Elektrophysiologische Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung der N-Glykosilierung des GABA-Transportproteins besonders in Bezug auf die Kinetik der Natrium-Transporter-Interaktion

Die hier vorgelegte Arbeit hatte zur Aufgabe, funktionellen Einflüsse auf den Neurotransmittertransporter GAT-1 zu erhellen, welche durch eine N-Glykosilierung des Transportproteins hervorgerufen werden. Frühere Untersuc
Die hier vorgelegte Arbeit hatte zur Aufgabe, funktionellen Einflüsse auf den Neurotransmittertransporter GAT-1 zu erhellen, welche durch eine N-Glykosilierung des Transportproteins hervorgerufen werden. Frühere Untersuchungen deuteten bereits darauf hin, daß der Glykosilierung der drei extrazellulär vorhandenen N-Glykosilierungsstellen des GAT- 1 neben einer expressionellen Bedeutung auch eine funktionelle zukam. So zeigten sich bei Arbeiten anderer Gruppen, welche N-Glykosilierungsmutanten des GAT-1 verwendeten, um die Glykosilierung des Transportproteins zu beeinträchtigen, daß fehlende Oligosaccharide an den N-Glykosilierungsstellen des GAT-1 durchaus in eine Reduktion der GABA-Aufnahme in die Zellen mündete, was zumindest bei Oozyten des Xenopus laevis auf eine verminderte Transportrate zurückgeführt werden konnte. An CHO-Zellen konnte nun auf gleiche Weise eine Reduktion der GABA-Aufnahme beobachtet werden, und es galt, mit elektrophysiologischen Methoden die Ursachen dieser Reduktion zu erkunden. Die hier vorgelegte Arbeit vermochte nun bei CHO-Zellen, eine Verminderung der Transportrate als Ursache jener reduzierten GABA-Aufnahme auszumachen. Zu diesem Zwecke wurden die CHO-Zellen entweder mit der DNA des mGAT1 Wild-Typs (einem aus der Maus klonierten GAT-1-Transporter) oder mit der DNA von N-Glykosilierungsmutanten des mGAT1 transfiziert. Es fanden zwei verschiedene N-Glykosilierungsmutanten Verwendung, an denen jeweils zwei der drei N-Glykosilierungsstellen Asparagin durch Aspartat bzw. Glycin ersetzt wurden: (Asp176, Gly181, Asn184) bzw. DDN (Asp176, Asp181, Asn184). Wie indes die durch eine beeinträchtigte N-Glykosilierung verminderte Transportrate zustande kam, und wie sich eine entsprechende Erklärung in die bisherige Annahme den GAT-1 Reaktionszyklus betreffend einfügen und mit dessen Struktur verbinden ließe, vermochte die hier vorgelegte Arbeit zu einem großen Teil einsichtig zu machen. Zwei Phänomene konnten die Transportrate vermindern: Zunächst waren die Zeitkonstanten transienter Ströme, welche bei Abwesenheit von GABA auftreten, verlangsamt. Weil diese Ströme den ratenlimitierenden Schritt im Reaktionszyklus zu repräsentieren scheinen, mußte also jener Schritt, welcher die Okklusion des ersten Natriums oder die darauffolgende Konformationsänderung beinhaltet, verlangsamt sein. Im weiteren zeigten Analysen der bei den transienten Strömen auftretenden Ladungsverschiebungen, daß die Natrium-Transporter-Interaktion auf extrazellulärer Seite durch das Fehlen von Oligosacchariden an den N-Glykosilierungsstellen des GAT-1 beeinträchtigt war, wobei als Grund hierfür eine Verstärkung der dimensionalen bzw. elektrogenen Schranke zu sehen ist, welche sich vor der Natriumbindungsstelle des GAT-1 befindet. Eine Veränderung der Expressionsrate als tragende Ursache verminderter Transportraten bzw. reduzierter GABA-Aufnahmen konnte hingegen ausgeschlossen werden. Experimente mit dem N-Glykosilierungs-Inhibitor dMM sowie Vergleiche von Experimenten verschiedener Mutanten vermochten die oben beschriebenen Effekte hauptsächlich auf die durch die Mutationen fehlenden Oligosaccharide zurückzuführen und weniger auf andere durch die Mutation hervorgerufene strukturelle Änderungen des GAT-1-Proteins.
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Metadaten
Author:Petrus Stephan Salonikidis
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000003485
Referee:Wolfgang Schwarz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2004/01/29
Year of first Publication:2003
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2003/11/20
Release Date:2004/01/29
Tag:CHO; Deoxymannojirimycin; Elektrophysiologie; GABA Transporter Typ 1; dMM
Chinese hamster ovary; Patch-clamp
HeBIS PPN:118596136
Institutes:Physik
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $