Analyse differentiell-gebildeter mitochondrialer Proteine während des Alterns in dem filamentösen Ascomyceten Podospora anserina und Charakterisierung der O-Methyltransferase PaMTH1

Analysis of differential formed mitochondrial proteins during ageing in the filamentous ascomycete Podospora anserina and characterization of the O-methyltransferase PaMTH1

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Eindimensionale Gelelektrophoresen Die Analyse mitochondrialer Proteine aus juvenilen und seneszenten P. anserina-Wildstämmen
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Eindimensionale Gelelektrophoresen Die Analyse mitochondrialer Proteine aus juvenilen und seneszenten P. anserina-Wildstämmen mit Hilfe von eindimensionalen SDS- und eindimensionalen Blau-Nativen-Gelelektrophoresen zeigt keine deutlichen, seneszenzspezifischen Unterschiede. Im Gegensatz dazu werden in initialen Versuchen der nicht-radioaktiven 2D-PAGE differentiell gebildete Proteine visualisiert. 2. 2D-PAGE mit radioaktiv-markierten, mitochondrialen Proteinen aus jungen und alten P. anserina-Wildstämmen In der ungerichteten Proteomanalyse wurden 29 differentiell-gebildete Proteine identifiziert und zusätzlich zahlreiche Isoformen einiger Proteine gezeigt. Von der ß-ATPase wurden modifizierte Isoformen gefunden. Außerdem wurde eine seneszenspezifisch verringerte Bildung von ROS-Abwehr-Proteinen in den Mitochondrien detektiert. Im Gegensatz dazu wurde eine größere Menge eines Chaperons gefunden, das bei der Proteinsynthese eine Rolle spielt: eine Protein-Disulfid-Isomerase, die die Umlagerung und Neubildung von Di-Sulfid-Brücken bei der Faltung von Proteinen katalysiert. Zusätzlich wurde eine erhöhte Menge des Proteins SSC1 identifiziert. Dieses gehört zur Hsp70-Hitzeschock-Proteinfamilie. Es wurde ebenfalls eine erhöhte Menge des Apoptosefaktors Cyclophilin D in den mitochondrialen Proben aus den seneszenten Wildstämmen identifiziert. Die Identifizierung dieses Proteins in Mitochondrien von P. anserina stellt neben der Charakterisierung der Metacaspasen (Hamann et al., 2007) einen weiteren Ansatzpunkt für die Apoptoseforschung in P. anserina dar. Die molekularbiologische Analyse dieses Proteins wurde aufgrund dieser Proteomanalyse im Arbeitskreis aufgenommen (Dissertation D. Brust). Ein weiteres Protein, das in stark erhöhter Menge in den Proteinisolaten identifiziert wurde, ist PaMTH1. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und die Funktion dieser neu identifizierten differentiell-gebildeten Methyltransferase während der Alterung in P. anserina mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und physiologischen Analysen untersucht. 3. Charakterisierung von PaMTH1 Im Rahmen von Northernblot-Analysen wurde gezeigt, dass die PaMth1-Transkriptmenge in drei unabhängigen alten Wildstämmen im Vergleich zu den entsprechenden jungen Wildtsämmen deutlich erhöht ist. In einer Westernblot-Analyse von Gesamtproteinen und Mitochondrien aus jungen und seneszenten Wildstämmen wird der seneszenzspezifische Anstieg der Proteinmenge verifiziert. Die genauere Einordnung von PaMTH1 in die Klasse I der Methyltransferasen und die Ergebnisse der Analyse der Substratspezifizität geben einen Hinweis auf eine Schutzfunktion durch die Verhinderung einer ROS-Entstehung unter der Beteiligung von Substanzen mit einer Catecholgruppe. Die Ergebnisse der Analyse der Modulation der PaMth1-Expression in P. anserina deuten ebenfalls auf eine Schutzwirkung von PaMTH1 hin: PaMth1-Überexpressionsstämme zeigen eine verbesserte Wuchsrate auf stress-induzierenden Medien, weniger carbonylierte Proteine und vor allem eine verlängerte Lebensspanne ohne physiologische Nachteile im Vergleich zum Wildstamm. Dagegen lebt die PaMth1-Deletionsmutante kürzer und wächst schlechter auf ROS-induzierenden Medien, sie zeigt allerdings keine erhöhte Menge von carbonylierten Proteinen im eindimensionalen „Oxyblot“. Die beobachtete Lebensspannenverkürzung der PaMth1-Deletionsmutante wird jedoch durch die Reversion dieser Stämme wieder aufgehoben, sodass die Hypothese des Schutzes vor der ROS-Generierung durch die Methylierung von Dihydroxylgruppen anhand der erhaltenen Daten unterstützt wird.
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The experiments in this work showed the following results: 1. one-dimensional SDS- and BN-PAGES The analyses of mitochondrial proteins of juvenile and senescent P. anserina wild type strains via SDS- and BN-PAGE did not 
The experiments in this work showed the following results: 1. one-dimensional SDS- and BN-PAGES The analyses of mitochondrial proteins of juvenile and senescent P. anserina wild type strains via SDS- and BN-PAGE did not show significant differences in the protein compositions. However, during initial experiments by non-radioactive 2D-PAGE, age-specific differential formed proteins were visualized. 2. 2D-PAGE using radioactive-marked, mitochondrial proteins from juvenile and senescent P. anserina wild type isolates In an unbiased proteome analysis, 29 differentially formed proteins were identified, in addition numerous isoforms of some specific proteins were shown. Modified isoforms of the ß-ATPase und an age-specific reduced formation of ROS-scavenging proteins in the mitochondria were detected. In contrast, an increased abundance of a protein-disulfide isomerase was found, which catalyses the formation of disulfide bridges during protein folding. Furthermore, an age-dependent formation of the protein SSC1 was identified, which belongs to the heat shock proteinfamily and an increased amount of the apoptosis factor cyclophilin D was detected in the samples of the old P. anserina strains. The identification of cyclophilin D constitutes a further point beside the analysis of the metacaspases in apoptosis-research in P. anserina. Based on this result of the proteome analysis, the characterization of cyclophilin D was started in our group (dissertation D. Brust). Another protein, which was also found in highly increased abundance in the protein samples of senescent wild type strains is PaMTH1. In this work, the structure and function of this newly detected age-dependent differentially formed methyltransferase in P. anserina was investigated using molecularbiological, biochemical and physiological analyses. 3. characterization of PaMTH1 By an age-related transcript analysis of RNA-samples of three independent P. anserina wild-type strains an increase of transcript levels was found to occur during ageing. In Western Blot analyses of total and mitochondrial wild-type protein extracts using an antibody against PaMTH1 the age-dependent increase in the abundance of PaMTH1 was verified. The classification of PaMTH1 as a class I-methyltransferase and the results of the analysis of the substrate specificity point to a scavenging function via the prevention of ROS-development caused by substances possessing a catechol-residue. Also the results of the modulation of the PaMth1-expression in P. anserina hint to a scavenging function of PaMTH1: PaMth1-overexpressing strains show an improved growth rate on stress-inducing media, less carbonylated proteins and most notably an elongated life span without any physiological disadvantages compared to the wild type strains. In contrast to this, the PaMth1 deletion mutant lives shorter and shows an impaired growth on ROS-inducing media. However, these strains do not show an increased amount of carbonylated protein in one-dimensional oxyblot-analyses. But the shortened life span of the deletion mutant is abandoned by the reversion of this strain, thus the hypothesis of the scavenging role against ROS-generation via a methylation of dihydroxyl groups is supported by the obtained data of this work.
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Metadaten
Author:Birgit Knab
URN:urn:nbn:de:hebis:30-85565
Referee:Heinz D. Osiewacz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/11/23
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2009/12/11
Release Date:2010/11/23
Tag:ageing ; mitochondria ; proteome analysis
SWD-Keyword:Altern ; Mitochondrium ; Proteomanalyse
HeBIS PPN:22896198X
Institutes:Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $