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Diese Arbeit beschreibt die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung von zwei neuen humanen S1P-Rezeptoren. Damit wird die Familie der S1P-Rezeptoren um einen hochaffinen und einen niedrig affinen Rezeptor erweitert. Die Untersuchungen der Expressionsprofile aller humanen S1P/LPA-Rezeptoren sowohl in Herz-Kreislauf-relevanten Geweben als auch in Endothelzellen und glatten Muskelzellen erfolgten bisher nicht im Sinne der hier dargestellten familienübergreifenden Betrachtung. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit erstmalig auch der hS1P5-Rezeptor mit eingeschlossen. Wir konnten zeigen, dass zur Beurteilung der S1P- und LPA-Effekte in den untersuchten Gewebe- und Zellarten neben den bisher bekannten sieben Rezeptoren auch der hS1P5-Rezeptor betrachtet werden muss. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da in bisherigen Untersuchungen insbesondere bei der Interpretation der S1P-Wirkungen nur die Rezeptoren S1P1-3 berücksichtigt wurden. In dieser Arbeit wurde außerdem zum ersten Mal eine große Anzahl potentieller Lipidliganden an den S1P-Rezeptoren S1P1-3 und 5 sowie am hGPR63 getestet. Auch wenn hierbei keine neuen Liganden identifiziert werden konnten, grenzen unsere Untersuchungen die Zahl potentieller zusätzlicher Liganden ein. Außerdem konnten wir zeigen, dass Suramin nicht - wie bisher vermutet - ein spezifischer Antagonist des S1P3-Rezeptors ist, sondern auch S1P5-Rezeptor-vermittelte Effekte blockieren kann. Hierdurch kann eine Fehlinterpretation von durch Suramin-hemmbaren Effekten verhindert werden. Ein wichtiger Befund dieser Arbeit, insbesondere für die pharmazeutische Industrie, ist die speziespezifische Expression des S1P5-Rezeptors. Während in der Ratte hauptsächlich eine Verteilung des Rezeptors im ZNS zu beobachten ist, findet sich das humane Homologe hauptsächlich in peripheren und hier insbesondere Herz-Kreislauf-relevanten Geweben. Der Einsatz von Tiermodellen, bei denen es sich in der Regel um Nager handelt, zur Untersuchung der S1P-Effekte muss daher kritisch überdacht werden, da in diesem Fall ein im Menschen potentiell relevanter Rezeptor nicht in den peripheren Geweben der Ratte vorhanden und somit nicht an den S1P-Wirkungen beteiligt ist. Zudem konnten wir auch funktionelle Unterschiede zwischen den beiden Rezeptoren unterschiedlicher Spezies beobachten, was zusätzlich gegen die Verwendung von Tiermodellen zumindest bei Untersuchungen des S1P5-Rezeptors spricht. Neben der erstmaligen Charakterisierung der Signaltransduktionswege des S1P5-Rezeptors konnte im Laufe dieser Arbeiten eine weitere neue Eigenschaft des S1P5-Rezeptors festgestellt werden: Dieser ist in der Lage, ligand-unabhängige Effekte hervorzurufen. Dies ist von Bedeutung, da häufig Rezeptoren, die aufgrund von Mutationen konstitutiv aktiv sind, für die Ausbildung von Krankheiten verantwortlich sind. Wir konnten darüberhinaus zeigen, dass der zweite in dieser Arbeit identifizierte S1P-Rezeptor, der orphan-hGPR63, von relativ hohen Konzentrationen an S1P sowie von doPA angeschaltet wird. Wenngleich die Affinität des hGPR63 zu doPA niedrig ist, ist dies jedoch der erste Rezeptor, der auf dieses Lipid reagiert. Welche physiologische Bedeutung diesem Rezeptor zukommt, ist noch völlig offen, die primäre Expression im Hirn weist jedoch auf eine zumindest partielle zentrale Wirkung hin. Zusätzlich zu den molekularbiologischen Befunden können aus dieser Arbeit wichtige Informationen für das Screenen von GPCRs und hier insbesondere von Lipid-GPCRs abgeleitet werden. Allgemein gilt, dass der Auswahl des richtigen Versuchssytems im Hinblick auf die Fragestellung und das zu untersuchende Protein eine entscheidende Bedeutung zukommt. Während bei Rezeptoren mit einer restriktiven Gewebeverteilung die Suche nach einem geeigneten Zellsystem keine Schwierigkeiten bereitet, stellt dies das Hauptproblem in der Lipidforschung dar. Da es keine Säugerzellen gibt, die nicht auf S1P reagieren, muss jedes Versuchssystem erneut auf Eignung und optimale Zellart untersucht werden. So konnten in transient transfizierten CHO-K1-Zellen hintergrundfreie S1P-Signale im FLIPR-Versuch gemessen werden, während in den MAP-Kinase-Versuchen in CHO-K1-Zellen der hohe endogene Hintergrund das Versuchsfenster auf ein Minimum reduzierte. Während die Messung von LPA-Effekten in CHO-K1-Zellen mit der FLIPR-Technologie aufgrund der endogenen Signale nicht möglich ist, können LPA-Effekte in McARH7777-Zellen ohne störenden Hintergrund gemessen werden. In diesem Zellsystem ist wiederum die Messung von S1P nicht oder nur begrenzt möglich. Auch wenn diese Beispiele spezifisch für Lipidrezeptoren sind, lässt sich doch aus dieser Arbeit die Notwendigkeit ableiten, neben der richtigen Substanz-Bibliothek besonders bei der Suche nach Liganden für orphan-GPCRs das richtige zelluläre System einzusetzen.

G­Protein­gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine der größten in der Natur vorkommenden Proteinfamilien dar (Watson and Arkinstall, 1994). GPCRs sind plasmamembranständige Proteine, die mit heterotrimären G­Proteinen interagieren und eine Vielzahl an Signaltransduktionswegen aktivieren. Trotz der strukturellen Vielfalt der an GPCRs angreifenden Liganden stimulieren die meisten GPCRs nur eine begrenzte Anzahl strukturell sehr ähnlicher G­Proteine (Hedin et al., 1993; Conklin and Bourne, 1993). Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die dieser Rezeptor/G­Protein­Kopplungsselektivität zugrunde liegen, ist von fundamentaler Wichtigkeit für das Verständnis zellulärer Signaltransduktion. Ausführliche Struktur­Funktionsanalysen verschiedener Neurotransmitter­ rezeptoren, einschließlich der Muskarinrezeptoren (Wess, 1996) und adrenergen Rezeptoren (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994), haben einen beträchtlichen Beitrag zur Identifizierung der strukturellen Elemente, die für die G­Protein­Kopplungsselektivität dieser Rezeptorgruppe verantwortlich sind, geleistet. Im Gegensatz dazu ist bisher noch weitgehend ungeklärt, welche molekularen Mechanismen der Kopplungsselektivität von GPCRs, die durch Peptidliganden aktiviert werden, zugrunde liegen. Das Ziel dieser Arbeit war daher, molekulare Grundlagen der G­Protein­ Kopplungsselektivität von Peptid­GPCRs näher zu untersuchen und aufzuklären. Die Vasopressinrezeptorfamilie unterscheidet sich von nahezu allen anderen Peptid­GPCRs darin, daß die einzelnen Rezeptorsubtypen deutlich unterschiedliche G­Protein­ Kopplungspräferenzen aufweisen. Die V1a­ und