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Bisherige zellfreie Labormethoden und in-vitro-Diagnostik zielen darauf ab, die Zeit von der Auslösung der Gerinnung bis zur Gerinnselbildung zu messen. Sie sind aber nicht für die Messung der Wirksamkeit von rFVIIa als Medikament geeignet, das für seine hämostatische Wirksamkeit die Funktionen von Blutzellen, besonders Plättchen, benötigt. Außerdem erfassen diese Gerinnungsteste nur einen bestimmten Abschnitt der Gerinnung und ein Zeitablauffenster, welches einen geringen Anteil (<5 %) des insgesamt gebildeten Thrombins erfasst und die Dynamik der Thrombingenerierung unberücksichtigt lässt. Die Plättchen und ihre Physiologie spielen aber die Hauptrollle in der Phospholipid-Präsentation die auf der Plättchenmembran erfolgt. Dies ist Voraussetzung für eine individuell ausreichende Thrombinbildung. Die Erfassung des endogenen Thrombinpotentials (ETP) in plättchenreichem Plasma, wie sie in dieser Arbeit verwendet wurde, überwindet diese methodischen Nachteile der etablierten Teste. Damit lässt sich eine individuelle Wirkungs- und Risikovorhersage erstellen, da hämostaserelevante Charakteristika wie z.B. Erkrankungen, Komedikation, Geschlecht, Umwelt- und lebensstilabhängige Faktoren, in die Untersuchungen einbezogen werden. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, die inter- und intraindivuellen Unterschiede in der Thrombinbildung in plättchenreichem Plasma (PRP) zeigt. Ausgehend von den dargestellten in-vitro Ergebnissen mit gesunden Probanden wurde die Wirksamkeit von rFVIIa im TGT, zusätzlich vergleichend und validierend mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS), bei Patienten mit Thrombasthenie Glanzmann untersucht. Diese sind aufgrund einer thrombozytenfunktionsstörungsbedingten Blutungsneigung in den plasmatischen Gerinnungstesten unauffällig. Evaluiert wurden hetero- und homozygote Patienten mit unterschiedlichen zugrundeliegenden Mutationen. Zuerst wurden Proben von einer Familie in-vitro untersucht, dann eine Patientin, die im Rahmen eines zahnärztlichen Eingriffs (ex-vivo-in-vitro) unter Einbindung der klinischen Beobachtung überwacht wurde. Der TGT zeigt eine deutliche prohämostatische Wirksamkeit von rFVIIa bei allen Probanden und Patienten, FACS erfasst die zugrundeliegenden Zellfunktionen. Dabei werden Unterschiede zwischen gesunden Probanden, heterozygoten und homozygoten Patienten aufgezeigt, die diagnostisch und therapeutisch verwertbar sind. Unterschiedliche Mutationen und weitere ursächliche thrombozytäre Mechanismen schlagen sich in entsprechenden Änderungen der gemessenen FACS-Parameter nieder, die zum großen Teil mit den TGT-Werten für ETP und PEAK korrelieren. Die TGT-Werte zeigen, gerade für die Patientin EG, deren Behandlung mit rFVIIa überwacht wurde, eine stärkere Korrelation mit der Klinik als die FACSMethode. Diese wiederum erfasst die zellfunktionsbedingten Ursachen analytischer. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Messung und Auswertung der TGT-Parameter ETP und PEAK, in geringerem Maße LT und TTP, die prohämostatische Wirkung Zellfunktions-basierter Medikamente in plättchenreichem Plasma erfasst. Damit erlaubt sie über die Charakterisierung von Gerinnungsstörungen hinaus prädiktive Aussagen über die individuell angemessene Dosierung von rFVIIa (NovoSeven®).

