Open Access

Laura-Varenne Wilk

• Plants absorb sunlight via photosynthetic pigments and convert light energy intochemical energy in the process of photosynthesis. These pigments are mainly bound to antenna protein complexes that funnel the excitation energy to the photosynthetic reaction centres. The peripheral antenna of plant photosystem II (PSII) consists of the major light-harvesting complex of PSII (LHC-II) and the minor LHCs CP29, CP26 and CP24. Light intensity can change frequently and plants need to adapt to high-light conditions in order to avoid photodamage. When more photons are absorbed than can be utilised by the photosynthetic machinery, excessive excitation energy is dissipated as heat by short-term adaptation processes collectively known as non-photochemical quenching (NPQ). A decrease in PSII antenna chlorophyll (Chl) fluorescence yield and a reduction in the average Chl fluorescence lifetime are associated with NPQ. The main component of NPQ is the so-called energy-dependent quenching (qE), and it is triggered by the rapid drop in thylakoid lumenal pH resulting from the plant’s photosynthetic activity. This process is thought to take place at the PSII antenna complexes, which therefore not only capture and transfer light energy but are also involved in balancing the energy flow. The decrease in lumenal pH acivates the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE), which converts the xanthophyll violaxanthin (Vio) into zeaxanthin (Zea) in the xanthophyll cycle. In addition, the PSII subunit PsbS was discovered to be essential for qE by screening qE-deficient Arabidopsis thaliana mutants. This membrane protein is considered a member of the LHC superfamily, which also includes LHC-II and the minor LHCs. Previous studies on PsbS isolated either from native source or refolded in vitro have produced inconsistent results on its pigment binding capacity. Interestingly, a pH-dependent change in the quaternary structure of PsbS under high light conditions has been reported. This observed dimer-tomonomer transition very likely follows the protonation of lumenal glutamates upon the drop in pH and is accompanied by a change in PSII supercomplex localisation. PsbS dimers are preferentially found in association with the PSII core, whereas PsbS monomers co-localise with LHC-II.Despite the identification of !pH, Zea and PsbS as key players in qE, both the nature of the quencher(s) as well as the underlying molecular mechanism leading to excess energy dissipation still remain unknown. Several models have been put forward to explain the reversible switch in the antenna from an energy-transmitting to a quenched state. Proposals include a simple pigment exchange of Vio for Zea, and aggregation or an internal conformational change of LHC-II. Charge transfer (CT)quenching in the minor LHCs or quenching by carotenoid dark state (Car S1)-Chl interactions have also been suggested. However, none of these qE models has so far been capable of accommodating all the physiological observations and available experimental data. Most importantly, the function of PsbS remains an enigma. A recent qE model suggested that monomerisation of PsbS enables the protein to transiently bind a carotenoid and form a quenching unit with a Chl of a PSII LHC. In view of the various proposed qE mechanisms, this thesis aimed at understanding the interplay of the different qE components and the contribution of the PSII subunits LHC-II, the minor LHCs and PsbS to qE. The initial approach was to investigate the properties of the PSII subunits in the most simple in vitro model system, namely in detergent solution. For this purpose, LHC-II was isolated either from native source or refolded from recombinantly produced protein. Investigation of the minor LHCs and PsbS required heterologous expression and refolding. In addition, experiments were performed on aggregated LHC-II. Aggregates of LHC-II have been used as a popular model system for qE because they exhibit highly quenched Chl fluorescence. At the final stage of this doctoral work, a more sophisticated model system to approximate the thylakoid membrane was developed by reconstitution of the PSII subunits LHC-II and PsbS into liposomes. This system not only allowed for investigation of these membrane proteins in their native environment, but also for mimicking the xanthophyll cycle by distribution of Zea within the membrane as well as !pH by outside buffer exchange. The role of Zea in qE was first investigated with detergent solubilised antenna proteins. The requirement of this xanthophyll for qE is well-known, but the specific contribution to the molecular quenching mechansim is unclear. Previous work had shown that replacement of Vio for Zea in LHC-II was not sufficient to induce Chl fluorescence quenching in Zea-LHC-II, as suggested by the so-called molecular gearshift mechanism. However, by means of selective two-photon excitation spectroscopy, an increase in electronic interactions between Car S1 and Chls was observed for LHC-II upon lowering the pH of the detergent buffer. Electronic Car S1-Chl coupling became even stronger when Zea-LHC-II was probed. The extent of Car S1-Chl coupling correlated directly with the extent of Chl fluorescence quenching, in a similar way as observed previously in live plants under high-light conditions. However, very similar results were obtained with LHC-II aggregates. This implied that the increase in electronic interactions and fluorescence quenching was independent of Zea and low pH. Further experiments on aggregates of LHC-II Chl mutants indicated that the targeted pigments were also not essential for the observed effects. It is proposed that the same molecular mechanism causes an increase in electronic Car S1-Chl interactions and Chl fluorescence quenching in Zea-LHC-II at low pH as well as in aggregated LHC-II. Most likely, surface exposed pigments form random quenching centres in both cases. On the other hand, it was possible that Zea could act as a direct quencher of excess excitation energy in the minor LHCs. However, enrichment of refolded CP29, CP26 and CP24 with Zea did not lead to a change in the Chl excited state lifetime. Formation of a carotenoid radical cation, previously implied in CT quenching, was also not observed, although artificial generation of such a radical cation was principally possible as shown for CP29. During the course of this work, a study reporting the formation of Zea radical cations in minor LHCs was published. Therefore, Zea-enriched minor LHCs were again investigated on the experimental apparatus used in the reported study. Indeed, the presence of at least one carotenoid radical cation for each minor complex was detected. It is suggested that either the preparation method of incubating the refolded minor LHCs with Zea in contrast to refolding the complexes with only Zea and lutein causes the observed differences or that the observed spectral radical cation signatures are due to experimental artifacts. While the experiments with LHC-II and the minor LHCs gave useful insights into the putative qE mechanism, the quencher site and the mode of action of Zea could still not be unambiguously identified. Most importantly, these studies could not explain the function of the qE keyplayer PsbS. Therefore, the focus of the work was shifted to PsbS protein production, purification and characterisation. In view of inconsistent reports on the pigment binding capacity of this PSII subunit, refolding trials with and without photosynthetic pigments were conducted. The formation of a specific pigmentprotein complex typical for other LHCs was not observed and neither was the earlier reported “activation” of Zea for qE by binding to this protein. Nevertheless, PsbS refolded without pigments displayed secondary structure content in agreement with previous studies, indicating pigment-independent folding. Reconstitution of pigmentfree, refolded PsbS into liposomes confirmed that the protein is stable in the absence of pigments. Zea distributed in PsbS-containing liposomes also showed no spectral alteration that would indicate its “activation”. With the ability to reconstitute PsbS, it was then possible to proceed to modelling qE in a proteoliposome system. For this purpose, PsbS was co-reconstituted with LHC-II, which has been reported to interact with PsbS. One-photon excitation (OPE) and two-photon excitation (TPE) spectroscopy measurements were performed on LHC-II- and LHC-II/PsbS-containing liposomes. This enabled both quantification of Chl fluorescence quenching as well as determination of the extent of electronic Car S1-Chl interactions. The effect of Zea was investigated by incorporating it in the proteoliposome membrane. It was shown that Zea alone was not able to induce significant Chl fluorescence quenching when only LHC-II was present. However, when LHC-II and PsbS were co-reconstituted, pronounced Chl fluorescence quenching and an increase in electronic Car S1-Chl interactions were observed and both effects were enhanced when Zea was present. Western blot analysis indicated the presence of a LHC-II/PsbS-heterodimer in these proteoliposomes. In addition to the OPE and TPE measurements, the average Chl fluorescence lifetime was determined in detergent-free buffer at neutral pH and directly after buffer exchange to low pH. No significant changes in the average lifetime were observed for LHC-II proteoliposomes when either Zea was present or after exchange for low pH buffer. This indicated that Zea alone cannot act as a direct quencher, which concurs with the OPE measurements. Moreover, the complex was also properly reconstituted as no aggregation or significant Chl fluorescence quenching were observed. The average lifetime was not significantly affected in LHC-II/PsbS-proteoliposomes, independent of Zea or pH. However, a shortlived component in the presence of a long-lived component was not resolvable with the time resolution of the fluorescence lifetime apparatus. Implications for qE model systems and the in vivo quenching mechanism are discussed based on the experiments in detergent solution, on LHC-II aggregates and with the proteoliposome model system.
• Pflanzen absorbieren Sonnenlicht mit Hilfe photosynthetischer Pigmente und wandeln Lichtenergie in chemische Energie innerhalb der Photosynthese um. Diese Pigmente sind hauptsächlich an Antennenproteine gebunden, welche wie ein Energietrichter Anregungsenergie an die photosynthestischen Reaktionszentren weiterleiten. Die äußere Antenne des pflanzlichen Photosystems II (PSII) besteht aus dem Hauptlichtsammelkomplex des PSII (light-harvesting complex of PSII, LHC-II), sowie den kleinen Lichtsammelkomplexen (minor light-harvesting complexes, minor LHCs) CP29, CP26 und CP24. Die Lichtintensität unterliegt häufigen Schwankungen und Pflanzen müssen auf Starklichtbedingungen reagieren, um Lichtschäden zu vermeiden. Wenn mehr Photonen absorbiert werden, als vom Photosyntheseapparat verwendet werden können, wird überschüssige Anregungsenergie in Form von Wärme abgeführt. Dies geschieht durch kurzfristige Anpassungsprozesse, die als nicht-photochemisches Löschen von Anregungsenergie (non-photochemical quenching, NPQ) bekannt sind. Eine Abnahme der Chlorphyll (Chl)-Fluoreszenzausbeute in der Antenne von PSII, sowie eine Reduktion in der durchschnittlichen Chl-Lebenszeit, sind mit NPQ verbunden. Den Hauptanteil am NPQ besitzt das sogenannte energieabhängige Löschen von Anregungsenergie (energy-dependent quenching, qE), welches durch das schnelle Absinken des pH-Wertes im Thylakoidlumen auf Grund der photosynthetischen Aktivität der Pflanze ausgelöst wird. Es wird angenommen, dass dieser Prozess in den Antennenkomplexen von PSII abläuft, welche deshalb nicht nur Lichtenergie sammeln und weiterleiten, sondern auch den Energiefluss ausbalancieren. Das Absinken des luminalen pHs aktiviert das Enzym Violaxanthin De-epoxidase (VDE), welches das Xanthophyll Violaxanthin (Vio) in Zeaxanthin (Zea) im Xanthophyllzyklus umwandelt. Zusätzlich zeigte sich in Testreihen mit qE-defizienten Arabidopsis thaliana Mutanten, dass die PSII-Untereinheit PsbS essentiell für qE ist. Dieses Membranprotein wird der LHC-Superfamilie zugerechnet, zu welcher auch LHC-II und die kleinen Lichtsammelkomplexe gehören. Vorangegangene Studien an PsbS, welches entweder von natürlichem Ausgangsmaterial isoliert oder in vitro rückgefaltet wurde, haben keine übereinstimmenden Ergebnisse in Bezug auf seine Pigmentbindungseigenschaftengeliefert. Interessanterweise wurde von einer pH-abhängigen Änderung der PsbSQuartärstruktur unter Starklichtbedingungen berichtet. Dieser beobachtete Übergang vom Dimer zum Monomer erfolgt sehr wahrscheinlich durch die Protonierung luminaler Glutamatreste infolge des Absinkens des pH-Wertes und geht mit einem Lokalisationswechsel im PSII-Superkomplex einher. PsbS-Dimere werden hierbei bevorzugt in Assoziation mit dem PSII-Kern gefunden, wohingegen PsbS-Monomere mit LHC-II co-lokalisieren. Trotz der Identifikation von !pH, Zea und PsbS als Schlüsselkomponenten von qE sind die Natur des/der Quencher(s), sowie der zugrundeliegende molekulare Mechanismus, der ein Abführen von Überschussenergie bewirkt, weiterhin unbekannt. Diverese Modelle wurden vorgeschlagen, um das reversibe Umschalten von einem energieweiterleitenden zu einem energielöschenden Zustand in der Antenne zu erklären. Diese Vorschläge beinhalten einen einfachen Pigmentaustausch von Vio gegen Zea und die Aggregation oder eine innere Konformationsänderung von LHC-II. Des Weiteren wurde Energielöschung durch Ladungstransfer (charge transfer (CT) quenching) in den kleinen Lichtsammelkomplexen oder Wechselwirkungen zwischen Carotinoiddunkelzuständen (Car S1) und Chlorophyllen vorgeschlagen. Nichtsdestotrotz konnte bisher keines dieser qE-Modelle alle physiologischen Beobachtungen und zur Verfügung stehenden experimentellen Daten in sich vereinen. Im Besonderen liegt die Funktion von PsbS weiterhin im Dunkeln. Ein neueres Modell für qE besagt, dass die Monomerisierung von PsbS es dem Protein ermöglicht, transient ein Carotinoid zu binden und eine energielöschende Einheit