Synthese und Anwendung 2´-O-modifizierter universeller Nucleosidanaloga als RNA Inhibitoren

Synthesis and application of 2´-O-modified universal nucleoside analogues as RNA inhibitors

Ideale universelle Nucleosid-Analoga könnten im Hinblick auf therapeutische Oligonucleotide einen Fortschritt in der Entwicklung darstellen. Zudem bieten solche Nucleosidanaloga auch aus synthetischer Sicht Vorteile: Dur
Ideale universelle Nucleosid-Analoga könnten im Hinblick auf therapeutische Oligonucleotide einen Fortschritt in der Entwicklung darstellen. Zudem bieten solche Nucleosidanaloga auch aus synthetischer Sicht Vorteile: Durch ihre Struktur sind chemische Modifikationen – wie beispielsweise Modifizierungen an der Zuckereinheit – leichter zugänglich, als bei den natürlichen Nucleosiden. Ein Ziel der vorliegenden Doktorarbeit bestand darin, bereits bekannte universelle Nucleosidbausteine solchermaßen zu modifizieren, das bei ihrer Anwendung in Oligonucleotiden ihre Vorteile besser zum Tragen kommen. Vor diesem Hintergrund besaßen vor allem protonierbare 2´-O-Modifikationsmotive eine besondere Relevanz. Im Vergleich zur bereits bekannten 2´-O-Aminoethyl-Modifikation des 4,6-Difluorbenzimidazol-Nucleosidbausteins konnte eine um eine Methyleneinheit längere 2´-O-Aminopropylfunktion des Nucleosids hergestellt werden. Dabei wurde eine Syntheseroute eingeschlagen, mit der diese Modifikation in hohen Ausbeuten und hoher Reinheit aus dem 3´-,5´-Markiewicz-geschützten Nucleosid eingeführt werden konnte. Grundlage dieser Modifizierungsmethode ist eine Michael-Addition von Acrylnitril an die 2´-OH-Funktion unter basischen Bedingungen. Damit konnte ein 2´-O-Cyanoethylrest an das Nucleosid geknüpft werden; dieser wurde als Modifikationsmotiv beibehalten und es konnte das entsprechende 3´-Phosphoramidit hergestellt werden. Außerdem lässt sich ein 2´-O-Cyanoethylrest mittels Raney-Nickel-katalysierter Hydrierung in das primäre Amin überführen. Durch diese Michael-Addition-Reduktionssequenz konnte die erwähnte 2´-O-Aminopropylmodifikation in nur zwei Stufen mit einer Gesamtausbeute von über 80 % an das Difluorbenzimidazolnucleosid geknüpft werden. Die 2´-O-Aminopropylfunktion wurde zudem als Ausgangspunkt zur Kupplung weiterer erfolgsversprechender Modifikationsmotiven verwendet: In diesem Ansatz wurden mittels standardisierter Peptidkupplungschemie Carbonsäurederivate an die freie Aminofunktion gekuppelt. Hierdurch waren neuartige 2´-O-Modifizierungen, wie z.B. Lysin- oder auch Laurinsäurekonjugate zugänglich; diese waren über den Propylamidlinker mit dem Nucleosid verbunden. Im Hinblick einer polykationischen Modifizierung konnte auch ein Sperminderivat an die Aminopropylfunktion gekuppelt werden. Sämtliche dieser Konjugate konnten ebenfalls nach mehrstufigen Synthesen in das 3´-Phosphoramidit überführt werden und wurden schließlich erfolgreich in RNA-Oligonucleotide eingebaut. Für den Einbau der 2´-modifizierten universellen Nucleosidanaloga in RNA-Oligonucleotide wurden zunächst kurze 12mer-Sequenzen gewählt, die sich bereits als gute Testsysteme für spektroskopische Untersuchungen herausgestellt haben. Hernach konnten mit diesen Duplexen spektroskopische Untersuchungen wie UV-Schmelzkurvenanalysen und CD-Spektroskopie durchgeführt werden. Zudem stand die biologische Testung dieser Modifikationen in synthetisch zugänglichen siRNA-Oligonucleotiden im Fokus dieser Arbeit. Um die Flexibilität der Konjugationsmethode zu erhöhen konnte auch eine postsynthetische Kupplung an das festphasengebundene RNA-Oligomer etabliert werden. Dies wurde durch den Einbau des geeignet geschützten 2´-Aminopropyl-Nucleosidbausteins in ein RNA-Oligomer erreicht: Durch einfache Zugabe von Bocanhydrid in den Reduktionsansatzes gelang eine simultane Boc-Schützung des 2´-O-Aminopropylderivats in quantitativer Ausbeute. Diese Prozedur konnte auch auf ein 7N-Purinnucleosidanalogon übertragen werden, welches im Hinblick auf die thermodynamische Stabilisierung eines RNA-Duplexes einem 4,6-Difluorbenzimidazolbaustein gegenüber überlegen zu sein scheint. Die Boc-geschützen Derivate wurden als Phosphoramidite in die automatisierte Festphasensynthese von Oligonucleotiden eingesetzt. Der große synthetische Vorteil dieser Methode besteht einerseits in ihrer einfachen Durchführbarkeit, andererseits in ihrer effizienteren und ökonomischeren Vorbereitung: Es muss nur jeweils ein Phosphoramiditbaustein (mit Boc-geschützter 2´-O-Aminopropylfunktion) synthetisiert und in ein Oligonucleotid eingebaut werden. Sowohl