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Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, MALDI-Massenspektrometrie als robuste Analysenmethode für die quantitative Analyse niedermolekularer Verbindungen aus komplexen biologischen Matrizes zu etablieren. Zu Beginn der Arbeit wurden drei typische Fragestellungen im Bereich der Lebensmittelanalytik, der medizinischen Forschung und der klinischen Chemie ausgewählt, um die Methodik anhand dieser Modellsysteme zielgerichtet zu entwickeln und zu bewerten. Für jede dieser Fragestellungen wird routinemäßig ein hoher Probendurchsatz verlangt und damit werden hohe Anforderungen an die Probenvorbereitung gestellt, da diese einfach, schnell, reproduzierbar, Matrix-tolerant und automatisierbar sein muss um die Weiterentwicklung zur Hochdurchsatzanalytik zu erlauben.
Der quantitative Nachweis von Melamin und seinen Derivaten wurde aufgrund des Aufkommens von Milchprodukten, die mit diesen Verbindungen kontaminiert waren, ein wichtiger Bestandteil der Analytik dieser Lebensmittel. Insbesondere an diesem Beispiel zeigte sich der Vorteil des Einsatzes von MALDI-Massenspektrometrie zur Analyse kleiner Moleküle. Aufgrund der höheren Toleranz gegenüber Puffern und Salzen konnte die Probenvorbereitungszeit der für die FDA entwickelten Methode zur Quantifizierung von Melamin in Milchpulver mittels LC-ESI von ca. 140 min auf 90 min reduziert werden, da auf die zeitaufwendige Flüssigchromatographie verzichtet werden konnte. So wurde Melamin mit einem LLOQ von 0,5 ppm quantifiziert, was unterhalb der Vorgaben der WHO (2,5 ppm in Milichpulver und 1 ppm in Babynahrung) lag. Cyanursäure, ein Derivat von Melamin welches für die Bildung schwerlöslicher Komplexe in der Niere mitverantwortlich gemacht wird, konnte ebenfalls mit der entwickelten MALDI-MS Methode quantifiziert werden. Allerdings war die ermittelte Bestimmungsgrenze mit 15 ppm um den Faktor 30 schlechter als bei Melamin. Die Nachweisgrenze bei MALDI-MS ist stark von der MALDI-Matrix abhängig und die Verwendung von Sinapinsäure war eine gute Kompromisslösung, um die Analyten in einem Spot im positiven und negativen Reflektormodus zu analysieren. Allerdings wurde diese Matrix zur Analyse von Analyten im positiven Reflektormodus entwickelt. Bislang wurden nur wenige Matrizes für MALDI-MS im negativen Reflektormodus beschrieben, um z.B. Säuren besser nachweisen zu können. Forschung in diesem Bereich wird neue Möglichkeiten zur Detektion negativ geladener kleiner Moleküle ergeben.
Des Weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Lösungen für klinische Fragestellungen wie etwa den Nachweis von Methylphenidat im Plasma und Gehirn von Ratten oder der Dried Blood Spot Analytik entwickelt. Bei beiden Methoden wurde jeweils nur eine einfache Flüssig-Flüssig-Extraktion zur Probenvorbereitung angewendet und sie ließen sich sehr gut auf Realproben übertragen.
Methylphenidat konnte im Plasma im Konzentrationsbereich von 0,1-40 ng/mL und im Hirnhomogenat im Konzentrationsbereich von 0,4-40 ng/mL quantifiziert werden, was gut im Konzentrationsbereich der Realproben von mit Methylphenidat gefütterten Ratten lag. Dazu standen das Plasma und die Gehirne von fünf Ratten zur Verfügung. Es wurde eine lineare Korrelation zwischen der MPH-Konzentration im Gehirnhomogenat und im Plasma gefunden, was basierend auf den bis dato bekannten Literaturergebnissen ein zu erwartendes Ergebnis war, aber zukünftig mit einer größeren Anzahl von Versuchstieren verifiziert werden sollte. Während der Methodenentwicklung war auch bei diesem Projekt die Auswahl der MALDI-Matrix ausschlaggebend für den Erfolg der Messungen. Im MALDI-Massenspektrum interferierte das Signal des Natriumaddukts von CHCA mit dem Signal von MPH. Für dieses Problem kamen zwei mögliche Lösungen in Betracht. Erstens die Quantifizierung mit ClCCA als MALDI-Matrix, da hier keine Interferenzen auftraten. In ersten Vorversuchen konnte MPH so in einem Konzentrationsbereich von 1-48 ng/mL mit einer exzellenten Linearität von R2=0,9992 quantifiziert werden. Eine zweite mögliche Problemlösung war die Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie. Hierzu wurden Fragmentionen-Massenspektren der überlagerten Signale aufgenommen. MPH und der verwendete interne Standard MPH-d9 zeigten dabei spezifische Fragmentionensignale, über die quantifiziert wurde. Da die Sensitivität um den Faktor 100 im Vergleich zu MS-Spektren von CHCA und ClCCA gesteigert werden konnte, wurde die weitere Methodenentwicklung basierend auf der Tandem-Massenspektrometrie mit der MALDI-Matrix CHCA durchgeführt. Überdies sind MS/MS-Versuche unter Verwendung von ClCCA als MALDI-Matrix für kleine Moleküle sehr erfolgsversprechend und sollten in weiteren Forschungsarbeiten durchgeführt werden.
Die Dried Blood Spot Technik als alternative Probenvorbereitung bietet eine Reihe von Vorteilen, wie etwa den einer einfacheren Lagerung und eines einfacheren Transports einer großen Menge von Proben. Darüber hinaus werden nur wenige Mikroliter Blut verwendet, was vorteilhaft ist bei z B. klinischen Studien oder dem Therapeutic Drug Monitoring. Diese Art der Probennahme ist somit eine perfekte Ergänzung für weitere quantitative Analysen von Methylphenidat in Rattenblut. Den Ratten würden nur wenige Mikroliter Blut entnommen werden, was ihr Überleben sichert und der Transport der Proben auf dem Postweg wäre wesentlich einfacher. Um eine allgemein verwendbare DBS-MALDI-MS-Methode zu entwickeln, wurden neben Methylphenidat auch bekannte Analyten aus dem Bereich des Dopings sowie Lamotrigin, Coffein und Theophyllin als Beispiele für das Therapeutic Drug Monitoring verwendet. Es wurden verschiedene Lösungsmittel zur Extraktion eingesetzt, wobei sich eine Kombination aus Methyl-tert-Butylether und Ethanol, sowie Aceton als am besten geeignet erwies. Einige Analyten wie Coffein, Theophyllin und Lamotrigin wurden bis zu einer Konzentration von 0,5 μg/mL quantifiziert. Diese Bestimmungsgrenze ist bei Analyten aus dem Bereich des Dopings wie z.B. Salbutamol, Methylphenidat oder Clenbuterol, deren therapeutisch wirksame Plasmakonzentration im Bereich von wenigen Nanogramm pro Milliliter Blut liegt, um den Faktor 15-500 zu hoch. Diese Analyten waren bis zu einer Konzentration von 5 μg/mL im Blut mittels MALDI-MS problemlos nachweisbar. Um die Sensitivität zu erhöhen, ist es allerdings sinnvoll, die Extraktion zukünftig für die einzelnen Analyten zu optimieren, sie mittels Festphasenextraktion oder LC anzureichern und MS/MS-Spektren aufzunehmen. Für die Analyten Coffein, Theophyllin und Lamotrigin, deren therapeutisch wirksame Plasmakonzentration im ein- bis zweistelligen Mikrogramm-pro-Milliliter Bereich liegt, eignete sich die entwickelte Methode sehr gut. Es wurde eine Methodenvalidierung durchgeführt, wobei die validierten Parameter den Vorgaben der FDA entsprachen.
Da die Auswahl der MALDI-Matrix bei den verschiedenen Methodenentwicklungen jeweils ein kritischer Faktor war, wurden abschließend eine Auswahl von Analyten mit einer Molekülmasse bis ca. 600 Da mit verschiedenen MALDI-Matrizes präpariert. Ein Großteil der Analyten wurde am sensitivsten mit ClCCA nachgewiesen. Im Rahmen dieser Versuche wurde auch erstmals ein Strukturanalogon von ClCCA, und zwar ClCCA-Tetrazol, als alternative MALDI-Matrix eingesetzt, bei welchem die Carboxylgruppe durch einen Tetrazolring ausgetauscht wurde. Diese zeigte eine sehr homogene Kristallisation und für einige Analyten eine bis zu Faktor 3 höhere Signalintensität im Vergleich zu ClCCA. Außerdem war auffällig, dass einige Analyten unter bestimmten Präparationsbedingungen wie z B. der Graphite Supported Preparation sensitiver mittels MALDI-MS nachweisbar waren. Bei anderen Analyten verschlechterten sich die Analysenergebnisse. Graphit verändert stark die Kristallisation der MALDI-Matrix und es wird vermutet, dass sich dies auf den Einbau der Analyten in die Matrixkristalle auswirkt. Es konnte bislang aber noch nicht abschließend geklärt werden, wie genau die Präparation der Proben Einfluss auf den Einbau der Analyten in die Matrix nimmt. Eine Untersuchung dieser Phänomene sollte daher Gegenstand weiterer Forschungsprojekte sein.
Zusammenfassend stellt die MALDI-Massenspektrometrie eine schnelle und robuste Methode zur Quantifizierung einer Vielzahl kleiner Moleküle in komplexen biologischen Matrizes dar.
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide nicht nur eine strukturgebende Funktion in der Plasmamembran aufweisen, sondern ebenfalls als Botenstoffe intra- und extrazellulär aktiv sind. Sphingosin-1-Phosphat (S1P) bildet dabei einen Schlüssel-Metaboliten, da es verschiedene Zellfunktionen wie Wachstum und Zelltod beeinflusst. Es wird durch zwei Isoformen der Sphingosinkinasen, SK1 und SK2, gebildet. Die SK1 wurde bereits gut untersucht und es konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Rolle beim Zellwachstum einnimmt und einen entscheidender Regulator bei inflammatorischen Erkrankungen und Krebs darstellt. Über die SK2 ist soweit wenig bekannt und die Ergebnisse sind zum Teil kontrovers. Sowohl pro-proliferative als auch anti-proliferative Funktionen der SK2 wurden beschrieben. Andererseits handelt meine Arbeit von Nierenfibrose, da beschrieben wurde, dass Sphingolipide einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung chronischer Nierenerkrankungen nehmen. Nierenfibrose stellt das Endstadium chronischer Nierenerkrankungen dar und führt zu einer Akkumulation der Extrazellulärmatrix, Organvernarbung und zum Verlust der Nierenfunktion. Die SK1 spielt dabei eine protektive Rolle bei der Entstehung von Nierenfibrose. Deshalb sollte in dieser Arbeit die Rolle der Sk2 bei der Entstehung von Nierenfibrose untersucht werden.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurde das Mausmodell der unilateralen Ureterobstruktion (UUO) verwendet, welches zur Entwicklung einer tubulointerstitiellen Nephritits und nachfolgender Fibrose führt. Es konnte dabei gezeigt werden, dass sowohl die Protein-Expression als auch die Aktivität der SK2 im fibrotischen Nierengewebe gesteigert wurden. Allgemein wiesen die SK2-/--Mäuse eine verminderte Fibrose in Folge des UUO auf im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen. Dies wurde bestätigt durch eine reduzierte Kollagenakkumulation, sowie eine verminderte Protein-Expression von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, connective tissue growth factor (CTGF) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor1 (PAI-1). Diese Effekte gingen einher mit einer gesteigerten Protein-Expression des inhibitorischen Smad7 und erhöhten Sphingosin-Spiegeln in SK2-/--UUO-Nieren. Auf mechanistischer Ebene vermindern die erhöhten Sphingosin-Spiegel die durch transforming growth factor-β (TGFβ) induzierte Kollagenakkumulation, die PAI-1- und CTGF-Expression, aber induzieren die Smad7-Expression in primären Nierenfibroblasten. In einem komplementären Versuch mit hSK2 tg-Mäusen wurde eine verstärkte Entstehung von Nierenfibrose mit erhöhter Kollagenakkumulation, sowie erhöhte Protein-Expressionen von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, CTGF und PAI-1 festgestellt. Die Smad7-Expression dagegen war vermindert.
Im zweiten Teil meiner Arbeit stand der glomeruläre Teil der Niere im Fokus und es wurde untersucht, ob die Überexpression der SK2 zu einer phänotypischen Veränderung der glomerulären Mesangiumzellen führt. Mesangiumzellen wurden dazu aus den hSK2 tg-Mäuse isoliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass hSK2 und mSK2 in den transgenen Zellen hauptsächlich in der zytosolischen Fraktion lokalisiert sind, während S1P ausschließlich im Kern akkumulierte. Weiterhin konnte eine verminderte Proliferation unter normalen Wachstumsbedingungen der hSK2 tg-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen beobachtet werden. Die Zellen reagierten auch sensitiver auf Stress-induzierte Apoptose. Auf molekularer Ebene konnte dies durch eine reduzierte ERK- und Akt/PKB-Aktivierung erklärt werden. Nach Staurosporin-Behandlung wurde Apoptose durch den intrinsischen, mitochondrialen Apoptosesignalweg induziert. Dabei konnte eine reduzierte anti-apoptotische Bcl-xL-Expression und vermehrte Prozessierung von Caspase-9 und Caspase-3 und PARP beobachtet werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine verminderte tubulointerstitielle Fibrose-Entstehung durch die Deletion der SK2, sowie anti-proliferative und Apoptose-induzierende Effekte durch die SK2 in Mesangiumzellen nachgewiesen werden konnten. Somit könnten SK2-Inhibitoren die Entstehung tubulointerstitieller Fibrose und mit Proliferation assoziierte Erkrankungen wie mesangioproliferative Glomerulonephritis positiv beeinflussen.
