absorbierenden Spezies mit anschließender Bildung des 13-cis-Photoprodukts. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein Reaktionsmodell für die ersten Prozesse nach der UV-Anregung des Retinals im GPR aufgestellt werden, welches möglicherweise für weitere UV-Rezeptoren genutzt werden kann.
Licht ist ein wertvolles Werkzeug zur Regulation biochemischer Reaktionsabläufe. Denn die Applikation von Licht erlaubt eine sehr präzise Einflussnahme auf den Ort und den Startzeitpunkt der zu untersuchenden Reaktionen. Als nichtinvasives Medium bietet die Lichtkontrolle bei der Wahl einer geeigneten Anregungswellenlänge den Vorteil nur minimal in einen lebenden Organismus einzugreifen. Um eine solche lichtbasierte Kontrolle für biologische Anwendungen zu realisieren, ist die Anwesenheit einer lichtsensitiven Verbindung nötig. Ein Konzept der lichtsensitiven Verbindungen ist die sogenannte photolabile Schutzgruppe. Im Allgemeinen handelt es sich hierbei um einen Chromophor der temporär an ein Biomolekül angebracht wurde, um dessen biologische Aktivität zu unterdrücken.
In dieser Arbeit wurde dieses Konzept auf das Antibiotikum Puromycin angewendet, welches durch das synthetische Anbringen der Cumarin-Schutzgruppe DEACM in seiner biologischen Aktivität behindert und durch einen Lichtpuls wieder freigesetzt wurde. DEACM st eine photolabile Schutzgruppe mit breitem Anwendungsspektrum, da es im Vergleich zu anderen Cumarin-Derivaten vorteilhafte photophysikalische Eigenschaften aufweist. Zum einen ist durch den 7-Diethylamino-Substituenten das Absorptionsmaximum dieser Verbindung um etwa 20 nm bathochrom verschoben. Zum anderen zeichnet sich dieses Derivat durch einen erheblich erhöhten Extinktionskoeffizienten aus, sodass eine Freisetzungsreaktion mit einer geringeren Lichtdosis induziert werden kann, was weniger Stress für die Zellen in lebenden Systemen bedeutet.
Die antibiotische Wirkung von Puromycin beruht auf der strukturellen Ähnlichkeit zum5'-Ende von Tyrosyl-tRNA, wodurch sich das Antibiotikum kondonunspezifisch während der Translation der Proteinsynthese an das Ribosom anlagern kann. Anschließend wird die naszierende Polypeptidkette auf das Puromycin transferiert. Da diese neue Bindung unter biologischen Bedingungen nicht spaltbar ist, führt dies zu einer verfrühten Freisetzung des Polypeptid-Puromycin-Fragments. Schließlich ist die Proteinsynthese vollständig abgebrochen.
Die Motivation zur photoinduzierten Kontrolle von Puromycin besteht in der Vielzahl an biologischen Applikationsmöglichkeiten, da die lichtregulierte Freisetzung der biologischen Aktivität als Trigger für sich anschließende biochemische Abläufe verwendet werden kann. Durch das hier gezeigte System kann in Kombination mit anderen Techniken (z.B. NMR) die posttranslationale Proteinfaltung beobachtet werden, welche als hochgradig komplexer Prozess bisher nicht verstanden ist. Eine weitere Motivationsgrundlage ist die Anwendung von DEACM-puromycin in Nervenzellen. Hier kann durch die Photofreisetzung die Proteinsynthese in den Dendriten der Neuronen beobachtet werden, wodurch Rückschlüsse auf neurodegenerative Krankheiten möglich sein sollten, wie z.B. Alzheimer-Krankheit. In dieser Arbeit konnte in-vitro nachgewiesen werden, dass die antibiotische Wirkung von Puromycin mittels Licht kontrollierbar ist. Aus der photophysikalischen Grundcharakterisierung ging hervor, dass DEACM-puromycin einen hohen Extinktionskoeffizienten bei Wellenlängen größer als 380 nm aufweist. Folglich kann zur Induktion der Photolyse eine geringere Lichtdosis mit energiearmer Strahlung als bei dem Vorläufersystem NVOC-puromycin verwendet werden, angesichts dessen ist das hier vorgestellte DEACM-puromycin für Anwendungen in Zellen zu empfehlen.