mit dem 4,6-Difluorbenzimidazolnucleosid, als auch mit seinem 7N-Purin-Pendant konnten erfolgreiche Festphasenkupplungen durchgeführt werden. Im Hinblick auf die thermodynamischen Eigenschaften konnten vor allem für das 7N-Purinnucleosid interessante Resultate erzielt werden: Das via Festphasenkupplung erhaltene RNA-12mer, welches eine Argininmodifikation am 2´-O-Aminopropyl-7N-Purinnucleosid trägt, zeigt eine im Vergleich zum unmodifizierten A-U-Basenpaar ähnliche Stabilität bei leicht erhöhtem Tm-Wert. Um den Ursprung dieses Effekts genauer zu ergründen wären weitere thermo-dynamische Untersuchungen anhand des 7N-Purinbausteines z.B. mit anderen Modifikations-motiven oder auch an unterschiedlichen Positionen im Oligomer sinnvoll.
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Ideal universal nucleoside analogues could be an improvement in the field of therapeutical oligonucleotides. Furthermore, they offer some advantages for their chemical synthesis. Due to their structure, chemical modifica
Ideal universal nucleoside analogues could be an improvement in the field of therapeutical oligonucleotides. Furthermore, they offer some advantages for their chemical synthesis. Due to their structure, chemical modifications – of the sugar moiety for example – are more easily accessible in comparison to natural nucleosides. One aim of this PhD-thesis was the modification of already known universal nucleosides in a novel manner. Thus, especially cationic modification-motifs have a particular relevance. In comparison to the already known 2´-O-aminoethyl-modification of the 4,6-Difluorbenzimidazole-nucleoside, a longer 2´-O-aminopropyl modification was synthesized in a very efficient manner. This synthetic pathway starts from a Michael-reaction with acrylonitrile at the 2´-OH under basic conditions. This results in a 2´-O-cyanoethyl modified nucleoside and the accordant phosphoroamidite was synthesized subsequently. Moreover, after introduction of this 2´-O-cyanoethyl-group, via Raney-nickel catalyzed reduction a 2´-O-aminopropyllinker was available in very high yields and excellent purity. This amino function could be used as a precursor for further coupling reactions due to peptide couplings by carboxylic acids. Thereby, novel 2´-O-modification-motifs like lysine or lauric acids conjugates onto a universal nucleoside are possible. In respect to polycationic modifications, also a spermine-derivative was coupled to the 2´-O-amino function successfully. All modifications were inserted into RNA-oligonucleotide 12mers in order to determine thermodynamic properties (Tm-value, CD-spectra). For this purpose, standard phosphoramidite chemistry has been used. Furthermore, RNA-21mers (siRNAs) containing these novel 2´-O-modified universal nucleosides were synthesized, too. They have been used for biological investigations to check for improved cellular uptake, nuclease stability and RNAi-activity. Finally, the flexibility of the conjugation method was improved via a postsynthetic solid-phase-coupling. For this purpose, the 2´-O-cyanoethyl derivative was directly converted into the Boc-protected 2´-O-aminopropyl modification in one step. This building block was converted into the appropriate phosphoroamidite, which was used for automatic oligo-synthesis. During oligosynthesis, the Boc-protecting group was cleaved under acidic conditions, whereby an amino function was liberated. Thus, it was possible to couple carboxylic acids, like protected amino acids, directly on solid-support to a RNA-oligomer carrying such a modification. This method was not only performed with a 4,6-Difluorobenzimidazole nucleoside, but also with a 7N-purine analogue, which seems also to have universal properties. In thermodynamic measurements, a 7N-purine compound with a 2´-O-aminopropylarginine- modification seems to stabilize an RNA-duplex in an even better manner than an unmodified one. The reason for this stability-phenomenom is still not clear and has to be investigated in future research.
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Metadaten
Author:Jens Haas
URN:urn:nbn:de:hebis:30-61139
Referee:Joachim W. Engels
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/12/23
Year of first Publication:2008
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2008/12/12
Release Date:2008/12/23
Tag:RNA interference; RNA synthesis ; chemical synthesis
SWD-Keyword:Organische Synthese ; RNS-Interferenz; RNS-Synthese
HeBIS PPN:207812160
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $