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Oral presentation from 4th International Conference of cGMP Generators, Effectors and Therapeutic Implications ; Regensburg, Germany. 19–21 June 2009 Background: An exaggerated pain sensitivity is the dominant feature of inflammatory and neuropathic pain both in the clinical setting and in experimental animal models. It manifests as pain in response to normally innocuous stimuli (allodynia), increased response to noxious stimuli (hyperalgesia) or spontaneous pain, and can persist long after the initial injury is resolved. Research over the last decades has revealed that several signaling pathways in the spinal cord essentially contribute to the pain sensitization. To test the contribution of cGMP produced by NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) to pain sensitization, we investigated the localization of NO-GC in the spinal cord and in dorsal root ganglia, and we characterized the nociceptive behavior of mice deficient in NO-GC (GC-KO mice). Results: We show that NO-GC (β1 subunit) is distinctly expressed in neurons of the mouse spinal cord, while its distribution in dorsal root ganglia is restricted to non-neuronal cells. GC-KO mice exhibited a considerably reduced nociceptive behavior in models of inflammatory or neuropathic pain, but their responses to acute pain were not impaired. Moreover, GC-KO mice failed to develop pain sensitization induced by spinal administration of drugs releasing NO. Surprisingly, during spinal nociceptive processing cGMP produced by NO-GC may activate signaling pathways different from cGMP-dependent protein kinase I (cGKI), while cGKI can be activated by natriuretic peptide receptor-B (NPR-B) dependent cGMP production. Conclusion: Taken together, our results provide evidence that NO-GC has a dominant role in the development of exaggerated pain sensitivity during inflammatory and neuropathic pain. Furthermore, beside the NO-mediated cGMP synthesis, cGMP produced by NPR-B contributes to pain sensitization by activation of cGKI.
Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung der zentralen Lipidhomöostase durch Statine
(2009)
Die adoptive Immuntherapie mit hochaufgereinigten NK-Zellen bei pädiatrischen Patienten mit malignen Erkrankungen nach haploidenter SZT ist eine mögliche Therapieoption, um einen verstärkten GvL/GvT-Effekt zu bewirken und möglicherweise die Immunregeneration zu fördern. Als schwerwiegende Nebenwirkung ist bisher noch nicht eindeutig belegt, ob neben T-Zellen auch NK-Zellen in der Lage sind, eine GvHD auszulösen. In der Frankfurter Universitätskinderklinik wurden 7 Patienten (4xALL, 1xAML, 1xRMS IV und 1xM. Hodgkin) mit hochaufgereinigten unstimulierten NK-Zellen und 3 Patienten (3xNB IV) mit IL-2 stimulierten NK-Zellen nach haploidenter SZT behandelt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in vitro untersucht, ob NK-Zellen durch die Stimulierung mit IL-2 einen gesteigerten GvL/T-Effekt aufweisen. Es wurden NK-Zellen von 5 verschiedenen gesunden Spendern (2 im Rahmen von Validierungsläufen und 3 zur Behandlung der 3 Patienten mit NB) zunächst immunomagnetisch im klinischen Maßstab mittels CD3-Depletion und darauffolgender CD56-Selektion aufgereinigt. Danach erfolgte die Aktivierung mit IL-2 (Proleukin®S) über 14 Tage unter GMP. Während sich die NK-Zellen aller Spender nach Aufreinigung in eine kleine Population CD56+CD16- immunregulatorischer NK-Zellen (2,3 bis 7,1 %) und eine große Population zytotoxischer CD56+CD16+ NK-Zellen (92,9 bis 97,7 %) unterteilen ließen, zeigte sich nach IL-2 Stimulierung ein heterogenes Bild von CD16+ zu CD16- NK-Zellen. Durch die 9-tägige IL-2 Stimulierung vergrößerte sich der Anteil KIRnegativer NK-Zellen. Es konnte auf den NK-Zellen aller Spender gezeigt werden, dass durch die IL-2 Stimulierung wichtige Rezeptoren (NKG2D, NCR), die für ein hohes zytotoxisches Potential stehen, verstärkt auf der NK-Zelloberfläche exprimiert wurden. Die gesteigerte Zytokinproduktion der IL-2 stimulierten NK-Zellen untermauerte die Funktionalität der ex vivo stimulierten NK-Zellen und dies konnte in funktionalen Assays, die die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen belegen, bewiesen werden. Durch die IL-2 Stimulierung der NK-Zellen konnte die Killing Aktivität gleichmäßig auf über 90 % gesteigert werden. Interessanterweise wies Spender A bei den funktionellen und phänotypischen Analysen eine Sonderrolle auf. Die NK-Zellen dieses Spenders zeigten bereits vor IL-2 Stimulierung eine hohe Zytotoxizität gegenüber malignen Zellen, welches auf eine Voraktivierung, gemessen an der Expression von Aktivierungsmarker CD69, schließen lässt. Die in vivo Untersuchungen zeigten, dass bei einer verabreichten T-Zell-Dosis unter 50 x 103/KG, nur milde GvHDs (Grad I/II) auftraten. Bis zu 60 x 106 NK-Zellen/KG wurden gut toleriert. Nebenwirkungen wie Fieber und Schüttelfrost waren transient und gingen einher mit erhöhten Zytokinspiegeln von inflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-8, IFN-γ) im Serum der Patienten. Ein engmaschiges Monitoring nach der NK-Zell-Applikation der IL-2 stimulierten NK-Zellen zeigte, dass die NK-Zellen in 5/6 Applikationen aus der peripheren Blutbahn abwanderten, einhergehend mit der Migration von Antigen-präsentierenden Zellen. Bei der Untersuchung des langfristigen Einflusses von adoptiver NK-Zell-Immuntherapie auf die Immunrekonstitution bei Patienten nach haploidenter SZT wurde vorausgehend eine Normwertstudie zu verschiedenen Leukozytensubpopulationen von 100 gesunden Kinder und Erwachsenen vorgenommen. Nach der Entwicklung eines stufenlosen, nicht-linearen Regressionsmodells konnte der Einfluss auf die Immunrekonstitution der Patienten nach SZT altersgerecht beurteilt werden. Weiterhin wurden Patientengruppen, die ebenfalls haploident transplantiert wurden, den NK-Zell-Studienpatienten gegenübergestellt. Eine signifikante Verbesserung durch die Gabe von NK-Zellen konnte nicht beobachtet werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass die NK-Zellzahl innerhalb des ersten Monats nach SZT Normwerte erreichte, gefolgt von den zytotoxischen CD3+CD8+ T-Zellen 5-6 Monate nach haploidenter SZT, den THelfer Zellen und den B-Zellen nach über einem Jahr nach haploidenter SZT. Die allogene additive NK-Zell-Immuntherapie ist eine vielversprechende Therapieoption bei Patienten mit malignen Erkrankungen wie bspw. dem NB. Die NK-Zell-Aktivierung mit IL-2 bewies den Erhalt der Immunkompetenz. Dies war erkennbar an der gesteigerten zytotoxischen Funktionalität, der Zytokinproduktion und der Hochregulierung von zytotoxisch aktiven Rezeptoren. Eine verbesserte Immunrekonstitution kann durch das neue altersgerechte Lymphozyten-Norm-Modell besser beurteilt werden. Allerdings ist die Patientenanzahl und die Beobachtungszeit bisher zu gering, um in vivo ein verbessertes Überleben mit additiver NK-Zell-Immuntherapie wirklich abschätzen zu können.
Aufgrund der zunehmenden Marktbedeutung und der Fülle pflanzlicher Präparate in Europa und den USA stellte sich die Frage, ob - im Sinne des Patienten und rationaler Phytotherapie - eine ausreichende Qualität der Produkte deren Einsatz rechtfertigt. Die Qualität pflanzlicher Produkte ist aufgrund der Besonderheit eines Vielstoff-Gemisches mit oftmals unbekannten wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffen schwer zu beurteilen. In Europa sind deshalb schon vor Jahren Bestrebungen angestellt worden, pflanzliche Produkte aufgrund von Monographien (Kommission E) zumindest in ihren Ausgangsdrogen und ihrer Extraktspezifikation zu vereinheitlichen. Normierung und Standardisierung von Extrakten wurden gefordert. Während der Diskussion über die Qualität der Extrakte (Normierung/Standardisierung) ist dabei ein wesentlicher Aspekt hinsichtlich der Vergleichbarkeit von Qualität und Wirksamkeit von Fertigprodukten verloren gegangen: der Einfluß der Arzneistoff-Formulierung auf die in vivo-Situation. Ausmaß und Geschwindigkeit der Resorption des enthaltenen Pharmakons (Bioverfügbarkeit) können sowohl von den physiko-chemischen Wirkstoffeigenschaften, wie Löslichkeit und Permeabilität, als auch von Eigenschaften der Darreichungsform abhängen. Entscheidend ist, welcher Prozeß für die Resorption in den Organismus der geschwindigkeitsbestimmende ist: die Freisetzung des Wirkstoffes aus der Darreichungsform oder der Permeationsprozeß durch die Darmmembran. Ist letzterer der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, so sind gewisse Veränderungen der Wirkstofffreisetzung ohne Belang. Das Vergleichen von Extraktqualitäten (Wirkstoffen), wie es durch die Kommission E-Monographie vorgeschlagen wird, ist folglich nicht ausreichend. Einflüsse der Darreichungsform (biopharmazeutische Eigenschaften) sind zu berücksichtigen. Wie bei chemisch-synthetischen Wirkstoffen sollte therapeutische Vergleichbarkeit über Bioäquivalenz-Studien belegt werden. Als bioäquivalent gelten zwei Produkte, wenn sie pharmazeutisch äquivalent sind und wenn ihre Bioverfügbarkeiten bei Gabe gleicher Dosen so ähnlich sind, daß die erzielten Effekte bezüglich Wirksamkeit und Sicherheit praktisch identisch sind. Das Problem des Belegs der pharmazeutischen Äquivalenz (gleiche Mengen gleicher Wirkstoffe in gleicher oder ähnlicher Darreichungsform) bei pflanzlichen Produkten ergibt sich aus der Tatsache, daß sie sich phytochemisch als Vielkomponenten-Gemische nur schwer charakterisieren lassen. Wirksamkeitsbestimmende Substanzen sind häufig nicht bekannt. Die Kenntnis wirksamkeitsmitbestimmender Komponenten ermöglicht nur einen partiellen Beleg der Äquivalenz, und pharmakologisch irrelevante Leitsubstanzen können höchstens Zwecken der Standardisierung dienen. Vergleichende Bioverfügbarkeitsuntersuchungen im Sinne von Analysen einzelner Bestandteile in Körperflüssigkeiten sind nur möglich, wenn die wirksamkeitsbestimmenden Komponenten des pflanzlichen Produktes bekannt sind. Alternativ werden Bestimmungen der Bioverfügbarkeit im Form pharmakodynamischer Ansätze diskutiert. Durch die Bestimmung pharmakodynamischer Parameter soll dabei die Aufnahme und Ausscheidung des gesamten „wirksamen Prinzips“ des pflanzlichen Produktes in den Organismus verfolgt werden. Voraussetzung ist natürlich, daß der untersuchte Effekt graduell quantifizierbar ist, in seiner Ausprägung eine Beschreibung von Ausmaß und Geschwindigkeit der Resorption erlaubt und vor allem mit der klinischen Wirksamkeit des betreffenden Produktes korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Ginkgo biloba-haltige Fertigprodukte des US-amerikanischen Marktes hinsichtlich ihrer therapeutischen Vergleichbarkeit untersucht. Für Ginkgo biloba-Extrakte sind wirksamkeitsmitbestimmende Komponenten benannt worden: Flavonglykoside und Terpenlaktone. Anhand derer wurden Untersuchungen zur pharmazeutischen Qualität der Ginkgo-Präparate durchgeführt. Hinsichtlich der Gehalte an Flavonglykosiden und Terpenlaktonen ergaben sich beachtliche Unterschiede. Als Maßstab wurde die Spezifikation der Kommission E angelegt; viele der untersuchten Extrakte lagen signifikant außerhalb der vorgegebenen Spannen, andere wiederum erfüllten diese Anforderungen. Auch die Begleitstoffmuster und -gehalte der diversen Extrakte unterschieden sich deutlich voneinander. Als Beispiel seien hier die Ginkgolsäure-Gehalte angeführt, deren Spanne von < 5 ppm bis 90.000 ppm reichte. Die untersuchten Extrakte konnten also schon aufgrund der Gehalte an wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffen in der Mehrzahl nicht als miteinander pharmazeutisch äquivalent angesehen werden. Zusätzlich ergaben Untersuchungen zu biopharmazeutischen Qualitäten (in vitro-Freisetzungsverhalten) einiger Produkte deutliche Unterschiede. Da auch für Ginkgo biloba-Extrakt nicht alle wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe bekannt sind, wäre es wünschenswert gewesen, die Produkte in einem pharmakodynamischen Ansatz hinsichtlich ihrer Bioverfügbarkeiten miteinander vergleichen zu können. Allerdings konnte im Rahmen dieser Arbeit kein in vitro-Modell gefunden werden, welches sich als sensitiv genug und als potentieller Bioassay geeignet erwiesen hätte. Deshalb wurde wenigstens eine vergleichende Bioverfügbarkeitsstudie zweier Präparate – im klassischen Sinne - durch Analyse einiger wirksamkeitsmitbestimmender Substanzen (Ginkgolid A, B und Bilobalid) in Körperflüssigkeiten (Blut) durchgeführt. Zwei Produkte mit stark differierendem Freisetzungsverhalten wurden gegeneinander verglichen. Die Studie ergab einen signifikanten Einfluß der Darreichungsform auf die Bioverfügbarkeit und letztendlich Bioinäquivalenz der untersuchten Produkte. Die vorliegende Arbeit zeigt, wie relevant die pharmazeutische Qualität der Produkte, inklusive ihrer biopharmazeutischen Eigenschaften, für die therapeutische Austauschbarkeit von Produkten sein kann. Auf dem Sektor pflanzlicher Produkte sind bis dato sehr wenige Untersuchungen hinsichtlich des Einflusses der Darreichungsform auf in vivo-Verhältnisse und der Bioverfügbarkeit durchgeführt worden. Des weiteren fehlen Kenntnisse zu wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffen oder alternativ pharmakodynamische Modelle, die eine Bestimmung der Bioverfügbarkeit ohne Kenntnis der pharmakologisch relevanten Inhaltsstoffe ermöglichen.
Untersuchung hochmolekularer Proteinkomplexe in menschlichen Leukämien mittels Proteomics-Werkzeugen
(2009)
Funktionelle Multiproteinkomplexe stellen im Sinne von Proteomics das kleinste isolierbare Proteom dar. Die Untersuchung von Proteinkomplexen gibt uns die Möglichkeit, Funktionen innerhalb der Zelle oder des Zellkompartiments genauer zu verstehen. Erst durch das Verständnis der einzelnen kleinen Zusammenspiele innerhalb einer Zelle, können wir die Auswirkungen auf ein betreffendes Organ und damit auf den Körper betrachten. Wir erhalten dadurch auch Informationen über die Funktion von spezifischen Genen und können so Erklärungsansätze für Gendefekte finden und über mögliche Therapieansätze nachdenken. Neben den Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen und dem Nachweis von Protein-Interaktionen mittels Immunopräzipitationsexperimenten stellt die Massenspektrometrie seit den 90er Jahren ein essentielles Werkzeug der Proteom-Forschung dar. Sie entwickelte sich zu einem etablierten Verfahren für die Charakterisierung von Biomolekülen und ermöglicht die Identifizierung unbekannter Proteine eines Komplexes. Das MLL-Gen auf Chromosom 11 Bande q23 ist in zahlreiche, reziproke chromosomale Translokationen verwickelt, die mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert sind. Chromosomale Translokationen des MLL-Gens werden aufgrund ihrer sehr schlechten Prognose und Therapierbarkeit als Hochrisiko-Leukämien eingestuft. Bis heute konnten 64 Translokations-Partnergene identifiziert werden, wobei das AF4-Gen mit 42% bei allen untersuchten Leukämien und mit ca. 66% bei ALL (akute lymphatische Leukämie) den größten Prozentsatz ausmacht. Bei der Translokation t(4;11) sind das MLL-Gen auf Chromosom 11 und das AF4-Gen auf Chromosom 4 beteiligt. Akute Leukämien mit einer t(4;11)-Translokation treten häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und betreffen vorwiegend den lymphatischen Zweig des blutbildenden Systems. Durch die Translokation entstehen zwei neue Derivatchromosomen – Derivat 11 (MLL•AF4, der11) und Derivat 4 (AF4•MLL, der4). Beide Fusionsgene verfügen über einen intakten Leserahmen und führen zur Expression der zwei Fusionsproteine MLL•AF4 (der11) und AF4•MLL (der4). Der pathomolekulare Mechanismus der t(4;11)-vermittelten ALL ist bis heute noch nicht hinreichend geklärt. Funktionen des der11-Fusionsproteins werden zwar schon intensiv erforscht, aber es gibt noch keine Erkenntnisse über die Funktion des der4-Fusionsproteins. Ähnlich sah die Situation zu Beginn dieser Arbeit für das AF4-Protein aus. Während schon einige Daten zur Funktion des MLL-Multiproteinkomplexes vorlagen, gab es nur wenige Informationen über die Funktion von AF4. Im Zuge dieser Arbeit wurden der AF4- und der der4-Multiproteinkomplex mittels affinitätschromatographischer Methoden aus transient transfizierten 293T-Zellen erfolgreich isoliert. Eine Größenbestimmung der Komplexe über eine Größenausschlusschromatographiesäule ergab für beide Komplexe eine Größe von ca. 2 MDa. Die Charakterisierung der beteiligten Interaktionspartner erfolgte mittels nLC-MALDI-MS/MS, Western Blot Analyse und Immunopräzipitation. Es konnte gezeigt werden, dass AF4 zusammen mit den Proteinen ENL/AF9, CDK9, CCNT1, AF10, DOT1L und der RNA-Polymerase II in einem Komplex vorliegt. Bereits 2007 konnte dieser Komplex in einem Mausmodell isoliert werden. Damit fungiert der AF4-Komplex auch in humanen Zellen als Stimulator der RNA-Polymerase-II-abhängigen transkriptionellen Elongation und vermittelt eine DOT1L-abhängige H3K79-Methylierung, die einen aktiven Transkriptionsstatus aufrechterhält. Zusätzlich konnten 6 neue Interaktionspartner identifiziert werden (AF5q31, BDR4, DDX6, HEXIM1, NFkB1/RELA und NPM1). Die Anwesenheit von BRD4 und HEXIM1 lässt vermuten, dass der AF4-Komplex in einem aktiven und einem inaktiven Zustand vorliegen kann. Außerdem wird der AF4-Komplex möglicherweise über den NFkB-Signalweg reguliert bzw. durch die Anwesenheit von NFkB1 an dessen Zielgene rekrutiert. Die Untersuchung des der4-Komplexes zeigte, dass er sich aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt. So wurden die Proteine P-TEFb, HEXIM1, NFkB1, NPM1, DDX6 und das AF4 selbst aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, DPY-30, CBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex identifiziert. Der der4-Komplex weist somit partielle Eigenschaften des AF4- und MLL-Wildtyp-Proteins auf. Diese Eigenschaften sind ausreichend für eine kompetitive Situation zwischen dem der4-Komplex und den beiden AF4- und MLL-Wildtyp-Komplexen. Die Gleichgewichte dieser Wildtyp-Komplexe werden vermutlich gestört. Für beide Komplexe wurde mit Hilfe eines in vitro Histon-Methyltransferase-Assays eine Histon-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen. Für den AF4-Komplex muss zusätzlich eine bisher noch unbekannte Methyltransferase-Aktivität angenommen werden, da eine Methylierung des Histons H3 in den ersten 46 Aminosäuren gezeigt werden konnte, die sich nicht auf die Methyltransferase-Aktivität des DOT1L-Proteins im AF4-Komplex zurückführen lässt. Die H3K4-Methyltransferase-Aktivität des der4-Komplexes wird auf die Anwesenheit des SET-Domänen-Komplexes (ASH2L, WDR5, RBBP5 und DPY-30) zurückgeführt. Im Zusammenhang mit dem AF4-Protein wurde auch der ENL-Komplex untersucht. Mittels Western Blot konnten die Interaktionspartner AF4, CDK9, CCNT1, RNA-Polymerase II, NFkB1 und RING1 identifiziert werden. Damit ist auch das ENL mit dem globalen positiven transkriptionellen Elongationsfaktor P-TEFb assoziiert und beeinflusst die RNA-Polymerase-II-abhängige transkriptionelle Elongation.