Über die Kombination von quantenchemischen Rechnungen und spektroskopischen Methoden konnten die frühen Schritte der Freisetzungsreaktion bestimmt und quantifiziert werden. Zudem zeigte sich ein Einfluss der Lösungsmittelzusammensetzung auf die Uncaging-Schritte. In Gegenwart eines protischen Lösungsmittels wird der zum Uncaging in Konkurrenz stehende Prozess der Fluoreszenz unterdrückt, wodurch die Freisetzungsschritte effektiver werden. Zudem führt die Präsenz von Protonen zu einer Stabilisierung des ionischen Intermediates, sodass die Bildung dessen beschleunigt ablaufen kann. Die Spaltung der photolabilen Schutzgruppen vom Puromycin findet mit einer Rate von 0,71*10^8 s-1 statt, welche im Vergleich zu Vorgängersystem um eine Größenordnung größer ist. Die Wiederherstellung der biologischen Aktivität resultiert aber erst nach einem anschließenden Decarboxylierungsschritt. Mithilfe von IR-Messungen konnte die Decarboxylierung beobachtet und daraus die Quantenausbeute zu 2,5% determiniert werden. Die so bestimmte Quantenausbeute entspricht etwa dem Zweifachen von NVOC-puromycin, sodass die hier untersuchte Verbindung eindeutig als das effizientere System zu betrachten ist. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass DEACM-puromycin vorteilhafte photophysikalische Eigenschafen aufweist, die diese Verbindung zu einem wertvollen Hilfsmittel für eine Vielzahl von lichtkontrollierten Untersuchungen in biologischer Umgebung macht. Zudem wurden Einblicke in den Reaktionsmechanismus gegeben, die das Verständnis der photolytischen Spaltung von Carbamat-geschützten Cumarinen erstmals auf der ultrakurzen Zeitskala ermöglicht.
The endoplasmic-reticulum-associated protein degradation pathway ensures quality control of newly synthesized soluble and membrane proteins of the secretory pathway. Proteins failing to fold into their native structure are processed in a multistep process and finally ubiquitinated and degraded by the proteasome in order to protect the cell from proteotoxic stress. My thesis covers structural as well as functional studies of various protein components that constitute the protein complexes that are responsible for this process.
One sub-project addressed the mechanism of glycan recognition by Yos9 as part of the ERAD substrate selection. NMR solution structures of the mannose-6-phosphate homology (MRH) domain of Yos9 both in a free and glycan bound conformation reveal a gripping movement of loop regions upon binding of correctly processed glycan structures.
The main projects focused on revealing the mechanism of efficient ubiquitin chain assembly by the ERAD ubiquitination machinery. This included the investigation of the role of the ERAD components Cue1 and Ubc7 in processive ubiquitin chain formation, how ubiquitin chain conformations change during elongation, how the conformation of a chain is impacted by interacting proteins and finally understand the activity regulation of the ERAD E2 enzyme Ubc7 by its cognate RING E3 ligases. Nuclear magnetic resonance (NMR) analysis and fluorescence-based ubiquitination assays show that the CUE domain of Cue1 contributes with its proximal binding preference as well as with its position dependent accelerating effect to efficient ubiquitin chain formation. This is required to efficiently drive degradation of substrates. Specific ubiquitin binding events dictate and coordinate the spatial arrangement of the E2 enzyme relative to the distal tip of a chain. This process can be further accelerated by RING E3 ligases that promote Ubc7 activity by more than ~20 fold via inducing allosteric changes around the catalytic cysteine. My results additionally suggest a model where Ubc7 dimerization results in proximity induced activation of the E2. This data ensures rapid diubiquitin formation that is followed by a CUE domain assisted chain elongation mechanism where Cue1 acts in an E4 like fashion.