V1b­Vasopressinrezeptoren stimulieren selektiv G­Proteine der Gq/11 ­Familie, was zur Aktivierung von Phospholipase­Cbeta-Isomeren führt. Im Gegensatz dazu koppelt der V2­Vasopressinrezeptor vornehmlich an das G­Protein G s , was in einem Anstieg an intrazellulärem cAMP resultiert. Daher stellen die Vasopressinrezeptorsubtypen ein attraktives Modellsystem zum Studium der Peptid­ GPCR­Rezeptordomänen, die für die selektive G­Protein­Aktivierung verantwortlich sind, dar. Als Modellsystem für diese Arbeit diente primär der V2­Vasopressinrezeptor. Molekulare Faktoren, die die Gs ­ Kopplungsselektivität des V2­ Vasopressinrezeptors bestimmen. Eine frühere Studie zeigte, daß die Gegenwart der V1a­Rezeptorsequenz in der zweiten intrazellulären (i2) Schleife notwendig war, um den Wildtyp V1a und V1a/V2­ Rezeptorchimären effizient an Gq/11 ­Proteine zu koppeln (Liu and Wess, 1996). Effiziente Interaktionen zwischen Wildtyp V2 oder V1a/V2­Rezeptorchimären und dem G­Protein G s waren hingegen hauptsächlich von V2­Rezeptorsequenzen in der dritten intrazellulären (i3) Schleife abhängig. Um die molekularen Grundlagen der Gs ­ Kopplungsselektivität des V2­Rezeptors näher zu untersuchen, wurden zunächst klassische Mutagenesetechniken (zielgerichtete Mutagenese'') angewandt. Definierte V2­Rezeptorsegmente (oder einzelne Aminosäuren) wurden in den V1a­Rezeptor transferiert, und die resultierenden Hybrid­Vasopressinrezeptoren wurden anschließend in funktionellen Studien auf ihre Fähigkeit, hormonabhängig intrazelluläre cAMP­ Konzentrationen zu steigern (G s ­vermittelt), getestet. Diese Strategie schien besonders geeignet, da die Aktivierung des V1a­Wildtyprezeptors nahezu keine Auswirkungen auf intrazelluläre cAMP­Spiegel hat. Wie bereits erwähnt, ist die effiziente Kopplung des V2­Rezeptors an das Gs ­ Protein vornehmlich von V2­Rezeptorsequenzen in der i3­Schleife abhängig (Liu and Wess, 1996). Eine V1a­Rezeptormutante, deren i3­Schleife durch die homologe V2­ Rezeptorsequenz ersetzt worden war, war in der Lage, effizient mit Gs zu interagieren. Die Fähigkeit dieser Rezeptormutante, Gs zu aktivieren, war jedoch im Vergleich zum V2­Wildtyprezeptor vermindert. Diese Beobachtung ließ die Vermutung zu, daß noch andere intrazelluläre V2­Rezeptordomänen zur optimalen Gs ­Kopplung notwendig sind. Daher wurde zunächst eine Reihe von V1a/V2­Rezeptorchimären erzeugt, die den Beitrag der zweiten (i2) und vierten intrazellulären (i4) Rezeptordomäne zur V2­ Rezeptor/G s ­Kopplungsselektivität klären sollten. Funktionelle Untersuchungen der resultierenden Hybrid­Rezeptormutanten in Säugetierzellen (COS­7) zeigten, daß ein kurzes Segment im N­terminalen Abschnitt der i4­Domäne einen deutlichen Beitrag zur V2­Rezeptor/G s ­Kopplungsselektivität leistet. Eine V1a­Rezeptormutante, welche in der i3­Schleife und dem N­terminalen Segment der i4­Domäne (Ni4) homologe V2­ Rezeptorsequenzen enthielt, zeigte ein funktionelles Profil (EC 50 und E max ), welches mit dem V2­Wildtyprezeptor nahezu deckungsgleich war. Anschließend wurden strukturelle Elemente innerhalb der i3­Schleife näher untersucht. Funktionelle Analysen zeigten, daß der N­terminale Abschnitt der i3­Schleife weitgehend das G­Protein­Kopplungsprofil des V2­Rezeptors bestimmt. Eine Reihe von V1a­Rezeptormutanten wurde erzeugt, in denen kurze Segmente des N­terminalen Bereichs der i3­Schleife mit der entsprechenden V2­Rezeptorsequenz ausgetauscht wurden. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß ein Aminosäurepaar (Gln225, Val226) und ­triplet (Phe229, Arg 230, Glu231) am Beginn der i3­Schleife des V2­ Rezeptors für die effiziente Aktivierung von Gs von entscheidender Bedeutung sind. Durch Punktmutationen in diesem Bereich wurden zwei polare Aminosäuren, Gln225 und Glu231, identifiziert, die für die effiziente V2­Rezeptor/G s ­Interaktion essentiell sind. Untersuchungen mit anderen GPCR­Klassen (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994; Wess, 1996) haben ebenfalls gezeigt, daß dem N­ Terminus der i3­Schleife eine besondere Rolle im Rezeptor/G­Protein­Kopplungsprozeß zukommt. In diesen Studien wird berichtet, daß vornehmlich hydrophobe und ungeladene Aminosäuren Schlüsselrollen in der rezeptorvermittelten G­Protein­Aktivierung einnehmen. Die hier beschriebenen Untersuchungen hingegen ergaben, daß zwei polare/geladene Aminosäuren, Gln225 und Glu231, für die V2­Rezeptor/G s ­Kopplung von besonderer Wichtigkeit sind und zeigen daher, daß die Rezeptor/G­Protein­ Kopplungsselektivität nicht auf ausschließlich hydrophoben Wechselwirkungen beruht. Desweiteren konnte beobachtet werden, daß die Länge der i3­Schleife die Effizienz, mit der der V2­Rezeptor G­Proteine der Gs ­Klasse zu aktivieren vermag, beeinflußen kann. Die V1a­ und V2­Rezeptoren weisen unterschiedlich lange i3­ Schleifen auf (die i3­Schleife des V2­Rezeptors ist 13 Aminosäuren kürzer als die des V1a­Rezeptors). Eine V1a­Rezeptormutante, deren N­terminaler Abschnitt der i3­ Schleife durch homologe V2­Rezeptorsequenz ersetzt wurde, konnte deutlich effizienter mit Gs interagieren, wenn der mittlere Abschnitt der i3­Schleife um elf Aminosäuren verkürzt wurde. Gleichermaßen konnte die effiziente Kopplung bestimmter V1a/V2­Hybridrezeptoren an Gs durch Einfügen von elf Aminosäuren in den zentralen Bereich der i3­Schleife deutlich gehemmt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß der zentrale Bereich der i3­Schleife die Rezeptor/G­Protein­Kopplungsselektivität beeinflussen kann, obgleich diese Rezeptordomäne vermutlich nicht direkt mit dem G­Protein interagiert. Es ist denkbar, daß die Länge der i3­Schleife den Zugang des G­Proteins zu funktionell wichtigen Rezeptordomänen, z.B. Aminosäuren im Bereich der fünften Transmembrandomäne (TM V) und der i3­Schleife, reguliert. Identifizierung einzelner Aminosäuresubstitutionen und Aminosäuredeletionen, die die G­Protein­Kopplungsselektivität des V2­Rezeptors beeinflussen: Einsatz von Hefeexpressionstechnologie und zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Hefe­(Saccharomyces cerevisiae)­ Expressionstechnologien angewandt, um Struktur­Funktionsanalysen des V2­Rezeptors zu erleichtern und Beschränkungen klassischer Mutagenesetechniken zu überwinden. Der V2­Wildtyprezeptor und verschiedene G­Proteinchimären aus Hefe­ und Säugetier­Galpha­ Untereinheiten wurden in genetisch modifizierten Hefelinien, deren Zellwachstum von effizienter Rezeptor/G­Protein­Kopplung abhängig war, co­exprimiert. In diesem System aktiviert produktive Rezeptor/G­Protein­Kopplung den Hefe­MAP­Kinase/Pheromon­ Signaltransduktionsweg. Dies führt zur Transkription des FUS1­HIS3­Reportergens und somit zur Expression von His3­Protein, was den Histidin­auxotrophen (his3) Hefelinien ermöglicht, in histidinfreiem Medium zu wachsen (Pausch et al., 1998). Es konnte gezeigt werden, daß heterolog exprimierte V2­Rezeptoren weder mit der Hefe­G­Protein­ alpha­Untereinheit (Gpa1p) noch mit einem mutierten Gpa1­Protein, in dem die C­terminalen fünf Aminosäuren gegen homologe Galpha q ­Sequenz ausgetauscht worden waren (Gq5), effizient interagierten. Im Gegensatz dazu erwies sich die Interaktion zwischen dem V2­ Rezeptor und einem mutierten Gpa1­Protein, dessen C­terminale fünf Aminosäuren die homologe Galpha s ­Sequenz enthielten (Gs5), als hocheffizient. Diese Beobachtungen zeigten, daß der V2­Rezeptor im Hefesystem sein physiologisches Kopplungsprofil beibehielt. Zur weiteren Validierung des Hefeexpressionssystems wurden die G q/11 ­ gekoppelten M 1 ­, M 3 ­ und M 5 ­Muskarinrezeptoren und verschiedene mutierte Vasopressin­ und M 3 ­Muskarinrezeptoren mit veränderten funktionellen Eigenschaften heterolog in Hefe exprimiert. Funktionelle Analysen zeigten, daß die Wildtyprezeptoren und die verschiedenen Rezeptormutanten in Hefe und Säugetierzellen ähnliche Phänotypen aufwiesen. Um zu untersuchen, weshalb der V2­Rezeptor nicht effizient an G­Proteine der Gq/11 ­Familie koppelt, sollte der in Hefe exprimierte V2­Rezeptor zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') unterzogen und Mutanten mit veränderten G­ Protein­Kopplungeigenschaften isoliert werden. Im speziellen wurde die i2­Schleife untersucht, da eine frühere Studie gezeigt hatte, daß vornehmlich die i2­Schleife des V1a­ Rezeptors für die V1a­Rezeptor/G q/11 ­Kopplungsselektivität verantwortlich ist (Liu and Wess, 1996). Mittels zufallsgerichteter Mutagenesetechnik wurde in Hefe eine Bibliothek von V2­Rezeptormutanten erzeugt, deren i2­Schleife Mutationen mit einer Mutageneserate von ungefähr 10% (auf der Nukleotidebene) enthielt. Anschließend wurden in einem Selektionsverfahren (screen'') 30 000 V2­Rezeptormutanten auf ihre Fähigkeit, mit Gq5 zu interagieren, überprüft. Es konnten vier V2­Rezeptormutanten isoliert werden, welche effizient an Gq5 (jedoch nicht an Hefe­Gpa1p) koppelten. Funktionelle Untersuchungen mit diesen und anderen mittels zielgerichteter Mutagenese erzeugter V2­Rezeptormutanten zeigten, daß die Substitution einer einzigen Aminosäure (Met145) im zentralen Bereich der i2­Schleife beträchtliche Auswirkungen auf die Rezeptor/G­Protein­Kopplungsselektivität hatte. Die Fähigkeit des V2­Rezeptors, produktiv mit Gq5 zu interagieren, war von der Anwesenheit relativ großer, hydrophober Aminosäuren wie Leucin und Tryptophan abhängig. Austausch von Met145 mit kleinen Aminosäuren wie Glycin oder Alanin erlaubte dem V2­Rezeptor nicht, Gq5 zu aktivieren. Interessanterweise interagierten alle V2­Rezeptormutanten, die eine Met145­ Punktmutation aufwiesen, mit Gs5 ähnlich effizient wie der V2­Wildtyprezeptor. Die Unfähigkeit der V2(Met145Gly)­ und V2(Met145Ala)­Rezeptoren, Gq5 zu aktivieren, beruht daher nicht auf einem Faltungsdefizit. Gleichermaßen basierte die Fähigkeit der V2(Met145Trp)­ und V2(Met145Leu)­Rezeptoren, produktiv an Gq5 zu koppeln, nicht auf der Überexpression von Rezeptorprotein. Diese Ergebnisse zeigen, daß die