mit einem Chl eines LHC in PSII zu bilden. In Anbetracht der verschiedenen vorgeschlagenene Mechanismen für qE war die Zielsetzung dieser Doktorarbeit, das Zusammenspiel der unterschiedlichen qEKomponenten, sowie den Beitrag der PSII-Untereinheiten LHC-II, der kleinen Lichtsammelkomplexe, sowie PsbS, zu verstehen. Der erste Ansatz hierbei war die Untersuchung der PSII-Untereinheiten in Detergenzlösung, welches das einfachste in vitro Modellsystem darstellt. Für diesen Zweck wurde LHC-II entweder von natürlichem Ausgangsmaterial isoliert oder von rekombinant hergestelltem Protein rückgefaltet. Die Untersuchung der kleinen Lichtsammelkomplexe und PsbS erforderte ebenfalls deren heterologe Expression und Rückfaltung. Des Weiteren wurden Experimente an aggregiertem LHC-II durchgeführt.LHC-II-Aggregate stellen ein beliebtes Modellsystem für qE dar, da sie eine starke Chl-Fluoreszenzlöschung zeigen. Gegen Ende dieser Doktorarbeit wurde ein verfeinertes Modellsystem entwickelt, in welchem durch Rekonstitution von LHC-II und PsbS in Liposomen die Thylakoidmembran nachempfunden wird. Dieses System ermöglichte nicht nur die Untersuchung von Membranproteinen in ihrer natürlichen Umgebung, sondern auch das Nachahmen des Xanthophyllzyklus durch die Verteilung von Zea in der Membran, sowie eines pH-Gradienten durch äußeren Pufferwechsel. Die Rolle von Zea in qE wurde zuerst mittels detergenzsolubilisierten Antennenproteinen untersucht. Es ist bekannt, dass dieses Xanthophyll für qE benötigt wird, allerdings ist sein spezifischer Beitrag zum molekularen Mechanismus der Energielöschung unklar. Vorherige Arbeiten hatten gezeigt, das ein Austausch von Vio gegen Zea in LHC-II nicht ausreicht, um, wie im “Schaltungsmechanismus”-Modell (gear-shift model) vorgeschlagen, ein Löschen der Chl-Fluoreszenz in Zea-LHC-II zu induzieren. Jedoch wurde durch Absenken des pH-Wertes des Detergenzpuffers per selektiver Zweiphotonen-Anregungsspektroskopie eine Zunahme der Car S1-Chl-Wechselwirkungen für LHC-II beobachtet. Die elektronische Car S1-Chl-Kopplung wurde sogar stärker, wenn stattdessen Zea-LHC-II benutzt wurde. Das Ausmaß der Car S1-Chl-Kopplung korrelierte hierbei direkt mit dem der Chl-Fluoreszenzlöschung - in ähnlicher Weise wie zuvor für lebende Pflanzen unter Starklichtbedingungen beobachtet. Sehr ähnliche Resultate konnten jedoch auch mit LHC-II-Aggregaten erzielt werden. Dies implizierte, dass ein Anstieg der elektronischen Wechselwirkungen und der Fluoreszenzlöschung von Zea und niedrigem pH unabhängig war. Weitere Experimente mit LHC-II-Chl-Mutanten legten zudem nahe, dass die anvisierten Pigmente ebenfalls nicht essentiell für die beobachteten Effekte waren. Es wird postuliert, dass derselbe molekulare Mechanismus einen Anstieg der Car S1-Chl-Wechselwirkungen und der Chl-Fluoreszenzlöschung sowohl in Zea-LHC-II bei niedrigem pH, als auch in aggregiertem LHC-II, verursacht. Sehr wahrscheinlich bilden in beiden Fällen an der Oberfläche exponierte Pigmente zufällige Quench-Zentren. Auf der anderen Seite bestand jedoch die Möglichkeit, dass Zea als direkter Quencher von überschüssiger Anregungsenergie in den kleinen Lichtsammelkomplexen agiert. Nichtsdestotrotz bewirkte das Anreichern von rückgefaltetem CP29, CP26 und CP24 mit Zea keine Änderung der Lebenszeit des angeregten Chl-Zustands. Die Bildung eines Carotinoidradikalkations, welches zuvor mit Fluoreszenzlöschung perLadungstransfer in Verbindung gebracht worden war, wurde nicht beobachtet. Prinzipiell war die artifizielle Erzeugung eines solchen Carotinoidradikalkation jedoch möglich, wie anhand von CP29 gezeigt wurde. Während dem Verlauf dieser Arbeit wurde eine Studie über die Bildung von Zea-Radikalkationen in den kleinen Lichtsammelkomplexen publiziert. Aus diesem Grund wurden mit Zea angereicherte kleine Lichtsammelkomplexe nochmals untersucht, diesmal jedoch mit der Apparatur der betreffenden Studie. Tatsächlich konnte die Anwesenheit von mindestens einem Carotinoidradikalkation per kleinem Lichtsammelkomplex detektiert werden. Es wird vorgeschlagen, dass entweder die Präparationsmethode, bei der rückgefaltete kleine Lichtsammelkomple mit Zea inkubiert und nicht mit Zea und Lutein rückgefaltet werden, ursächlich für die beobachteten Differenzen ist, oder dass die beobachteten spektralen Signaturen der Radikalkationen möglicherweise auf experimentellen Artefakten beruhen. Die Experimente mit LHC-II und den kleinen Lichtsammelkomplexen gaben zwar nützliche Einblicke in den möglichen qE-Mechanismus, allerdings konnten die Seite der Fluoreszenzlöschung und der Wirkmechanismus von Zea nicht eindeutig identifiziert werden. Im Besonderen konnten diese Studien nicht die Funktion der qESchlüsselkomponente PsbS erklären. Deswegen wurde der Schwerpunkt auf die Proteinproduktion, -aufreinigung und -charakerisierung von PsbS gelegt. In Anbetracht der nicht übereinstimmenden Berichte über die Pigmentbindungskapazität dieser PSIIUntereinheit wurden Rückfaltungstests mit oder ohne photosynthetische Pigmente durchgeführt. Die für andere LHCs typische Bildung eines spezifischen Pigment-Proteinkomplexes wurde nicht beobachtet, ebenso wenig wie eine “Aktivierung” von Zea durch Bindung an das Protein, von der zuvor berichtet worden war. Ohne Pigmente rückgefaltetes PsbS zeigte jedoch, in Übereinstimmung mit früheren Studien, einen Gehalt an Sekundärstruktur, der auf eine pigmentunabhängige Faltung hinweist. Die Rekonstitution von pigmentfreiem, rückgefalteten PsbS in Liposomen bestätigte, dass das Protein in der Abwesenheit von Pigmenten stabil ist. In PsbS-Liposomen verteiltes Zea zeigte ebenfalls keine spektrale Veränderung, die auf eine “Aktivierung” hinweisen würde. Mittels der Rekonstitution von PsbS war es nun möglich, mit der Nachstellung von qE in einem Proteoliposomen-Modellsystem fortzufahren. Zu diesem Zweck wurde PsbS mit LHC-II co-rekonstituiert, dessen Interaktion mit PsbS beschrieben ist.Einphotonenanregungs- (OPE) und Zweiphotonenanregungs- (TPE) Spektroskopiemessungen wurden an LHC-II- und LHC-II/PsbS-Liposomen durchgeführt. Dies ermöglichte sowohl die Quantifizierung der Chl-Fluoreszenzlöschung, als auch die Bestimmung des Ausmaßes der elektronischen Car S1-Chl-Wechselwirkungen. Die Auswirkung von Zea wurde durch dessen Beimischung zur Proteoliposomenmembran untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Zea alleine nicht in der Lage ist, eine signifikante Löschung der Chl-Fluoreszenz zu bewirken, wenn nur LHC-II anwesend ist. Wenn jedoch LHC-II und PsbS corekonstituiert wurden, wurde eine ausgeprägte Chl-Fluoreszenzlöschung und ein Anstieg der Car S1-Chl-Wechselwirkungen beobachtet. Beide Effekte wurden durch die Anwesenheit von Zea verstärkt. Westernblotanalysen wiesen auf das Vorhandensein eines LHC-II/PsbS-Heterodimers in diesen Proteoliposomen hin. Zusätzlich zu den OPE- und TPE-Messungen wurde die durchschnittliche Chl-Fluoreszenzlebensdauer in detergenzfreiem Puffer bei neutralem pH und direkt nach einem Pufferwechsel zu niedrigem pH bestimmt. Signifikante Änderungen der Lebenszeit für LHC-IIProteoliposomen wurden weder für die Anwesenheit von Zea, noch nach Pufferwechsel zu niedrigem pH beobachtet. Dies weist in Übereinstimmung mit den OPE-Messungen darauf hin, dass Zea alleine nicht als direkter Quencher wirken kann. Zusätzlich war der Komplex korrekt rekonstituiert, da weder Aggregation, noch signifikante Chl-Fluoreszenz-löschung beobachtet wurden. Die durchschnittliche Lebenszeit in LHCII/PsbS-Liposomen war nicht signifikant beeinflußt, weder durch Zea, noch durch niedrigen pH. Jedoch konnte auf Grund der Zeitauflösung eine kurzlebige in Gegenwart einer langlebigen Komponente mit der Fluoreszenzlebenszeit-Apparatur nicht aufgelöst werden. Schlussfolgerungen für qE-Modellsysteme und den Mechanismus der Energielöschung in vivo, basierend auf den Experimenten in Detergenzlösung, an LHCII-Aggregaten und im Proteoliposomen-Modellsystem, werden diskutiert.