HIV vaccine preclinical testing is difficult because HIV’s only relevant hosts are humans and no correlates of protection are known. To this end, we are working on the humanization of different mouse strains with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as well as human hematopoietic stem cells (HSC) to generate a useful small animal model.
We generated immune deficient mice (NOD Scid IL2gc -/- /NOD Rag1-/- IL2gc -/-) expressing human MHC class II (HLA-DQ8) on a mouse class II deficient background (Ab-/-). Here, the human HLA-DQ8 should interact with the matching T cell receptors of transferred matching human PBMCs and therefore could support the functionality of the transferred human CD4+ cells in the mice.
Mice that were adoptively transferred with human HLA-DQ8 PBMCs only showed engraftment of CD3+ T cells. Surprisingly, the presence of HLA class II did not significantly change the repopulation rates in the mice. Also, the presence of HLA class II did not advance B cell engraftment, such that humoral immune responses were undetectable. However, the overall survival of DQ8-expressing mice was significantly prolonged, compared to mice expressing mouse MHC class II molecules, and correlated with an increased time span until onset of GvHD.
To avoid GVHD and to increase and maintain the level of human cell reconstitution over a long period of time, the same mouse strains were reconstituted with human HSC. Compared to PBMC-repopulated mice, HSC-reconstituted mice develop almost all subpopulations of the human immune system detectable at week 12 after HSC transfer. These mice developed adaptive immune responses after Tetanus Toxoide (TT) immunizations. In addition, we are testing the susceptibility of these humanized mice to different HIV strains with a detailed look at immune responses.
Im Rahmen der in dieser Arbeit vorgestellten Daten konnten zwei Erkenntnisse gewonnen
werden:
1. Der Einsatz volatiler Anästhetika bei der Narkose erhöht die extrazellulären Laktatspiegel im
Gehirn der Maus.
2. Die Applikation von Laktat entfaltet neuroprotektive Wirkung im fokalen Schlaganfallmodell
der Maus und zwar in Abhängigkeit von dem für das Modell verwendete Anästhetikum.
Im 1. Teil der Arbeit wurde in ersten Voruntersuchungen mit Hilfe der Mikrodialysetechnik
ein starker Anstieg extrazellulärer Laktatspiegel im Gehirn von Mäusen unter einer Narkose mit
Isofluran detektiert. Ein Kernthema dieser Arbeit war die Untersuchung der neuroprotektiven
Wirkung von Laktat im Schlaganfallmodell der Maus. Da dieses Modell zwingend eine Narkose
erforderte und Isofluran eine deutliche Wirkung auf den zerebralen Laktatstoffwechsel aufwies,
wurden die metabolischen Wirkungen weiterer, in der tierexperimentellen Forschung gebräuchlichen,
Anästhetika untersucht.
In mehreren Mikrodialyseexperimenten wurden die metabolischen Wirkungen inhalativer
(Sevofluran, Isofluran und Halothan) und injizierbarer Anästhetika (Ketamin/Xylazin, Chloralhydrat,
Propofol und Pentobarbital) auf die extrazellulären Glukose- und Laktatspiegel im
Gehirn von Mäusen untersucht. In separaten Versuchen wurde für das jeweilige Anästhetikum
zusätzlich die Glukose- und Laktatwerte im Blut und CSF der Tiere bestimmt. Begleitet wurden
diese Versuche mit der Untersuchung physiologischer Parameter (Blutgase und zerebraler Blutfluss)
innerhalb der Narkose mit verschiedenen Anästhetika. Abschließend wurde in einem in
vitro-Experiment mit inkubierten Hirnschnitten die lokale, metabolische Wirkung von Isofluran
untersucht.
Die Experimente zeigten, dass volatile Anästhetika spezifisch die extrazellulären Laktatwerte
im Gehirn von Mäusen erhöhen (um das 3-4 fache) und so eine metabolische Wirkung auf den
zerebralen Laktatstoffwechsel besitzen, welcher bisher in der Literatur nicht beschrieben worden
ist. Mit dem Vergleich der Laktatdaten aus den CSF/Blut-proben, aus den in vitro-Versuchen,
sowie aus der Analyse der physiologischen Parameter konnte zusammenfassend folgendes festgestellt
werden: die durch inhalative Anästhetika induzierte Laktaterhöhung ist dosisabhängig, tritt
unabhängig von peripheren Einflüssen lokal im Gehirn auf und wird weder durch eine Hypoxie
noch durch eine Hypotension verursacht. Injizierbare Anästhetika (Ketamin/Xylazin, Chloralhydrat
und Propofol) besaßen diese Wirkung auf die Laktatwerte nicht und fielen vielmehr durch
eine moderate Erhöhung der Glukosekonzentrationen (um das 1,5-2 fache) im Blut und Extrazellularraum
des Gehirns auf, die wiederum bei den volatilen Anästhetika nicht zu beobachten war.
Nur Pentobarbital zeigte als einziges Anästhetikum keine Veränderungen in den extrazellulären
Glukose- und Laktatwerten im Gehirn der Tiere und verminderte sogar die Laktatspiegel im
Blut.
Ausgehend von den durchgeführten Untersuchungen wird für inhalative Anästhetika die
Stimulation von „Two-pore“-Kaliumkanälen als Ursache für die Erhöhung der extrazellulären
Laktatwerte vermutet. Dieser stellt für die Gruppe der volatilen Anästhetika einen spezifischen
Wirkmechanismus dar. Andere Wirkmechanismen von Anästhetika wie der NMDA-Rezeptor-
Antagonismus und der GABA-Rezeptor-Agonismus konnten ausgeschloßen werden, da eine Erhöhung
der extrazellulären Laktatspiegel im Gehirn der Tiere unter Ketamin/Xylazin- und
Pentobarbitalnarkose nicht auftrat. Der genaue Wirkmechanismus muss aber in weiteren Versuchen
näher geklärt werden.
Die aus den Mikrodialysedaten gewonnenen Erkenntnisse bildeten eine wichtige Grundlage
für ein besseres Verständnis der Schlaganfallexperimente und deren Zusammenhang zwischen
Laktat, Neuroprotektion beim Schlaganfall und der zerebralen, metabolischen Wirkung einzelner
Anästhetika.
Im 2. Teil der Arbeit wurde, als eine der ersten Arbeiten, die neuroprotektive Wirkung von
Laktat im permanenten und transienten Schlaganfallmodell der Maus getestet. Dies bot sich vor
dem Hintergrund der derzeit stattfindenden Neuinterpretation des Laktats als wichtigem Energiemetabolit
an.