Mechanistische Untersuchungen zur Modulation der zytosolischen Phospholipase A2 durch Hyperforin
(2009)
Aus der Familie der Phospholipasen A2 nimmt die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in der Bereitstellung von Arachidonsäure (AA) für die Produktion von entzündungsfördernden Eikosanoiden und Lysophospholipiden eine Schlüsselrolle ein. Inwieweit die Modulation dieses Enzyms zum antientzündlichen Wirkspektrum von Hyperforin beiträgt, war Gegenstand dieser Arbeit. Hyperforin als Bestandteil des Johanniskrauts greift auf vielfältige Art und Weise in Entzündungsprozesse ein und hemmt unter anderem die Aktivität der 5-Lipoxygenase und Cyclooxygenase-1 in mikromolaren Konzentrationen. Zur Erforschung der cPLA2 als weitere potentielle Zielstruktur wurden die Effekte Hyperforins auf frisch isolierte humane polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) und Thrombozyten untersucht. Dabei ergaben sich erstaunlich widersprüchliche Ergebnisse. Während in PMNL die A23187- und Thapsigargin-induzierte AA-Freisetzung potent unterdrückt wurde (IC50 = 1,5 bis 1,9 µM), konnte Hyperforin die cPLA2-Aktivität in Thrombozyten nach A23187-Stimulation nicht und nach Thrombin-Induktion nur leicht beeinträchtigen. Hingegen resultierte aus der Behandlung von Thrombozyten mit 10 µM Hyperforin eine 2,6- bzw. 8,1-fache Steigerung der AA-Freisetzung und 12-Hydro(pero)xyeikosatetraensäure(H(P)ETE)-Produktion, die von einer Translokation der cPLA2 an die Plasmamembran begleitet war. In PMNL wurde eine Aktivierung der cPLA2 nicht beobachtet. Diese widersprüchlichen Befunde führten zu näheren mechanistischen Untersuchungen. Insbesondere der Einstrom von Ca2+, wie auch die Aktivierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) tragen in PMNL und Thrombozyten zur cPLA2-Aktivierung bei. Allerdings konnte eine Beeinträchtigung dieser Signaltransduktionswege durch Hyperforin ausgeschlossen werden. In PMNL wird der durch A23187- oder Thapsigargin-induzierte Ca2+-Einstrom nicht inhibiert und die Aktivierung der entsprechenden MAPK konnte durch Hyperforin (bis zu 10 µM) nicht vermindert werden. In Thrombozyten wurde die Translokation der cPLA2 sowie die AA- und 12-H(P)ETE-Produktion durch die Chelatierung von extra- und intrazellulärem Ca2+ nicht gehemmt. Auch die Unterbindung der Phosphorylierung der cPLA2 durch Hemmung der MAPK-Aktivierung konnte die Aktivierung der cPLA2 nicht verhindern. In zellfreien Untersuchungen an aufgereinigtem Enzym zeigte Hyperforin weder hemmende noch aktivierende Effekte, wenn Liposomen aus 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylcholin (PAPC) eingesetzt wurden. Nach Einbau von Dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol und Cholesterol in PAPC-Liposomen sowie gegenüber Lipid-Raft-Adaptionen (PAPC/Sphingomyelin/Cholesterol 1:1:1) zeigte Hyperforin allerdings inhibitorisches Potential (IC50 = 13,2 µM, 7,6 µM, 5,5 µM und 4,4 µM). Aktivierende Effekte des Hyperforins konnten in Abwesenheit von Ca2+ beobachtet werden, wenn cholesterolhaltige, Lipid-Raft-artige- oder 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylethanolamin(PAPE)-Vesikel eingesetzt wurden. 10 bis 30 µM Hyperforin erhöhten die AA-Freisetzung 3,3- bis 7,3-fach, wobei die Bindung des Enzyms an Liposomen mit Cholesterol und Lipid-Raft-Strukturen, aber nicht gegenüber dem PAPE-Substrat verstärkt war. Alle Effekte konnten durch die Zerstörung der Membranoberfläche und –struktur nach Zugabe von Triton-X-100 aufgehoben werden, wodurch die Bedeutung der Struktur der Lipidaggregate für die Hyperforinwirkung in den Vordergrund tritt. Darüber hinaus konnte die essentielle Rolle der vinylogen Carbonsäurestruktur des Hyperforins gezeigt werden, da ein O-Methylester des Hyperforins weder die Hemmung der cPLA2 in PMNL noch deren Aktivierung in Thrombozyten reproduzieren konnte und im Liposomenassay nur eine unspezifische Aktivierung der cPLA2 unabhängig von der Membranstruktur bewirkte. Neben der cPLA2-Aktivität wurde auch die Dichte der Liposomen abhängig von der Membranstruktur durch Hyperforin moduliert, allerdings konnten Änderungen der Membrandichte nicht mit Einflüssen auf die Enzymaktivität korreliert werden. Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Prof. Glaubitz, Universität Frankfurt, 1H-MAS-NMR-NOESY-Spektren von Liposomen aus 1-Palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin mit integriertem Hyperforin aufgenommen. Das sich aus der Analyse der Spektren ergebende Modell postuliert die Lokalisation des sauerstoffreichen Bizyklus des Hyperforins im Kopfgruppenbereich der Lipide und eine Penetration der Isoprenylgruppen in die hydrophobe Schicht der Membranen. Die Ergebnisse dieser Arbeit in intakten Zellen und zellfreien Systemen verweisen somit auf komplexe Zusammenhänge, bei denen Interkalationen von Hyperforin mit speziellen Membranstrukturen im Vordergrund stehen. Die unspezifische Einlagerung der lipophilen Substanz Hyperforin in zelluläre Membrankompartimente könnte somit unter Umgehung der regulären Signaltransduktionswege zelltypabhängig die cPLA2-Aktivität modulieren.
Beteiligung der Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen
(2009)
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide neben ihrer Funktion als Plasmamembranbestandteile auch als intra- und extrazelluläre Botenstoffe in zelluläre Signalwege eingreifen können. So haben das Lysosphingolipid S1P und sein Vorläufermolekül Ceramid wichtige regulatorische Funktionen in der Regulation von Zelltod- und wachstum. Dabei agiert Ceramid als proapoptotisches und wachstumshemmendes Lipid, während S1P zellprotektive und wachstumfördernde Funktionen in der Zelle hat und dadurch als „Gegenspieler“ von Ceramid wirkt. Durch die zwei Enzymklassen der Ceramidasen und Sphingosinkinasen wird in der Zelle ein sogenanntes „Sphingolipid-Gleichgewicht“ durch die stete Interkonvertierbarkeit der Lipide aufrechterhalten. Das zu einem bestimmten Zeitpunkt in seiner Konzentration dominierende Sphingolipid entscheidet so über das Schicksal der Zelle, ob es zum Zelltod oder zum Wachstum kommt. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen untersucht. Dafür wurden aus SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Mäusen Mesangiumzellen isoliert. Obwohl beide Sphingosinkinasen dasselbe Produkt S1P generieren, zeigen die beiden „knock-out“-Zelllinien unterschiedliches Apoptose- und Wachstumsverhalten. In einem ersten Kapitel wurde gezeigt, dass eine Depletion der SK1 in einer Desensitivierung der Mesangiumzellen gegenüber dem apoptotischen Stimulus Staurosporin und in einer drastischen Wachstumsverlangsamung im Vergleich zu den Wt-Zellen resultierte. Im Gegensatz dazu führte eine Depletion der SK2 zu einem Schutz vor Apoptose und zu einer erhöhten Wachstumsrate. In einem zweiten Kapitel wurden mögliche molekulare Mechanismen untersucht, die für diese gegensätzlichen Zellantworten verantwortlich sind. Nachdem eine vermehrte Prozessierung der Caspase 3 in SK1(-/-)-Zellen und eine verminderte Prozessierung in SK2(-/-)- Zellen festgestellt wurde, ergaben weitere Westernblot-Analysen eine Beteiligung der beiden Signalkaskaden PKB/Bad sowie MEK/ERK1/2 im Apoptosemechanismus der Mausmesangiumzellen. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine verminderte Phosphorylierungsrate der involvierten Enzyme PKB, MEK1/2 und ERK1/2, wohingegen die Signalkaskaden von SK2(-/-) durch vermehrte Phosphorylierung dieser Kinasen konstitutiv aktiviert sind. Daneben scheint auch der antiapoptotische Faktor Bcl-xL am Vorgang der mesangialen Apoptose beteiligt. Eine Depletion der SK1 führt zu einer reduzierten Bcl-xL-Proteinexpression, wohingegen SK2(-/-)- Zellen eine drastisch erhöhte Expressionsrate dieses antiapoptotischen Faktors aufweisen. Als zentraler Regulator des Zellwachstums zeigt sich das Retinoblastoma-Protein (Rb) in den SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zellen antagonistisch reguliert. Während keine basale Phosphorylierung des Proteins in SK1(-/-)-Zellen gefunden werden konnte, ist Rb in SK2(-/-)-Zellen hyperphosphoryliert. Anschliessend konnte in SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zelle eine Beteiligung von weiteren zellzyklus-regulierenden Enzymen, die Rb-Protein vorgeschaltet sind, gefunden werden. So ist die cyklinabhängige Kinase CDK6 in hyperproliferierenden SK2(-/-)-Zellen auf Proteinebene vermehrt exprimiert. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine erhöhte Proteinexpression des Zellzyklushemmers p27. In einem dritten Kapitel konnte gezeigt werden, dass eine Depletion der SK2 auch in Mausfibroblasten, die aus der Lunge von SK2(-/-)-Mäusen isoliert worden waren, zu einer vermehrten DNA-Synthese führt; die Funktion des Enzyms scheint also nicht zellspezifisch zu sein. Ein viertes Kapitel machte deutlich, dass Mausmesangiumzellen, die eine humane Variante der SK1 überexprimieren, vor stimulusinduzierter Apoptose geschützt sind. Darüberhinaus ist die DNA-Synthese der hSK1-transgenen Mausmesangiumzellen im Vergleich zu Wt- Zellen erhöht. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Sphingosinkinasen 1 und 2 in den primären Mausmesangiumzellen zelluläres Wachstum und Apoptose in entgegengesetzterweise regulieren: die SK1 wirkt mitogen und zellprotektiv, die SK2 hingegen wachstumshemmend und proapoptotisch
Platelets are anucleate cells that play a major role in hemostasis and thrombosis in the vasculature. During primary hemostasis platelets adhere to sites of vascular damage and the initial platelet coat is reinforced by additional platelets forming a stable aggregate. At the same time platelets secrete their intracellular granules containing substances that further activate platelets in an autocrine and paracrine fashion and affect local coagulation and endothelial smooth muscle cell function. The small guanine nucleotide binding protein Rap1 regulates the activity of the platelet integrin alphaIIbbeta3 and thus platelet aggregation. Rap1 activity is controlled by guanine nucleotide exchange factors and GTPase activating proteins. In platelets, Rap1GAP2 is the only GTPase activating protein of Rap1. In order to identify Rap1GAP2-associated proteins, a genetic two-hybrid screening in yeast was performed and synaptotagmin-like protein 1 (Slp1, also called JFC1) was found as a new putative binding partner of Rap1GAP2. Slp1 is a tandem C2 domain containing protein and is known to bind to Rab27, a small GTPase involved in platelet dense granule secretion. The direct interaction between Rap1GAP2 and Slp1 was confirmed in yeast and in transfected cells. More importantly, Slp1 is expressed in platelets and binding of endogenous Rap1GAP2 and Slp1 was verified in these cells. The Rap1GAP2 and Slp1 interaction sites were mapped by mutational analysis. Rap1GAP2 binds through the -TKXT- motif within its C-terminus to the C2A domain of Slp1. Moreover, the Slp1 binding -TKXT- motif of Rap1GAP2 was confirmed by complementary approaches using short synthetic Rap1GAP2 peptides. The C2A domain of Slp1 is a phospholipid binding domain and thus mediates binding of Slp1 to the plasma membrane. Phospholipid overlay assays revealed that simultaneous binding of Slp1 via its C2A domain to Rap1GAP2 and to phospholipids can occur. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is regulated by cAMP-dependent protein kinase (cAK or PKA), and kinase activation in platelets enhanced binding of endogenous Rap1GAP2 to Slp1. In-vitro phosphorylation assays revealed that Slp1 is a substrate of PKA, and serine 111 was identified as phosphorylation site. Since Slp1 is a Rab27 binding protein, a trimeric complex of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 is conceivable. The association of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 was investigated by immunofluorescence and co-immuno-precipitation experiments in both, transfected cells and platelets. By Slp1 affinity chromatography and subsequent mass spectrometric analysis additional Slp1 binding proteins were identified in platelets, and binding of Slp1 to Rab8 was confirmed in pull-down assays. To investigate the functional significance of the interaction between Rap1GAP2 and Slp1, an assay system was established to determine serotonin secretion of streptolysin-O permeabilized platelets. Addition of recombinant Slp1 protein to permeabilized platelets strongly inhibited platelet dense granule secretion, whereas addition of recombinant Rap1GAP2 protein or synthetic Rap1GAP2 peptide enhanced secretion. Deleting the Slp1 binding -TKXT- motif abolished the stimulatory effect of Rap1GAP2 on secretion. Addition of Rap1 to permeabilized platelets had no effect on secretion. These findings indicate that the Rap1GAP2 effect on platelet secretion does not depend on the GTPase activating function of Rap1GAP2, but is rather dependent on the -TKXT- mediated interaction of Rap1GAP2 with Slp1. In addition, in-vitro GAP assays revealed that Slp1 binding to Rap1GAP2 does not affect the Rap1GAP activity of Rap1GAP2, and adhesion assays excluded a role for the Rap1GAP2/Slp1 interaction in cell adhesion. Altogether, the results of the present study demonstrate that besides its function in platelet aggregation by controlling the activity of the small guanine nucleotide binding protein Rap1, Rap1GAP2 is involved in platelet dense granule secretion by the new -TKXT- mediated interaction with the Rab27 and membrane binding protein Slp1. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is embedded into an elaborate network of protein-protein interactions in platelets which appear to be regulated by phosphorylation. Future studies will in particular aim to dissect the molecular details of Rap1GAP2 and Slp1 action in platelet secretion and investigate the potential biochemical and pharmacological value of the unique protein binding -TKXT- motif of Rap1GAP2.
Die Analyse der Phosphorylierung mittels Massenspektrometrie stellt in vielerlei Hinsicht große Anforderungen an die Analysenmethoden, die eingesetzt werden. Durch die substöchiometrische Modifzierung einer Aminosäure mit einem Phosphatrest ist die grundlegende Herausforderung der Sensitivtät an anzuwendende Analysetechniken gegeben. Die Biomassenspektrometrie hat mit den weichen Ionisierungmethoden ESI und MALDI zwar die Techniken zur Verfügung gestellt, die eine routinemäßige Identifzierung von vorher per MS nicht zugänglichen Proteinen über die Untersuchung der enzymatischen Spaltpeptides ermöglicht, gleichwohl ist der Aufwand, der für die massenspektrometrische Charakterisierung eines bestimmten Proteins besteht, um ein vielfaches höher. Wegen des in vivo variablen und potentiell sehr geringen Phosphorylierungsgrades ist die genaue Identifizierung der Phosphorylierungstelle allein durch das Vermessen der Probe in einem modernen Massenspektrometer nicht zu bewerkstelligen. Die sich in der Probe befindlichen Phosphopeptide stehen nach einem Verdau des entsprechenden Proteins einer mengenmäßig großen Zahl unphosphorylierter Peptide gegenüber. Auch die hohe Sensitivität von modernen Massenspektrometern reicht in der Regel nicht aus, um das entsprechende Phosphopeptid zu analysieren. Soll die exakte Phosphorylierungstelle des untersuchten Phosphopeptids bestimmt werden, so müssen ausreichende Mengen an Analyten für eine MS/MS-Analyse generiert werden. Bei realen Proben kann der Phosphorlyierungsgrad nicht erhöht werden, somit ist auch die Menge an vorhandenen Phosphopeptiden begrenzt. Somit kommt man an eine Anreicherung von Phosphopeptiden bzw. Abreicherung von unmodifzierten Peptiden nicht vorbei. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Anreicherungstechniken für Phosphopeptide hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität untersucht. Hierfür wurden verschiedene Affinitätstechniken (Graphit, IMAC und TiO¬¬2) hinsichtlich Empfindlichkeit und Selektivität untersucht. Von diesen drei Methoden zeigte sich Graphit aufgrund zu geringer Wechselwirkung zwischen Analyt und Medium als ungeeigneteste Methode. IMAC zeigt bei verbesserter Sensitvität eine höhere Spezifität, gleichwohl saure Peptide nicht von Phosphopeptiden zu trennen sind. Von den drei genannten Methoden zeigte TiO¬¬2 die höchste Sensitivität und Selektivität. Da das TiO¬¬2 als Goldstandard in der Anreicherung von Phosphopeptiden angesehen wird, sollte im Rahmen dieser Dissertation eine neuartige Methode entwickelt werden, die dieser Technik sowohl im Hinblick auf Spezifität und Selektivität überlegen sein sollte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden MALDI-Probenteller erstmals mit Hilfe von SAMs (Self Assembled Monolayers) mit Phosphonatgruppen modifiziert, aus denen durch Beladen mit vierwertigem Zirkonium eine neue funktionelle Oberfläche für die Anreicherung von Phoshopeptiden hergestellt werden kann, die der Titandioxid-Methode überlegen ist. Anhand von reproduzierbaren Modellsystemen von bekannten Phosphoproteinverdaus (z.B. Ovalbumin) konnte gezeigt werden, dass diese neue Technik Analyten im niedrigen Femtomol-Bereich auch vor einem großen nicht-phosphorlyierten Hintegrund selektiv anreichern kann. Um zu demonstrieren, dass die Phosphonat-Oberfläche auch bei realen Proben die massenspektrometrische Phosphorylierungsanalyse ermöglicht, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen die Mitogen Activated Protein Kinase 1 (MAPK-1) aus einem in-Lösungs-Verdau und das Heat Shock Protein (HSP), welches aus einem 2-D-Gel stammt, untersucht. Mit der neu etablierten Phosphonat-Oberfäche konnten die Phosphopeptide aus den Proben angereichert und mittels MALDI-MS/MS die Phosphatgruppe eindeutig der modifizierten Aminosäure zugeordnet werden. Neben dem Komplex der Anreicherungstechniken wurden im Rahmen dieser Dissertation noch andere relevante Fragestellungen für die Phosphoproteomanalytik untersucht. So konnte gezeigt werden, dass für phosphorylierte Peptide keine Suppression der Signale im MALDI-Gerät stattfindet, was eine noch weit verbreitete Meinung in vielen Arbeitsgruppen ist. Auch Versuche zur MALDI-Matrix und deren Kombination mit der Säurekomponente wurden durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass es neben DHB in Kombination mit Phosphorsäure momentan keine bessere Matrix-Kombination gibt. Im Hinblick auf die Quantifizierung der Phosphorlyierung eines Proteins konnte exemplarisch am Ovalbumin als Modellsystem eine einfache und valide Quantifizierungsmethode mit Hilfe der Dephosphorylierung entwickelt werden, die nicht die Nachteile von sonst häufig eingesetzten Derivatisierungsreagenzien besitzt.
Die vorliegende, in kumulativer Schreibweise verfasste Arbeit erläutert die Entwicklung, Charakterisierung und Optimierung zweier unterschiedlicher Leitstrukturen, die als Agonisten von Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) und gleichsam als duale Inhibitoren der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO) wirken. Chemisch betrachtet sind dies zum ersten die Gruppe der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate und zum zweiten die Gruppe der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate. Die Publikation zur Synthese und in vitro-pharmakologischen Charakterisierung der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate an PPAR (Zettl et al., QSAR & Combinatorial Science, 28:576–586, 2009) enthält einerseits die strukturelle Optimierung durch Variation der Aryl-Substitution des zentralen Pyrimidinringes der Leitstruktur und andererseits die durch Docking-Verfahren gestützte Untersuchung des Einflusses der Stereochemie auf die PPAR-Aktivierung. Letztlich konnte durch die Einführung von Biphenyl-Substituenten eine Verbesserung insbesondere der PPARalpha-Aktivität gegenüber der als strukturellen Referenz dienenden alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäure (Rau et al., Archiv der Pharmazie, 341:191–195, 2008) erreicht werden. Mit Hilfe von präparativer enantioselektiver HPLC wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre beiden Enantiomere getrennt. Deren in vitro-pharmakologische Charakterisierung ergab, dass das (R)-Enantiomer insbesondere bei PPARalpha als Eutomer fungiert. Dieses Ergebnis konnte mit Hilfe von Docking-Studien weiter untermauert werden. Hierbei wurde deutlich, dass die Besetzung der linken proximalen Bindetasche der PPARalpha-Liganden-Bindungs-Domäne durch den alpha-n-Hexyl-Rest lediglich im Fall einer (R)-Konfiguration optimal erfolgen kann. Die Synthese und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung der Substanzklasse der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate an PPAR sind in Zettl et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19: 4421-4426, 2009 zusammengefasst. Bei der Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen erwies sich die Leitstruktur als hochaktiv und sehr robust. Je nach Substitutionsmuster des lipophilen Molekülteils wurden potente selektive PPARalpha-Agonisten wie auch PPARalpha-präferenzielle duale PPARalpha/gamma-Agonisten dargestellt. Durch die Synthese von Kohlenstoff-Analoga und alpha-unsubstituierten Verbindungen wurde des Weiteren der Einfluss des Schwefelatoms und des n-Butylrestes in alpha-Position zur Carbonsäure auf die PPAR-Aktivität untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass beide Strukturelemente einen großen Beitrag zur hohen PPARalpha-Aktivität der Leitstruktur leisten. Wie auch bei den alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivaten wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre Enantiomere getrennt und der Einfluss des Stereozentrums in alpha-Position zur Carbonsäure untersucht. Das Ergebnis bestätigte die Resultate der vorangegangenen Studie: Das (R)-Enantiomer wirkte als Eutomer, wobei der stereochemische Einfluss bei PPARalpha besonders deutlich war. Ausgewählte Synthesen und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung von Pirinixinsäurederivaten an mPGES-1, 5-LO sowie der Cyclooxygenase (COX) sind in Koeberle und Zettl et al., Journal of Medicinal Chemistry, 51:8068–8076, 2009 publiziert. Die Arbeit beinhaltet eine umfassende Reihe an Pirinixinsäurederivaten mit Strukturvariationen in alpha-Position zur Carbonsäure und im Aryl-Substitutionsmuster des Pyrimidinringes. Hinsichtlich der alpha-Substitution zeigte sich, dass für Alkylreste eine Kettenlänge von mindestens 6 Kohlenstoffatomen für einen dualen Wirkmechanismus erforderlich ist. Als Leitstruktur für duale mPGES-1/5-LO-Inhibitoren ergab sich somit alpha-n-Hexyl-substituierte Pirinixinsäure, deren Aryl-Substitutionsmuster am zentralen Pyrimidin weiter optimiert wurde. Als vorteilhaft erwies sich die Substitution mit Biphenylresten, wodurch die Darstellung von niedrig mikromolar aktiven dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren gelang. Bei der Analyse der Strukur-Wirkungs-Beziehungen von unterschiedlichen Biphenylresten zeigte sich eine hohe strukturelle Toleranz hinsichtlich der dualen inhibitorischen Aktivität an der mPGES-1 und der 5-LO. Somit stellen die alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate die ersten publizierten dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren dar.
In vielen Tumorzellen kommt es zu einer Überexpression des Hypoxie-induzierbaren Faktor 1alpha (HIF-1alpha), was zu einer verbesserten Anpassung des Tumors an die intratumorale Hypoxie sowie zu einer Resistenz gegen Strahlen- und Chemotherapie führt. Je nach Tumor kann HIF-1alpha auf verschiedenen Wegen induziert werden. Eine Möglichkeit ist die Hemmung des Abbaus von HIF-1alpha über das 26S-Proteasom, wie z.B. beim van Hippel-Lindau (VHL)-Syndrom aufgrund einer Mutation im VHL Gen. Patienten mit VHL-Syndrom entwickeln häufig renal clearcell carcinomas (RCCs). In diesen Karzinomen kann HIF-1alpha nicht über den klassischen Weg über das 26S-Proteasom abgebaut werden. Um das Verständnis für alternative Regulationsmechanismen von HIF-1alpha zu erweitern, wurde mit RCC4-Zellen gearbeitet. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass in RCC4-Zellen das HIF-1alpha-Protein unter Hypoxie, in Kombination mit NO, durch die Ca2+-abhängige Protease Calpain abgebaut wird. Unter Hypoxie kam es zu einem Anstieg der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in den Mitochondrien, die mit NO zu Peroxynitrit und weiteren reaktiven Stickstoffintermediaten (RNI) reagierten. Die kombinierte Stimulation der Zellen mit NO und O2- unter Normoxie löste ebenfalls einen Anstieg des intrazellulären Ca2+-Gehaltes und der Calpain-Aktivität aus, was gleichzeitig zu einem reduzierten HIF-1alpha-Proteingehalt führte. Der Calpain-vermittelte HIF-1alpha-Abbau konnte auch in Zellen mit funktionellem VHL-Protein (pVHL) durch NO und O2- ausgelöst werden, wenn der proteasomale Abbau gehemmt war. Diese Ergebnisse beschreiben einen neuen Regulationsmechanismus für das HIF-1alpha-Protein, der unabhängig vom Sauerstoffgehalt und vom 26S-proteasomalen Abbau durch NO/O2- und Calpain erfolgt. Bisher war noch nicht bekannt, dass HIF-1alpha anders als über das 26S Proteasom abgebaut werden kann. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Calpain-vermittelte Abbau neben dem proteasomalen Abbau zur Regulierung von HIF 1 beiträgt. In Tumorgeweben stellt nicht nur HIF-1, welches in den Tumorzellen aktiviert ist, einen Selektionsvorteil für die Zellen des Tumorgewebes dar. Ebenso tragen die Zellen des Tumorstromas, darunter die Makrophagen, die in den Tumor einwandern, zur Progression des Tumors durch die Anpassung an die hypoxischen Umgebung bei. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Regulation von HIF-1alpha in den durch konditioniertes Medium von apoptotischen Zellen (KMAZ) aktivierten Makrophagen und der Bedeutung der daraus resultierenden HIF-1-Aktivierung untersucht. Makrophagen, die durch apoptotische Zellen (AZ) aktiviert werden, stellen einen anti-inflammatorischen, pro-angiogenetischen Phänotyp dar, der vergleichbar mit dem der Tumor-assozierten Makrophagen (TAMs) ist. TAMs infiltrieren in das Tumorgewebe und sind essentiell am Übergang von einem avaskulären zu einem invasiven, vaskularisierten und malignen Tumor beteiligt. Unsere Arbeitsgruppe konnte in Vorarbeiten zeigen, dass Makrophagen zunächst Tumorzellen abtöten, wodurch die apoptotischen Tumorzellen Mediatoren (u.a. Sphingosin-1-Phosphat (S1P)) freisetzen, die eine Polarisierung zu einem alternativen, TAM-ähnlichen-Phänotyp der Makrophagen bewirken. Die Inkubation der Makrophagen mit KMAZ führte zu einer Induktion der HIF-1alpha-mRNA und des -Proteins unter Normoxie, was unabhängig von der Proteinstabilität auf eine gesteigerte Proteinsynthese zurückgeführt werden konnte. Weiterhin führte die Induktion von HIF-1alpha zu einer gesteigerten HIF-1-Aktivität. Die Differenzierung von Stammzellen zu CD31+-Endothelzellen wurde durch die Überstände von den durch KMAZ polarisierten Makrophagen HIF-1-abhängig hervorgerufen und ist ein Indiz für die Ausbildung des HIF 1-vermittelten pro-angiogenetischen Phänotyps der Makrophagen. Als Mediatoren, die von den AZ freigesetzt wurden und an der HIF-1alpha-mRNA-Induktion beteiligt sind, konnten S1P und transforming growth factor-beta (TGF-beta) identifiziert werden. Des Weiteren kommt es zu einer Aktivierung des nuclear factor of activated T-cells (NFAT), der an den HIF-1alpha-Promotor bindet und die Transkription induziert. Aufgrund der verstärkten Synthese kommt es zur Akkumulation von HIF-1alpha und zur Aktivierung von HIF-1. Bisher ist die Aktivierung von HIF-1 in TAMs durch die Lokalisation in hypoxischen Arealen erklärt und nicht weiter untersucht worden. Die Erkenntnisse über die Regulierung von HIF-1 durch AZ beschreiben einen neuen Mechanismus, der zur HIF-1-Aktivierung auch unter Normoxie führt. Dabei vermitteln AZ statt der beschriebenen hypoxischen Stabilisierung des HIF-1α-Proteins eine Induktion der HIF-1alpha-mRNA. Weiterhin zeigen die Ergebnisse eine Möglichkeit auf, wie TAMs bereits unter Normoxie zur Angiogenese Induktion in Tumoren beitragen können und erweitern damit das Verständnis, wie die Tumor-unterstützende Wirkung der TAMs vermittelt wird.
Lipidartige Formulierungen zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit schwer löslicher Arzneistoffe
(2002)
In dieser Arbeit wurde anhand der zwei schwerwasserlöslichen Modellsubstanzen EMD 57033 und Danazol untersucht, inwieweit sich (schwerpunktmäßig halbfeste) lipidartige Hilfsstoffe zur Verbesserung der Wirkstofffreigabe aus der Arzneiform eignen, um dadurch eine im Vergleich mit einer Standardrezeptur erhöhte Bioverfügbarkeit zu erhalten.
Antikarzinogene Effekte konnten mehrfach für sowohl klassische NSAIDs als auch für selektive COX-2-Inhibitoren belegt werden, wobei Celecoxib eine herausragende Stellung einnimmt und als einziges NSAID zur Behandlung der familiären adenomatösen Polyposis den Zulassungsstatus erreicht hat. Dimethylcelecoxib (DMC), ein Strukturanalogon des Celecoxibs, zeigte aufgrund einer strukturellen Molekülaufweitung in vitro in Konzentrationen kleiner 100 µM keine Hemmung der COX-2. Dennoch weist dieses Molekül ähnliche antikarzinogene Eigenschaften auf und wird daher häufig als Vergleichssubstanz zu Celecoxib verwendet, um COX-abhängige Mechanismen von COX-unabhängigen zu trennen. In der vorliegenden Arbeit konnte für DMC eindeutig gezeigt werden, dass es in vitro die PGE2-Synthese in den drei humanen Krebszellen HeLa, A-549 und HCA-7 im niedrigen mikromolaren Bereich hemmt. Da DMC weder die COX-Aktivität noch die Proteinexpression der COX-Isoenzyme in HeLa-Zellen beeinflusst, muss diese Substanz mit anderen Enzymen des PGE2-Syntheseweges interagieren. Die mPGES-1 zeigte wie die COX-2 eine gesteigerte Expression in einer Vielzahl von Tumorgeweben. Eine daraus resultierende gesteigerte PGE2-Produktion erwies sich durch die Wirkung auf spezifische Rezeptoren als prokarzinogen. DMC zeigte in einem zellfreien Assay eine Hemmung der mPGES-1-Aktivität bis zu einem maximalen Effekt von 65 % und einer daraus resultierenden IC50 von ca. 16 µM. Daneben konnte DMC in HeLa-Zellen auch die Protein- und mRNA-Expression der mPGES-1 in Konzentrationen größer 15 µM hemmen. Die Analyse der Gesamtprostanoide in Krebszellen nach DMC-Behandlung zeigte eine Hemmung der Synthese aller vorhandenen Prostanoide. Da extern zugesetzte Arachidonsäure diesen Effekt von DMC sowohl in HeLa- als auch in HCA-7-Zellen unterbinden konnte, war eine Hemmung der Arachidonsäurefreisetzung durch Beeinflussung der Phospholipasen A2 nahe liegend. Es konnte für DMC eine Hemmung der cPLA2a-Aktivität in einem in vitro Assay mit einer IC50 von 58 µM gezeigt werden. Die zur Steigerung der Aktivität notwendige Translokation der cPLA2a vom Cytosol zu intrazellulären Membranen sowie die Phosphorylierung am Serin505 blieben wie auch die Gesamtproteinexpression der cPLA2a von DMC unbeeinflusst. Somit konnte für DMC in vitro eine Hemmung von mPGES-1 und cPLA2a nachgewiesen werden. Jedoch wurden in vitro weitaus höhere Konzentrationen an DMC eingesetzt, um diese Enzyme zu hemmen, als für die Hemmung der PGE2-Produktion in intakten Zellen benötigt wurde. Für die bereits wiederholt gezeigte antiproliferative Wirkung von DMC in vitro konnte die PGE2-Unabhängigkeit bestätigt werden. Aufgrund der hier dargestellten Ergebnisse kann DMC jedoch nicht mehr als COX- und Prostaglandin-unabhängige Kontrollsubstanz im Vergleich zu anderen Coxiben eingesetzt werden. Für die mehrfach beschriebenen antiproliferativen Wirkungen von Celecoxib und DMC sowie die Hemmung der identifizierten Zielmoleküle wurden in vitro meist sehr hohe Konzentrationen benötigt. Die Relevanz dieser Ergebnisse wird daher stark diskutiert, da die in vivo erreichten Plasmakonzentrationen von Celecoxib nicht mit den hohen Konzentrationen in vitro korrelieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde zunächst gezeigt, dass DMC und Celecoxib eine intrazelluläre Anreicherung in verschiedenen humanen Krebszelllinien und in vaskulären Endothelzellen aufweisen. In den untersuchten Zellsystemen wurden im Vergleich zu den restlichen Coxiben für Celecoxib und DMC ca. 5 - 10-fach höhere intrazelluläre Konzentrationen erreicht, die linear von den eingesetzten Konzentrationen abhängig waren. DMC und Celecoxib zeigten dabei eine Akkumulation in zelluläre Membranstrukturen und hier insbesondere eine Interaktion mit den lipophilen Bestandteilen des Phospholipidbilayers, was mittels subzellulärer Fraktionierung und zweidimensionaler 1H MAS NOESEY NMR-Spektroskopie nachgewiesen werden konnte. Die intrazelluläre Anreicherung für DMC und Celecoxib ist vermutlich vom Zelltyp und der Lipidzusammensetzung der vorliegenden Membran abhängig, da dieser Effekt in Fibroblasten nicht bestätigt werden konnte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Beeinflussung der Membranintegrität neben der Anreicherung in Phospholipidmembranen zu einer effizienteren COX-2-Hemmung durch Celecoxib im Vergleich zu Rofecoxib und Etoricoxib in HCA-7 Zellen führte. Im humanen COX-2-Vollblutassay wurden hingegen ähnliche Effektivitäten der Coxibe auf die COX-2 nachgewiesen. Eine Steigerung der Wirksamkeit von Celecoxib oder DMC auf Membran-gebundene oder Membran-assoziierte Enzyme, die eine Affinität gegenüber diesen Substanzen aufweisen, wäre somit denkbar und würde speziell in solchen Krebszellen eine Rolle spielen, wo durch eine erhöhte Aktivität dieser Enzyme eine verstärkte Proliferation und Überlebensrate nachgewiesen werden konnte. Pharmakokinetische Studien zeigten für Celecoxib im Vergleich zu anderen Coxiben ein vielfach höheres Verteilungsvolumen. Somit besteht die Möglichkeit, dass sich Celecoxib in solche tieferen Kompartimente einlagert, die vermehrt durch hydrophobe Membranstrukturen gekennzeichnet sind. Aufgrund der hier beschriebenen Ergebnisse ist anzunehmen, dass in intakten Zellen die Wirkung von Celecoxib und DMC auf Zielmoleküle mit einer gewissen Affinität zu diesen Substanzen stärker ist als in vitro und so die Diskrepanz zwischen den Wirkkonzentrationen in vitro und in vivo erklärt werden kann.
Background Translocations of the Mixed Lineage Leukemia (MLL) gene occur in a subset (5%) of acute myeloid leukemias (AML), and in mixed phenotype acute leukemias in infancy - a disease with extremely poor prognosis. Animal model systems show that MLL gain of function mutations may contribute to leukemogenesis. Wild-type (wt) MLL possesses histone methyltransferase activity and functions at the level of chromatin organization by affecting the expression of specific target genes. While numerous MLL fusion proteins exert a diverse array of functions, they ultimately serve to induce transcription of specific genes. Hence, acute lymphoblastic leukemias (ALL) with MLL mutations (MLLmu) exhibit characteristic gene expression profiles including high-level expression of HOXA cluster genes. Here, we aimed to relate MLL mutational status and tumor suppressor gene (TSG) methylation/expression in acute leukemia cell lines. Results Using MS-MLPA (methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification assay), methylation of 24 different TSG was analyzed in 28 MLLmu and MLLwt acute leukemia cell lines. On average, 1.8/24 TSG were methylated in MLLmu AML cells, while 6.2/24 TSG were methylated in MLLwt AML cells. Hypomethylation and expression of the TSG BEX2, IGSF4 and TIMP3 turned out to be characteristic of MLLmu AML cell lines. MLLwt AML cell lines displayed hypermethylated TSG promoters resulting in transcriptional silencing. Demethylating agents and inhibitors of histone deacetylases restored expression of BEX2, IGSF4 and TIMP3, confirming epigenetic silencing of these genes in MLLwt cells. The positive correlation between MLL translocation, TSG hypomethylation and expression suggested that MLL fusion proteins were responsible for dysregulation of TSG expression in MLLmu cells. This concept was supported by our observation that Bex2 mRNA levels in MLL-ENL transgenic mouse cell lines required expression of the MLL fusion gene. Conclusion These results suggest that the conspicuous expression of the TSG BEX2, IGSF4 and TIMP3 in MLLmu AML cell lines is the consequence of altered epigenetic properties of MLL fusion proteins.
The utilization of Ginkgo biloba in medicinal practice dates back to 1505 A.D. Ironically, the mechanisms of action of Ginkgo are not fully clarified till now. Nowadays, Ginkgo biloba leaf extracts are mainly indicated for mild to moderate cerebrovascular insufficiency and different forms of dementia. The fact that it is an herbal extract composed of several different components indeed adds to the intricacy of finding its mechanisms of actions. Indisputably, many scientists tried to elucidate the mechanisms of actions of Ginkgo. The first step to achieve this goal was to standardize the leaf extract. The standardized Ginkgo leaf extract contains 22-27 % flavonol glycosides, 2.8-3.4 % of ginkgolide A, B and C, as well as approximately 2.6-3.2 % bilobalide and below 5 ppm ginkgolic acids. A widespread standardized Ginkgo extract is the EGb 761, which was utilized in the current work. One of the earliest proposed mechanisms is the ability of the Ginkgo extract to act as an anti-oxidant, which could be explained by its high flavonoid contents. However, without doubt EGb 761 encompasses other characteristics which distinguish it from other herbal extracts that are also rich in flavonoids. Since free radicals and reactive oxygen species are highly associated with the mitochondrial functions, examination of the effect of EGb 761 on mitochondrial functions was lately addressed. Moreover, this was encouraged as the link between Alzheimer’s disease [AD] and the mitochondria started to emerge. Previously, our group observed mitochondrial protective actions of EGb 761 on cell culture in vitro. Furthermore, anti-apoptotic effects were previously described for EGb 761. However, only very few studies addressed the single constituents and their effect on mitochondrial functions. Flavonoids were studied in several other plant extracts and their radical scavenging activity is unquestionable, but EGb 761 has anti-apoptotic actions which may be attributed to its terpenoid fraction. Exclusively found in the Ginkgo plant, are the ginkgolides and therefore their actions are not yet fully elucidated. Moreover, those who attempted to address these constituents concentrated on one or two candidates, for example bilobalide or ginkgolide B and ignored the rest. Unfortunately, this led to incomplete results, and one couldn’t compare the relative activities of all EGb 761 components in order to state whether all the components are effective or not. ...
Das NANOG2-Gen ist ein Genduplikat des nur in embryonalen Stammzellen exprimierten Stammzellfaktors NANOG1, der eine Schlüsselrolle bei der Pluripotenz und der Selbsterneuerung der Stammzellen und möglicherweise der Krebsstammzellen hat. Zur Analyse, ob NANOG2 die beschriebenen Funktionen von NANOG1 in Gewebestammzellen und Krebsstammzellen übernimmt und ursächlich für die Leukämieentstehung verantwortlich ist, wurden embryonale Zellen und primäre Leukämiezellen auf NANOG2-Expression durch RT-PCR-Experimente, Western Blot Analysen und ChIP Assays untersucht. Dabei konnte eine Methode zur Unterscheidung der NANOG1 und NANOG2-Transkripte etabliert, neue Genstrukturen dieser Gene charakterisiert und NANOG2-Transkripte in hämatopoetischen Stammzellen und in allen primären Leukämiezellen detektiert werden. Außerdem konnte mit Hilfe von Genexpressionsanalysen eine äquivalente Funktion von NANOG2 zu NANOG1 festgestellt werden.
Entwicklung einer In-vitro-Methode zur Detektion von residualer Toxizität in Tetanusimpfstoffen
(2004)
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines sensitiven, schnellen, immunologischen in-vitro-Nachweises für die Endoprotease Tetanustoxin. Der klassische ELlSA, bei dem an eine Festphase immobilisiertes Antigen detektiert wird, wurde hier um einen endoproteolytischen Schritt erweitert, in dem das gebundene Substrat des Tetanustoxins an der Festphase in das nachzuweisende Antigen gespalten wird. Somit wird die Enzymaktivität des Tetanustoxins indirekt bestimmt. Bei dem Substrat handelt es sich um rekombinantes Synaptobrevin-2 (rSyb2), das von Tetanustoxin spezifisch und selektiv an einer Peptidbindung hydrolysiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit molekularbiologischen Methoden drei unterschiedliche rSyb2 Fragmente in Escherichia coli hergestellt, die einen unterschiedlichen Aufbau des TeNT-Endopeptidase-Assays ermöglichen. Zur Maximierung der Proteinausbeute wurde die Expression in drei verschiedenen E. co/i-Stämmen miteinander verglichen. Der Stamm mit der höchsten Expressionsleistung wurde in 500ml-Schüttelkulturen sowie im 101-Maßstab fermentiert. Es wurde ein Protokoll zur Aufreinigung des rekombinanten Synaptobrevin-2 erstellt und optimiert. Zur immunologischen Detektion des durch Tetanustoxin gespaltenen rSyb2s standen zwei in Eigenarbeit hergestellte Antikörper zur Verfügung. Im Gegensatz zu den kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen Synaptobrevin-2, deren Epitope inmitten der rSyb2-Aminosäuresequenz liegen, detektieren die beiden selbst hergestellten Antikörper die Aminosäuresequenzen, die die N- bzw. die C-terminale Seite der Tetanus-Spaltstelle in Synaptobrevin-2 darstellen. Beide Antikörper vermögen zwischen ungespaltenem und gespaltenem rSyb2 zu differenzieren. Besonders der gegen das N-terminale Spaltfragment gerichtete Antikörper ist ein hochspezifisches Werkzeug, das nur die von Tetanustoxin generierte, terminale Aminosäuresequenz an der SpaltsteIle detektiert. Im ELISA wurde zunächst untersucht, in welcher Reihenfolge Spaltung und Immobilisierung an die Festphase durchgeführt werden sollten. Die Immobilisierung des rSyb2s mit anschließender Spaltung durch Tetanustoxin erwies sich als die sensitivere Methode und wurde deshalb weiter optimiert. Dazu gehörte die Wahl der Festphase, die Untersuchung unterschiedlicher Beschichtungsmethoden, der Vergleich verschiedener Umgebungsbedingungen in der enzymatischen Reaktion sowie die Titration der eingesetzten Antikörper und die Auswahl der geeignetsten Pufferzusammensetzungen und Inkubationszeiträume. Zur Optimierung der Beschichtung wurden die drei rSyb2-Fragmente an unterschiedliche Polystyrenoberflächen gebunden. Die gezielte Ausrichtung der Moleküle, mit der nach der Inkubation mit Tetanustoxin nur ein bestimmtes Spaltfragment an der Platte gebunden bleibt und mit dem entsprechenden Antikörper detektiert werden kann, bringt dabei keinen Vorteil gegenüber der ungerichteten Bindung. Insgesamt differiert die Bindung an die Festphase zwischen Plattentypen und rSyb2-Fragmenten und hat einen großen Einfluss auf die Aktivität des Tetanustoxins und auf die Bindung des jeweiligen Antikörpers. Diese binden in Abhängigkeit vom Plattentyp teils stark an ungespaltenes rSyb2; offensichtlich ist das Epitop des jeweils eingesetzten Antikörpers in diesen Fällen also auch vor der Spaltung schon exponiert. Insgesamt zeigen die Versuche, dass die ungerichtete Bindung des Fragments rSyb2(N;1-97) mit der Detektion des N-terminalen Spaltfragments die sensitivste Methode zur Detektion von Tetanustoxin ist. Durch die Optimierung der weiteren InkubationsschriUe konnte die Nachweisgrenze des ELISA auf 0,54ng/ml Tetanustoxin gesenkt werden. Sie liegt damit im Bereich von Literaturdaten für eine Meerschweinchen-LD5o und könnte bereits unter der Nachweisgrenze des Tierversuchs liegen. Der Mangel an Daten zur Toxizität des in der Testentwicklung verwendeten, hochaufgereinigten Toxins lässt keine genauere Einschätzung zu. Der Vergleich mit der Empfindlichkeit von Tieren ist aber relevant, weil der ELiSA die Detektion des Toxins im Tierversuch ersetzen soll und eine vergleichbare Sensitivität aufweisen muss. Eine bessere Einschätzung kann mit einem krudem Tetanustoxin vorgenommen werden, für das die Meerschweinchen-LD5o vom Hersteller bestimmt wurde. Mit diesem Toxin wurde eine Nachweisgrenze des ELISA von 0,049 Meerschweinchen-LD5o ermittelt. Der ELISA scheint somit eine vielversprechende Methode zur Detektion von Tetanustoxin zu sein und könnte sich deshalb zum Ersatz des Tierversuchs eignen.
Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse ermöglichten die Identifizierung neuer Inhibitoren der bakteriellen Transkriptions-/Translationsreaktion durch den Einsatz eines eigenständig etablierten nicht-kommerziellen zellfreien prokaryotischen GFP-Expressionsassays (ZFTT-Assay) als Screening Werkzeug. Der Nachweis der selektiven Inhibition der ZFTT-Reaktion durch antimikrobielle Translationsinhibitoren im Vergleich zu Antibiotika anderer Wirkmechanismen gelang im Rahmen einer proteomanalytischen Studie. Die parallele Anwendung des etablierten ZFTT-Assays und standardisierter Ganzzellassays ermöglichte die Charakterisierung der Aktivitätsprofile neun antimikrobieller Substanzen aus vier repräsentativen Translationsinhibitorklassen unter zellfreien und Ganzzellbedingungen in Abhängigkeit ihrer physikochemischen Substanzeigenschaften (Weidlich et al., 2008). Der Aufbau mehrerer interdisziplinärer Forschungkooperationen mit unterschiedlichen wissenschaftlichen Arbeitsgruppen wurde genutzt, um eine Substanzbibliothek chemisch heterogener Verbindungen als Quelle potentieller antimikrobieller Inhibitoren der bakteriellen Transkriptions-/Translationsreaktion zu generieren. Sowohl die Anwendung virtueller Screeningansätze und der Einsatz synthetischer Tripeptide ermöglichte die Identifizierung aktiver Substanzen. Im Rahmen einer globalen Identifizierungs- und Charakterisierungsphase wurde neben der zellfreien Aktivität auch die Wirksamkeit gegenüber bakteriellen Zellen, sowie die Toxizität gegenüber humanen Zellen untersucht. Der Einsatz der proteomanalytischen DIGE-Technologie ermöglichte schließlich die Charakterisierung der antimikrobiellen Wirkmechanismen ausgewählter Substanzen.
During the past several years, ceramide has emerged as an important second messenger triggering cell responses including proliferation, differentiation, growth arrest and apoptosis. This thesis has focused on the regulation of neutral ceramidase which critically determines, in concert with ceramide generating sphingomyelinases, the intracellular ceramide levels. In the first part it is reported that besides a rapid and transient increase in neutral sphingomyelinase activity a second delayed peak of activation occurs after hours of IL-1beta treatment. This second phase of activation is first detectable after 2 h of treatment, and steadily increases over the next two hours reaching maximal values after 4 h. In parallel, a pronounced increase in neutral ceramidase activity is observed, which accounts for a constant or even decreased level of ceramide after long-term IL-1beta treatment, despite continuous sphingomyelinase activation. The increase in neutral ceramidase activity is due to expressional up-regulation, as detected by an increase in mRNA level and enhanced de novo protein synthesis. The increase of neutral ceramidase protein levels and activity can be blocked dosedependently by the p38- mitogen-activated protein kinase (p38-MAPK) inhibitor, SB 202190, whereas the classical MAPK pathway inhibitor U0126, and the PKC inhibitor Ro 31-8220 were ineffective. Moreover, co-treatment of cells for 24 h with IL-1~ and SB 202190 leads to an increase in ceramide formation. Interestingly, IL-1beta-stimulated neutral ceramidase activation is not reduced in mesangial cells isolated from mice deficient in MAPK-activated protein kinase 2 (MAPKAPK-2), which is one possible downstream substrate of the p38-MAPK, thus suggesting that the p38-MAPK-mediated induction of neutral ceramidase occurs independently of MAPKAPK-2. The results suggest a biphasic regulation of sphingomyelin hydrolysis in cytokine-treated mesangial cells with a delayed de novo synthesis of neutral ceramidase counteracting sphingomyelinase activity and apoptosis. Neutral ceramidase may thus represent a novel cytoprotective enzyme for mesangial cells exposed to inflammatory stress conditions. In a second part, the effect of NO on neutral ceramidase was studied. Ceramide levels are strongly increased in a delayed fashion by stimulation of renal mesangial cells with NO. This effect is due to a dual action of NO, comprising an activation of sphingomyelinases and an inhibition of ceramidase activity. The inhibition of neutral ceramidase activity correlates with the decrease of neutral ceramidase protein. A complete loss of neutral ceramidase protein is obtained after 24h of NO stimUlation. Moreover, the NO-induced degradation is reversed by the protein kinase C (PKC) activator, 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) , but also by the physiological PKC activators platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), angiotensin II and ATP, resulting in a normalisation of neutral ceramidase protein as well as activity. In vivo phosphorylation studies using 32Pj-labelled mesangial cells, reveal that TPA, PDGF-BB, angiotensin II and ATP trigger an increased phosphorylation of the neutral ceramidase, which is blocked by the broad-spectrum PKC inhibitor Ro-31 8220, but not by CGP 41251, which has a preferential action on Ca2+-dependent PKC isoforms, thus suggesting the involvement of a Ca2+-independent PKC isoenzyme. In vitro phosphorylation assays using recombinant PKC isoenzymes and neutral ceramidase immunoprecipitated from unstimulated mesangial cells, show that particularly the PKC-alpha isoform, and to a lesser extent the PKC-a isoform, are efficient in directly phosphorylating neutral ceramidase. The data show that NO is able to induce degradation of neutral ceramidase thereby promoting accumulation of ceramide in the cell. This effect is reversed by PKC activation, most probably by the PKC-delta isoenzyme, which may directly phosphorylate and thereby, prevent neutral ceramidase degradation. In the third chapter it is demonstrated that the NO-triggered degradation of neutral ceramidase involves activation of the ubiquitin/proteasome complex. The specific proteasome inhibitor, lactacystin, completely reverses the NO-induced degradation of ceramidase protein and neutral ceramidase activity. As a consequence, the cellular amount of ceramide, which drastically increases by NO stimulation, is reduced in the presence of lactacystin. Furthermore, ubiquitinated neutral ceramidase accumulates after NO stimulation. The data clearly show that the ubiquitin/proteasome complex is an important determinant of neutral ceramidase activity and thereby regulates the availability of ceramide. In a last part, the cellular localisation of neutral ceramidase was investigated using green fluorescent protein (GFP) as fusion protein to examine cellular distribution and translocation of neutral ceramidase. Unstimulated HEK 293 cells reveal after transient transfection experiments that neutral ceramidase is preferentially localized in the cytoplasm. PKC activation led to an accumulation of neutral ceramidase at the nuclear membrane. In summary, this work demonstrates that the neutral ceramidase is a fine regulated protein that plays a critical role in regulating intracellular ceramide levels and thereby the cell's fate to undergo apoptosis or survive. Regulation of neutral ceramidase can be achieved on all levels, i.e. on the mRNA level, the protein level or posttranslationally by phosphorylation and subcellular translocation. Future work will reveal whether neutral ceramidase can serve as a therapeutic target in the development of novel antiinflammatory and anti-tumour drugs.
IL-18, a recently identified member of IL-1 family, is now recognized as an important regulator of innate and acquired immune responses. Therefore, the antitumor activities of IL-18 have been investigated. IL-18 has been shown to induce IFN-γ production by T, B, and NK cells, enhances NK cell activity, activates Fas ligandmediated apoptosis of the tumor cells, and improves the overall antitumor immunity. KG-1 cells were derived from a patient with acute myeloid leukemia (AML). IL-18 has been shown to induce IFN-γ production in those leukemic cells. TLR-3, in addition to its ability to recognize viral double stranded RNA, also can recognize the synthetic analogue poly(I:C) and induces type I IFN, inflammatory cytokine production, e.g TNF-α, and maturation of denderitic cells. In the present work the potential modulatory effect of PIC on IFN-γ and TNF-α production by KG-1 cells treated with IL-18 was investigated. Indeed, PIC strongly amplified the production of IFN-γ induced by IL-18 on mRNA and protein levels via NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Compared to IFN-γ, TNF-α showed different behaviour in KG-1 cells. On mRNA level I found only weak induction of TNF-α by IL-18 which was potentiated in the presence of PIC. Similarly, the release of TNF-α by IL-18 plus PIC required NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Furthermore, in the present work I found that TLR-3 is required for IFN-γ and TNF-α production. In addition, it is demonstrated by immunofluoresence that TLR-3 is localized in cytoplasm but not on the cell surface in KG-1 cells. Recently, it has been demonstrated that IFN-γ shows therapeutic potential as detected in AML blasts, specifically via inhibition of proliferation and induction of apoptosis. Thus our data could serve as a rationale for the clinical use of PIC and IL-18 in combination therapy. In search for new cytokines potentially modulated by the combination IL-18 plus PIC in KG-1 cells, cytokine antibody array analysis was performed. I found an upregulation of expected genes like IP-10 but most interestingly unexpected upregulation of PDGF-AA. Searching for detailed mechanisms of PDGF-AA induction, I found that neither p38 nor JNK is involved in PDGF-AA production but NF-κB is essential for the expression of PDGF-AA. Furthermore, I found that PDGF-AA is not able to increase the proliferation of KG-1 cells. PDGF and TGF-β are examples of signaling molecules which control the growth, survival, motility, and differentiation of cells. Therefore, the release of TGF-β by IL-18 plus PIC was monitored by ELISA. The level of TGF-β in cellular supernatants revealed that neither PIC nor IL-18 was able to significantly mediate release of TGF-β indicating that only PDGF-AA but not TGF-β is induced by PIC and IL-18 in KG-1 cells. To the best of our knowledge this is the first time that IL-18 or PIC is shown to induce the expression of PDGF-AA in KG-1 cells.
Die Mehrheit (60%) aller AML-Erkrankungen beruhen auf chromosomalen Aberrationen, genauer genommen Translokationen, bei der zwei chromosomale Bruchstücke zu einem Chimärgen refusionieren. Die daraus resultierenden Fusionsproteine sind charakteristisch für die verschiedenen Formen der AML-Erkrankungen. In 97% aller Fälle der APL-Erkrankungen, einer Unterform der AML, tritt die t(15;17) und in weniger als 2% die t(11;17) auf. Die t(15;17) führt zu dem rekombinanten Fusionsprotein PML/RARK und die t(11;17) zu PLZF/RARK (X-RARK). Der APL-assoziierte leukämische Phänotyp X-RARKpositiver Zellen zeichnet sich durch die Blockierung terminaler Differenzierung früher hämatopoetischer Vorläuferzellen und dem gesteigerten Selbsterneuerungspotenzial leukämischer Stammzellen (LSCs) aus. Demzufolge können PML/RARK und PLZF/RARK auf der Ebene des frühen Vorläufers sowie der HSCs die leukämische Pathogenese initiieren. Bei der Erforschung der molekularen Grundlagen für die X-RARK-vermittelte Steigerung der aberranten Selbsterneuerung LSCs hat sich ergeben, dass die aberrante Aktivierung des Wnt-Signalweges eine zentrale Rolle einnimmt. Die Schlüsselmoleküle der aberranten Aktivierung des Wnt-Signalweges und damit der gesteigerten Selbsterneuerung sind 2-Catenin und Plakoglobin, die wiederum durch AML-assoziierte Fusionsproteine wie PML/RARK, PLZF/RARK und AML1/ETO transkriptionell hochreguliert werden. Das ansteigende Proteinniveau von 2-Catenin und Plakoglobin, welches entscheidend zur Initiation der Leukämieerkrankung beiträgt, führt zur nukleären Akkumulation von 2-Catenin und zur Aktivierung der CF/LEF-Familienmitglieder kontrollierten Genexpression. Aus diesem Grund stellen 2-Catenin und Plakoglobin einen wichtigen Ansatzpunkt für neue Therapieansätze in der Behandlung der AML dar. Die aberrante Aktivierung und pharmakologische Inhibition des Wnt-Signalweges, insbesondere von 2-Catenin, hat in zahlreichen humanen Krebserkrankungen, wie Brust-, Prostata-, Adenom- und Kolonkarzinomen, zu therapeutischen Erfolgen geführt. Grundlage der erfolgreichen pharmakologischen Inhibition des aberranten Wnt-Signalweges ist die Verwendung von Inhibitoren aus der Gruppe der nichtsteroidalen Entzündungshemmer (NSAIDs). Sulindac und seine Metabolite, Sulfon, das keine COX-inhibitorische Wirkung aufweist, und Sulfid, einem spezifischen COX-1/-2- Inhibitor, sind Vertreter der Gruppe der NSAIDs und haben in klinischen Studien erfolgreich die Größe und Anzahl der Kolorektaltumore von FAP-Patienten reduziert. Es deutet alles daraufhin, dass die vermittelten Effekte von Sulindac und seinen Metaboliten in den bisher untersuchten Zellsystemen in einem zur COX-Inhibition unabhängigen Kontext stehen. Zusammenfassung: 135 Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Ziel verfolgt herauszufinden, ob die Verwendung von NSAIDs einen neuen Therapieansatz in der gezielten pharmakologischen Bekämpfung der leukämischen Stammzelle („ stem cell targeting“) zur Behandlung der AML darstellen können. Sulindac (S), Sulindac Sulfid (SSi) und Sulindac Sulfon (SSo) sind in der Lage unabhängig von der PML/RARK-Expression die Viabilität leukämischer monozytärer U937-Zellen zu reduzieren und dosisabhängig in X-RARKpositiven U937-Zellen die Apoptose zu induzieren. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass in einem Konzentrationsbereich von 75-100 μM PML/RARK-positive U937-Zellen geringfügig stärker auf die Apoptoseinduktion reagieren als die Kontrollzellen. Des Weitern senkt SSi in PML/RARK-positiven NB4-Zellen am effektivsten das Proteinniveau von PML/RARK, 2-Catenin und Plakoglobin. Dem gegenüber weist sich SSo in KG-1-Zellen als potenteres Agenz aus, das Proteinniveau von PML/RARK, 2-Catenin und Plakoglobin effektiv zu senken. Zusätzlich deuten die Ergebnisse der Westernblotanalyse aus den KG-1- Experimenten daraufhin, dass der induzierte Proteinabbau nicht auf einen PML/RARKvermittelten Effekt zurückzuführen ist. Hinzu kommt, dass gezeigt werden konnte, dass SSi im Vergleich zu SSo in klinisch relevanten Konzentrationsbereichen weit aus effektiver die Viabilität PML/RARK-positiver NB4-Zellen reduziert und Apoptose induziert. Im Rahmen der seriellen Replattierungsexperimente konnte gezeigt werden, dass SSi in der Lage ist, mit dem leukämogenen Potenzial PML/RARK- und PLZF/RARK-exprimierender Stamm- und Progenitorzellen zu interferieren bzw. dieses zu revertieren. Darüber hinaus beherrscht und hebt SSi die 2-Catenin- und Plakoglobin-vermittelten Effekte auf das Stammzellpotenzial HSCs auf. Im Zuge der experimentellen Analyse des Einflusses von SSi auf die Wnt-Signalwegaktivierung hat sich gezeigt, dass SSi in der Lage ist, die PML/RARK- und S33A-vermittelte aberrante Wnt-Signalwegaktivierung zu reduzieren. Hinzu kommt, dass SSi die Siah1-Promotoraktivität stimuliert, die wiederum zur Expression von Siah-1 führt und einen phosphorylierungsunabhängigen 2-Catenin- und PML/RARK-Abbau induziert. Ferner hebt SSi den X-RARK-vermittelten Differenzierungsblock auf und inhibiert spezifisch die Proliferation PML/RARK- und PLZF/RARK-positiver HSCs. In humanen APL-Zellsystemen ist SSi alleine nicht imstande in vergleichbarem ATRA-Ausmass granulozytäre Differenzierung zu induzieren, aber den ATRA-vermittelten Effekt in der humanen APL-Patienten abgeleiteten NB4-Zelllinie zu verstärken. Infolge der Zellzyklusanalyse konnte gezeigt werden, dass SSi zu einer PML/RARK-spezifischen Apoptoseinduktion, ermittelt durch den Anstieg der subG0/G1-Phase, führt, welche in der PML/RARK-negativen Zelllinie ausbleibt. Darüber hinaus verhindert die Präsenz von PML/RARK ein SSi induziertes Ausscheren der Zellen in die G0/G1-Phase. Zusätzlich haben in vivo Experimente (CFU-S12) ergeben, dass SSi die Kurzzeitstammzellkapazität X-RARK-positiver HSCs senkt. SSi induziert außerdem im humanen Stammzellmodel der KG-1-Zellen die RARK-spezifische Reduktion der stammzellähnlichen CD34+/CD38-/ALDH+-KG1-Subpopulation, wobei die Reduktion dieser Subpopulation nicht auf zytotoxischen Effekten beruht. Des Weiteren ist SSi in der Lage die ALDH+-NB4-Subpopulation zu senken, wohingegen die Abwesenheit von PML/RARK in U937-Zellen eine Stimulation der ALDH+-Population zulässt. Zusammenfassend bleibt zusagen, dass SSi ein vielversprechender Kandidat für den Einsatz in der „Stammzelltargeting-Therapie“ zur Behandlung akuter Leukämien darstellt. Nicht nur die effiziente Inhibition des aberranten Wnt-Signalweges, der maßgeblich am X-RARK-vermittelten leukämischen Phänotyp beteiligt ist, sondern auch die gezielte Reduktion der X-RARK-assoziierten Stammzellpopulation könnte SSi möglicherweise favorisieren, unterstützend zu anderen Chemotherapeutika, in der Erhaltungstherapie eingesetzt zu werden. SSi-assoziierte renale und gastrointestinale Nebeneffekte sowie der beobachtete Wachstumskompensationsmechanismus sollten zum gegenwärtigen Zeitpunkt pharmakologisch beherrschbar sein.
Background: Nitric oxide (NO) is an essential vasodilator. In vascular diseases, oxidative stress attenuates NO signaling by both chemical scavenging of free NO and oxidation and down-regulation of its major intracellular receptor, the alpha/beta heterodimeric heme-containing soluble guanylate cyclase (sGC). Oxidation can also induce loss of sGC's heme and responsiveness to NO.
Results: sGC activators such as BAY 58-2667 bind to oxidized/heme-free sGC and reactivate the enzyme to exert disease-specific vasodilation. Here we show that oxidation-induced down-regulation of sGC protein extends to isolated blood vessels. Mechanistically, degradation was triggered through sGC ubiquitination and proteasomal degradation. The heme-binding site ligand, BAY 58-2667, prevented sGC ubiquitination and stabilized both alpha and beta subunits.
Conclusion: Collectively, our data establish oxidation-ubiquitination of sGC as a modulator of NO/cGMP signaling and point to a new mechanism of action for sGC activating vasodilators by stabilizing their receptor, oxidized/heme-free sGC.