How ubiquitin binding events can modulate the conformations of a ubiquitin chain were investigated by pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) spectroscopy combined with molecular modeling. This shows that K48-linked diubiquitin samples a broad conformational space which can be modulated in distinct ways. The CUE domain of Cue1 uses conformational selection of pre-populated open conformations to support ubiquitin chain elongation. In contrast, deubiquitinating enzymes shift the conformational distribution to weakly or even non-populated conformations to allow cleavage of the isopeptide bond that connects adjacent ubiquitins. Ubiquitin chain elongation increases the sampled conformational space and suggests that this high conformational flexibility might contribute to efficient proteasomal recognition.
Verschiedene physikalische Effekte erlauben es Licht so zu führen und zu verändern, dass es Einblicke in für Menschen sonst unzugängliche Bereiche gewährt. Eines von insgesamt drei Elementen dieser Dissertationsschrift ist der Aufbau eines Multiphotonen-Mikroskops. Dieses fortschrittliche Werkzeug erweitert das zur Verfügung stehende Instrumentarium um verschiedene Analysemethoden, allen voran die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie. Durch geringfügige Modifikationen können auch weitere Methoden, wie beispielsweise stimulierte Raman-Streuung realisiert werden.
Insbesondere die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie war für das zweite Element dieser Dissertationsschrift von großer Bedeutung. In dieser Studie wurde das Bleichverhalten von Spinach bei 2-Photonen-Absorption untersucht, sowohl an frei in Lösung befindlichen als auch auf einem Träger immobilisierten Spinach-Komplexen. Die Ergebnisse zu den frei in Lösung befindlichen Spinach-Komplexen zeigen, dass die Verstärkung der Fluoreszenz von DFHBI grundsätzlich auch im Fall der 2-Photonen-Absorption eintritt. Dabei wurde ein Ausbleichen der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz für frei in Lösung befindliche Spinach-Komplexe erst bei außerordentlich hohen Intensitäten der Anregungsstrahlung beobachtet. Dieser Befund kann zumindest teilweise auf das Eindiffundieren fluoreszenter Spinach-Komplexe in das sehr kleine Fokalvolumen innerhalb der 2-Photonen-Anregung stattfindet zurückgeführt werden. Für immobilisierte Spinach-Komplexe konnte gezeigt werden, dass eine kontinuierliche Bildaufnahme gegenüber einer Bildaufnahme in Intervallen mit jeweils zusätzlichen Dunkelphasen zur Erholung des reversiblen Bleichens der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz, sowie der generelle Verzicht auf spezielle Belichtungsschemata und Methoden der Datenakquise mit keinen besonderen Nachteilen verbunden ist. Abschließend betrachtet erweist sich Spinach bei 2-Photonen-Anregung als ausgesprochen resistent gegenüber einem irreversiblem Ausbleichen des Fluoreszenzsignals.
Als drittes Element dieser Dissertationsschrift wurde die Dynamik von Chrimson, einem Kanalrhodopsin mit rot-verschobener Absorption mittels zeitaufgelöster Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Sowohl die Anregungswellenlänge als auch der pH-Wert bzw. der Protonierungszustand des Gegenions haben einen messbaren Einfluss auf die Primärreaktion. Diese verlangsamt sich, sobald der pH-Wert abgesenkt oder die Anregungswellenlänge rot-verschoben wird. Darüber hinaus führt eine Rot-Verschiebung der Anregungswellenlänge zu einer geringeren Effizienz der Isomerisation des Retinal-Chromophors. Die Primärreaktion von Chrimson entspricht dabei einem Reaktionsmodell mit einer Verzweigung des Reaktionspfades auf der Energiehyperfläche des angeregten Zustandes. Ein Reaktionspfad führt dabei durch ein lokales Minimum, welches in seiner Ausprägung stark von der elektrostatischen Umgebung des Retinal-Chromophors abhängt. Je nach ursprünglichem Protonierungszustand des Gegenions der Retinal-Schiff-Base wurden große Unterschiede hinsichtlich der beobachteten transienten Absorptionsmuster für den im Anschluss von Chrimson durchlaufenen Photozyklus gefunden. Bei pH 6,0 weist der Photozyklus von Chrimson eine insgesamt deutlich schnellere Kinetik auf, als es für den Photozyklus bei pH 9,5 beobachtet wurde. Es ist bemerkenswert, dass in elektrophysiologischen Messungen für beide Photozyklen eine Öffnung des Ionenkanals gefunden wurde. Die Kanalfunktion von Chrimson ist somit grundsätzlich nicht vom Protonierungszustand des Gegenions abhängig, wenngleich die Kinetik des Ionenkanals durchaus davon beeinflusst wird. Dies deutet auf Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen dem Ionenkanal und dem Gegenion der Retinal-Schiff-Base hin.
Im ersten Projekt der vorliegenden Arbeit wurden CD - 1 Mäuse mit drei unterschiedlichen Diäten für zwei Wochen ad libitum gefüttert. Die Diäten bestanden aus zwei kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten und einer Standard Haltungsdiät. Die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten enthielten entweder Triheptanoin (dreifach mit Heptanoat verestertes Glycerol) oder Soja - Öl als Fettkomponente (jeweils 35 % der Gesamtkalorien). Nach zwei Wochen wurde ein ischämischer Schlaganfall für 90 min. mithilfe eines Silikonfadens induziert. Die Leber, das Blut und das Gehirn wurden nach dem Schlaganfall entnommen und die Konzentrationen der Metabolite β - Hydroxybutyrat, Glukose, Laktat und Citrat wurden mit der zuvor etablierten GC - MS-Methode ermittelt. Unter gleichen Bedingungen wurde eine Mikrodialysestudie durchgeführt.
Bei den Tieren, die die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten erhielten, konnte in den Leber - und Hirnhomogenaten, im Plasma sowie im Mikrodialysat eine Ketose festgestellt werden. Die BHB Konzentrationen durch eine Soja Diät erreichten im Leberhomogenat bis zu 4 mM, im Plasma bis zu 1,5 mM, im Hirnhomogenat bis zu 1,5 mM und im Mikrodialysat bis zu 30 µM. Um eine Aussage treffen zu können, ob das Gehirn die von der Leber produzierten Ketonkörper als Energiesubstrate nutzen kann, wurde eine Folgestudie (unter gleichen Bedingungen) durchgeführt. Bei dieser Studie wurde der Zeitpunkt der Gewebeentnahme 60 min. nach Entfernen des Fadens (Reperfusion) gewählt. In den Leber – und Hirnhomogenaten konnten erniedrigte Konzentrationen des Ketonkörpers BHB nachgewiesen werden. Die nicht operierten Tiere, die eine fettreiche Diät erhielten, hatten erhöhte Konzentrationen an Citrat in den genannten Geweben. Durch den Abbau des Ketonkörpers BHB können bei Verstoffwechslung in Geweben außerhalb der Leber, zwei Moleküle Acetyl - CoA gebildet werden. Diese gebildeten Acetyl - CoA Moleküle können in den Citratzyklus eingespeist werden.
Um diesen Befund mechanistisch besser verstehen zu können, wurde den Mäusen Propranolol (ein unselektiver β - Blocker) verabreicht, und zwar kurz nachdem der Faden die mittlere Zerebralarterie verschlossen hatte. Als Folge blieb bei den fettreich gefütterten Tieren die zuvor beobachtete Ketose, aus. Daraus wurde geschlossen, dass die auftretende Ketose bei den fettreich gefütterten Tieren durch adrenerge β - Rezeptoren vermittelt wurde. Zusammengefasst kann eine fettreiche bzw. ketogene Ernährung im Falle einer Ischämie die Versorgung des Gehirns durch die Bildung von Ketonkörper gewährleisten.