Für den Schlaganfall in der Maus wurde ein silikonbeschichteter Nylonfaden verwendet, mit
welchem die mittlere Zerebralarterie der Tiere verschlossen wurde. Im permanenten Schlaganfallmodell
verblieb der implantierte Faden die gesamte Zeit über im Gehirn der Maus, während
beim transienten Modell der Faden nach einer gewissen Okklusionszeit (30-60 min) wieder
entfernt und der zerebrale Blutfluss wieder hergestellt wurde. Laktat (250 mg/kg) wurde im
permanenten Modell zu unterschiedlichen Zeitpunkten (45, 30, 15 min vor und 15 min nach
der Okklusion) intraperitoneal verabreicht. Als Anästhetika kamen Isofluran und Pentobarbital
zum Einsatz. Die Applikation im transienten Modell erfolgte direkt nach der wiederhergestellten
Reperfusion ebenfalls intraperitoneal. Hierbei kamen Isofluran und Ketamin/Xylazin als Anästhetika
zum Einsatz. Einen Tag später wurde für jedes Tier das allgemeine Verhalten, die
motorische Koordination im Cornertest sowie der Gewichtsverlust dokumentiert. Anschließend
wurde das Gehirn entnommen, eine TTC-Färbung durchgeführt und das Infarktvolumen und
der Schweregrad des Infarkts anhand der Graustufendifferenz bestimmt.
Eine neuroprotektive Wirkung des Laktats konnte sowohl im permanenten und als auch
im transienten Schlaganfallmodell der Maus nachgewiesen werden. Im permanenten Modell war
unter Isoflurannarkose eine neuroprotektive Wirkung erkennbar, die sich durch Reduktion des
Infarkvolumens, Verminderung der Graustufendifferenz sowie eine Reduktion des Gewichtsverlusts
bei Gabe von Laktat (30 und 15 min vor der Okklusion) nachwiesen ließ. In der allgemeinen
Verhaltensanalyse und im Cornertest war kein signifikanter Unterschied zu erkennen. Unter
Pentobarbitalnarkose trat diese Form der Neuroprotektion nicht auf. Im transienten Schlaganfallmodell
war eine Neuroprotektion des Laktats (bei Gabe direkt nach der Reperfusion) sowohl
unter Isofluran- als auch unter Ketamin/Xylazin-Narkose nachzuweisen. Diese äußerte sich in der
Reduktion des Infarktvolumens und der Graustufendifferenz. Eine Veränderung in der Reduktion
des Gewichtverlustes, in der allgemeinen Verhaltensanalyse und im Cornertest war jedoch nicht
zu sehen. Unter Bezugnahme der Mikrodialysedaten verschiedener Anästhetika, ist festzustellen,
dass die neuroprotektive Wirkung des Laktats davon abhängt, welches Anästhetikum zum
Einsatz kommt und wie dieses den Laktatstoffwechsel moduliert. So war eine Neuroprotektion
durch Laktat unter Verwendung von Anästhetika feststellbar, die die peripheren Laktatspiegel im
Blut erhöhen (Isofluran) oder nicht beeinflussen (Ketamin/Xylazin). Bei Pentobarbital, welches
die peripheren Laktatwerte im Blut der Tiere verminderte, zeigte die exogene Laktatgabe keine
Wirkung.
Die Experimente konnten also nachweisen, dass Laktat neuroprotektive Wirkungen im Schlaganfallmodell
von Mäusen besitzt.Weiterführende Versuche bieten sich hier an, um Aussagen über
die optimale Dosierung und den geeignetsten Therapiezeitpunkt zu ermöglichen, bevor eine Untersuchung des klinischen Nutzens beim Menschen sinnvoll erscheint.
Endocannabinoids (eCB) are signaling lipids and became known for their importance in the central nervous system as well as in immune defense. Beneficial effects of eCB are shown in processes of excitotoxic lesion, secondary damage and neuronal plasticity throughout the last years. Two canabinoid receptors, type 1 (CB1) and type 2 (CB2) as the respective endogenous ligands belong to the endocannabinoid system (eCBS). In 1990, the CB1 could be cloned and was localised mainly on neurons. Shortly thereafter in 1993, the CB2 was characterised and found primarily on cells belonging to the immune system. N-arachidonoylethanolamide (AEA), often called anandamide, and 2-arachidonoylglycerol (2-AG) are the best characterised eCB. N-palmitylethanolamide (PEA) and N-oleoylethanolamide (OEA) have no or only low affinity to CB1 but enhance the affinity of AEA significantly. This group is therefore often summarized as N-ethanolamides (NEA). ECB are derivates of arachidonic acid and are stored in membranes where they become hydrolysed on demand by specific enzymes. Traumatic brain injury altered the levels of eCB in the blood in vivo and when applied in vitro after neuronal damage, eCB could reduce the damaging burden. Further studies demonstrated that eCB are potent to down-regulate pro-inflammatory cytokines and most important to decrease neuronal excitation.
In the present study, the intrinsic regulation of the endocannabinoid system after neuronal damage over time was investigated in rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures (OHSC). Temporal and spatial dynamics of eCB levels were analysed after transection of the perforant pathway (PPT) in originating neurons (enthorhinal cortex, EC), areas of deafferentiation/anterograde axonal degeneration (dentate gyrus, DG) and of the synaptically linked cornu ammonis region 1 (CA1) as well as after excitotoxic lesion in the respective regions.
A strong increase of all eCB was observed only in the denervation zone of the DG 24 hours post PPT. In excitotoxic lesioned OHSC all eCB were elevated, in the investigated regions up to 72 hours post lesion (hpl). The responsible enzyme for biosynthesis of the NEA, NAPE-PLD protein, was increased during the early timepoints of measurement (1-6 hpl). The responsible catabolizing enzyme, FAAH, and the CB1 receptor were up-regulated at a later timepoint, 48 hpl, explaining the eCB levels. In the present model, the inhibition of the enzyme responsible for 2-AG hydrolysis (MAGL) was neuroprotective as previously shown and a re-distribution within neurons and astrocytes during neuronal damage could be observed. In primary cell cultures microglia expressed the regulating enzymes of 2-AG and the enzyme responsible for NEA down-regulation, FAAH. Astrocytes expressed mainly the catalyzing enzymes, indicating the role for eCB break-down. All these findings together demonstrate the great capacity of the eCBS to control inflammatory processes and consequently neuronal cell death.