Charakterisierung der Amyloidplaque-assoziierten Entzündungsreaktion in APP23 transgenen Mäusen
(2009)
Ein charakteristisches Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Ablagerung von Amyloid-beta (A beta) Protein im Gehirn. Die Proteinaggregate bilden Plaques, in deren Umgebung eine chronische Entzündungsreaktion nachgewiesen werden kann. Welche Rolle diese plaqueassoziierte Inflammation für die Pathogenese der Alzheimerschen Krankheit spielt, ist unklar. Es wird diskutiert, dass es sich um einen Versuch des Immunsystems handelt, A beta durch Prozessierung und Phagozytose aus dem Gehirn zu entfernen. Durch die dadurch entstehende chronische Entzündung könnten Nervenzellen in der Umgebung von Plaques geschädigt werden ("bystander attack"). Ein Schritt zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsprozesse und ihrer pathogenetischen Bedeutung ist die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Daher beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit drei zentralen Fragen: (1) Welche Moleküle sind an der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion beteiligt? (2) Sind ausgewählte Kandidatenmoleküle (Toll-like Rezeptoren, SOCS) in der Umgebung von Plaques reguliert? (3) Welche Rolle spielen Entzündungsmediatoren aus Endothelzellen in der Nähe von Plaques? Die plaqueassoziierten Entzündungsprozesse wurden im Gehirn von alten APP23 transgenen Mäusen, einem Modell der Alzheimer-Erkrankung, untersucht. Plaques, plaquenahes Gewebe und plaquefreies Gewebe wurden mittels Laser Mikrodissektion ausgeschnitten und anschließend mit Hilfe von Mikroarrays und quantitativer RT-PCR analysiert. Dazu wurden zwei methodische Ansätze gewählt: Im ersten Teil der Arbeit wurden in einem hypothesenfreien Ansatz neue regulatorische Kandidatenmoleküle identifiziert, unter ihnen der Rezeptor Trem2. Dabei konnten sowohl eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA als auch eine erhöhte Protein Expression von Trem2 sowie dessen Lokalisation auf Mikrogliazellen nachgewiesen werden. Trem2 spielt anscheinend eine Rolle bei der Herbeiführung eines mikroglialen Aktivierungsstatus, der die Phagozytose unterstützt, während die Entstehung von proinflammatorischen Zytokinen unterdrückt wird. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit einem hypothesenbasierten Ansatz die plaqueassoziierte mRNA Expression von Molekülen untersucht, die bereits in anderen Untersuchungen mit der Alzheimer-Erkrankung in Zusammenhang gebracht wurden. Dabei konnte eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA Expression der Toll-like Rezeptoren Tlr2, 4 und 9 sowie einzelner SOCS in APP23 transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Tlr2 und 4 sind in der Lage, Mikrogliazellen und andere phagozytierende Zellen zu aktivieren und werden mit der Aufnahme und Beseitigung von Amyloid-beta in Verbindung gebracht. Im dritten Teil der Arbeit wurde ebenfalls mit einem hypothesenbasierten Ansatz die mRNA Expression von plaqueassoziiertem Endothelgewebe überprüft. Dabei konnte eine erhöhte mRNA Expression von MIP-1 alpha und CXCL10, zwei Entzündungsmediatoren aus der Familie der Chemokine, in plaqueassoziiertem Endothelgewebe gezeigt werden. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass auch das Endothelgewebe an der Entzündungsreaktion beteiligt ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion im Rahmen der Alzheimer-Erkrankung bei. Die Aufklärung der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung ist entscheidend, um in den nächsten Jahren und Jahrzehnten neue und effektive Medikamente zur Behandlung dieser schweren Demenzerkrankung zu entwickeln.
Antiproliferative und proapoptotische Mechanismen des Morphins - Konsequenzen für die Krebstherapie
(2008)
Im Rahmen dieser Arbeit sollte geprüft werden, ob Morphin in der Prostatakarzinomtherapie eingesetzt werden kann. Prostatakrebs ist bei Menschen eine der vier häufigsten aber kaum therapierbare Krebserkrankung. Nach dem Wiederauftreten des Karzinoms weist diese eine extrem hohe Mortalitätsrate auf. Morphin hemmt in MCF7-Zellen, die wie Prostatakarzinome zu den Adenokarzinomen gehören, das Tumorwachstum bei klinisch relevanten Plasmakonzentrationen und weist einen scheinbar μ-Opioid-Rezeptor unabhängigen antiproliferativen Effekt auf. In Kombination mit Naloxon kann dieser Effekt noch gesteigert werden. Somit könnte in Patienten das Tumorwachstum gehemmt werden, ohne die klassischen Nebenwirkungen hervorzurufen. Für den antiproliferativen Effekt ist die Stabilisierung von p53 notwendig. Prostatakarzinome schienen für eine Therapie mit Morphin prädestiniert, da p53 nur sehr selten in diesen Karzinomen mutiert ist. Für die Experimente wurde die LNCAP Prostatakarzinomzelllinie eingesetzt. Da Morphin weder das Tumorwachstum, noch die Zellproliferation in LNCAP-Zellen hemmte, scheint Morphin für die Behandlung von Prostatakarzinomen nicht geeignet zu sein. Durch Untersuchung der Angiogenese in LNCAP Tumoren konnte gezeigt werden, dass eine geringere Vaskularisierung keine verminderte Tumormasse zur Folge hat. Für eine erfolgreiche Krebstherapie scheint es im Gegenteil wichtig zu sein, eine normale Vaskularisierung in Tumoren wiederherzustellen. Die unterschiedlichen Morphinsensitivitäten der beiden Adenokarzinomzelllinien führte zu der Hypothese, dass der μ-Opioid-Rezeptor - zumindest partiell - doch an der Vermittlung des antiproliferativen Effekts des Morphins beteiligt sein könnte. Morphin induziert verschiedene Effekte in MCF7-Zellen, während LNCAP-Zellen kaum auf Morphin reagierten. Es sollte daher untersucht werden, warum MCF7-Zellen sensitiver auf Morphin ansprechen. Durch Überlebenstests mit MCF7-Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung der Zellen mit Morphin in Kombination mit exogenem Glutathion das Überleben der MCF7-Zellen im Vergleich zu morphinbehandelten Zellen signifikant steigern konnte. Dies war ein Hinweis, dass Morphin erstens die Bildung von ROS induziert und dies zweitens in einem Ausmaß geschieht, dass die Überlebensrate der MCF7-Zellen konzentrationsabhängig gehemmt wurde. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass die Inkubation der MCF7-Zellen mit Morphin weder die endogene Glutathionkonzentration noch die Expressionsraten der detoxifizierenden Enzyme SOD1 und P5 moduliert. Morphin induziert bei Konzentrationen von 100 μM und 1000 μM in MCF7-Zellen eine signifikant gesteigerte Superoxidanionenbildung. Wie bei den MCF7 Überlebenstests konnte exogen gegebenes Glutathion die durch 100 μM Morphin induzierte Superoxidanionenbildung unterdrücken. Die verstärkte Bildung der Superoxidanionen ist auf Morphin beschränkt, da sie nicht durch die Gabe von Fentanyl, Levomethadon oder Oxycodon induziert werden konnte. Die Bildung der Superoxidanionen könnte Morphin durch die Modulation einer plasmamembranständigen NADH Oxidase hervorrufen. Weiterhin wurden die Folgen einer chronischen Morphingabe im Rückenmark untersucht. Es wird vermutet, dass Morphin im Rahmen einer chronischen Behandlung Apoptose in GABAergen Neuronen auslöst. Für die neuronenspezifische Apoptose nach chronischer Morphingabe konnten durch FACS-Analysen ebenfalls Hinweise gefunden werden. Mittels vergleichender Proteomanalyse konnte festgestellt werden, dass VDAC1 im Rückenmärkgewebe von Tieren, die eine beginnende Morphintoleranz aufweisen, verstärkt exprimiert wurde. Neue Untersuchungen zeigen, dass VDAC1 in der Plasmamembran als Redoxenzym fungieren kann. Dort ist es mit einer NADH Oxidase in den PMOR Komplex eingebunden, der eine wichtige Rolle in der Regeneration von NAD+ aus NADH spielt und so Überleben und Zellwachstum ermöglicht. Eine Störung des PMOR Komplexes hat die Bildung von Radikalen zur Folge. In dieser Arbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass Morphin durch Modulation der plasmamembranstädnigen NADH Oxidase in MCF7-Zellen die Bildung von Superoxidanionen induziert. Als Konsequenz könnte VDAC1 verstärkt phosphoryliert werden, um die NAD+/NADH Homöostase aufrecht zu erhalten. Im Laufe der chronischen Morphingabe wird postuliert, dass sich derart viele Superoxidanionen akkumulieren, dass schwerwiegende Schäden an den Makromolekülen vorliegen und die Zelle daher in die Apoptose geht.
Die Depression gehört zu den häufigsten Volkskrankheiten. Derzeit sind rund vier Millionen Deutsche an einer behandlungsbedürftigen Depression erkrankt. Die Erkrankung verläuft typischerweise in Form von Episoden, die Wochen bis Monate, manchmal auch Jahre anhalten können. Wenn die Erkrankung unbehandelt bleibt, kann sie wiederkehren und einen chronischen Verlauf nehmen. Rund 75 Prozent der Betroffenen erleiden nach einer Ersterkrankung innerhalb von fünf Jahren mindestens eine neue depressive Phase. Zudem werden mit steigender Episodenzahl die episodenfreien Zwischenzeiten immer kürzer. Es gilt heute als unstrittig, dass mehr als die Hälfte aller Depressionen nicht diagnostiziert und allenfalls ein Fünftel adäquat behandelt werden. Das verursacht nicht nur enorme Kosten für die Volkswirtschaft, sondern ist für die Betroffenen auch mit erheblichem Leid und Lebensgefahr verbunden.
We developed the Pharmacophore Alignment Search Tool (PhAST), a text-based technique for rapid hit and lead structure searching in large compound databases. For each molecule, a two-dimensional graph of potential pharmacophoric points (PPPs) is created, which has an identical topology as the original molecule with implicit hydrogen atoms. Each vertex is coloured by a symbol representing the corresponding PPP. The vertices of the graph are canonically labelled. The symbols associated with the vertices are combined to a so-called PhAST-Sequence beginning with the vertex with the lowest canonical label. Due to the canonical labelling the created PhAST-Sequence is characteristic for each molecule. For similarity assessment, PhAST-Sequences are compared using the sequence identity in their global pairwise alignment. The alignment score lies between 0 (no similarity) and 1 (identical PhAST-Sequences). In order to use global pairwise sequence alignment, a score matrix for pharmacophoric symbols was developed and gap penalties were optimized. PhAST performed comparably and sometimes superior to other similarity search tools (CATS2D, MOE pharmacophore quadruples) in retrospective virtual screenings using the COBRA collection of drugs and lead structures. Most importantly, the PhAST alignment technique allows for the computation of significance estimates that help prioritize a virtual hit list.
Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection
(2008)
Autoimmune liver diseases, such as autoimmune hepatitis (AIH) and primary biliary cirrhosis, often have severe consequences for the patient. Because of a lack of appropriate animal models, not much is known about their potential viral etiology. Infection by liver-tropic viruses is one possibility for the breakdown of self-tolerance. Therefore, we infected mice with adenovirus Ad5 expressing human cytochrome P450 2D6 (Ad-2D6). Ad-2D6–infected mice developed persistent autoimmune liver disease, apparent by cellular infiltration, hepatic fibrosis, “fused” liver lobules, and necrosis. Similar to type 2 AIH patients, Ad-2D6–infected mice generated type 1 liver kidney microsomal–like antibodies recognizing the immunodominant epitope WDPAQPPRD of cytochrome P450 2D6 (CYP2D6). Interestingly, Ad-2D6–infected wild-type FVB/N mice displayed exacerbated liver damage when compared with transgenic mice expressing the identical human CYP2D6 protein in the liver, indicating the presence of a stronger immunological tolerance in CYP2D6 mice. We demonstrate for the first time that infection with a virus expressing a natural human autoantigen breaks tolerance, resulting in a chronic form of severe, autoimmune liver damage. Our novel model system should be instrumental for studying mechanisms involved in the initiation, propagation, and precipitation of virus-induced autoimmune liver diseases.
Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection
(2009)
Autoimmune hepatitis (AIH) is a chronic liver disease of unknown etiology, characterized by a loss of tolerance against hepatocytes leading to the progressive destruction of hepatic parenchyma and cirrhosis. Clinical signs for AIH are interface hepatitis and portal plasma cell infiltration, hypergammaglobulinemia, and autoantibodies. Based on serological markers AIH is defined in subtypes. The hallmark of AIH type 2 are type 1 liver/kidney microsomal autoantibodies (LKM-1), whereas AIH type 1 is characterized by the presence of anti-nuclear (ANA) and/or anti-smooth muscular (SMA) autoantibodies. The major autoantigen recognized specifically by LKM-1 autoantibodies was identified as the 2D6 isoform of the cytochrome P450 enzyme family (CYP2D6). Not much is known about the etiology and pathogenic mechanisms of AIH so far and most animal models available result in only transient hepatic liver damage after a rather complex initiation method. It was the aim of my project to generate a novel animal model for AIH that reflects the chronic and progressive destruction of the liver characteristic for the human disease while using a defined and feasible initiating event to further analyze the pathogenic mechanisms leading to the autoimmune-mediated destruction of the liver. Therefore, mice transgenically expressing the human CYP2D6 in the liver and wild-type mice were infected with a liver-tropic adenovirus expressing the human CYP2D6 (Ad-2D6). Selftolerance to CYP2D6 was broken in Ad-2D6-infected mice, resulting in persistent autoimmune liver damage, apparent by cellular infiltration, hepatic fibrosis and necrosis. Similar to type 2 AIH patients, Ad-2D6-infected mice generated LKM-1-like antibodies recognizing the same immunodominant epitope of CYP2D6. Taken together, we could introduce a new animal model that reflects the persistent autoimmune-mediated liver damage as well as the serological marker characteristic for AIH type 2 and we could demonstrate that chronic autoimmune diseases targeting the liver can be triggered by molecular mimicry occurring in the context of a hepatotropic viral infection.
Ein weit verbreitetes Merkmal von Leukämien sind genetische Veränderungen, wobei die Entstehung der Leukämie häufig mit reziproken chromosomalen Translokationen assoziiert ist, welche zur Bildung chimärer Genprodukte führen. Eine Vielzahl dieser reziproken Translokationen basieren auf Translokationen des MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia), die mit dem Krankheitstyp einer AML oder einer ALL verbunden sind. Die häufigste chromosomale Translokation ist die t(4;11) Translokation. Sie tritt vor allem bei Kleinkindern bzw. auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie auf und resultiert in einer akuten lymphatischen Leukämie. Es handelt sich um eine Hochrisikoleukämie, welche aufgrund ihrer nahezu Therapie-resistenten Blasten mit einer besonders schlechten Prognose assoziiert ist. Der Mechanismus der Leukämieentstehung durch die MLL-Translokationen und der dabei entstehenden Fusionsproteine konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Für einige MLL-Translokationen, die mit einer myeloischen Leukämie verknüpft sind, konnte zunächst das onkogene Potenzial der Fusionsproteine im Mausmodell belegt werden. Im Bezug auf die t(4;11) Translokation blieben Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells jedoch lang erfolglos. Erst 2006 konnten mittels einer knock-in-Strategie bzw. einem „inverter“-System Mausmodelle für MLL•AF4 entwickelt werden, in denen die Mäuse nach sehr langer Latenzzeit ein disseminiertes B-Zell-Lymphom aufwiesen. Ein neueres konditionales MLL•AF4 knock-in-Modell, in dem MLL•AF4 unter der Kontrolle des endogenen Zellzyklus-abhängigen MLL-Promotors steht, resultierte hingegen in einer ALL oder AML. Im Allgemeinen steht somit bislang das MLL•AF4-Fusionsprotein im Vordergrund der Erforschung des pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation. Aufgrund der Tatsache, dass in der Regel jedoch neben dem MLL•AF4- ebenso ein AF4•MLL-Fusionstranskript nachgewiesen werden kann, befassten sich Studien unserer Arbeitsgruppe mit der Funktion des AF4•MLLFusionsproteins. Diese Untersuchungen zeigten, dass das AF4•MLL-Fusionsprotein in der Zelle akkumuliert und in der Entwicklung onkogener Effekte sowie der Wachstumstransformation der Zelle resultiert. Ergänzend belegten retrovirale Transduktions-/Transplantations-Experimente die Entwicklung einer akuten Leukämie im Mausmodell, wenn zuvor mit AF4•MLL bzw. mit AF4•MLL und MLL•AF4 transduzierte Stammzellen transplantiert wurden. Um nun die Funktion des AF4•MLL-Proteins sowie die molekularen Ursachen der beobachteten Eigenschaften besser verstehen zu können, wurde der AF4•MLL-Proteinkomplex mittels einer Strep-Tag-Affinitätschromatographie erfolgreich gereinigt und ein Molekulargewicht von ca. 2 MDa über Größenausschlusschromatographie bestimmt. Damit nicht nur ein Vergleich mit dem MLL- sondern auch mit dem AF4-Wildtyp- Proteinkomplex möglich war, wurden ebenfalls eine Größenbestimmung und eine Reinigung des AF4-Proteinkomplexes durchgeführt. Die folgenden Analysen der Komplexkomposition über Immunopräzipitationen, Western Blot-Analysen sowie massenspektrometrische Analysen zeigten, dass sich der AF4•MLL-Proteinkomplex aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt; es wurden P-TEFb, HEXIM1, NFKB1, NPM1, DDX6 und das AF4-Wildtypprotein aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, CREBBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex nachgewiesen. Auf diese Weise werden im AF4•MLL-Proteinkomplex Eigenschaften bzw. Funktionen beider Wildtyp-Proteinkomplexe kombiniert. Um einen weiteren Hinweis auf die Funktion zu erhalten, wurde ergänzend ein in vitro Histon-Methyltransferase-Assay etabliert, der für beide gereinigten Proteinkomplexe eine Histonmethyltransferase-Aktivität zeigte. Basierend auf den vorliegenden Daten kann eine Konkurrenzsituation zwischen dem AF4•MLL-Proteinkomplex und den beiden Wildtyp-Proteinkomplexen um die entsprechenden Faktoren angenommen werden, welche die Assemblierung vollständiger und funktioneller Wildtyp-Proteinkomplexe verhindern könnte. Des Weiteren weisen die Ergebnisse auf Funktionen des AF4•MLL-Proteins in transkriptionellen Prozessen, Histonacetylierungen sowie der H3K4-Trimethylierung hin. Die Fehlregulation epigenetischer und transkriptioneller Prozesse durch die Anwesenheit des AF4•MLL-Proteinkomplexes spielt somit vermutlich eine entscheidende Rolle im pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation.
