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Die thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) ist ein schweres, heterogenes Syndrom, bei welchem es zu einer lebensbedrohlichen, disseminierten Mikrothrombosierung in den arteriellen Kapillaren kommt. Bei Patienten mit TTP wurde 1997 erstmalig ein Mangel an der Von Willebrand Faktor (VWF)-spaltenden Protease entdeckt. Diese Protease wurde 2001 als ein neues Mitglied der "a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs"-Familie identifiziert und als ADAMTS-13 bezeichnet. Der ADAMTS-13-Mangel soll eine Anreicherung großer VWF-Multimere verursachen, welche für die pathologische Thrombenbildung bei Patienten mit TTP verantwortlich gemacht wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität entwickelt. Mittels des neuen Verfahrens wurde die Bedeutung von ADAMTS-13 in der Pathophysiologie der erworbenen TTP und in der Genese anderer Erkrankungen untersucht. Bei der hier entwickelten Methode wird eine beliebige Testprobe mit einem ADAMTS-13-freien VWF-Substrat versetzt und nach entsprechender Inkubation die ADAMTS-13-Aktivität ermittelt, indem der Abfall der VWF-vermittelten Aggregation von Thrombozyten gemessen wird. Das neuartige Verfahren zeigt eine gute Reproduzierbarkeit und wurde durch extensiven Vergleich mit der herkömmlichen Immunoblotting-Methode validiert. Zudem wurde die Richtigkeit der Methode durch erfolgreiche Teilnahme an einer internationalen Multicenterstudie bestätigt. Die neue Methode ist im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren im klinisch-diagnostischen Routinelabor anwendbar, da das Verfahren auf der Verwendung eines routineerprobten, automatisierten Testes zur Bestimmung der VWF:Ristocetin-Kofaktor-Aktivität beruht. Der Test ist bei hohem Probendurchsatz schnell und einfach durchführbar und benötigt keine spezielle Laborausrüstung oder besondere Expertise. In den untersuchten Patientenkollektiven war der schwere ADAMTS-13-Mangel mit einer Spezifität von 100% und einer Sensitivität von 89% mit einer akuten TTP korreliert. Bei 85% der Plasmaproben mit hochgradig erniedrigter ADAMTS-13-Aktivität konnte in vitro eine inhibitorische Aktivität gegen ADAMTS-13 detektiert werden. Die Plasmapherese-Therapie (PP-Therapie) führte in 75% der untersuchten TTP-Episoden zu einer letztendlichen Eliminierung des Inhibitors mit einer korrespondierenden Erhöhung der ADAMTS-13-Aktivität. Der Anstieg der ADAMTS-13-Aktivität war in diesen Fällen eng mit dem Anstieg der Thrombozyten assoziert. In 15% der untersuchten Episoden führte die PP-Therapie zu einer Erniedrigung des Inhibitortiters ohne messbare Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität. Bei 10% der untersuchten Episoden kam es unter PP-Therapie zu einem permanenten Anstieg des Inhibitortiters. Trotz fehlender Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität in den letztgenannten Fällen induzierte die PP-Therapie eine klinische Remission. Zwei Patienten zeigten nach Splenektomie bzw. Rituximab-Gabe ohne nachweisbare Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität ebenfalls eine konsistente, klinische Remission. Die Ergebnisse zeigen, dass die in vitro gemessene ADAMTS-13-Aktivität die pathophysiologisch wirksamen Prozesse der akuten TTP nicht immer eindeutig erklären. Dies weist auf bislang unentdeckte pathogene Mechanismen hin. Zudem könnten die derzeit gängigen Methoden zur Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität (einschließlich des hier entwickelten Verfahrens) die tatsächliche in vivo VWF-Proteolyse durch ADAMTS-13 nicht ausreichend widerspiegeln. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein ADAMTS-13-Mangel als ein Risikofaktor, und nicht als der alleinige Auslöser, für die akute TTP betrachtet werden sollte. Die Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität bei den unterschiedlichsten hämatologischen Erkrankungen offenbarte eine moderat erniedrigte ADAMTS-13-Aktivität in einer Vielzahl von schweren, zumeist intensivpflichtigen Erkrankungen. Bei einigen Patienten konnte nachgewiesen werden, dass sich die ADAMTS-13-Aktivität in Remission normalisiert. Daraus lässt sich möglicherweise vermuten, dass sich die ADAMTS-13-Aktivität generell bei einer Akut-Phasen-Reaktion erniedrigt. Die Untersuchungen der ADAMTS-13-Aktivität bei Patienten mit malignen Erkrankungen zeigte bei 21% der getesteten Patienten einen milden ADAMTS-13 Mangel. Bei den untersuchten Patienten mit Hirn- und Prostatatumoren konnte, im Gegensatz zu vorhergehenden Studien mit anderen Tumortypen, keine Korrelation zwischen erniedrigter ADAMTS-13-Aktivität und dem Grad der Malignität bzw. der Dissemination des Tumors gefunden werden. Die Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität bei einem umfangreichen Patientenkollektiv mit thromboembolischen Erkrankungen zeigte, dass der ADAMTS-13 Mangel kein häufig vorkommender Risikofaktor für das Auftreten von arteriellen oder venösen Thrombosen darstellt. In der vorliegenden Studie wurde jedoch der weltweit erste Fall eines milden, congenitalen ADAMTS-13 Mangels bei einer Patientin mit familiären, rezidivierenden, ischämischen Schlaganfällen gefunden. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der VWF-spaltenden Proteaseaktivität von ADAMTS-13 entwickelt, welchem durch seine klinische Anwendbarkeit in Zukunft eine weitreichende Bedeutung zufallen könnte. Die klinischen Studien dieser Arbeit belegen zum einen den Zusammenhang zwischen ADAMTS-13 und TTP und weisen zum anderen auf andere bislang nicht identifizierte Mechanismen hin, welche das klinische Bild der TTP determinieren. Des weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ADAMTS-13 neben einer Beteiligung an der Akut-Phasen-Reaktion, eine möglicherweise sehr bedeutsame Rolle bei malignen und thromboembolischen Erkrankungen spielt. Dies sollte in zukünftigen Studien, insbesondere im Hinblick auf neuartige therapeutische Möglichkeiten durch die Gabe von ADAMTS-13, näher untersucht werden.
Die thrombotisch-thrombozytopenische Purpura (TTP, Moschcowitz-Syndrom) ist eine seltene, durch mikroangiopathische hämolytische Anämie mit Fragmentozyten, Thrombopenie und neurologische Symptome gekennzeichnete Erkrankung, die 1924 erstmals durch Eli Moschcowitz beschrieben wurde. Nachdem über viele Jahre hinweg aufgrund der unbekannten Pathophysiologie und mangelnder Therapieoptionen eine Mortalität der akuten Erkrankung von mehr als 90% beobachtet wurde, haben in den letzten Jahren die Entdeckung zugrundeliegender Pathomechanismen und die sich daraus ergebenden Therapiemöglichkeiten zu einer wesentlichen Prognoseverbesserung geführt. So konnte 1998 durch Furlan et al. eine Metalloprotease (von Willebrand factor-cleaving protease) dargestellt und quantifiziert werden, deren Mangel oder Fehlfunktion zu einer unzureichenden Lyse von abnorm großen von Willebrand-Faktor Multimeren führt, die bei gesunden Menschen physiologischerweise durch die Protease abgebaut werden, mit der Folge einer thrombotischen Obliteration kleiner und mittlerer Gefäße. Einerseits findet sich eine familiäre Form des Proteasemangels mit autosomal rezessivem Erbgang, andererseits in der Mehrzahl der Fälle eine erworbene Form mit Nachweis eines gegen die Protease gerichteten IgG-Inhibitormoleküles. Als Triggerfaktoren der akuten TTP gelten unter anderem virale und bakterielle Infektionen, verschiedene Medikamente und Chemikalien, Autoinununerkrankungen, Tumore und Schwangerschaft. In vielen Fällen bleibt der auslösende Faktor jedoch auch unklar. Grundlage der modernen Therapie ist der Plasmaaustausch durch Plasmapherese, wodurch einerseits die Inhibitoren der Protease ausgewaschen werden, andererseits Protease substituiert wird. Begleitend werden meist Steroide, in therapieresistenten Fällen ergänzt durch Vincristin oder Immunsuppressiva gegeben. Diese Arbeit untersucht den Krankheitsverlaufbei 15 TTP-Patienten zwischen 1982 und 2001 retrospektiv mittels der Auswertung stationärer und ambulanter Krankenakten. Neben der Beschreibung der wichtigsten präklinischen und klinischen Symptome und Begleiterkrankungen, der Dauer bis zur Diagnose der Erkrankung, der eingeleiteten Therapiemaßnahmen und des klinischen Verlaufes, wurde die Bedeutung der von Willebrand-Faktor: Ag-Konzentration, der vWF:Ag-spaltenden Protease, des C-reaktiven Proteines sowie der Thrombozytenzahl und Lactatdehydrogenase hinsichtlich Verlauf, Prognose und Rezidivgefahrdung besonders berücksichtigt. Das Verhältnis von weiblichen zu männlichen Patienten lag bei 3:2, das mittlere Erstmanifestationsalter der Frauen bei 30,2, das der Männer bei 44,8 Jahren. Nikotinkonsum fand sich überdurchschnittlich häufig und stark. Bei mehr als einem Drittel der TTP-Ereignisse fand sich vorausgehend ein gastrointestinaler oder Atemwegsinfekt, bei 2 Patientinnen waren 4 Ereignisse schwangerschaftsassoziiert. 5 von 9 weiblichen Patientinnen nahmen vor Erstmanifestation hormonelle Kontrazeptiva ein. Die Rezidivereignisse wurden erheblich früher diagnostiziert und therapiert als die Erstmanifestationen, was zu einer deutlich kürzeren Behandlungsdauer und einer erheblich geringerer Komplikationsrate führte. Das klinische Bild der Ersttnanifestationen war erheblich stärker von neurologischen Komplikationen, Hauterscheinungen und Allgemeinsymptomen gekennzeichnet als die Rezidive. Rezidive wurden teilweise noch im asymptomatischen Stadiwn ruthand von Laborkontrollen (Thrombozytenzahl, LDH, Fragmentozyten) diagnostiziert. 8 Patienten erlitten mindestens ein Rezidiv, 6 bleiben rezidivfrei, eine Patientin verstarb in der Erstmanifestation. Rezidivpatienten waren zum Zeitpunkt der Ersttnanifestation im MitteljÜßger als die Patienten ohne Rezidiv. Die Dauer der Erstmanifestation bei Rezidiv- bzw. non-Rezidivpatienten war nicht wesentlich verschieden, die Rezidive jedoch deutlich kürzer als die Erstmanifestationen, was vermutlich als Folge des früheren Behandlungsbeginnes zn werten ist. Wichtigste Laborpararneter zur Verlaufsbeurteilung der TTP waren Thrombozytenzahl und Lactatdehydrogenase (LDH). Bei den Erstmanifestationen fand sich im Durchschnitt eine wesentlich höhere LDH und niedrigere Thrombozytenzahl als bei den Rezidiven. Da gleichzeitig eine längere Behandlungsdauer gesehen wurde, kann vermutet werden, dass bei Rezidiven mit nur leicht oder mäßig ausgeprägten Veränderungen der LDH und Thrombozytenzahl im Vergleich zn Erstmanifestationen mit deutlich ausgeprägten pathologischen Laborparrunetern eine günstigere Prognose hinsichtlich Verlauf und Behandlungsdauer gestellt werden kann. Die im Akutstadium gemessenen vWF:Ag-Konzentration lag bei den schwerer verlaufenden Ers1manifestationen höher als bei den Rezidiven, so dass auch dieser Parameter zur Einschätzung der Schwere des akuten Krankheitsbildes geeignet scheint. Ob eine erhöhte Rezidivgefährdung oder eine besonders lange Behandlungspflichtigkeit bei Patienten mit im Akutstadiwn oder Remission stärker erhöht gemessener vWF:Ag-Konzentration besteht, muss arthand größerer Patientenzahlen untersucht werden. Patienten mit in Remissionsphasen deutlich erniedrigter oder nicht nachweisbarer Aktivität der vWF-cleaving protease zeigten eine höhere Rezidivhäufigkeit, als Patienten mit nur leicht erniedrigten oder normalen Werten. Ein wesentlicher Unterschied hinsichtlich der Behandlungsdauer im Akutstadium konnte nicht gesehen werden. Die Konzentration des C-reaktiven Proteines im Akutstadiwn scheint ebenso wie LDH, Thrombozytenzahl und vWF:Ag-Konzentration als Parameter zur Einschätzung der Schwere des akuten Krankheitsbildes geeignet. Ob auch eine Einschätzung der zn erwartenden Behandlungsdauer hierdurch möglich ist, müssen weitere Untersuchungen an einem größeren Patientenkollektiv zeigen.
In dieser Studie wurden die Veränderungen der Fibrinolyse während der Geburt bei insgesamt 84 Gebärenden untersucht. Gemessen wurden die Konzentrationen des Plasminogen-Aktivator-Inhibitors, alpha-2-Antiplasmins und Plasminogens mit Hilfe von photometrischen Tests mit chromogenem Substrat kurz vor Geburt, direkt nach Geburt des Kindes, 30 und 90 Minuten nach Lösung der Plazenta bei 41 Spontangebärenden und 43 Sectiopatientinnen. 30 Frauen erhielten kurz vor der Geburt eine Kurzinfusion von einer Millionen KIE Aprotinin (Trasylol®), darunter 15 Spontangebärende und 15 Sectiopatientinnen. Sowohl bei den Spontangebärenden als auch bei den Sectiopatientinnen ohne Gabe von Aprotinin war ein offensichtlicher Abfall der PAI-Konzentrationen nach Geburt zu beobachten, die Konzentrationen für alpha-2-Antiplasmin und Plasminogen blieben im gemessenen Zeitraum unverändert. Nach Gabe von Aprotinin dagegen stieg die PAI-Aktivität sowohl bei den Spontangebärenden als auch bei den Sectiopatientinnen nach Geburt leicht an und fiel dann - im Vergleich zu den Patientinnen ohne Verabreichung von Aprotinin - langsamer und schwächer ab. alpha-2-Antiplasmin stieg bei den mit Aprotinin behandelten Patientinnen nach Geburt an und fiel dann wieder bis auf den Ausgangswert ab, die Plasminogenkonzentrationen blieben im gemessenen Zeitraum weitgehend unverändert. Signifikante Unterschiede zwischen Spontangebärenden und Sectiopatientinnen gab es für alle drei Parameter nicht. Die Veränderungen der Faktoren sprechen für eine erhöhte fibrinolytische Aktivität nach Geburt, die als Reaktion auf die gesteigerte Gerinnung zum gleichen Zeitpunkt zu werten ist. Die Verminderung des Plasminogen-Aktivator-Inhibitors versteht sich als reaktiver Verbrauch durch die bei gesteigerter Gerinnung und folgender Fibrinolyse einsetzende "Anti-Fibrinolyse" durch die entsprechenden Hemmfaktoren. Die Veränderungen des PAI und des alpha-2-Antiplasmin unter Aprotinin sind am ehesten als geringere Beanspruchung des fibrinolytischen Systems zu interpretieren. Abschließend läßt sich aus den Beobachtungen ableiten, daß sich der durch die Plazentalösung ausgelöste Verbrauch von Gerinnungs- und Fibrinolysefaktoren durch die Gabe von Aprotinin reduzieren läßt, ein gerade bei intrapartalen Gerinnungsstörungen erwünschter Effekt.
Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um den Einfluss der präanalytischen Temperatur- und Lagerungsbedingungen für die Bestimmung der VWF-Parameter eingehender zu untersuchen. Wir untersuchten bei 10 gesunden Personen, 10 Patienten mit von Willebrand-Syndrom Typ 1, 5 Patienten mit VWS Typ 2 und 10 Patienten der neurochirurgischen Klinik den Einfluss verschiedener Lagerungsbedingungen auf VWF:RCo, VWF:Ag, VWF:CB, APTT und FVIII:C. Pro Patient entstanden so folgende Proben: PS Das Blut (ein Röhrchen) wurde sofort zentrifugiert und der Überstand anschließend bei 80° C eingefroren. CR3/CR6 Das Citratblut (zwei Röhrchen) wurde für drei bzw. sechs Stunden bei Raumtemperatur gelagert, daraufhin zentrifugiert und eingefroren.. CE3/CE6 Das Citratblut (zwei Röhrchen) wurde für drei bzw. sechs Stunden in Eis gelagert, dann zentrifugiert und eingefroren. CK3/CK6 Das Citratblut (zwei Röhrchen) wurde für drei bzw. sechs Stunden zwischen zwei Kühlakkus gelagert, anschließend zentrifugiert und eingefroren. PR3/PR6 Der Plasmaüberstand aus einem Citratröhrchen wurde nach der Zentrifugation abpipettiert, auf zwei Reagenzgläser verteilt und für drei bzw. sechs Stunden bei Raumtemperatur gelagert und danach eingefroren. PE3/PE6 Der Plasmaüberstand aus einem Citratröhrchen wurde nach dem Zentrifugieren abpipettiert, auf zwei Reagenzgläser verteilt und für drei bzw. sechs Stunden in Eis gelagert und nachfolgend eingefroren. Wie man an Hand der Ergebnisse sehen kann, verursachte die gekühlte Lagerung von Citratvollblut teilweise dramatische Veränderungen der Ausgangswerte PS. Zusammenfassend fanden wir keine Kälteinduzierte Erniedrigung der VWF-Parameter im Plasma und bei Patienten mit VWS, Typ 2 ohne messbare Ristocetin-Cofaktor-Aktivität. Auf Grund dieser Ergebnisse nahmen wir an, dass der Kälte-induzierte Verlust der VWF-Parameter und der Faktor VIII-Aktivität zum einen die Gegenwart von Thrombozyten und zum anderen die Anwesenheit hochmolekularer vWF-Multimere benötigte. Wir vermuteten, dass es nur bei Anwesenheit von Thrombozyten und HMW-VWF zu einem hochgradig kälteinduzierten Verlust von VWF:RCo, VWF:Ag und FVIII:C kommt. Von Berger et al (1998) wurde bereits publiziert, dass sich die Thrombozyten bei Kälteeinwirkung in ihrer Zytoskelettstruktur verändern. Hoffmeister et al. (2003) konnten eine kälteinduzierte Zusammenlagerung der GPIb-Rezeptoren n der Thrombozyten-Zelloberfläche beobachten. Wir nahmen an, dass der kälteinduzierte Verlust des VWF auf eine durch Kälte geförderte Bindung des VWF an Thrombozyten, wahrscheinlich durch die gesteigerte Zugänglichkeit der GPIba Untereinheit des vWF, zurückzuführen ist. Auf Grund unserer Ergebnisse empfehlen wir Blut zur Analyse der vWF-Parameter bei Raumtemperatur und nicht bei 4°C zu lagern, ebenso Blutproben zur Bestimmung nicht auf Eis zu verschicken. Empfehlungen für die Behandlung von Blutproben für die Gerinnungsdiagnostik: Die Blutentnahme soll wegen der möglichen tageszeitlichen Schwankungen zwischen 7.00 Uhr und 9.00 Uhr erfolgen. Eine lange und intensive Venenstauung ist zu vermeiden. Die Blutabnahme sollte mit einer großlumigen Kanüle, unter einem gleichmäßigen und zügigem Bluteinstrom, erfolgen. Bei der Abnahme mehrerer Blutentnahmeröhrchen sollte die Gerinnungsdiagnostik erst als zweites oder drittes Röhrchen entnommen werden, um eine Kontamination mit Gewebsthrombokinase zu vermeiden. Das Gerinnungsröhrchen sollte bis zu Markierung gefüllt sein und anschließend mehrfach geschwenkt werden, um eine gleichmäßige Durchmischung von Antikoagulans und Blut zu gewährleisten (Fiedler et al, 2004). Für eine unmittelbare Untersuchung sollte die Lagerung bei Zimmertemperatur erfolgen, Aufbewahrung im Kühlschrank sollten durch Kälteaktivierung unbedingt vermieden werden, da dies zu Gerinnungszeitveränderungen führen kann. Dies steht im Gegensatz zu den NCCLS-Richtlinien von 1998 (Wayne, 1998), die vorgaben, dass für Gerinnungsanalysen verwendete Proben gekühlt gelagert werden sollten, wenn sie nicht innerhalb von zwei Stunden getestet werden können. Bei einer für einen späteren Zeitpunkt geplanten Untersuchungen sollte Citratplasma portioniert eingefroren werden. Das Auftauen der gefrorenen Proben sollte im Wasserbad bei 37°C erfolgen, wobei auf gründliche Durchmischung und vollständige Lösung eventueller Kryopräzipitate zu achten ist. Die anschließende Untersuchung muß unverzüglich erfolgen, da die Stabilität verschiedener Faktoren nach dem Auftauen herabgesetzt ist (Lutze et al, 1999). Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist nicht zulässig. Die Durchführung der Globaltests sollte maximal vier Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt worden sein (Guder et al, 2000; Guder et al, 2002; Narayanan, 2000;Tilsner et al, 1986). Die Bestimmung der Faktor VIII-Aktivität sollte jedoch bis spätestens zwei Stunden nach der Blutentnahme abgeschlossen sein (Lutze et al, 1999; Müller, 1993).
Ziel aller medizinischen und naturwissenschaftlichen Forschung seit Beginn der Ära der Operationen am offenen Herzen unter Einbeziehung der Herz-Lungen-Maschine ist die Untersuchung ihrer Pathogenität auf den menschlichen Körper. Den schädigenden Einfluss der extrakorporalen Zirkulation zu limitieren und damit die Induktion gerinnungsaktiver Substanzen so gering wie möglich zu halten ist eine der vordringlichen Ziele im Rahmen dieser Forschung. Die vorliegende Studie mit sechsundsiebzig eingeschlossenen Patienten hatte das Ziel, unter doppelblind - randomisierten - Bedingungen zu klären, ob beschichtete extrakorporale Kreisläufe wie das SMA - System der Firma COBE® insbesondere im Hinblick auf Drainageblutverlust, Substitutionsparameter und spezielle Gerinnungsparameter fiir den herzchirurgischen Patienten Vorteile bieten. Durchgängig ist bei den analysierten Parametern wie Blutverlust, Substitution von Erythrozytenkonzentraten und FFP' s, Nachbeatmungszeit, Intensivaufenthalt, Thrombozyten, Thrombozytenfunktion, Prothrombinfragmente F1+2, D - Dimer, und Antithrombin III ein Trend pro SMA zu erkennen, welcher allerdings insgesamt nicht signifikant ausflUlt. Positiv ist dabei zu erwähnen, dass das hier untersuchte SMA - System für den Patienten ein sicher eiuzusetzender extrakorporaler Kreislauf ist, welcher im Vergleich zum Standardsystem keinerlei Nachteile bietet. Die Gesamtheit der Werte gibt aber keine Veranlassung unter Routinebedingungen Kreisläufe mit SMA - Kopolymerbeschichtung herkömmlichen Standardsystemen vorzuziehen, da sie filr den Patienten mit keinem spürbaren klinischen Vorteil verbunden, derzeit aber noch ungleich teurer als das sonst verwendete vergleichbaren Standardsystem sind. Es ist somit noch ein weiter Weg zu wirklich biokompatiblen Oberflächen, welcher über verschiedenste Ansatzpunkte beschritten werden kann und noch sehr viel Forschung, Arbeit und Mühen fordern wird. Die Kopolymerbeschichtung extrakorporaler Oberflächen wie bei SMA kann in dieser Forschung entweder mit Verbesserungen weiterentwickelt und kombiniert werden, oder zugunsten vielversprechender anderweitiger Methoden wieder verlassen werden.