Die zu beobachtende hepatische Ketogenese aus dem ersten Projekt hat die Frage entstehen lassen, ob eine akute Gabe von β - Hydroxybutyrat (BHB) bei Entfernen des Fadens schützende Effekte auf das Verhalten bzw. die Mitochondrien als Kraftwerke der Zelle hat. Hierzu wurde BHB bei Reperfusion gegeben und die Wirkungen dieser Einmalgabe nach 24 h untersucht. Als erster Schritt wurde der Nachweis erbracht, dass eine exogene Gabe von BHB das Gehirn erreicht. Im zweiten Schritt wurde das Verhalten der Mäuse nach 24 h untersucht. Hierbei erbrachte die Gabe von BHB eine signifikante Verbesserung der sensorischen und motorischen Fähigkeiten der Mäuse. Die metabolischen Veränderungen nach 24 h wurden erneut in Leberhomogenaten und Plasma vermessen. Eine Einzelgabe von BHB bewirkte eine milde Ketose auch 24 h nach Reperfusion der mittleren Zerebralarterie. Um eine detailliertere Erkenntnis über die Wirkung von BHB zu erlangen, wurden die Mitochondrien als potentielles Ziel für BHB in den Fokus genommen. Die Einmalgabe von BHB verhinderte ein Absinken der Komplex – II Aktivität. Außerdem kann die Aktivität der Citratsynthase unter der Gabe von BHB erhalten werden, sodass die Mitochondrien vor allem im wichtigen Zeitraum nach der Reperfusion geschützt werden. Im Rahmen der Untersuchungen der Mitochondrien wurden unterschiedliche Substrateinflüsse auf die Respiration der isolierten Mitochondrien getestet. Bei Zugabe von BHB, Oxalacetat + Acetat oder Citrat zu dem Respirationsmedium stieg die Respiration der Mitochondrien an. Im Falle von Glukose, Propranolol oder Acetat wird die Respiration verringert. Bei Zugabe von Laktat, verbleibt die Respiration auf Ausgangsniveau. Abschließend ist festzustellen, dass die Einzelgabe von BHB nach 24 h das Verhalten der Mäuse verbessert, eine milde Ketose induziert, sowie Mitochondrien und die Citratsynthase gegen ischämische Ereignisse schützt.
Um die in dieser Arbeit gezeigten Daten über metabolische Veränderungen zeigen zu können, musste eine vorherige Etablierung der GC – MS Analytik vollzogen werden. Auf der einen Seite musste die Probenvorbereitung, aber auch die gesamte Vermessung der Proben aufgebaut werden. Es wurden insgesamt 11 Analyte in vier unterschiedlichen Kompartimenten quantifiziert. Die Nachweisgrenze lag bei diesen 11 Analyten bei 0,01 - 1 ng/µl, was einer umgerechneten Stoffmengenkonzentration von 0,5 - 10 µM entspricht. Mithilfe dieser Methode können optional weitere Substanzen aus verschiedenen Geweben zugänglich gemacht werden. Diese Arbeit bietet hierzu eine Anleitung, wie die Etablierung erfolgen kann. Im Rahmen der Probenvorbereitung wurden alle Schritte systematisch verbessert. Dazu wurden Wiederholungsmessungen für unterschiedliche Modalitäten vollzogen. Die Abundance und die Zeitbeständigkeit waren die wesentlichen Beurteilungskriterien. So wurden die Daten für die Extraktionseffektivität, die Lösungsmittelabhängigkeit der Silylierung, der Zusatz von Hünig - Base sowie die Temperatur und Zeitabhängigkeit der Silylierung in dieser Arbeit erarbeitet. Die Quantifizierung wurde anhand von internen Standardverbindungen durchgeführt. Die jeweiligen Response – Faktoren blieben über die gesamte Zeit nach der Etablierung konstant und erlaubten die Quantifizierung mit geringen Fehlern. Die Beurteilung der ermittelten Daten über die Validierung wurden anhand von geltenden Regelwerken der pharmazeutischen Industrie entschieden. Es wurde ein Protokoll entwickelt, das im Rahmen der universitären Forschung eine vertrauenswürdige Aussage über Veränderungen von Metabolitenspiegeln in vielen Geweben der Maus und der Ratte geben kann.
G-protein coupled receptors (GPCRs) are a predominant class of cell-surface receptors in eukaryotic life. They are responsible for the perception of a broad range of ligands and involved in a multitude of physiological functions. GPCRs are therefore of crucial interest for biological and pharmaceutical research. Molecular analysis and functional characterisation of GPCRs is frequently hampered by challenges in efficient large-scale production, non-destructive purification and long-term stability. Cell-free protein synthesis (CFPS) provides new production platforms for GPCRs by extracting the protein synthesis machinery of the cell in an open system that allows target-oriented modulations of the synthesis process and direct access to the nascent polypeptide chain. CFPS is fast, reliable and highly adaptable. Unfortunately, highly productive cell-free synthesis of GPCRs is often opposed by low product quality. This thesis was aimed to adapt and improve some of the new possibilities for the cell-free production of GPCRs in high yield and quality for structural and pharmaceutical analysis. An E. coli based CFPS system was applied to synthesise various turkey and human Beta-adrenergic receptor (Beta1AR) derivatives as well as human Endothelin receptors type A and B (ETA and ETB) constructs. Both receptor families are important drug targets and pharmacologically addressed in the treatment of several cardiovascular diseases. CF-synthesis was mainly performed in presence of nanodiscs (ND), which are reconstituted high density lipoprotein particles forming discoidal bilayer patches with a diameter varyring from 6 to approx. 15 nm. The supplementation of ND in the CF-synthesis reaction caused the co-translational solubilisation of the freshly synthesised GPCRs. The fraction of the solubilised GPCR that was correctly folded was analysed by the competence to bind its ligand alprenolol or Endothelin-1, respectively. Both the solubilisation efficiency and the ability to fold in a ligand binding competent state was strongly affected by the lipid composition of the supplied ND. Best results were generally achieved with lipids having phosphoglycerol headgroups and unsaturated fatty acid chains with 18 carbon atoms. Furthermore, thermostabilisation by introduction of point mutations had a large positive impact on the folding efficiency of both Beta1AR and ETB receptor. Formation of a conserved disulphide bridge in the extracellular region was additionally found to be crucial for the function of the ETB receptor. Disulphide bridge formation could be enhanced by applying a glutathione-based redox system in the CFPS. Further improvements in the quality of ETB receptor could be made by the enrichment of heat-shock chaperones in the CF-reaction. Depending on the receptor type and DNA-template, roughly 10 – 30 nmol (350 – 1500 µg) of protein could be synthesised in 1 ml of CF-reaction mixture. After the applied optimisation steps, the fractions of correctly folded receptor could be improved by several orders of magnitude and were finally in between 35% for the thermostabilised turkey Beta1AR, 9% for the thermostabilised ETB receptor, 6.5% for the non-stabilised ETB receptor, 1 - 5% for non-stabilised turkey Beta1AR and for human Beta1AR isoforms and 0.1% for ETA receptor. Therefore, between 2 and 120 µg of GPCR could be synthesised in a ligand binding competent form, depending on the receptor and its modifications. Correctly folded turkey Beta1AR and ETB receptors were thermostable at 30°C and could be stored at 4°C for several weeks after purification. Yields of the thermostabilised turkey Beta1AR were sufficient to purify the receptor in a two-step process by ligand-binding chromatography to obtain pure and correctly folded receptor in the lipid bilayer of a ND. Furthermore, a lipid dependent ligand screen could be demonstrated with the turkey Beta1AR and significant alterations in binding affinities to currently in-use pharmaceuticals were found. The established protocols are therefore suitable and highly competetive for a variety of applications such as screening of GPCR ligands, analysis of lipid effects on GPCR function or for the systematical biochemical characterisation of GPCRs. Most promising for future approaches appears to address the suspected bottlenecks of intial insertion of the GPCR-polypeptide chain in the ND bilayer and the thermal stability of the receptors. Nevertheless, the estabilised protocols for the analysed targets in this thesis are already highly competitive to previously published production protocols either in cell-based or cell-free systems with regard to yield of functional protein, speediness and costs. Moreover, the direct accessibility and other general characteristics of cell-free synthesis open a large variety of possible applications and this work can therefore contribute to the molecular characterisation of this important receptor type and to the development of new pharmaceuticals.