IL-22 ist ein TH17-Signaturzytokin und wird primär von aktivierten T- und NK-Zellen produziert. Die Literatur beschreibt IL-22 als immunregulatorisches Signalmolekül, welches vor allem bei Infektionen und Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle spielt. Typische IL-22-induzierte Gene sind beispielsweise Akut-Phase-Proteine, β-Defensine sowie Matrixmetalloproteasen. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass IL-22 die IFNγ-induzierte iNOS-Expression in humanen DLD-1 Kolonkarzinomzellen massiv verstärkt. Eine gestörte iNOS-Induktion mit folglich extensiver NO-Produktion trägt zu entzündlichen Veränderungen und zur Tumorentstehung bei. Insbesondere gibt es stichhaltige Belege, welche iNOS und NO in Verbindung mit Krebs als potentes Mutagen, als Angiogenesefaktor, als Verstärker der Protoonkogenexpression und als Inhibitor der Apoptose charakterisieren. Demzufolge ist gerade die Identifikation von Signaltransduk-tionswegen von Interesse, welche das Potential zur Regulation der iNOS-Expression in epithelialen Kolonkarzinomzellen besitzen. Der Nachweis des IL-22-Rezeptorkomplexes sowie einer STAT3-Phosphorylierung belegte die IL-22-Responsivität der hier verwen-deten DLD-1 Kolonkarzinomzellen. Der Transkriptionsfaktor STAT3 gilt als prominentes Signalmolekül in der Signaltransduktionskette von IL-22. In der aktuellen Literatur wird STAT3 aufgrund seiner antiapoptotischen und proliferativen Eigenschaften als Onkogen definiert. Sowohl in Patienten mit Morbus Crohn als auch im humanen Kolorektalkarzinom ist eine Überexpression von STAT3 und iNOS beschrieben. Unter Verwendung einer STAT3-spezifischen siRNA konnte der Nachweis erbracht werden, dass STAT3 ein essen-tieller Faktor in der IL-22-vermittelten Induktion der iNOS-Expression ist. Luciferase-Reporterstudien zeigten, dass IL-22 die humane iNOS-Promotoraktivität in DLD-1 Zellen, welche die Photinus pyralis (Firefly)-Luciferase unter Kontrolle eines 16kb-iNOS-Promotor-konstrukts überexprimieren (DLD-1/pXP2-16kb), erhöht. Somit kann eine Regulation der Transkription durch IL-22 angenommen werden. Dennoch vermag diese Arbeit die Frage nach den transkriptionellen Regulationsmechanismen der IL-22-vermittelten iNOS-Expres-sion in DLD-1 Zellen nicht abschließend zu beantworten. Eine Beteiligung ausgewählter Parameter der Zellaktivierung wie beispielsweise NFκB, STAT1α oder IRF-1 an der IL-22-vermittelten iNOS-Induktion konnte durch die vorliegende Arbeit ausgeschlossen werden. Neben transkriptionellen Regulationsmechanismen übernimmt auch die Regulation der iNOS mRNA-Stabilität eine wichtige Funktion bei der Induktion der iNOS-Expression. Allerdings zeigten auch hier die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass IL-22 die iNOS-mRNA nicht stabilisieren kann. Dies bekräftigt wiederum die Annahme, dass IL-22 auf transkriptioneller Ebene den iNOS-Promotor reguliert. Weitere Versuche zeigten auch, dass IL-22 spezifisch an der iNOS-Expression in Kolonkarzinomzellen beteiligt ist und keinen generellen Verstärker der IFNγ-induzierten Genexpression darstellt. Beachtet man hierbei die bedeutende Rolle von STAT3 und iNOS bei Entzündung und Karzinogenese, so repräsentiert IL-22 möglicherweise eine neue Zielstruktur für immuntherapeutische Interventionen im Rahmen dieser Erkrankungen. Der zweite Abschnitt der vorgelegten Arbeit beschäftigte sich mit der Regulation der IL-22-Sekretion im Kontext von Sepsis und systemischer Entzündung. Es stellte sich die Frage, inwiefern IL-22 in diesem komplexen klinischen Syndrom der Sepsis nachzuweisen ist. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass sowohl eine generelle T-Zellaktivierung sowie verschiedene Stimuli der angeborenen Immunität, hier im Besonderen ein hitze-inaktiviertes Lysat von Staphylococcus epidermidis, eine vermehrte IL-22-Produktion anre-gen. Eine wichtige Frage ist hier die pharmakologische Beeinflussung der IL-22-Sekretion. Da bei der Therapie einer Sepsis die Behandlung mit niedrig dosierten Glukokortikoiden Erfolg versprechend ist, wurde im Folgenden der Einfluss des klassischen antientzünd-lichen Pharmakons Dexamethason auf die IL-22-Sekretion in PBMC untersucht. Es konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass Dexamethason sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene einen sehr potenten Inhibitor der S. epidermidis-induzierten IL-22-Sekretion darstellt. Um die in vitro-Daten der IL-22-Sekretion nach Immunaktivierung humaner PBMC durch in vivo-Experimente zu ergänzen, wurde ein kürzlich etabliertes Nagermodell der schweren Sepsis mit akutem Verlauf verwendet (CLI; caecum ligation and incision). In diesem Modell ist IL-22 im Vergleich zu unbehandelten Tieren signifikant erhöht. In Über-einstimmung mit den in vitro-Experimenten in humanen PBMC hat die Applikation von Dexamethason im CLI-Modell die Hemmung der IL-22-Produktion zur Folge. Zur Abrun-dung dieser Ergebnisse wurde das Serum von Patienten mit einer Peritonitis-bedingten Sepsis untersucht und es konnte erstmals eindrucksvoll gezeigt werden, dass IL-22 in dieser Patientengruppe signifikant erhöht ist. Zum aktuellen Zeitpunkt ist die Rolle von IL-22 in der Sepsis noch nahezu unbekannt. Daher ist zu klären, wie die eingehend beschriebene IL-22-vermittelte Aktivierung der epithelialen Immunabwehr, die systemische Immunsuppression über die Induktion von IL-10 sowie das proinflammatorische und destruktive Potential von IL-22 in Einklang zu bringen sind.
The epithelial absorbing cells of the small intestinal villi, the enterocytes, are the main protagonists for the transport of nutrients from the intestinal lumen to the interstitial fluids. The oriented flow of nutrients is carried out by different and complementary transport systems present in the apical and the basolateral domains of the enterocyte’s plasma membrane. One of the distinctive characteristics of those intestinal cells is the presence of numerous structurally distinct protrusions (referred as microvilli) on the apical surface of the plasma membrane. They confer the brush-like appearance of the microvillus border (commonly referred to as the "brush border") typically observed in the light microscope. Over the years, there has been considerable interest to study the molecular mechanisms driving the transport of molecules across the intestinal brush border membrane (BBM). Defects have been described to cause a variety of pathological conditions, such as disorders in the metabolism of saccharides (glucose and galactose malabsorption, lactose intolerance), amino acids (Hartnup disease, aminoacidurias), ions (sodium and potassium in the case of familiar diarrhea), metals (zinc in acrodermatitis enteropathica) and cholesterol lipids (cardiovascular diseases). In particular, the essential role of the BBM in regulating the delicate balance between cholesterol influx and efflux from the lumen to the enterocyte has been recently highlighted through the genetic analysis of individuals suffering of cholesterol disorders as well as in several clinical studies involving the use of dietary plant sterols (phytostrerols) or specific protein inhibitors blocking essential components of the cholesterol absorption/resorption pathway. ...
Schützen Statine vor Schlaganfall und Alzheimer? : neue Therapiemöglichkeiten im Zentralnervensystem
(2005)
Statine stellen heute Medikamente der ersten Wahl bei zu hohen Cholesterin- Blutwerten dar. Denn sie hemmen die Hydroxymethylglutaryl-CoA Reduktase (HMG-CoA Reduktase), ein wichtiges Schlüsselenzym, das für die körpereigene Herstellung von Cholesterin notwendig ist. Bei der pharmakologischen Bewertung der Statine muss allerdings auch der Cholesterinstoffwechsel im Gehirn berücksichtigt werden, dem cholesterinreichsten Organ des menschlichen Körpers. Bislang existieren nur wenige Daten zu den Effekten dieser Medikamente im zentralen Nervensystem. Im Rahmen eines Leitprojekts des Zentrums für Arzneimittelforschung, -Entwicklung und Sicherheit (ZAFES) wird derzeit die Pharmakologie der Statine im Gehirn intensiv untersucht, um die therapeutischen Einsatzmöglichkeiten von Statinen im Zusammenhang mit der Therapie von Erkrankungen, wie Schlaganfall und Alzheimer-Demenz, aufzuklären und gegebenenfalls zu erweitern.
Nanotechnologie bringt Arzneistoffe sicher ans Ziel : bessere Wirkung bei reduzierter Nebenwirkung
(2006)
Analysis of knockout/knockin mice that express a mutant FasL lacking the intracellular domain
(2009)
Fas ligand (FasL; CD178; CD95L) is a type II transmembrane protein belonging to the tumour necrosis factor family; its binding to the Fas receptor (CD95; APO-1) triggers apoptosis in the receptor-bearing cell. Signalling through this pathway plays a pivotal role during the immune response and in immune system homeostasis. Similar to other TNF family members, the intracellular domain has been reported to transmit signals to the inside of the FasL-bearing cell (reverse signalling). Recently, we identified the proteases ADAM10 and SPPL2a as molecules important for the processing of FasL. Protease cleavage releases the intracellular domain, which then is able to translocate to the nucleus and to repress reporter gene activity. To study the physiological importance of FasL reverse signalling in vivo, we established knockout/knockin mice with a FasL deletion mutant that lacks the intracellular portion (FasLDeltaIntra). Co-culture experiments confirmed that the truncated FasL protein is still capable of inducing apoptosis in Fas-sensitive cells. Preliminary immune histochemistry data suggest that, in contrast to published data, the absence of the intracellular FasL domain does not alter the intracellular FasL localization in activated T cells. We are currently investigating signalling and proliferative capacities of T cells derived from homozygous FasLDeltaIntra mice to validate a co-stimulatory role of FasL reverse signalling.
Carma-1 is required for B cell receptor-/CD40- and T cell receptor-/CD28-induced B- and T-cell activation via JNK and NF-betaB. In B cells, Carma-1 becomes phosphorylated by PKCbeta, leading to its oligomerization. Subsequent Bcl10 binding induces IKKbeta-activation and, thereby, canonical NF-KB signalling. Despite these findings it is still unknown how exactly Carma-1 is connected to the plasma membrane and to the IKK-complex. Therefore, we purified Carma-1 complexes from mouse CH12 B cells using anti-Carma-1 affinity columns. Mass spectrometric analyses of the column eluates demonstrated the presence of Carma-1 as well as three previously uncharacterized adaptor proteins in B cells, one of which was the Trk-fused gene (Tfg), an adaptor protein containing PB1 and coiledcoil domains. Whereas Tfg was originally identified as fusion partner of oncogenic Trk tyrosine kinase mutants, the normal cellular homologue of Tfg has so far not been described in B cells. However, Tfg has been shown in other systems to interact with IKKgamma and to enhance TNFinduced NF-KB activation. Tfg and Carma-1 co-localized at the plasma membrane and perinuclear structures in B cells. We further corroborated the interactions of Tfg, IKKgamma and Carma-1 by Blue Native gel electrophoresis, where Carma-1 and Tfg formed a 0.7–1 MDa complex. Ectopic expression of Tfg increased the molecular mass of IKKgamma complexes, fused IKKgamma, Bcl10 and Carma-1 complexes to a ~2 MDa complex, and increased basal and CD40-induced canonical activity of NF-KB and IKKbeta. In contrast, shRNA-mediated silencing of Tfg decreased CD40-induced IKKbeta activity. Very interestingly, in primary B cells, highest expression of Tfg was detected in marginal zone and B1 B cells, and Carma-1 and Tfg formed complexes in these B cells. Since Carma-1 is required for marginal zone B cell and B1 B cell development, we suggest that a functional interaction between Carma-1 and Tfg contributes to development and maintenance of these cells by means of canonical NF-KB signals.
Chromosomale Aberrationen des humanen MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia) sind mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert. 5-10% aller akuten myeloischen und lymphatischen Leukämien beruhen auf einer Translokation des MLL Gens mit einem von mehr als 50 bekannten Partnergenen. Die reziproke Translokation t(4;11), die zur Entstehung der zwei Fusionsgene MLL/AF4 und AF4/MLL führt, stellt die häufigste genetische Veränderung des MLL Gens dar und prägt sich in Form einer akuten lymphatischen Leukämie aus. Besonders häufig sind von dieser Erkrankung Kleinkinder und Patienten mit einer Sekundärleukämie betroffen. Aufgrund einer ungewöhnlich hohen Resistenz der leukämischen Blasten gegenüber gängigen Therapie-Protokollen ist diese Erkrankung mit einer schlechten Prognose verbunden. Die beiden erzeugten Fusionsgene der t(4;11) werden als Fusionsproteine MLL/AF4 (der11) und AF4/MLL (der4) exprimiert. Transduktionsexperimente verschiedener MLL Translokationen zeigten, dass in vielen Fällen das jeweilige der11 Fusionsprotein (MLL_N/Translokationspartner) starkes onkogenes Potential besitzt und daher vermutlich ursächlich für die Transformation der betroffenen Zellen ist. Im Fall der Translokation t(4;11) hingegen, konnte für das der11 Fusionsprotein MLL/AF4 nur sehr schwaches onkogenes Potential nachgewiesen werden, während das der4 AF4/MLL Fusionsprotein sich als potentes Onkoprotein herausstellte. Untersuchungen zur Aufklärung des pathologischen Mechanismus des AF4/MLL Fusionsproteins zeigten, dass es, analog zum MLL Wildtyp Protein, einer Prozessierung durch die Taspase 1 unterliegt. Desweiteren ist bekannt, dass die gebildeten Proteinfragmente, der4_N und der4_C (MLL_C), über intramolekulare Interaktionsdomänen des MLL Proteins, in der Lage sind miteinander zu komplexieren. In der unprozessierten Form wird das Fusionsprotein über einen Bereich des AF4 Proteins unter Einsatz der E3-Ligasen SIAH 1/2 dem proteasomalen Abbau zugeführt. Nach der Proteolyse und Komplexbildung findet weiterhin eine Erkennung durch die SIAH Proteine statt, jedoch erfolgt keine Degradation mehr. Auf diese Weise kommt es zur Akkumulation des Komplexes, was letztendlich zur Transformation der betroffenen Zellen führt. Eine Möglichkeit dem onkogenen Charakter des AF4/MLL Fusionsproteins entgegen zu wirken, besteht in der Inhibition der Interaktion der zwei Proteinfragmente der4_N und der4_C (=MLL_C). Für eine mögliche Inhibition stellt die Kenntnis der minimalen Kontaktdomäne des MLL Proteins (und damit gleichermaßen des AF4/MLL Proteins) eine Grundvoraussetzung dar. Die grundlegende Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand daher in der Bestimmung des minimalen intramolekularen Interaktionsinterface. Zu diesem Zweck wurden Interaktionsanalysen verschiedener C-terminaler und N-terminaler MLL Proteinfragmente unter Verwendung des bakteriellen Zwei-Hybrid-Systems sowie eines zellbasierten Protein-Translokation-Biosensor-Systems durchgeführt. Dabei ist es gelungen, die Größe der minimalen Interaktionsdomänen von den bis heute publizierten >150 Aminosäuren auf 58 Aminosäuren im N-terminalen Proteinfragment (FYRN_A3) bzw. 56 Aminosäuren im C-terminalen MLL Fragment (FYRC_B3) einzugrenzen. Eine weitere Verkleinerung führte zu einem Stabilitätsverlust der Interaktion. Eine ungewöhnliche Akkumulation einiger C-terminaler MLL Fragmente, die während der Interaktionsstudien beobachtet wurde, führte zu der Hypothese, dass die generierten Fragmente mit dem zellulären Wildtyp MLL interagieren und möglicherweise als Inhibitor der intramolekularen Interaktion agieren können. Zusätzlich wurde bei diesen Transfektionen eine abnorm hohe Anzahl abgestorbener Zellen festgestellt. Dies wäre damit zu erklären, dass das zelluläre MLL, durch Interaktion mit dem kleinen MLL Fragment, nicht mehr in der Lage ist, seinen natürlichen Funktionen nachzukommen. Der Nachweis der Interaktion des minimierten C-terminalen MLL Proteinfragments FYRC_B3 mit den full length Proteinen MLL sowie AF4/MLL konnte über Co-Immunopräzipitationsversuche erbracht werden. Durchflusscytometrische Analysen transfizierter und Propidiumiodid gefärbter HeLa Zellen sowie t(4;11)-positiver SEM Zellen zeigten eindeutig letale Effekte einiger FYRC-Fragmente auf. Anhand dieser Daten kann postuliert werden, dass die Fragmente FYRB_B3 und FYRC_B1 durch Interaktion mit MLL_N bzw. der4_N die Interaktion der nativen Proteinfragmente MLL_N/der4_N mit MLL_C verhindern und dies in der Folge zum Absterben der Zellen führt. Die Tatsache, dass diese Fragmente einen solch deutlichen Effekt auf die sehr therapieresistenten SEM Zellen haben, zeigt, dass die Inhibierung der intramolekularen Proteininteraktion einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz für Leukämien mit einer Translokation t(4;11) darstellt.
Many highly active antitumour agents are currently not employable for the systemic chemotherapy of brain tumours since their entrance into the brain is blocked by the BBB. Obviously, the development of a strategy allowing effective delivery of these agents across the BBB would enormously extend the potential of the systemic chemotherapy. Chemotherapy of rat glioblastoma using nanoparticle-bound doxorubicin Doxorubicin bound to polysorbate-coated nanoparticles had been previously shown to significantly enhance survival in the orthotopic rat 101/8 glioblastoma model. The objective of this study was to investigate the therapeutic effects of this formulation by morphometric, histological and immunohistological methods. The 101/8 glioblastoma was implanted intracranially into the male Wistar rats. The animals were randomly divided into 3 groups; one group served as untreated control (n = 20). The second group received doxorubicin in solution (Dox-sol, n = 18), and the third group received doxorubicin bound to PBCA nanoparticles coated with PS 80 (Dox-NP + PS 80, n = 18). The treatment regimen was 3 × 1.5 mg/kg on days 2, 5, and 8 after tumor implantation. The formulations were injected into the tail vein. The untreated control animals were sacrificed on days 6, 8, 10, 12, and 14 after the implantation. The animals that had received chemotherapy were sacrificed on day 10, 14 and 18 after the implantation. The brains were investigated by morphometrical, histochemical, and immunohistochemical methods such as the measurement of the tumor size, proliferation of tumor cells, vessel density, expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP), expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), incidence and dimension of necrosis, and microvascular proliferation. Tumours showed signs of malignancy including invasion to brain tissue and brisk mitotic activity. The tumor proliferation remained stable at high levels throughout the host survival time. Overall, the tumor showed a reproducible growth pattern and temporal development that is comparable to human glioblastoma. Furthermore, the 101/8 glioblastoma had infiltrated diffusely the surrounding host brain at the edge of the solid tumor mass showed no signs of encapsulation. Thus the 101/8 glioblastoma fulfills the most criteria for an adequate glioma model and can be qualified as a reliable model. ...
Taspase1 stellt die bisher einzige Typ2-Asparaginase mit proteolytischer Aktivität dar. Das wichtigste Substrat der Taspase1 ist das MLL-Protein, einem Homolog des Trithorax- Proteins aus Drosophila melanogaster, das auch dort eine wichtige Rolle bei Differenzierungsprozessen spielt. Bei Patienten mit einer t(4;11)-Translokation ist Taspase1 maßgeblich an der Ausbildung einer t(4;11)-assoziierten Leukämie beteiligt. Die Inhibierung der proteolytischen Aktivität der Taspase1 könnte daher einen Ansatzpunkt für eine neuartige Krebstherapie darstellen. Aufgrund der ungewöhnlichen Eigenschaften von Taspase1 ist es bisher nicht gelungen einen selektiven Inhibitor für das katalytische Zentrum der Taspase1 zu identifizieren. Unter nativen Bedingungen (ca. 50 mM NaCl) befindet sich Taspase1 bereits in einem nahezu vollständig inhibierten Zustand, da im katalytischen Zentrum der Taspase1 ein Chloridion komplexiert ist. Dieses Chloridion wird einzig und allein nach Interaktion mit dem natürlichen Substrat MLL aus dem katalytischen Zentrum verdrängt, was zu einer kurzfristigen Aktivierung der Taspase1 führt. Nach Ablauf der hydrolytischen Spaltung des Substrates nimmt das Chloridion wieder seine Position im katalytischen Zentrum ein. Unter diesen Bedingungen ist aus sterischen Gründen die Bindung eines potentiellen Inhibitors im katalytischen Zentrum nicht möglich. Durch Herstellung von Mutanten der Taspase1 und deren Substrats konnte der Mechanismus der katalytischen Spaltung durch Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei erwiesen sich drei Aminoäuren als essentiell für die Hydrolyse. Interessanterweise ist die Anwesenheit des Substrates, insbesondere des Aspartates an Position Sieben der cleavage sites CS1 bzw. CS2 notwendig um den katalytischen Prozess zu starten. Das negativ geladene Aspartat, verdrängt zunächst das Chloridion von seiner Position und aktiviert dadurch das katalytische Zentrum (Rotation von Threonin 234). Erst dadurch wird Threonin 234 zu einer katalytisch aktiven Aminosäure und kann einen nukleophilen Angriff auf die Peptidbindung zwischen Aspartat und Glycin des Substrates durchführen. Die Hydrolyse wird dabei durch die OH-Gruppe des Serins 252 durch Wechselwirkung mit dem Carboxylsauerstoff unterstützt. Durch Mutation beider Aspartate an Position sieben im artifiziellen Substrat 2CL zu Glycin oder Lysin führte zu einem vollständigen Verlust der hydrolytischen Spaltung an CS1 und zu einem starken Rückgang der hydrolytischen Spaltung an CS2. Die Mutationen T234D und S252D der Taspase1 führten beide zum vollständigen Verlust der katalytischen Spaltung, sowohl in cis, als auch in trans. Unter Verwendung des Taspase1-Aktivitätsassays konnte der transkriptionelle Regulator MLL4 als potentielles Substrat der Taspase1 identifiziert werden.
Glutamat ist einer der wichtigsten erregenden Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (ZNS), der unter anderem metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) aktiviert. Die Signalübertragung der mGluRs erfolgt indirekt durch Aktivierung intrazellulär gekoppelter heterotrimerer G-Proteine, die daraufhin zelluläre Signalprozesse beeinflussen. Es sind acht verschiedene mGluRs bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, ihrer Struktur und ihren pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden. Die hauptsächlich präsynaptisch lokalisierten Gruppe III mGluRs sind an der Regulation der Neurotransmission an exzitatorischen Synapsen beteiligt. Sie fungieren als Autorezeptoren, die rückkoppelnd die Glutamatausschüttung hemmen. Um eine möglichst exakte Übersetzung der extrazellulären Glutamatsignale durch mGluRs zu gewährleisten, muss die Signaltransduktion dieser Rezeptoren sehr genau kontrolliert und reguliert werden. Als Regulatoren der Signalübertragung verschiedener G-Protein gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) haben sich Vertreter der RGS-(Regulators of G protein Signalling)-Proteinfamilie erwiesen. RGS-Proteine können direkten Einfluss auf die Kinetik der Signalübermittlung eines GPCRs nehmen. RGS-Proteine beschleunigen mittels ihrer GAP (GTPase Accelerating Protein)-Funktion die GTP-Hydrolyse, wodurch die Geschwindigkeit der Inaktivierung der Ga-Untereinheit und somit der Signalantwort des GPCRs deutlich erhöht wird. Bis heute wurden mehr als 30 verschiedene RGS-Proteine beschrieben, die alle eine konservierte RGS-Domäne besitzen, die die Bindung an die Ga-Untereinheit des G-Proteins und die GAP-Aktivität vermittelt. Für einige GPCRs wurde bereits eine spezifische und selektive Interaktion sowie Regulation durch bestimmte RGS-Proteine gezeigt. An Gruppe III mGluRs gab es bisher keine einschlägigen Untersuchungen, außer am in der Retina exprimierten mGluR6, der jedoch einen Sonderfall innerhalb dieser Rezeptorgruppe darstellt. Deshalb sollte in dieser Dissertation untersucht werden, ob Gruppe III mGluRs, mit besonderem Augenmerk auf eine der zwei bekannten Spleißvarianten des mGluR7 (mGluR7a), durch ein oder auch mehrere Mitglieder der RGS-Familie reguliert werden können. Zwei Vertreter der RGS-Protein Familie, RGS3 und RGS4, die beide im Gehirn exprimiert werden, wurden als potentielle Kandidaten ausgewählt. Biochemische Interaktionsanalysen dieser Dissertation zeigten, dass sowohl RGS3 als auch RGS4 direkt an mGluR7a binden. Die Bindung zwischen mGluR7a und RGS3 bzw. RGS4 war in Abwesenheit von Ca2+ deutlich verstärkt. Da Calmodulin (CaM) in Anwesenheit von Ca2+ sowohl an mGluR7a als auch an RGS3 und RGS4 bindet, wurde postuliert, dass gebundenes Ca2+/CaM ein räumliches Hindernis für die Wechselwirkung zwischen Rezeptor und RGS-Protein darstellen könnte. Die Daten dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Bindung von Ca2+/CaM an den C-Terminus des mGluR7a die Interaktion zwischen dem Rezeptor und RGS4 abschwächt. Ein physiologischer Effekt der beiden RGS-Proteine auf die mGluR7a-vermittelte Signalübermittlung wurde zunächst in transfizierten HEK-Zellen nachgewiesen. Hierzu wurde die Signalantwort des mGluR7a in An- und Abwesenheit von RGS3 oder RGS4 durch Bestimmung der Menge der sekundären Botenstoffe gemessen und verglichen. RGS3 sowie RGS4 beschleunigten in diesem System durch ihre GAP-Aktivität die GTP-Hydrolyse an der Ga-UE und damit die Inaktivierung der Signaltransduktion des Rezeptors. Mittels hochauflösender Elektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass RGS3 und RGS4 wie auch mGluR7a in vivo an der präsynaptischen Membran kortikaler Maus-Neuronen zu finden sind. Da die Proteine in den Nervenzellen kolokalisieren, sollte die Interaktion und Regulation, die in vitro nachgewiesen wurde, auch in vivo möglich sein. Ein in vivo-Nachweis des regulatorischen Effektes von RGS4 auf die Signaltransduktion der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a erfolgte durch Vergleich der Signalantworten dieser Rezeptoren in kultivierten kortikalen Neuronen aus Wildtyp- und RGS4-defizienten Mäusen. Mit dem Gruppe III mGluR-spezifischen Agonisten L-AP4 konnte im Vergleich zu den Wildtyp-Neuronen keine Antwort der mGluRs in den RGS4-defizienten Nervenzellen gemessen werden. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass die Signalübermittlung der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a ohne das RGS4-Protein nicht korrekt ablaufen kann. Zusammenfassend kann mit den Daten der vorliegenden Arbeit das bereits bestehende Modell eines mGluR7a-Signalkomplexes erweitert werden: Dabei bildet der Rezeptor bereits vor Stimulation durch einen Agonisten einen Komplex mit dem G-Protein und nachgeschalteten Effektoren, die durch den Rezeptor beeinflusst werden. Durch eine solche lokale Organisation funktionell zusammengehöriger Proteine, die die Initiation (wie das G-Protein) und Termination (wie die RGS-Proteine) der Signaltransduktion bewirken, wird eine schnelle und feinregulierte Signalübermittlung gewährleistet.
Ziel dieser Arbeit war es, die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf Leukämiezellen von pädiatrischen Patienten mit Akuten Leukämien zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in vitro und erste in vivo Untersuchungen durchgeführt: 1. In vitro Untersuchungen Zuerst wurde eine durchflusszytometrische Methode optimiert zum Nachweis der Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf maligne Zellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien. Mit diesem durchflusszytometrischen Assay war es möglich, die Zytotoxizität auf maligne von der auf nicht maligne Zellen zu unterscheiden. Dies war unerlässlich, da in den frisch isolierten Leukämiezellen der Patienten bis zu 55% normale Lymphozyten enthalten waren. Darüber hinaus erlaubte diese Methode die simultane Bestimmung der Zell-Apoptose in jeder Probe. An Leukämie-Zelllinien wurde dieser multiparametrische Assay anschließend mit dem MTT-Assay verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Bestimmung von Zytotoxizitäten mit beiden Methoden an den Zelllinien Molt 4/8 und H9 gut korrelierte (r≥0,95). Für das Arbeiten mit Patientenmaterial wurde ausschließlich die durchflusszytometrische Methode angewendet, da in den Proben der Patienten die Differenzierung zwischen leukemischen Zellen und normalen Lymphozyten essentiell war. In den Leukämie-Zelllinien Molt4/8, H9 und K562 zeigte sich, dass Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität zeigte als Busulfan. In die Untersuchungen frischer Leukämiezellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien konnten 24 Proben unterschiedlicher Leukämien (cALL, reife B-ALL, reife TALL, AML) und unterschiedlicher Erkrankungszeitpunkte (bei Diagnose oder bei Rezidiv) eingeschlossen werden. In diesen Proben zeigte Treosulfan eine deutlich bessere Wirkung als Busulfan. Es wurde trotz des kleinen Patientenkollektivs deutlich, dass die T-ALL gegenüber der cALL sensitiver auf Treosulfan reagiert. Außerdem war die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan gegenüber der T-ALL signifikant höher als gegenüber c-ALL (Treosulfan: p=0,02, Busulfan: p=0,03). Die IC50-Werte stiegen vom Zeitpunkt der Diagnose (Median: Treosulfan: 11,45 μM, Busulfan: 96,45 μM) über die Progression (Median: Treosulfan: 45,95 μM, Busulfan: 253,75 μM) bis zum Rezidiv (Median: Treosulfan: 153,15 μM, Busulfan: 223,3 μM) hin an, und zwar um das 8-fache bei Treosulfan und das 2,5-fache bei Busulfan. Der Unterschied der Zytotoxizität von Treosulfan auf Leukämieproben zum Zeitpunkt der Diagnose gegenüber dem Rezidiv war statistisch signifikant (p=0,02). Für Busulfan ergab sich für diese Untersuchungszeitpunkte keinen signifikanten Unterschied (p=0,13). Vergleichend zu den Ergebnissen an frisch isolierten Leukämiezellen wurde die Wirkung von Treosulfan und Busulfan auf normale Lymphozytensubpopulationen und Stammzellen untersucht. Auch hier zeigte Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität im Vergleich zu Busulfan. Insgesamt reagierten normale Lymphozyten sensitiver auf die Alkylanzien im Vergleich zu den Leukämiezellen (Mediane IC50-Werte für Treosulfan und Busulfan auf Lymphozyten: 12,3 μM und 89,9 μM, auf Leukämieproben: 30,6 μM und 133 μM mit p=0,03 und p=0,02). In einem weiteren Experiment sollte die Interaktion von Treosulfan und Busulfan mit Fludarabin untersucht werden. Fludarabin ist ein Purin-Analogon, das in der Pädiatrie in Kombination mit Alkylanzien zur Chemo-Konditionierung eingesetzt wird. Bei der Inkubation von Fludarabin mit Treosulfan-Konzentration größer 1 μM war ein deutlicher Synergismus zu verzeichnen. Die Kombination von Fludarabin mit Busulfan ergab Antagonismus. 2. In vivo Untersuchungen Es wurde die zelluläre Immunrekonstitution bei pädiatrischen Patienten mit AML (n=9) nach allogener Knochenmarktransplantation überwacht. Ein Patient wurde mit Treosulfan konditioniert (n=1), die anderen Patienten (n=8) erhielten Busulfan zur Konditionierung. Die Rekonstitution der Leukozyten, B-Zellen, NK-Zellen und T-Helferzellen verlief in beiden Gruppen ähnlich. Ein signifikanter Unnterschied konnte für die Rekonstitution der CD3+CD8+ zytotoxischen T-Zellen gezeigt werden, die bei dem Patienten, der mit Treosulfan konditioniert wurde, signifikant niedriger war im Vergleich zur Busulfangruppe. Da bei dem Patienten, der Treosulfan erhielt, die CRP-Werte über einen längeren Zeitraum erhöht waren und Infektionen die Rekonstitution von zytotoxischen T-Zellen maßgeblich beeinflussen, bietet dies eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied. Aussagen können jedoch nur mit einem größeren Patientenkollektiv getroffen werden.
Der zur Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren gehörende N-Methyl-DAspartat (NMDA)-Rezeptor ist maßgeblich an der Weiterleitung erregender Signale zwischen Nervenzellen beteiligt. Er spielt sowohl physiologisch bei z.B. Vorgängen des Lernens oder der Gedächtnisbildung, als auch pathophysiologisch bei neurologischen Erkrankungen eine entscheidende Rolle. NMDA-Rezeptoren sind tetramere Membranproteine, welche aus den homologen NR1-, NR2A-NR2D- sowie NR3A- und NR3B-Untereinheiten aufgebaut sind. Die Untereinheiten sind modular aus jeweils vier verschiedenen Domänen aufgebaut, die spezifische Rollen beim Aufbau und der Funktion der Rezeptoren erfüllen. Konventionelle NR1/NR2-NMDA-Rezeptoren bestehen aus zwei Glyzin-bindenden NR1- und zwei Glutamat-bindenden NR2-Untereinheiten. Sie werden nur durch gleichzeitiges Binden der Agonisten Glutamat und Glyzin effizient aktiviert. Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Einfluss der extrazellulären N-terminalen Domänen (NTDs) auf die Assemblierung, Funktion und allosterische Modulation von rekombinanten NR1/NR2 NMDA-Rezeptoren mittels biochemischer und elektrophysiologischer Methoden zu untersuchen. Deletionsexperimente zeigten, dass die NTDs von NR1- und NR2A- bzw. NR2B-Untereinheiten die hochaffine, allosterische Zn2+- und Ifenprodil-Hemmung bestimmen, nicht aber für die Bildung funktioneller Rezeptoren von Bedeutung sind. Die NR2-NTDs stellen zusätzlich eine entscheidende strukturelle Determinate für die unterschiedliche Glyzinaffinität von NR1/NR2A- und NR1/NR2B-Rezeptoren dar. Ein zweiter Aspekt war die funktionelle Charakterisierung von NMDA-Rezeptoren, welche aus NR1- und NR3-Untereinheiten aufgebaut sind. Diese exzitatorischen NR1/NR3-Rezeptoren werden ausschließlich durch den Neurotransmitter Glyzin aktiviert und generieren nur sehr kleine Agonistaktivierte Ströme im Vergleich zu NMDA-Rezeptoren vom NR1/NR2-Typ. Es wurde gefunden, dass die Glyzinbindung an die NR1- und NR3-Ligandenbindungsdomänen (LBDs) entgegengesetzte Wirkungen auf die Rezeptorfunktion zur Folge hat. Während die NR3-LBD essentiell für die Aktivierung des Rezeptors ist, bewirkt Glyzin über die NR1-LBD eine Hemmung der NR1/NR3-Rezeptoren. Das erklärt die geringe Effizienz der Rezeptoraktivierung durch Glyzin. Weiterhin zeigen die Ergebnisse zum ersten Mal, dass Zn2+ an diesen Rezeptoren als Agonist und positiver Modulator wirkt und in Kombination mit einem NR1-Antagonisten die Glyzin-aktivierten Ströme >120-fach in supralinearer Weise potenzieren kann. Mutationsanalysen ergaben, dass die NR1-LBD für die Zn2+-Aktivierung und –Potenzierung verantwortlich ist. Da die physiologische Rolle von NR1/NR3-Rezeptoren noch nicht eindeutig geklärt ist, könnte die supralineare Potenzierung eine Strategie darstellen, diesen unkonventionellen NMDA-Rezeptor in zukünftigen Untersuchungen besser zu detektieren und zu charakterisieren. Zusammenfassend liefern die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zu Struktur-Funktionsbeziehungen in NMDA-Rezeptoren auf Ebene der NTDs und LBDs einen wichtigen Beitrag für das Verständnis der Pharmakologie dieser Rezeptorfamilie. Diese Ergebnisse können für die Entwicklung neuer neurologischer Therapeutika genutzt werden.
Der Extrakt des indischen Weihrauchs (Boswellia serrata) ist eines der wenigen pflanzlichen Heilmittel, dem von der EMEA der Orphan Drug Status zur Behandlung des peritumoralen Hirnödems verliehen wurde. Boswellia serrata Extrakt und die Boswelliasäuren, die wirksamen Inhaltsstoffe des Weihrauchs, zeigten in zahlreichen in vitro-Untersuchungen antiinflammatorische und antitumorale Wirksamkeit. Diese Wirkungen konnten auch in mehreren klinischen Studien nachgewiesen werden. Untersuchungen zum pharmakokinetischen Verhalten der Boswelliasäuren zeigten, dass Weihrauch nur eine geringe orale Bioverfügbarkeit aufweist. Ziel der Arbeit war es daher, den Einfluss von Löslichkeit, Metabolismus und Permeabilität auf die Bioverfügbarkeit der Boswelliasäuren zu untersuchen. Weihrauchextrakte sind in wässrigen Medien schlecht löslich. In einer Rattenstudie wurde deshalb untersucht, inwieweit die verbesserte Löslichkeit des Extrakts in einer nanoskaligen Boswellia serrata Formulierung zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit führt. Eine bestehende LC-MS-Methode zur Bestimmung von KBA und AKBA aus Plasma und Hirngewebe wurde optimiert und revalidiert. Zur Vervollständigung des pharmakokinetischen Profils wurden die KBA- und AKBA-Konzentrationen auch in der Leber der Ratten bestimmt. Die analytische Methode wurde hierfür nach den anerkannten FDA-Richtlinien erfolgreich validiert. Die Plasma- und Leberkonzentrationen waren jedoch bei den Ratten, die die nanoskalige Boswellia serrata Formulierung bekamen, in den ersten Stunden nach der oralen Verabreichung nicht signifikant höher als bei den Ratten, die den unbehandelten Extrakt erhielten. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur metabolischen Stabilität von KBA und AKBA in Rattenlebermikrosomen (RLM), Humanlebermikrosomen (HLM) und Rattenhepatozyten (RH) zeigten, dass KBA einer stark ausgeprägten hepatischen Metabolisierung unterliegt. AKBA hingegen erscheint metabolisch relativ stabil. Die Identifizierung der Metabolite ergab, dass Boswelliasäuren in RLM hauptsächlich Phase-I-Metabolite wie mono-, di-, und seltener auch trihydroxylierte Metabolite bilden. Von AaBA und AbBA konnten keine Metabolite detektiert werden. Das metabolische Profil von KBA und AKBA in RH war mit dem in RLM vergleichbar. In einer Rattenstudie konnten dann im Plasma und in der Leber jedoch nicht im Hirn der Ratten KBA-Metabolite nachgewiesen werden, während für AKBA in vivo keine Metabolite detektiert wurden. Phase-II-Metabolite konnten weder von KBA noch von AKBA nachgewiesen werden. Bisher war man davon ausgegangen, dass die niedrigen Plasmakonzentrationen von AKBA in vivo durch eine Deacetylierung zu KBA zustande kommen. Diese These konnte im Rahmen dieser Arbeit widerlegt werden. Im Caco-2-Zellmodell zeigte KBA eine mittlere Permeabilität. Es konnte gezeigt werden, dass KBA und AKBA offensichtlich keinem Efflux-Transport unterliegen. AKBA erwies sich sowohl in absorptiver und sekretorischer Richtung als auch bei 4° C als schlecht permeabel. Da KBA und AKBA die Aktivität des ABC-Transportproteins Pgp modulieren, wurde in dieser Arbeit überprüft, ob diese beiden Boswelliasäuren auch Substrate des Pgp sind. Die Permeation von KBA und AKBA war in Anwesenheit des Pgp-Inhibitors Verapamil jedoch nicht signifikant verändert, was darauf hindeutet, dass KBA und AKBA keine Pgp-Substrate sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden einen wichtigen Baustein zur weiteren Aufklärung des pharmakokinetischen Verhaltens von KBA und AKBA. So ist die begrenzte systemische Verfügbarkeit von KBA auf eine mittlere Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt in Kombination mit der umfangreichen hepatischen Metabolisierung zurückzuführen. Die niedrigen systemischen Konzentrationen von AKBA hingegen liegen eher in der schlechten Absorption begründet. Auf der Basis der extensiven Metabolisierung von KBA und der schlechten Permeabilität von AKBA stellt sich im Allgemeinen die Frage nach dem tatsächlichen Wirkmechanismus von KBA und AKBA. In keiner pharmakokinetischen Studie konnten die in vitro pharmakologisch aktiven Konzentrationen dieser beiden Boswelliasäuren erzielt werden. Es ist daher nicht auszuschließen, dass auch andere Wirkmechanismen als die bisher beschriebenen existieren. Unter dem Gesichtspunkt möglicher Arzneimittelinteraktionen wurde die Wirkung von KBA und AKBA auf MRP2 und OATP1B3 in zwei zellbasierten Assays untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass KBA und AKBA die Aktivität von MRP2 und OATP1B3 in Konzentrationen modulieren, welche im Rahmen dieser Arbeit in der Leber von Ratten nachgewiesen wurden. Da Weihrauchextrakt häufig in Comedikation verwendet wird, sollte im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit in Zukunft geprüft werden, ob es zu praxisrelevanten Arzneimittelinteraktionen mit klinisch relevanten MRP2- und OATP1B3-Substraten kommt.
Cytochrome P450 epoxygenases of the 2C family (CYP2C) are highly expressed in the endothelium and metabolize arachidonic acid to different regioisomers of epoxyeicosatrienoic acids (EET). They have a number of roles in the regulation of vascular tone and homeostasis by activating different signal transduction pathways and have recently been reported to be involved in proliferation and angiogenesis. However, the exact mechanisms by which epoxygenases regulate angiogenesis are still unclear. Therefore, the initial aim of the present study was to characterize the relevance of major signalling molecules that are involved in angiogenesis and to investigate possible signalling pathways involved. Initially the effect of CYP2C9 overexpression on expression levels of EphB4, a tyrosine kinase that plays a role in a number of developmental processes, was investigated. EphB4 protein expression was increased in CYP2C9 overexpressing cells without any effects on expression levels of its ligand ephrinB2. To clarify whether EphB4 is a critical determinant of CYP2C9-induced angiogenesis, endothelial cell sprouting was assessed using a collagen gel-based in vitro angiogenesis assay. Following transfection with EphB4 antisense or scrambled oligonucleotides, capillary-like structures were clearly present after 24 hours in cells overexpressing CYP2C9, while EphB4 downregulation abolished CYP2C9-induced sprouting. In addition stimulation of human umbilical vein endothelial cells with VEGF resulted in an increase in CYP2C expression and a subsequent increase of 11,12-EET production; an effect that was abolished by the CYP epoxygenases inhibitor MSPPOH as well as when cells were infected with a dominant negative mutant of AMPK. In vivo 11,12-EET treatment increased EphB4 expression in mesenteric arteries as well as in Matrigel plugs; an effect that was abolished when plugs were impregnated at the same time with small interfering RNA (siRNA) for EphB4. Furthermore, impregnation of Matrigel plugs with VEGF resulted in endothelial cell and smooth muscle cell recruitment into a Matrigel plug and this effect was mediated by CYP2C9-derived EETs as it was prevented by 14,15-EEZE. When infiltration of EET impregnated plugs with endothelial cells and pericytes/smooth muscle cells in vivo was compared to the effects seen in VEGF treated plugs, it was apparent that only EET treatment resulted in the formation of tube like structures that were covered by smooth muscle cells. Therefore, the final aim of the study was to further define the consequences of EET signalling in vivo as well as to characterize its physiological relevance. This hypothesis could be assessed by isolectin injection through the tail-vein where isolectin was taken up only by the EET-impregnated plug. Moreover ultrasound measurements revealed accumulation of contrast agent in EET impregnated plugs compared to control plugs. Taken together our findings emphasize that CYP2C plays a crucial role in the vessel formation process by modulating the effects mediated by two important control elements of the angiogenic response, namely VEGF and EphB4. CYP2C-derived EETs not only participate as second messengers in the angiogenic response, but have the potential to influence much more than angiogenesis by enhancing smooth muscle cell/pericyte recruitment to endothelial cell tubes to promote vascular maturation.