All effects of the known eCB could not be clarified by CB1/CB2 deficient mice. Several G-protein coupled receptors (GPR) are recently in discussion whether they might and should belong to the endocannabinoid system. The GPR55, the not yet cloned abnormal cannabidiol receptor and further GPRs are candidates as potential endocannabinoid receptors. Recently GPR55 has been discussed as a putative cannabinoid receptor type 3 (CB3). Quantitative PCR revealed that Gpr55 is present in primary microglia and the brain, but the exact regional and cellular distribution and the physiological/pathological effects downstream of GPR55 activation in the CNS still remain open. Therefore, the excitotoxic rat OHSC model, previously used to investigate the neuroprotective potency of eCB, was now used to investigate the neuroprotective potency of GPR55. Activation of GPR55 protected dentate gyrus granule cells in vitro after excitotoxic lesion, induced by NMDA. In parallel, GPR55 activation was able to reduce the number of microglia in the dentate gyrus. These neuroprotective effects vanished however in microglia depleted OHSCs as well as in OHSC transfected with Gpr55 siRNA, indicating a strong involvement of microglia in GPR55 mediated neuroprotection.
In summary, the present study found a strong time-dependent and anterograde mechanism of action of eCB after long-range projection damage and provided further evidence for the neuroprotective properties of eCB. The potential cannabinoid receptor 3 (GPR55) mediates neuronal protection on behalf of microglia.
Im ersten Projekt der vorliegenden Arbeit wurden CD - 1 Mäuse mit drei unterschiedlichen Diäten für zwei Wochen ad libitum gefüttert. Die Diäten bestanden aus zwei kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten und einer Standard Haltungsdiät. Die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten enthielten entweder Triheptanoin (dreifach mit Heptanoat verestertes Glycerol) oder Soja - Öl als Fettkomponente (jeweils 35 % der Gesamtkalorien). Nach zwei Wochen wurde ein ischämischer Schlaganfall für 90 min. mithilfe eines Silikonfadens induziert. Die Leber, das Blut und das Gehirn wurden nach dem Schlaganfall entnommen und die Konzentrationen der Metabolite β - Hydroxybutyrat, Glukose, Laktat und Citrat wurden mit der zuvor etablierten GC - MS-Methode ermittelt. Unter gleichen Bedingungen wurde eine Mikrodialysestudie durchgeführt.
Bei den Tieren, die die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten erhielten, konnte in den Leber - und Hirnhomogenaten, im Plasma sowie im Mikrodialysat eine Ketose festgestellt werden. Die BHB Konzentrationen durch eine Soja Diät erreichten im Leberhomogenat bis zu 4 mM, im Plasma bis zu 1,5 mM, im Hirnhomogenat bis zu 1,5 mM und im Mikrodialysat bis zu 30 µM. Um eine Aussage treffen zu können, ob das Gehirn die von der Leber produzierten Ketonkörper als Energiesubstrate nutzen kann, wurde eine Folgestudie (unter gleichen Bedingungen) durchgeführt. Bei dieser Studie wurde der Zeitpunkt der Gewebeentnahme 60 min. nach Entfernen des Fadens (Reperfusion) gewählt. In den Leber – und Hirnhomogenaten konnten erniedrigte Konzentrationen des Ketonkörpers BHB nachgewiesen werden. Die nicht operierten Tiere, die eine fettreiche Diät erhielten, hatten erhöhte Konzentrationen an Citrat in den genannten Geweben. Durch den Abbau des Ketonkörpers BHB können bei Verstoffwechslung in Geweben außerhalb der Leber, zwei Moleküle Acetyl - CoA gebildet werden. Diese gebildeten Acetyl - CoA Moleküle können in den Citratzyklus eingespeist werden.
Um diesen Befund mechanistisch besser verstehen zu können, wurde den Mäusen Propranolol (ein unselektiver β - Blocker) verabreicht, und zwar kurz nachdem der Faden die mittlere Zerebralarterie verschlossen hatte. Als Folge blieb bei den fettreich gefütterten Tieren die zuvor beobachtete Ketose, aus. Daraus wurde geschlossen, dass die auftretende Ketose bei den fettreich gefütterten Tieren durch adrenerge β - Rezeptoren vermittelt wurde. Zusammengefasst kann eine fettreiche bzw. ketogene Ernährung im Falle einer Ischämie die Versorgung des Gehirns durch die Bildung von Ketonkörper gewährleisten.
Die zu beobachtende hepatische Ketogenese aus dem ersten Projekt hat die Frage entstehen lassen, ob eine akute Gabe von β - Hydroxybutyrat (BHB) bei Entfernen des Fadens schützende Effekte auf das Verhalten bzw. die Mitochondrien als Kraftwerke der Zelle hat. Hierzu wurde BHB bei Reperfusion gegeben und die Wirkungen dieser Einmalgabe nach 24 h untersucht. Als erster Schritt wurde der Nachweis erbracht, dass eine exogene Gabe von BHB das Gehirn erreicht. Im zweiten Schritt wurde das Verhalten der Mäuse nach 24 h untersucht. Hierbei erbrachte die Gabe von BHB eine signifikante Verbesserung der sensorischen und motorischen Fähigkeiten der Mäuse. Die metabolischen Veränderungen nach 24 h wurden erneut in Leberhomogenaten und Plasma vermessen. Eine Einzelgabe von BHB bewirkte eine milde Ketose auch 24 h nach Reperfusion der mittleren Zerebralarterie. Um eine detailliertere Erkenntnis über die Wirkung von BHB zu erlangen, wurden die Mitochondrien als potentielles Ziel für BHB in den Fokus genommen. Die Einmalgabe von BHB verhinderte ein Absinken der Komplex – II Aktivität. Außerdem kann die Aktivität der Citratsynthase unter der Gabe von BHB erhalten werden, sodass die Mitochondrien vor allem im wichtigen Zeitraum nach der Reperfusion geschützt werden. Im Rahmen der Untersuchungen der Mitochondrien wurden unterschiedliche Substrateinflüsse auf die Respiration der isolierten Mitochondrien getestet. Bei Zugabe von BHB, Oxalacetat + Acetat oder Citrat zu dem Respirationsmedium stieg die Respiration der Mitochondrien an. Im Falle von Glukose, Propranolol oder Acetat wird die Respiration verringert. Bei Zugabe von Laktat, verbleibt die Respiration auf Ausgangsniveau. Abschließend ist festzustellen, dass die Einzelgabe von BHB nach 24 h das Verhalten der Mäuse verbessert, eine milde Ketose induziert, sowie Mitochondrien und die Citratsynthase gegen ischämische Ereignisse schützt.
Um die in dieser Arbeit gezeigten Daten über metabolische Veränderungen zeigen zu können, musste eine vorherige Etablierung der GC – MS Analytik vollzogen werden. Auf der einen Seite musste die Probenvorbereitung, aber auch die gesamte Vermessung der Proben aufgebaut werden. Es wurden insgesamt 11 Analyte in vier unterschiedlichen Kompartimenten quantifiziert. Die Nachweisgrenze lag bei diesen 11 Analyten bei 0,01 - 1 ng/µl, was einer umgerechneten Stoffmengenkonzentration von 0,5 - 10 µM entspricht. Mithilfe dieser Methode können optional weitere Substanzen aus verschiedenen Geweben zugänglich gemacht werden. Diese Arbeit bietet hierzu eine Anleitung, wie die Etablierung erfolgen kann. Im Rahmen der Probenvorbereitung wurden alle Schritte systematisch verbessert. Dazu wurden Wiederholungsmessungen für unterschiedliche Modalitäten vollzogen. Die Abundance und die Zeitbeständigkeit waren die wesentlichen Beurteilungskriterien. So wurden die Daten für die Extraktionseffektivität, die Lösungsmittelabhängigkeit der Silylierung, der Zusatz von Hünig - Base sowie die Temperatur und Zeitabhängigkeit der Silylierung in dieser Arbeit erarbeitet. Die Quantifizierung wurde anhand von internen Standardverbindungen durchgeführt. Die jeweiligen Response – Faktoren blieben über die gesamte Zeit nach der Etablierung konstant und erlaubten die Quantifizierung mit geringen Fehlern. Die Beurteilung der ermittelten Daten über die Validierung wurden anhand von geltenden Regelwerken der pharmazeutischen Industrie entschieden. Es wurde ein Protokoll entwickelt, das im Rahmen der universitären Forschung eine vertrauenswürdige Aussage über Veränderungen von Metabolitenspiegeln in vielen Geweben der Maus und der Ratte geben kann.
Alzheimer’s disease is a chronic neurodegenerative disease that causes problems with memory, thinking and behavior. The pathophysiological hallmarks of AD are extracellular senile plaques and intracellular neurofibrillary tangles. Amyloid plaques mainly contain the amyloid-β (Aβ) peptide, which appears as a cleavage product of the APP. APP is a type I transmembrane protein with a large extracellular domain and a short cytoplasmic tail. It is expressed in variety of tissues e.g. in neuronal tissue (brain, spinal cord, retina), and non-neuronal tissues (kidney, lung, pancreas, prostate gland, and thyroid gland) (Dawkins and Small, 2014). APP has been studied because of its link to AD, however, its role in normal brain function is poorly understood. APP is processed by two different pathways, amyloidogenic pathway and non-amyloidogenic pathway. In physiological condition, the majority of APP is processed via the non-amyloidogenic, thus leading to the generation of the secreted N-terminal APP processing product sAPPα. sAPPα is formed due to the cleavage of APP by α-secretase. In previous studies, our group has shown that sAPPα produce potent neuroprotective effect by altering gene expression, as well as by antagonizing several different types of neurotoxic stress stimuli (Copanaki et al., 2010; Kögel et al., 2003, 2005; Milosch et al., 2014). Several studies have shown that protein degradation is reduced in AD (Hong et al., 2014; Lipinski et al., 2010) but the role of APP and its cleavage products in protein degradation is still unknown. This thesis discusses about the physiological functions of APP in neuroprotection and protein homeostasis.
In the first part of the thesis (Section 4.1 - 4.4), the neuroprotective properties of yeast derived sAPPα and E1 (N-terminal domain of sAPPα) were investigated under serum and glucose deprivation conditions. In previous work, it was shown that recombinant sAPPα evoked a significant decrease in serum deprivation triggered cell death in human SH-SY5Y neuroblastoma cells and mouse embryonic fibroblast MEF cells. It was also observed that sAPPα induces the phosphorylation of Akt which leads to neuroprotection (Milosch et al., 2014). This study investigated whether this neuroprotection is associated with altered expression of downstream intracellular Akt targets such as FoxO, Bim, Bcl-xL and Mcl-1 under stress conditions. Here it was shown that sAPPα prevents activation and nuclear translocation of FoxO. FoxO act as a transcription factor for different proapoptotic genes such as Bim. It was also observed that Bim protein and mRNA expression was significantly reduced with sAPPα and E1 treatment. The expression of antiapoptotic protiens such as Bcl-xL and Mcl-1 were also examined and it was observed that sAPPα and E1 increases expression of both these proteins. Furthermore, it was previously demonstrated that uncleaved holo-APP functionally cooperates with sAPPα to activate Akt and provide neuroprotection (Milosch et al., 2014). Therefore, to investigate the function of the APP in sAPPα regulated Akt downstream proteins expressions, MEF APP KO cells were used. E1 and sAPPα only showed neuroprotective modulatory effect on these Akt downstream targets in MEF wt cells, but not in APP KO cells. In addition, sAPPα also showed neuroprotection in primary wt hippocampal neurons under trophic factor deprivation. Cellular fractionation experiments were also done to determine the role of sAPPα in cytochrome c release from mitochondria. It was observed that sAPPα treatment can inhibit mitochondrial cytochrome c release in wt MEF cells.
The second part of the thesis (Section 4.5 - 4.9) discusses about the role of sAPPα in protein homeostasis. It was observed that sAPPα prevents proteotoxic stress induced BAG3 protein expression in SH-SY5Y and MEF cells. This was also observed in mRNA levels which indicate a transcriptional regulation. Furthermore, treatment with sAPPα was also shown to decrease aggresomes formation. Aggresomes are perinuclear aggregates which are formed due to accumulation of damaged and misfolded proteins and BAG3 plays important role in their formation and the transport of degradation prone proteins into these structures. The analysis of proteasomal activity showed a reduced accumulation of proteasomal substrate d2 by sAPPα under proteasomal stress. In proteasomal activity assay, sAPPα was shown to increase the degradation of proteasomal substrate SUC-LLVY-AMC and the fluorigenic signal was measured spectrophotometrically. The sAPPβ fragment which is generated via the amyloidogenic pathway was also examined for its role in BAG3 expression and proteasomal degradation. sAPPβ, which has almost similar structure as sAPPα, only 17 amino acids at the C-terminus is missing, was failed to modulate BAG3 expression and proteostasis. This indicates that these biological effects are highly specific for sAPPα.
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Der ischämische Schlaganfall ist ein Ereignis, das zu gravierenden Langzeitschäden im Gehirn führen kann und für das es keine ausreichende Therapie gibt. Der Schlaganfall und seine Folgen sind Hauptursachen für die Behinderung und Pflegebedürftigkeit im Alter. Eine cerebrale Ischämie führt zu pathophysiologischen Veränderungen, wie z.B. einer Störung in der Energieversorgung und einem veränderten Metabolismus im Gehirn. Die hierbei beobachtbaren stark erhöhten Glutamatspiegel ergeben sich u.a. aus der Depolarisation der neuronalen Plasmamembran und der Umkehr des Na+-abhängigen Glutamattransporters. Die massive Freisetzung von Glutamat spielt eine Schlüsselrolle in der Pathophysiologie des Schlaganfalls und ist ein möglicher therapeutischer Angriffspunkt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Methode des fokalen cerebralen Schlaganfalls in der Maus etabliert. Hierbei ist u.a. der Nutzen einer Ringerlaktat Gabe nach der Schlaganfallinduktion belegt worden. Anschließend wurde der Einfluss einer cerebralen Ischämie in Bezug auf die Infarktgröße, die motorische Funktion der Tiere und den Energiestoffwechsel des Gehirns untersucht. Das Ausmaß des fokalen cerebralen Schlaganfalls der Maus wurde durch die Auswertung der Infarktfläche 24 Stunden nach einer permanenten oder transienten Okklusion der Arteria cerebri media berechnet. Die daraus folgenden sensomotorischen Defizite der Tiere wurden mit verschiedenen Verhaltenstests bewertet. Eine Verkürzung der Okklusionszeit der Arteria cerebri media führt nicht nur zu einer Reduktion der Infarktfläche, sondern auch zu einem besseren Ergebnis in den neurologischen Tests. Zur Messung des cerebralen Metabolismus ist die Mikrodialysetechnik mit dem Schlaganfallmodell kombiniert worden. Die Analyse der Dialysatproben zeigt, dass durch die Ischämie Glutamat innerhalb von 15-30 Minuten toxische Konzentrationen erreicht, wohingegen die Glukosekonzentration stark abfällt. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob das Infarktvolumen, die Glutamat-induzierte Exzitotoxizität im Gehirn und die motorischen Defizite durch die Gabe von Bilobalid moduliert werden können. Bilobalid ist ein Inhaltsstoff des Ginkgo biloba Extraktes EGb 761 und zeigte bereits in in vitro-Studien ein antiischämisches Potential. Da die Pharmakokinetik von Bilobalid im Gehirn völlig unbekannt war, ist zuerst untersucht worden, ob Bilobalid nach einer intraperitonealen Gabe in ausreichender Konzentration im gesunden und ischämischen Hirngewebe vorliegt. Die Proben wurden über die Mikrodialyse gewonnen. Die Analyse ergab, dass Bilobalid sowohl im gesunden, als auch im ischämischen Gehirn in ausreichender Konzentration (ca. 1 µM) vorliegt, um eine neuroprotektive Wirkung auszuüben. Eine Gabe von Bilobalid nach der Schlaganfallinduktion führt dagegen nur zu einer geringen Konzentration im ischämischen Gewebe (0,08 µM). Die Studie zum Einfluss von Bilobalid (0,3-10 mg/kg) auf das Infarktvolumen zeigt, dass in den Konzentrationen 3 und 10 mg/kg die Schlaganfallfläche im Striatum markant reduziert wird. Für die Dosis 10 mg/kg ist diese Wirkung zusätzlich auch bei einer Applikation erst nach der Schlaganfallinduktion zu sehen. Die Wirkung von Bilobalid auf die metabolischen Veränderungen nach einem Schlaganfall wurde ebenfalls mittels Mikrodialyse untersucht. Die Ischämie bedingten toxischen Glutamatkonzentrationen werden hierbei dosisabhängig durch Bilobalid reduziert, wohingegen die Substanz keinen Einfluss auf die Reduktion der Glukosespiegel zeigt. Abschließend wurde eine Untersuchung zum Verhalten der Bilobalid-behandelten Tiere nach einer permanenten oder transienten Okklusion durchgeführt. Die Bilobalid Tiere wiesen hierbei, besonders im transienten Schlaganfallmodell, eine bessere Motorik und Koordination als unbehandelte Tiere auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein fokaler Schlaganfall zu einer massiven Erhöhung der Glutamatkonzentration im Gehirn führt und die Tiere eine starke Beeinträchtigung in der Motorik und Koordination haben. Bilobalid reduziert in vivo dosisabhängig das Ausmaß eines Schlaganfalls und senkt die daraus resultierenden toxischen Glutamatkonzentrationen. Gleichzeitig zeigen die mit Bilobalid-behandelten gegenüber den unbehandelten Tieren eine Verbesserung in den neurologischen Tests. Sowohl eine Anreicherung der Substanz in einem Ginkgo biloba Extrakt, als auch die Einnahme der Reinsubstanz könnte positive Auswirkungen auf einen humanen Schlaganfall haben.
To this day, stroke is the leading cause of death and disability worldwide. Due to increasing age of the world population and poor lifestyle, the incidence is further rising. Besides mechanical thrombectomy as a surgical option, there is a lack of therapeutic options with recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) being the only approved drug for treatment for ischemic stroke. However, there are various problems that make the administration of rt-PA difficult. In particular, it can only be given for ischemic (not hemorrhagic) stroke, and there is a narrow time frame of 4.5 hours after onset of stroke, in which it can be successfully applied. While the success rates of combined thrombectomy with rt-PA are around 60%, less than 5% of patients receive this therapy.
ß-Hydroxybutyrate (BHB) is a ketone body that is formed in high amounts during fasting and lipolysis. Ketone bodes and the ketogenic diet have been shown to have neuroprotective properties in neurodegenerative diseases. In prior work of our group, the ketogenic diet was shown to have beneficial effects in mice after transient ischemia. In the present work, a single dose of BHB was tested for beneficial effects. For this purpose, microdialysis was used to demonstrate that BHB can cross the blood-brain barrier. For the next series of experiments, transient cerebral ischemia was induced in mice for 90 minutes by unilaterally occluding the middle cerebral artery (MCAO) with a silicone-covered filament. Behavioral tests one day after BHB administration showed that the moderate dose of 30 mg/kg, given immediately after reperfusion, improved the neurological score significantly whereas a lower (10 mg/kg) and a higher dose (100 mg/kg) had no effects The main part of the experiments focused on mitochondrial respiration as a potential mechanism of action for BHB. In isolated mitochondria from mouse brain, BHB (1-10 mM) was able to stimulate mitochondrial respiration stronger than pyruvate, but not as strong as succinate.. In the following experiments, MCAO was induced in vivo, and mitochondria were isolated and investigated ex vivo. Experiments were conducted 60 minutes, 24 hours, 72 hours, and 7 days after cerebral ischemia and reperfusion. Besides mitochondrial respiration (normalized to mitochondrial protein content or citrate synthase activity), several other parameters were monitored: the development of bodyweight throughout the experiment, citrate synthase activity, plasma metabolites and behavior to assess motor functions. Three behavioral tests were conducted: first, the Corner test, an experiment for measuring the extent of unilateral movement. Here, if a stroked mouse is put into a narrow corner (30°), it is most likely to turn unilaterally to the right, whereas an unimpaired mouse will turn to both sides randomly. From a total of 10 turns, a laterality index was calculated. Second, in the Chimney test, the mouse walks heads first into a tube. Once it reaches the end, the tube is tipped 90 degrees to stand on the table vertically. Motorically impaired animals have difficulties crawling backwards up to the top of the tube. The experiment was stopped if an animal did not reach the top of the tube within 60 seconds. Third, in the Rotarod test, the mouse is placed on a rotating beam on which it is supposed to walk for at least 60 seconds, and the time when the animal falls off the rotating tube is measured.