Metal ions as novel polarizing agents for dynamic nuclear polarization enhanced NMR spectroscopy
(2017)
High-spin complexes of Gd(III) and Mn(II) were introduced as polarizing agents (PAs) for solid-state dynamic nuclear polarization (DNP) in 2011. This dissertation was undertaken in 2013, with the intention of exploring these PAs further. Major goals of this work were to understand their DNP mechanism(s) and explore their application in biomolecular research. This cumulative thesis details the methods, advantages, and practical implications of using high-spin PAs for MAS DNP. Data from electron paramagnetic resonance (EPR) and NMR spectroscopy are discussed for a complete understanding of DNP mechanisms.
Out of the two main mechanisms − solid effect (SE) and cross effect (CE − active under experimental conditions of solid-state DNP, commonly used nitroxide PAs evoke CE owing to their broad EPR spectra. On the other hand, DNP mechanisms evoked by high-spin metal ions seem non-trivial due to additional features (originating from spin-orbit coupling or zero field splitting) in their EPR spectra. The features of the EPR signal generally influence the shape of enhancement profiles. Therefore, the metal ion with a simpler EPR signal i.e., Gd(III) , is chosen as the starting point for the investigation of DNP mechanisms. Varying concentrations (2, 10, 20 mM) of a water-soluble and stable complex Gd-DOTA was dissolved as the PA in a glycerol-water solution of 13C,15N - urea. Field profiles of DNP enhancement on each nuclear type (1H, 13C, and 15N) establishes SE as the active DNP mechanism at the smallest PA concentration (2 mM). This confirms the theoretical predictions that narrow line width of the Gd(III) EPR signal arising from the central transition (CT, ms = -1/2 +1/2) allows for resolved SE DNP. However, that is no longer the case at higher PA concentrations of 10 and 20 mM. At higher Gd(III) concentrations, the CE mechanism contributes significantly and varies with nuclear Larmor frequency (ωn) of the concerned nuclei. The enhancement maxima shifts towards the EPR resonance as the contribution from CE increases. This shift is evident in the field profiles of 15N and 13C, whereas that of 1H is least influenced. This observation can be explained by combining theoretical estimates with the experimental data; the CE is evoked by increased dipolar coupling (Dee) – a prerequisite for CE – between neighboring Gd(III) spins as the statistical inter-spin distance shortens at elevated concentrations. This finding is important because the knowledge of active DNP mechanisms is essential for accurate interpretation of results from DNP experiments.
From the experiments on Gd-DOTA it becomes clear that concentration, inter-spin distances, and hence induced Dee are intertwined. In order to explicitly address the influence of inter-spin distances on DNP mechanisms we started a collaboration with the group of Adelheid Godt (Bielefeld). In this collaborative project, bis-complexes of the type Gd(III)-spacer-Gd(III) with variable spacer lengths were investigated. These PAs provided an excellent model system where the influence of only inter-spin distances can be determined for a fixed Gd(III) concentration. A small PA concentration of 4 mM is used to ensure absence of significant inter-molecular dipolar interactions. A mono-Gd complex of similar geometry and chemistry is taken as a reference for SE DNP.
The mono-Gd complex yields enhancements arising from SE as expected from negligible inter-molecular Dee. The contribution of CE increases as the inter-spin distances between Gd(III) ions become shorter going from 3.4 nm 2.1 nm 1.4 nm 1.2 nm due to corresponding increase in Dee. The extent of CE on ωn follows the same trend as for Gd-DOTA. Highest CE contribution is observed on nuclei with the smallest ωn 15N because smaller ωn approaches the width of the EPR signal, this is an additional requirement for CE DNP.
The field position for maximum DNP enhancement corresponding to Gd-DOTA, is used for DNP experiments on Ubiquitin with an attached Gd-tag as PA. The success of DNP on this sample illustrates the possibility of site-directed DNP with metal ions tags as PAs. As a perspective Gd-tags can be used to examine change in conformation of a protein that would give higher enhancements due to CE if two Gd(III) labeled domains are closer in space. In a separate project, Mn(II) (s=5/2) bound to the divalent site of a hammerhead ribozyme was used as a PA which resulted in the first demonstration of intra-complex DNP using an intrinsically bound metal ion PA.