chemische Eigenschaft der Aminosäure an Position 145 die V2­Rezeptor/G­Protein­ Kopplungsselektivität reguliert. Interessanterweise befindet sich in allen anderen Subtypen der Vasopressin/Oxytocin­Rezeptorfamilie (V1a­, V1b­, und Oxytocin­ Rezeptoren), welche selektiv an G­Proteine der G q/11 ­Klasse gekoppelt sind, ein Leucin an der Stelle, die zu Met145 (V2­Rezeptorsequenz) homolog ist. Eine der vier ursprünglich isolierten V2­Rezeptormutanten enthielt neben verschiedenen Punktmutationen eine Deletion in Position Met145. In detaillierteren zielgerichteten Mutagenese­Studien wurden zwei V2­Rezeptormutanten erzeugt, die alle drei G­Proteine (Gq5, Gs5 und Gpa1p) aktivieren konnten. Um zu untersuchen, ob ein generelles Verkürzen der i2­Schleife um eine Aminosäure der Grund für die beobachtete Rezeptor/G­Protein­Promiskuität ist, wurden verschiedene V2­Rezeptormutanten erzeugt, in denen einzelne Aminosäuren unmittelbar N­ und C­terminal von Met145 deletiert worden waren. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß die Deletion einzelner Aminosäuren N­terminal von Met145 (Ile141delta, Cys142delta, Arg143delta oder Pro144delta) in V2­Rezeptormutanten resultierte, die nicht mit G­Proteinen interagieren konnten. Radioligand­Bindungsstudien zeigten, daß diese V2­Rezeptormutanten keine V2­Liganden binden konnten, was darauf schließen läßt, daß Deletionen einzelner Aminosäuren N­terminal von Met145 zu mißgefalteten Rezeptoren führen. Die Aminosäuren Ile141­Pro144 befinden sich am Beginn der i2­Schleife, unmittelbar neben der alpha­helikalen zytoplasmatischen Verlängerung der dritten Transmembrandomäne (TM III) in der Nähe des hochkonservierten DRY(H)­Motivs. Es ist denkbar, daß Aminosäuren innerhalb des Ile141­Pro144­Segments mit den zytoplasmatischen Abschnitten von TM III und/oder TM V interagieren und diese Wechselwirkungen die Rezeptorstruktur stabilisieren. Im Gegensatz dazu hatten Deletionen unmittelbar C­ terminal von Met145 (Leu146delta, Ala147delta, Tyr148delta oder Arg149delta) keinerlei Auswirkungen auf die Funktion des V2­Rezeptors. Diese Aminosäuren befinden sich im zentralen Bereich der i2­Schleife, der nicht mit den transmembranären Domänen des Rezeptorproteins interagieren kann.

Im kardiovaskulären System ist die lösliche Guanylatzyklase (soluble guanylyl cyclase, sGC) ein Schlüsselenzym der •NO/cGMP-Signaltransduktion. Stickstoffmonoxid (•NO) aktiviert durch direkte Anbindung an das Häm-Eisen die Produktion von zyklischem 3’,5’-Guanosinmonophosphat (cGMP). In glatten Muskelzellen führt ein erhöhter cGMP-Spiegel zur Aktivierung von cGMP-abhängigen Proteinkinasen (cGK) und letztendlich zur Vaso-dilatation. Superoxidanionradikale (•O2-) sind an der Entstehung und Progression von Herz-Kreis¬lauferkrankungen beteiligt. Im vaskulären Gewebe stellt •O2- einen Gegenspieler zum •NO dar. So führt eine vermehrte Produktion von •O2- zu einer eingeschränkten Bioverfügbarkeit von •NO (•O2- + •NO -> ONOO-) (Ohara et al., 1993a). Im Rahmen dieser Arbeit sollte aufgeklärt werden, ob bei einer vaskulären Störung des •NO-Systems die Funktion der sGC durch •O2- auch direkt betroffen ist. Damit könnte dem Superoxid eine weit größere biologische Bedeutung zukommen als bisher angenommen, nämlich die Funktion als Signaltransduktionsmolekül mit