Synthese spingelabelter Oligonukleotide zur Abstandsmessung mittels gepulster EPR

Synthesis of spinlabeled oligonucleotides for lange range distance measurements with PELDOR

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine wirksame synthetische und spektroskopische Methode entwickelt, um Abstände in DNA- und RNA-Duplexen mittels Elektronen-Paramagnetische-Resonanz (EPR) zu messen und um in Zukunft d
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine wirksame synthetische und spektroskopische Methode entwickelt, um Abstände in DNA- und RNA-Duplexen mittels Elektronen-Paramagnetische-Resonanz (EPR) zu messen und um in Zukunft die dreidimensionale Struktur biologisch relevanter RNAs bestimmen zu können. Die Synthese von iodierten Nukleotid-Bausteinen für die Oligonukleotidsynthese, an denen mit Hilfe der Palladium katalysierten Sonogashira-Kreuzkupplung sich EPR-aktive Nitroxid-Acetylene einführen lassen, wurde erfolgreich durchgeführt. Diese Phosphoramidite sollten die folgenden Kriterien erfüllen: Alle vier Basen (A, C, G und U) sollten modifiziert werden und das eingeführte Spinlabel 2,2,5,5- Tetramethyl-3-ethinyl-pyrrolin-N-oxyl (TPA) sollte entweder in die minor oder die major groove hineinragen. Im Falle der Pyrimidine (U und C) war nur die Orientierung in die major groove möglich, da das Iodid nur am C5 eingeführt werden kann. Obwohl 5-Iodo-desoxyuridin- und 5-Iodo-uridin-phosphoramidit käuflich sind, wurden diese Bausteine selber hergestellt, wobei die iodierten Bausteine mit hohen Ausbeuten erhalten wurden. Die Synthese von 5-Iodo-cytidin erfolgte aus Cytidin, insbesondere durch die Iodierung mit Iod, Iodsäure in Essigsäure und Tetrachlorkohlenstoff. Die einzige Möglichkeit, dass das Nitroxid eine Orientierung innerhalb der minor groove annimmt, war die Derivatisierung am C2 der Purine. Der Austausch von Iodo gegen eine Aminofunktion für Guanosin war wegen des Verschwindens einer potentiellen Wasserstoffbrücke ungünstig, im Gegensatz zu Adenosin. Die Synthese von 2-Iodo-adenosin-phosphoramidit wurde durchgeführt, wobei die Amino-Gruppe am C2 eines modifizierten Guanosins durch Iod mittels einer radikalischen Reaktion mit Iod, Iodmethan und Kupferiodid substituiert wurde. Die Synthese von 7-Deaza-adenosin (7-Iodo-tubercidin) und von 7-Deaza-guanosin wurde durch eine Lewissäure katalysierte Vorbrüggen-Glykosylierung zwischen der geschützen Nukleobase und der acetylierten Ribofuranose erzielt. Die Iodierung erfolgte für das geschützte Tubercidin mit N-Iodsuccinimid, während sie für Guanosin trotz zahlreicher Versuche leider scheiterte. Da natürlich vorkommende DNA und RNA nicht paramagnetisch sind, müssen sie durch die Einführung eines Spinlabels EPR-fähig gemacht werden. Dafür wurde das Spinlabel TPA ausgewählt, da es sich mit einer hohen Stabilität und Starrheit auszeichnet. Dafür wurde zuerst die Palladium(II) katalysierte Sonogashira-Kupplung in DNA-Strängen wärend der Oligonukleotidsynthese für 5-Iodo-desoxy-uridin optimiert: Sehr reine Proben mit einem oder zwei Spinlabels in einem Strang konnten hergestellt werden. Diese Methode wurde anschließend erfolgreich auf RNA mit geringfügigen Änderungen für U, C und A übertragen, um die Ausbeute der Kupplung zu verbessern. Die benutzte Chemie hat sich als entscheidend erwiesen, da es zu berücksichtigen gilt, wie sich die Reagenzien, die bei der RNA-Festphasensynthese eingesetzt werden, auf das Spinlabel auswirken. Es wurde festgestellt, dass die Oxidationsstufe des klassischen TBDMS-Festphasenzyklus mit Iod, Pyridin und Wasser für die Reduktion eines beträchtlichen Teils des Nitroxids verantwortlich ist, insbesondere im Falle von 2-Iodo-adenosin. Deshalb wurde beschlossen, die patentierte ACE-Chemie zu verwenden, in der das Phosphor-Atom während des Festphasenzyklus mit tert-Butylperoxid in Toluol oxidiert wird. Die Synthese der geeigneten Bausteine wurde hierfür durchgeführt, 5-Iodo-uridin-phosphoramidit ist bei Dharmacon kommerziell erhältlich. Leider scheiterte die Synthese von 7-Iodo-tubercidin-phosphoramidit auf der Stufe der Einführung des Orthoesters. Auf diese Weise wurden sehr reine doppelgelabelte DNA und RNA Duplexe erhalten, deren Stabilität durch UV-Spektroskopie überprüft wurde. Der Unterschied in den Tm-Werten überstieg nicht 3,2°C für DNA und 5,1°C für RNA im Vergleich zu den unmodifizierten Duplexen. CD-Spektren wurden ebenso aufgenommen und zeigten, dass die B- bzw. A-Form erhalten blieb. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prisner wurden die Abstände zwischen den zwei Nitroxiden in den synthetisierten fünf DNA- und sechs RNA-Duplexen mit Puls-Elektron-Doppel-Resonanz (PELDOR) gemessen. Diese experimentellen Werte wurden mit den theoretischen Werten verglichen, die mit Molecular Dynamics Simulationen erhalten wurden (Arbeitskreis Stock). Die mit beiden Methoden erhaltenen Ergebnisse stimmen überein. Erfolgreich wurde auch die Synthese von reinen spingelabelten biologisch relevanten RNAs wie TAR-RNA, der vier-Wege Kreuzung IIIa,b,c des Hepatitis C Virus und dem U4-U6 Komplex des Spleißosoms im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Die größte synthetisierte RNA betrug 65 Nukleobasen. Leider konnten wegen zu hoher Flexibilität oder nicht richtiger Faltung der RNA keine definierten Abstände gefunden werden.