In this thesis I have investigated the regulation of eicosanoid synthesizing-enzymes by cannabinoid receptor agonists. Rat renal mesangial cells were used as a model system. I could show that all three (CB1, CB2, and GPR55) cannabinoid receptors are expressed on the mRNA level in rat renal mesangial cells – but with differing expression profiles. The CB1 and GPR55 receptors are expressed in comparable amounts, whereas the CB2 receptor is considerably less expressed than the CB1 and the GPR55 receptors. Furthermore I could show that stimulation of renal mesangial cells with CB1 receptor agonists, such as R(+)MA or ACEA, increased IL-1β-induced cPLA2, sPLA2-IIa, and COX2 protein and mRNA expression which subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Additionally, the IL-1β- induced sPLA2-IIa promoter activity was also increased by CB1 receptor stimulation. Besides the modulated expression of the eicosanoid synthesizing enzymes, I could show that CB1 agonists also led to an increase of IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation. In contrast, stimulation with CB2 selective agonists led to a decrease in IL-1β- induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. Accordingly, the IL-1β-induced sPLA2-IIa promoter activity was also reduced by CB2 receptor agonists. IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation were not influenced by CB2 recptor activation. Matching the results I obtained with CB1 receptor agonists on IL-1β-induced PGE2 formation, I could observe an increased cPLA2 protein and mRNA expression with a subsequent increase in IL-1β-induced PGE2 formation by GPR55 stimulation. Stimulation with THC, an unselective CB agonist, increased the IL-1β-induced sPLA2-IIa protein expression and subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Subjecting the cells to higher THC concentrations surprisingly led to a reduction of the IL-1b-induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. A possible explanation may be the differential expression of the three CB receptors. At low concentrations THC may predominantly activate CB1 and GPR55 and with increasing concentration CB2 receptors may also be activated, slightly reversing the enhancing effect. Moreover, I could show that the CB1 receptor stimulation mediated phosphorylation and hence the activation of ERK1/2 MAPK. Additionally to ERK1/2, there was also a phosphorylation and activation of NFkB observed by CB1 receptor stimulation. In my thesis I could show for the first time that PPARα was activated by IL-1β in rMC. The IL-1β-induced PPARα promoter activity was completely inhibited by addition of the CB2 receptor agonist, JWH015. These findings were confirmed by inhibition of the IL-1β-induced PGE2 formation by a PPARα antagonist (MK-886). In summary, I could show that activation of CB1 receptors in our system led to a worsening of an inflammatory condition, whereas activation of the CB2 receptors led to the complete opposite; namely a reduction of the inflammatory response by reducing the sPLA2-IIa expression and PGE2 formation. GPR55 activation did not display any alteration of inflammatory conditions, since the classical inflammatory pathway was not influenced.
Die allogene Nierentransplantation ist im Vergleich zur extrakorporalen Blutreinigung die optimale Therapie, um Patienten mit terminaler Nieren-insuffizienz eine signifikante Erhöhung der Lebenszeit bei gleichzeitig hoher Lebensqualität zu ermöglichen. Die schwerwiegendsten Komplikationen und die in Bezug auf das Transplantatüberleben limitierenden Faktoren bei einer Nieren-transplantation haben ihren Ursprung in immunologischen Prozessen. IL-18, auch bekannt als Interferon-gamma(IFN-gamma)-induzierender Faktor, ist ein proximaler Mediator in der Regulation der angeborenen sowie erworbenen Immunabwehr. Es wird konstitutiv in Zellen des Immunsystems wie Makrophagen und in verschiedenen Gewebetypen in einer inaktiven pro-Form exprimiert und bis zu seiner Aktivierung gespeichert. Aktiviertes IL 18 induziert die Bildung einer Vielzahl proinflammatorischer Mediatoren, darunter sind IFN-gamma, TNF-alpha, IL 1beta und ver-schiedene Chemokine. Gleichzeitig ist IL 18 als Kostimulator von IL-12 an der Steuerung des Gleichgewichtes der Th1- und Th2-Antwort beteiligt. Damit könnte IL-18 maßgeblich zu der Entstehung von Abstoßungsreaktionen sowie einem verzögerten Funktionsbeginn des Nierentransplantates („Delayed Graft Function“ = DGF) beitragen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Beteiligung von lokal in der menschlichen Niere exprimiertem IL-18 an immuno-logischen Prozessen prinzipiell möglich ist, da die Expression von IL-18 und weiterer für seine Funktion essentieller Komponenten auf mRNA- und Protein-ebene in der gesunden menschlichen Niere nachgewiesen wurde. Über immun-histochemische Färbungen konnte eine Lokalisation des IL-18 im distalen Tubulussystem und Sammelrohrabschnitten der Niere nachgewiesen werden. Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen von IL-18 zusammen mit Proteinen, die für einzelne Tubulus- und Sammelrohrabschnitte spezifisch sind, zeigten, dass IL-18 in den Schaltzellen des distalen Konvolutes, des Verbindungstubulus und des Sammelrohrs lokalisiert ist. Weiterhin sind die für die Aktivierung von IL-18 notwendigen Komponenten, der purinerge Rezeptor P2X7 und Caspase-1, in der Niere mit IL-18 kolokalisiert. Damit sind grundlegende Voraussetzungen für eine Aktivierung von IL-18 in diesen Bereichen gegeben. Im Zuge von Abstoßungs-reaktionen nach Nierentransplantation könnte das im Nierengewebe exprimierte IL-18 an immunologischen Vorgängen beteiligt sein. Es wurde festgestellt, dass die Menge an konstitutiv exprimiertem IL-18 in den Schaltzellen von Tubulus- und Sammelrohrabschnitten bei akuten Abstoßungen sowie bei der chronischen Allograftnephropathie im Vergleich zur gesunden Niere abnahm, gleichzeitig lagen vermehrt infiltrierende Makrophagen sowie T- und B-Lymphozyten im Nieren-parenchym vor. Diese Beobachtung lässt die Spekulation zu, dass durch eine Ausschleusung von aktivem IL-18 aus den Schaltzellen eine Immunantwort unterhalten wird, und es im Zuge dessen zu einer Infiltration von Immunzellen kommt. Durch immunhistochemische IL-18 Färbungen an Transplantatbiopsien konnte keine de novo Expression von IL-18 in Bereichen der Tubuli oder der Glomeruli bei immunologischen Komplikationen nach Nierentransplantation nachgewiesen werden. Bei der chronischen Allograftnephropathie wurde IL-18 an kleineren Blutgefäßen nachgewiesen, was für eine Beteiligung von IL-18 an atherosklerotischen Veränderungen bei dieser Diagnose spricht. Weitere Rückschlüsse auf einen Effekt des IL-18 bei Komplikationen nach Nierentransplantation sollten durch die Analyse von IL-18 Genpolymorphismen erhalten werden. Funktionelle Einzelbasenaustausch-Polymorphismen („Single Nucleotide Polymorphisms“ = SNP´s) des IL-18 Promotors scheinen sich auf die Expression von IL-18 auszuwirken und wurden für eine Beteiligung an der Entstehung oder dem Verlauf verschiedener Erkrankungen verantwortlich gemacht. In dieser Arbeit wurde durch Assoziationsanalysen und Haplotypen-analysen gezeigt, dass sich die IL-18 Promotor SNP´s 607C/A und 137G/C des Empfängers auf die Entstehung einer DGF auswirken. Der 137CC Genotyp und das -137C Allel sowie der kombinierte Genotyp -607CA und -137CC des Empfängers sind mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer DGF assoziiert. Im Gegensatz dazu scheinen sich Unterschiede in der Genexpression des IL 18, welche durch die SNP´s 607C/A und 137G/C verursacht werden, nicht auf die Entstehung von Abstoßungsreaktionen auszuwirken. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass aus dem Empfänger stammendes IL 18 sowie lokal im Spenderorgan exprimiertes IL-18 an immunologischen Komplikationen nach Nierentransplantation beteiligt sein könnte. Durch seine Stellung am Beginn von proinflammatorischen Kaskaden stellt das IL-18 ein attraktives Target für die Entwicklung neuer Immunsuppressiva dar.
Dopamin-D2- und -D3-Rezeptorliganden als pharmakologische Werkzeuge und potenzielle Arzneistoffe
(2007)
Mit der Identifizierung der D2-ähnlichen Rezeptoren D2, D3 und D4 um das Jahr 1990 herum, begann die Erforschung deren physiologischer Bedeutung und die Suche nach selektiv bindenden Liganden. Die einzelnen Rezeptorsubtypen unterscheiden sich in ihrer Struktur, chromosomalen Lokalisation, Expressionsrate, anatomischen Verteilung und intrazellulären Signalweiterleitung. Verglichen mit D2-Rezeptoren sind D3-Rezeptoren insgesamt geringer an ihrer Zahl, weisen aber ein charakteristisches Verteilungsmuster im ZNS auf. Um eine vorwiegende Wirkung über D3-Rezeptoren hervorrufen zu können, ist eine Bindungsselektivität der Liganden gegenüber D2-Rezeptoren erforderlich, durch die die unterschiedliche Häufigkeit der beiden Rezeptorsubtypen wieder ausgeglichen wird. In einer richtungsweisenden Arbeit wurde 2003 die Rolle der D3-Rezeptoren in der Therapie des Morbus Parkinson und der Entstehung von L-DOPA-induzierten Dyskinesien aufgezeigt. Neuste Untersuchungen geben valide Hinweise auf klinisch relevante neuroprotektive und neuroregenerative Effekte bei Behandlung der neurodegenerativen Erkrankung mit D3-Rezeptoragonisten. Das Rückfallrisiko ehemals Drogenabhängiger durch mit dem Suchtstoff in Zusammenhang gebrachte Umweltstimuli ist entscheidend mit dem gleichen Rezeptorsubtyp verbunden. Die mögliche Behandlung Drogenabhängiger mit D3-Rezeptorliganden wird gegenwärtig intensiv untersucht. Mangels geeigneter Tiermodelle bisher wenig erforscht ist die therapeutische Bedeutung der D3-Rezeptorliganden bei schizophrenen Erkrankungen.Möglicherweise liegt hier ein besonderes Potential in der Behandlung von Negativsymptomen. Der im Handel befindliche Arzneistoff Pramipexol (Sifrol®) diente als Leitstruktur für die Synthese zahlreicher Liganden an D2- und D3-Rezeptoren. Weitere Leitstrukturen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit identifiziert und variiert. In einem ersten Schritt wurde die Bedeutung der 2-Aminogruppe an der Thiazolstruktur des Pramipexols untersucht. Sollte diese entgegen der in der Literatur verbreiteten Ansicht für die Ligand-Rezeptorinteraktion entbehrlich sein, könnten Verbindungen mit höherer Lipophilie und damit optimierter ZNS-Gängigkeit geschaffen werden. Für das L-Etrabamin, einem 2-unsubstituierten Derivat des Pramipexols, wurde bereits 1978 in einem Patent eine dopaminerge Aktivität beschrieben. Entgegen der in der Literatur verbreiteten Auffassung konnten durch Austausch der Aminogruppe gegen verschiedene Substituenten affine Derivate des Pramipexols entwickelt werden. Darüber hinausgehende Veränderungen der Leitstruktur dienten dem Aufbau umfangreicher Struktur-Wirkungsbeziehungen. Die Entwicklung einer konvergenten Synthesestrategie ermöglichte die Darstellung einer größeren Anzahl komplexer zusammengesetzter Etrabaminderivate. Die Umsetzung von Pramipexolderivaten zu den entsprechenden Diazoniumsalzen und anschließende Reduktion mit Hypophosphoriger Säure verbesserte die Verfügbarkeit von Etrabamin und seinen Derivaten gegenüber in der Literatur beschriebenen Synthesen. Das resultierende Etrabaminderivat konnte mit Aldehyden unter Verwendung komplexer Hydride reduktiv alkyliert werden. Die Aldehyde wurden entweder durch Acetalhydrolyse oder durch SWERN-Oxidation von Alkoholen erhalten. ....
Acetaldehydaddukte an Hämoglobin werden als potentieller biochemischer Marker für Alkoholmissbrauch betrachtet, konnten aber bisher in vivo noch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Es wurden Methoden entwickelt, um Acetaldehydmodifiziertes Hämoglobin sowohl nach Inkubation in vitro als auch in humanen Blutproben nachzuweisen. Verwendung fanden sowohl chromatographische als auch elektrophoretische Trennmethoden in Kombination mit unterschiedlichen Massenspektrometern zur Detektion. Es wurden unterschiedliche Patienten- und Probandenkollektive betrachtet. Aus Blutproben von Patienten aus Alkoholentzugskliniken, von Probanden eines kontrollierten Trinkversuches und Blutproben von Personen mit moderatem Alkoholkonsumverhalten wurde versucht, modifiziertes Hämoglobin mit Alkoholkonsum zu korrelieren. Desweiteren wurden Blutproben von Kindern untersucht, bei denen keine Alkoholexposition zu erwarten war, um eventuell vorhandenes endogenes modifiziertes Hämoglobin nachzuweisen. Zusätzlich zu den Untersuchungen in vitro und in vivo wurden auch post-mortale Proben analysiert, um modifiziertes Hämoglobin mit einem prämortalem Alkoholkonsum zu korrelieren und auf mögliche andere Einflüsse, insbesondere hinsichtlich post-mortaler Parameter zu untersuchen. Modifizierte Globinketten waren nach Synthese aus Hämoglobin und Acetaldehyd zugänglich und konnten in vitro nachgewiesen werden. Hierbei zeigte sich, dass Acetaldehyd auch mehrfach kovalent an beide Hämoglobinketten binden kann. Weder mehr- noch einfach modifizierte Hämoglobinketten konnten allerdings in authentischen humanen Blutproben nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit konnte jedoch nach proteolytischem Verdau so weit gesteigert werden, dass Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide nicht nur nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd, sondern auch in authentischen Blutproben sämtlicher untersuchter Kollektive nachweisbar waren. Es wurde gezeigt, dass ein intermolekularer Austausch von Acetaldehyd nach proteolytischem Verdau zur Bildung eines Peptidadduktes am neu entstandenen N-Terminus des jeweiligen Peptides führen kann. Ein Hinweis auf andere mögliche Bindungsstellen ergab die Analyse des in vitro synthetisierten Peptides Hbα(17-31)2Ach mit zwei gebundenen Molekülen Acetaldehyd. Insgesamt konnten in authentischen Proben 10 Peptide mit Acetaldehydmodifikation, welche jeweils als chromatographisch trennbare Stereoisomere auftraten, nachgewiesen werden. Dies geht einher mit einer bereits vorgeschlagenen Bildung diastereomerer Imidazolidinonderivate. Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide waren nicht nur in Proben von Patienten und Probanden mit nachweisbarem Blutalkohol vorhanden, sondern auch in Blutproben von Alkoholikern, Studenten und Kindern ohne akuten Alkoholkonsum. Der Nachweis dieser Addukte auch ohne exogene Alkohol- oder Acetaldehydexposition lässt darauf schliessen, dass diese posttranslationale Modifikation im menschlichen Körper abläuft, Acetaldehydaddukte also auch endogen gebildet werden. Ein erhöhtes Verhältnis von modifizierten Peptiden zu deren unmodifizierten Homologen zeigte sich konzentrationsabhängig nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd in vitro. Langfristiger zurückliegender Alkoholkonsum konnte in Studien mit Patienten einer Rehabilitationseinrichtung und mit Probanden mit moderatem Alkoholkonsum nicht mit Hämoglobinaddukten korreliert werden. Erhöhte Adduktverhältnisse im Vergleich mit Proben ohne Blutalkoholkonzentration des gleichen Kollektivs konnten bei Patienten einer Alkoholentzugsklinik, in post-mortalen Proben und im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches nachgewiesen werden. Die Kinetik der Bildung und Elimination Acetaldehydmodifizierten Hämoglobins wurde sowohl anhand von Blutproben von Patienten einer Alkoholentzugsklinik untersucht, erhöhte Adduktverhältnisse waren hier nur kürzer als 5 Tage nachweisbar. Diese schnelle Elimination wurde im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches bestätigt. Hierbei fand sich ein signifikanter Anstieg Acetaldehydmodifizierter Hämoglobinpeptide bereits nach einmaligem moderatem Alkoholkonsum, welcher bereits bei Blutalkoholkonzentrationen von durchschnittlich 0,12 g/L auftrat und noch mindestens 6 Stunden, aber nicht mehr 24 Stunden nach Trinkende anhielt. Daher liegt die mögliche Anwendung dieses empfindlichen Assays im Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums. Sämtliche Peptide wurden hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität zur Identifizierung eines Alkoholkonsums sowohl in vivo als auch in post-mortalen Proben anhand unterschiedlicher Schwellenwerte untersucht. Desweiteren wurde für diese Peptide die analytische Präzision betrachtet. Als Markerpeptid eines kurzfristigen Alkoholkonsum sowohl in vivo als auch in post-mortalen Blutproben wird hierbei Hbα(32-40)Ach vorgeschlagen. Der mögliche Vorteil bei der Betrachtung dieses Peptids im Vergleich mit anderen bereits etablierten Markern zum Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums liegt in der für den Nachweis benötigten geringen Materialmenge, welche bei der Bestimmung mittels HPLC/TOF-MS 80μg Hämoglobin betrug, was etwa der Hämoglobinmenge entspricht, die in etwa 2,5 Millionen Erythrozyten, entsprechend 0,6 μl Blut enthalten ist. Denkbar ist dadurch die Bestimmung in Blutspuren, aus denen ansonsten kein Nachweis von Ethanol oder anderer Marker eines Alkoholkonsums möglich wäre, z.B. aus getrockneten Blutspuren.
Extracts of Boswellia serrata, also known as Indian frankincense, have been used to treat inflammatory diseases in the Indian ayurvedic medicine or Chinese traditional medicine (TCM) for over 3000 years, but the molecular mechanisms of the anti-inflammatory effects are still not well understood. It is obvious that the boswellic acids, the major compounds in the extracts, are responsible for the efficacy. This work employed a protein fishing technique to identify putative targets of boswellic acids at different stages within the inflammatory cascade. For fishing experiments, boswellic acids were immobilized to sepharose and incubated with cell lysates. After washing and boiling, fished proteins were separated by SDS-PAGE and analysed by MALDI-TOF-MS. CatG, DNA-PK and the protein kinase Akt were identified by protein pulldowns with immobilised BAs and characterised as selective and important targets for BAs with an IC50 in the range of physiologically achievable plasma levels up to 5 microM. In addition, the influence on several signal transductions by BAs was tested. Calcium influx, arachidonic acid release, platelet aggregation and TNFalpha-release were assayed to reveal further pharmacological effects of BAs. Celecoxib is a well-known selective COX-2 inhibitor that is in clinical use. In this work, it is demonstrated that celecoxib is also a highly potent direct 5-LO inhibitor. Celecoxib is used in arthritis and its gastro-intestinal side effects are reduced compared to non-selective NSAIDs. In patients with a familiar disposition to polyp forming, celecoxib reduced polyps and the incidence of colon cancer. Because of lowered leukotriene levels in patients under celecoxib therapy it was plausible to test whether celecoxib interferes with 5-LO. Here it is shown that the activity of 5-LO is inhibited in PMNL and cell-free assays with IC50 of 8 microM in intact cells, 20 microM with supplemented arachidonic acid and 30 microM in cell-free systems. Thus, celecoxib is a dual inhibitor of COX-2 and 5-LO. Since 2006, celecoxib has been approved as an orphan drug for the treatment of familial adenomatous polyposis. Aside from this indication, it could be useful for treatment of asthma and other diseases where 5-LO is implicated.
Eine große Anzahl pharmakologischer und klinischer Studien zeigt die Wirksamkeit des standardisierten Ginkgo biloba Extraktes EGb 761 bei vaskulären und kognitiven Stö-rungen, wie der Alzheimer-Krankheit, der vaskulären Demenz und der peripheren arte-riellen Verschlusskrankheit. Experimentelle Ergebnisse weisen darauf hin, dass Terpen-laktone und Flavonolglykoside für die meisten pharmakologischen Wirkungen von EGb 761 verantwortlich sind. Allerdings gibt es wenige Studien, die die orale Biover-fügbarkeit von Terpenlaktonen und besonders von Flavonolglykosiden aus Ginkgo bilo-ba im Blut oder Zentralnervensystem untersuchten. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Fähigkeit der Flavonoidglykosiden bzw. deren Metaboliten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden im Tierversuch an männlichen Sprague-Dawley-Ratten erforscht. Unter-sucht wurden dabei orale Einfach- und Mehrfachgaben von EGb 761 über einen Zeit-raum von 8 Tagen in den Dosierungen 100 bzw. 600 mg Extrakt pro kg Körpergewicht. Zusätzlich wurde die Verteilung der Ginkgoflavonolmetabolite in den unterschiedlichen Bereichen des Gehirns untersucht (Hippocampus, frontaler Cortex, Striatum und Klein-hirn). Zu diesem Zweck wurde eine HPLC-Fluoreszenzmethode für die Ermittlung der Plasma- und Gehirnkonzentrationen der Flavonoidmetaboliten (Derivate von Quercetin, Kämpferol und Isorhamnetin) entwickelt und validiert. In beiden Studien (Einfach- und Mehrfachgabe) wurden Flavonoidmetaboliten im Plasma und im Gehirn nachgewiesen. Dabei wurden Metaboliten in allen untersuchten Gehirnbereichen gefunden. Bei der Dosierung von 100 mg/kg war Kämpferol vorzugsweise im frontalen Cortex lokalisiert, während die anderen Flavonole in allen Regionen vergleichbare Konzentrationen auf-wiesen. Bei der höheren Dosierung von 600 mg/kg waren die Konzentrationen der Fla-vonolmetaboliten in allen Gehirnbereichen vergleichbar. Obgleich die vier untersuchten Gehirnbereiche nur 38% des gesamten Gehirns darstellten, wurden die meisten Gink-goflavonole in diesen Regionen gefunden. Im übrigen Gehirngewebe wurden nur be-grenzte Mengen von Flavonolen nachgewiesen. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass es erstmalig gelungen ist, im Tier-versuch die Bioverfügbarkeit einer der therapeutisch aktiven Substanzklassen von Ginkgo biloba - die Flavonoide - sowohl im Plasma als auch im ZNS nachzuweisen.