All animals that had undergone ischemia showed massive weight loss until 72 hours after reperfusion. Weight loss then stagnated and there was a trend of increasing weight 7 days after reperfusion. The behavioral analysis showed that 24 hours after reperfusion, BHB-treated animals performed significantly better in the Corner test, meaning their moving patterns were more heterogeneous than those of saline-treated animals and in the Chimney test. 72 hours after reperfusion, BHB-treated animals still performed significantly better in the Chimney test, but 7 days after reperfusion, the performances of BHB- and saline-treated animals were no longer different from each other in any of the behavioral tests. In separate experiments, the plasma metabolites glucose, lactate, and pyruvate were changed in the animals that had undergone ischemia but were not affected by BHB administration.
Mitochondrial respiration was tested at four time points after the administration of BHB after reperfusion – 60 minutes, 24 hours, 72 hours, and 7 days after transient cerebral ischemia. 60 minutes later, data showed an increase of oxygen consumption of the complexes I and II. OxPhos was also increased but the effect at this point, did not reach statistical significance. 24 hours after reperfusion, this effect was consolidated: complex I, complex II and OxPhos respiration were significantly improved in the BHB-treated group compared to saline...
Im Forschungsgebiet der Proteomik hat sich die Massenspektrometrie als essenzielles Werkzeug etabliert. Zur Probengewinnung und deren Präparation für die chromatogra-phische Trennung und massenspektrometrische Analyse existieren eine Vielzahl von Protokollen, deren Verwendung jedoch unterschiedlichste Vor- und Nachteile mitbringt. Im Idealfall wäre ein solches Protokoll schnell und kostengünstig durchführbar, würde mit hoher Robustheit die Proteine aus den Ausgangszellmaterial quantitativ extrahieren und Probenverluste auf ein Minimum beschränken. Ziel dieser Arbeit war es, in einem strukturierten Ansatz sich diesem Ideal zu nähern und mögliche Kompatibilitaten mit anderen Methoden wie dem Arg-C analogen Proteinverdau zu untersuchen. Als Maß-stäbe dienen hierbei die aktuellen Standardprotokolle: die Acetonfällung der Proteine mit anschließender Solublisieung und das FASP-Protokoll, bei dem die zur Proteinpro-zessierung notwendigen Arbeitsschritte auf einer Größenausschlussmembran stattfinden. Dazu wurde zunächst das Adsorptionsverhalten von Proteinen auf den Silica-Oberflächen paramagnetischer Beads untersucht und dabei insbesondere der Einfluss von Chemikalien zur Zell-Lyse und den im Anschluss verwendeten Reduktions- und Alkylierungsreagenzien analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Proteine aus dem Totalzelllysat sehr effektiv an die Silicaoberfläche binden und dass der Prozess der Re-duktion von Disulfidbrücken mit nachfolgender Carbamidomethylierung positiv zur Adsorption beiträgt und negative Einflüsse auf die Immobilisierung negieren kann. Dar-aus wurde ein Protokoll zur kombinierten Lyse, Aufreinigung, Modifikation und Proteo-lyse (abgekürzt: ABP) entwickelt. Parallel dazu konnte die Kompatibilität des Protokolls mit dem ArgC-analogen Verdau gezeigt werden und in der Folge konnte die Komple-mentarität der Methoden erfolgreich getestet werden. Mit frischen Zell-Lysaten wurde der Einfluss der Lysisreagentien unter Einschluss einer kommerziellen Variante ("Bug-buster" Lysis-Puffer) bestimmt und Harnstoff konnte als Mittel der Wahl definiert wer-den, da mit diesem höhere Identifikationszahlen erreicht wurden, lipophile Proteine vermehrt in der Probe erhalten blieben und größere Ionscores ermittelt werden konnten. Das Potential von ABP wurde im Direktvergleich mit FASP und dem Verdau in Lösung anhand eines humanen Proteoms genauestens untersucht, wobei eine konsequente Ver-besserung gegenüber beiden Methoden festgestellt werden konnte, insbesondere im Hinblick auf Praktikabilität und die Zahl der erforderlichen Arbeitsschritte, Reprodu-zierbarkeit und Zahl der identifizierten Peptide. Ein Bias des ABP zugunsten spezieller Proteineigenschaften konnte nach ausführlicher Analyse der identifizierten Proteine und Peptide nicht festgestellt werden. Eine vermehrt auftretende Oxidation von Methionin wurde identifiziert, allerdings zeigten sich keine negativen Auswirkungen auf die Pro-teinidentifizierungen. Zur Unterdrückung potentieller und unerwünschter Nebenpro-dukte in Form von Methylierungen, die als Folge des ursprünglichen ArgC-analogen Verdaus36 auftreten, wurde mit Verwendung von Acetonitril eine Alternative erfolg-reich getestet. Ein humanes Proteom wurde mittels des formulierten Protokolls sowohl tryptisch als auch mit ArgC-analogen Verdau (mit Acetonitril bzw. Methanol) analysiert. In diesem Zusammenhang wurde die Vollständigkeit der Modifikation der Lysine unter Verwendung von ACN mit zufriedenstellenden 99% bestätigt und die unerwünschte Carbamylierung der Aminosäure durch Harnstoff als Lysisreagenz konnte ausgeschlos-sen werden. Beide Ansätze zum ArgC-analogen Verdau erwiesen sich zudem gegenüber der tryptischen Variante als überlegen, was sich in einer Erhöhung der Identifikations-zahlen des humanen Proteoms widerspiegelt. Insbesondere wenig abundante Proteine, Histone und membranassoziierte Proteine bildeten den Großteil der zusätzlich identifi-zierten Proteine. Zusätzlich konnte eine günstigeres Fragmentierungsverhalten beobach-tet werden. Die effektiven Grenzen des ABP im Hinblick auf die erforderliche Protein-menge wurden untersucht und beschrieben. Der zu erwartende Zusammenhang zwi-schen abnehmender Proteinmenge und Identifikationszahlen niedrig abundanter Protei-ne wurde bestätigt und ein effektiver Grenzwert von 5µg Ausgangsmenge humanen Proteoms ermittelt. Abschließend wurden Dauer und Aufwand der Probenvorbereitung durch Etablierung paralleler Reduktion, Carbamidomethylierung und Propionylierung minimiert und damit zusätzlich Probenverluste reduziert. Die dadurch erreichte Erhö-hung der Identifikationszahlen ergab sich wiederum aus der höheren Repräsentanz nied-rig abundanter Proteine.
Im Rückblick ist es überraschend, dass die Verwendung der Adsorptionstendenzen von Proteinen bisher keine größere Rolle in der Probenvorbereitung proteomischer Analysen eingenommen hat. Die symbiotisch wirkende, aktive Denaturierung als Resultat der durchgeführten Derivatisierung zur Analysenpräparation macht die Adsorption auf Sili-ca-Oberflächen zum prädestinierten Mittel der Probengewinnung und schafft die Vo-raussetzung für die erreichte Verkürzung der Arbeitsabläufe und Verbesserung der Ergebnisse.