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An efficient synthetic and spectroscopic tool was developed to measure distances in DNA- and RNA-duplexes using EPR, and therefore to be able to study, in the future, the three-dimensional structure of RNAs of biological
An efficient synthetic and spectroscopic tool was developed to measure distances in DNA- and RNA-duplexes using EPR, and therefore to be able to study, in the future, the three-dimensional structure of RNAs of biological importance. The rigid spin label 2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolin-1-yloxyl-3-acetylene (TPA) was base and site specifically introduced into DNA and RNA through a Sonogashira palladium catalyzed cross-coupling on column. For this purpose 5-iodo-deoxyuridine, 5-iodo-uridine, 5-iodo-cytidine and 2-iodo-adenosine phosphoramidites were synthesized and incorporated into DNA and RNA-sequences respectively. We took in consideration the orientation of the nitroxide spin label in the oligonucleotides, which can be directed for duplexes either into the major (for dU, U, C and potentially for A) or into the minor groove (for A and G). 5-Iodo-deoxyuridine and 5-iodouridine-phosphoramidite are commercially available but can be easily obtained in two or three steps from 5-iodo-deoxyuridine or 5-iodouridine respectively using standard methods. The key step for the synthesis of 5-iodocytidine was the iodination of the partially protected cytidine with iodic acid and iodine. For the minor groove modification, the nucleoside 2-iodoadenosine was synthesized in four steps from guanosine. In particular, the substitution of the exocyclic amine at C2 was performed with iodine, copper iodide and methylene iodide via a radical mechanism. Protected 7-deaza-adenosine and 7-deazaguanosine were synthesized through a Vorbrüggen glycosylation between the protected nucleobase and the acetylated ribofuranose. The iodination at C7 was successfully performed with N-iodosuccinimide for 7-deaza-adenosine but failed for 7-deazaguanosine depite several attempts. Chosen for its stability and rigidity, TPA was first introduced into DNA-duplexes to optimized the palladium(II) catalysed Sonogashira cross-coupling during the solid-phase oligonucleotide synthesis. Very pure samples with one or two spin-labels could be produced. In the case of RNA, the reagents used during the automated synthesis proved to be determining, as a significant amount of nitroxide was reduced into the corresponding amine. Indeed, during the classical TBDMS-solid-phase cycle, the oxidation step, performed with iodine/pyridine/water, was partly responsible for this side-reaction. That is why the patented ACE-chemistry was chosen: in this case, the oxidation of the phosphor-atom is obtained with tert-butyl peroxide in toluene. The corresponding building blocks (2-iodo-A and 5-iodo-C) were synthesised, 5-iodo-uridine-phosphoramidite was commercially available. Unfortunately the synthesis of 7-iodo-tubercidine-phosphoramidite failed at the orthoester stage. Whether the spin label disturbs the DNA/RNA structure was checked by UV-melting and CD studies. The difference in the Tm-values did not exceed 3.2°C for DNA and 5.1°C for RNA in comparison to the unmodified strands. CD-spectra showed that the B- for DNA and A-form for RNA were conserved. In cooperation with the Prisner group, the distances between two nitroxides in the synthesized DNA and RNA duplexes were measured with pulsed electron-electron double resonance (PELDOR). The experimental values corresponded with the values obtained with molecular dynamics simulations. The synthesis of spinlabeled RNAs of biological importance, like TAR-RNA, the four-way junction IIIa,b,c of HCV or the U4-U6 complex of the spliceosom was also successfully performed. The biggest synthesized RNA contained 65 nucleobases. Unfortunately, no defined distances could be measured because of the high flexibilty of the chosen systems.
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Metadaten
Author:Nelly Piton
URN:urn:nbn:de:hebis:30-49979
Referee:Joachim W. Engels
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/12/01
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2007/10/19
Release Date:2010/12/01
Tag:DNA; PELDOR; RNA
site-directed spinlabeling
SWD-Keyword:Elektronenspinresonanz ; Nitroxylradikal; Oligonucleotide
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

$Rev: 11761 $