der sGC als definiertem Rezeptor und Effektor. Die sGC-Aktivitätsuntersuchungen mit gereinigter sGC zeigten eine konzentrationsab¬hängige Hemmung der basalen und der YC-1- (100 µM) stimulierten (•NO-unabhängigen) sGC-Aktivität durch das •O2--generierende System Xanthinoxidase/Hypoxanthin (XO/HX) (IC50 (basal) = 0,0031 vs. IC50 (YC-1) = 0,022 mU/ml). Die Aufhebung dieser Hemmung durch Superoxiddismutase (SOD, 100 U/ml) deutete auf eine spezifische und schnell-reversible Hemmung der sGC-Aktivität durch •O2- hin. Die in-vitro gezeigte Hemmung der sGC-Aktivität durch •O2- konnte auch in-vivo nach¬gewiesen werden. Die Produktion von •O2- in kultivierten glatten Muskelzellen der Rattenaorta (VSMC) konnte mit Elektronenspinresonanz (ESR) und Lucigenin-abhängiger Chemilumineszenz gezeigt werden. Dabei wurde mit ESR eine ca. 5-fache Steigerung der basalen •O2--Produktion mit dem intrazellulären Redoxcycler Dimethoxynaphtochinon (DMNQ, 10 µM) beobachtet. Auch die Aktivierung membranständiger NADPH-Oxidasen durch die physiologischen Aktivatoren Angiotensin II (Ang II, 100 nM) und platelet-derived growth factor (PDGF, 50 ng/ml) führten zu einer ca. 2-fach gesteigerten •O2--Produktion. Die Hemmung der cGMP-Produktion durch •O2- in kultivierten VSMC konnte in-vivo mittels Enzym-Immuno-Assays (cGMP-EIA) [YC-1 (100µM) = 100 % vs. YC-1 + DMNQ (10 µM) = 21 % vs. YC-1 + PDGF (50 ng/ml) = 76,6 %] nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die Auswirkung von •O2- auf die cGMP-abhängige Signaltransduktion mit Immu¬noblotting (Western-Blot) von phosphoryliertem Vasodilator-stimulierten Phosphoprotein (VASP, vasodilator-stimulated phosphoprotein) gezeigt. Intrazelluläre •O2--Produktion durch Redoxcycling (DMNQ, 10 µM) reduzierte die YC-1-stimulierte Phosphorylierung von VASP um 44,4 %. In weiteren Untersuchungen sollte der molekulare Mechanismus der schnell-reversiblen Hemmung der sGC durch •O2- auf Ebene der sGC aufgeklärt werden. Dabei wies die direkte Detektion von Sulfinyl-Radikalen auf eine Oxidation von Proteinthiolen durch •O2- hin. Der spezifische Austausch von Cysteinen der sGC mittels Punktmutation und die Expression der sGC-Mutanten in COS1-Zellen zeigte, dass Thiol-Gruppen der sGC mit •O2- interagieren. Dabei stellte sich heraus, dass die sGC-Mutanten a1/b1C541S und a1C238S/b1 viel sensitiver auf •O2- (XO 3 mU/ml) reagieren als die Wildtyp-sGC (WTa1/WTb1 = -62 % vs. WTa1C238S/WTb1 = -93,7 % vs. WTa1/b1C541S = -90,2 %). Um zu untersuchen, ob das Häm-Eisen der sGC an der Aktivitätshemmung durch •O2- beteiligt ist, wurde einerseits das Häm entfernt (Tween 20), andererseits das Häm-Fe2+ zum Häm-Fe3+ oxidiert (NS2028). Beide Behandlungen führten zu einer weitgehend YC-1-insen¬sitiven sGC. Die mit Protoporphyrin IX (PIX) aktivierte Häm-freie sGC und die mit HMR3448 aktivierte Häm-oxidierte sGC wurden durch XO/HX wesentlich weniger potent gehemmt als die YC-1-sensitive sGC. Dieser Befund deutet auf eine Beteiligung des Häm-Eisens bei der Aktivitätshemmung der sGC durch •O2- hin. Die in dieser Arbeit gezeigte direkte und schnell-reversible Hemmung der sGC-Aktivität durch •O2- weist der löslichen Guanylatzyklase eine neue biologische Funktion zu. Die sGC könnte als Rezeptor- und Effektorenzym die Signaltransduktion des Signalmoleküls •O2- vermitteln.