Bisher existieren keine etablierten Methoden zur Überwachung einer Therapie mit GPIIb/IIIa Antagonisten. Die Dosierung erfolgt nach empirisch erhaltenen Schemata. Um eine antiaggregatorische Therapie mit GPIIb/IIIa Antikörpern (Reopro®) zu überwachen ist neben der turbidimetrischen Agonisten induzierten Aggregation die Bestimmung der Fibrinogenbindung mittels Durchflußzytometrie denkbar. Neue orale GPIIb/IIIa Antagonisten werden derzeit in klinischen Studien geprüft. Zukünftige Indikationen, wie eine dauerhafte antiaggregatorische Therapie in der Primärprophylaxe und der Sekundärprophylaxe nach kardiovaskulären Ereignissen benötigten die Einhaltung eines engen niedrigeren therapeutischen Bereich als bei der Behandlung nach einer PTCA. Dies ist auch im Hinblick optimaler Effektivität bei gleichzeitiger Limitierung von haemorrhagischen Komplikationen notwendig. Bisher ist nicht bekannt, ob die in einigen Studien benutzten Methoden (Aggregation, Durchflußzytometrie und Blutungszeit) zum Monitoring einer Therapie mit GPIIb/IIIa Antikörpern auch für ein Therapiemonitoring von oralen peptidomimetischen Antagonisten übertragbar sind. Ein adäquates Monitoring dieser Substanzen dürfte für ihre Weiterentwicklung unabdingbar sein, besonders vor dem Hintergrund der bisher durchgeführten Studien, die alle fehlgeschlagen sind und bei denen kein Therapiemonitoring durchgeführt wurde. In dieser Arbeit wurden folgende Methoden verglichen: Turbidimetrische Aggregometrie, Impedanzaggregometrie, Fibrinogenbindung und Blutungszeit. Für die durchflußzytometrische Bestimmung der Fibrinogenbindung wurde eine Vollblutmethode entwickelt mit der selektiv die Rezeptorblockade unterschiedlicher Fibrininogenrezeptorantagonisten bestimmt werden kann. Zunächst konnte gezeigt werden, daß verminderte Zellzahlen in der Probenaufbereitung keine Fehlerquelle darstellen. Lysierte Erythrozyten, auch in niedrigen Konzentrationen können den Meßansatz dagegen erheblich stören. Dadurch kommt zu einer linearen Aktivierung der Thrombozyten. Um Verdünnungseffekte bei einer Peptidomimetikatherapie während der Probenaufbereitung zu bestimmen, wurden Verdünnungsreihen mit SR121566a (einem peptidomimetischen Prodrug) gespiked und die Fibrinogenbindung bestimmt. Dabei konnte eine Reduktion der Hemmung der Fibrinogenbindung nachgewiesen werden. In einer klinischen Studie wurde die turbidimetrische Aggregometrie mit der durchflußzytometrischen Bestimmung der Fibrinogenbindung verglichen. Die Probanden wurden mit ASS und/oder Clopidogrel vorbehandelt und es erfolgte eine Probenentnahme vor und nach Medikamenteneinnahme. Ein Teil der Proben wurde mit SR121566a und Abciximab in vitro gespiked. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigten eine dosisabhängige Inhibition der Fibrinogenbindung bei allen vier Substanzen, die auch additiv wirkten. Die Hemmung lag in einem Bereich von 0% bis 95%. Im Gegensatz dazu war die induzierte Aggregometrie unterhalb einer 50% Rezeptorblockade nahezu normal und damit als Monitoringtest nicht geeignet. Der therapeutische Bereich bei zukünftigen Indikationen von einer Therapie mit oralen GPIIb/IIIa Hemmern in der Sekundärprävention von kardiovaskulären Ereignissen benötigt eine standardisierte und sensitive Methode zum Monitoring. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß die durchflußzytometrische Bestimmung von Fibrinogen am GPIIb/IIIa Rezeptor in 1:1 verdünntem Vollblut eine gute Möglichkeit für die Etablierung therapeutischer Bereiche in der Langzeitprophylaxe bietet.