Production of the human adenosine A2A receptor in Pichia pastoris, its solubilization and purification, and the selection of a specific single-chain Fv fragment by phage display

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Membranproteinfamilie dar. Sie sind in der Plasmamembran lokalisiert und spielen eine Schlüsselrolle bei der Signalübertragung in Eukaryonten, in dem sie extraze
G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Membranproteinfamilie dar. Sie sind in der Plasmamembran lokalisiert und spielen eine Schlüsselrolle bei der Signalübertragung in Eukaryonten, in dem sie extrazelluläre Signale in das Zellinnere weiterleiten und entsprechende Reaktionen veranlassen. Die Mitglieder der GPCR-Familie sind durch zwei gemeinsame Merkmale charakterisiert. Zum einen bestehen sie aus sieben membranständigen Helices, und zum anderen übertragen sie ein extrazelluläres Signal über die Bindung eines Liganden auf intrazelluläre heterotrimere G-Proteine. Verschiedene GPCRs binden hochspezifisch eine große Anzahl verschiedener Liganden (Neurotransmitter, Hormone, Peptide, Nukleotide, Licht, Geruchsstoffe, Ionen...). Wie diese enorme Vielfalt an Spezifität auf molekularer Ebene verwirklicht wird, ist weitgehend unbekannt. Die Bedeutung dieser Rezeptorfamilie drückt sich dadurch aus, dass etwa 50 % aller auf dem Markt befindlichen Arzneimittel an GPCRs binden. Möglichst genaue strukturelle Informationen über GPCRs sind daher unabdingbar zum Verständnis ihrer Wirkungs- und Regulationsmechanismen. Bisher liegt nur die Struktur einer inaktiven Form des Rhodopsins (Palczewski et al., 2000) hochaufgelöst vor. Die Gründe für den Mangel an hochaufgelösten Strukturen von GPCRs sind vielfältig, denn teilweise kaum überwindliche Schwierigkeiten gibt es bei der heterologen Expression, der funktionalen Solubilisierung aus der Membran, der Reinigung in Milligrammmaßstab und in homogener Form bis zur Erzeugung von gut streuenden Kristallen. Adenosin ist ein endogenes Purinnukleosid, welches extrazellulär in allen Säugergeweben vorliegt. Es vermittelt Stoffwechselreaktionen über die Aktivierung des Adenosinrezeptors, einem GPCR der Rhodopsin-Unterfamilie, welche in 4 Mitglieder, A1, A2A, A2B and A3, unterteilt wird. Die Adenosinrezeptoren des Menschen haben untereinander eine Sequenzhomologie von 39-61 % und werden in nahezu allen Organen und Geweben gefunden. Der Adenosin A2A Rezeptor hat ein Molekulargewicht von 45 kDa und ist durch eine C-terminale Domäne gekennzeichnet, die den Kopplungsprozess zwischen der extrazellulären Bindung des Liganden und der Aktivierung des G-Proteins nicht beeinflusst, jedoch von maßgeblicher Bedeutung für den hohen Aktivitätsgrad des Rezeptors auch ohne Adenosin-Bindung und für die Wechselwirkung mit anderen Proteinen ist. Er wird hauptsächlich im zentralen Nervensystem, aber auch auf der Oberfläche von Leukozyten und Blutplättchen gefunden und ist an Vorgängen wie der Regulation des Immunsystems, der Erweiterung der Blutgefäße und der Anregung sensorischer Nerven beteiligt. Ferner lagert sich der Adenosin-A2A-Rezeptor mit dem Dopaminrezeptor, ebenfalls ein GPCR, zu einem Heterodimer zusammen und wirkt ihm gegenüber als Antagonist. Aufgrund dieser Eigenschaften gilt er als vielversprechendes Zielprotein für Arzneimittel zur Behandlung der Parkinson’schen Krankheit. MePNet („Membran Protein Network“) war ein europäisches Konsortium, welches Strukturuntersuchungen an den pharmakologisch so wichtigen GPCRs vorantreiben wollte. Das gesteckte Ziel war, die Struktur eines GPCR im vorgegebenen Zeitraum aufzuklären. Die Konzeption bestand darin, 100 Zielproteine herauszusuchen, die für Kristallisationsexperimente geeignet erschienen und diese parallel in Escherichia coli, Pichia pastoris und Säugerzellen (mit Hilfe des Semliki Forest Virus) herzustellen. Unsere Arbeitsgruppe übernahm die Herstellung in Pichia pastoris. Pichia pastoris, als Hefe, hat die Vorteile eukaryotischer Expressionssysteme, und ist insbesondere in der Lage, die meisten posttranslationalen Modifikationen auszuführen. Gleichzeitig ist sie einfacher handhabbar, schneller und billiger im Vergleich zu Expressionssystemen aus Säugern und Insekten. Verglichen mit Saccharomyces cerevisiae verursacht Pichia keine Überglykosylierung an den Proteinen und wächst zu einer hohen Zelldichte. Pichia pastoris ziegt sich also für die Produktion von Membranproteinen and inbesondere von GPCRs erfolgsversprechend. Von den 100 ausgewählten Proteinen des MePNet wurden 38 in unserer Gruppe untersucht. Für jeden der 38 Rezeptoren wurde die Prozesskette (Expression, funktionale Charakterisierung, Solubilisierung, Reinigung und Kristallisation) gestartet, aber nur mit solchen Proteine, die zuvor festgelegte Qualitätsanforderungen erfüllten, wurde in den nächsten Schritte weitergearbeitet. Zunächst wurde das zu exprimierende Gen stabil in das Genom von P. pastoris mittels homologer Rekombination eingebaut. Mehrfacher Geneinbau in das Genom ist möglich, beinflußt aber je nach Rezeptor sehr stark die Proteinproduktion. Daher ist für jeden Rezeptor eine Suche nach dem produktivsten Klon unerlässlich. Der geeignetste Klon wurde mit Hilfe der „dot-blot“ Methode identifiziert, welche die Anwesenheit der Rezeptoren in den Membranen durch Bindung des N-terminalen "tag" an einen Antikörper nachweist. 92 % der ausgewählten Rezeptoren zeigten mit dieser Methode ein Expressionssignal. Der produktivste Klon jedes Rezeptors wurde anschließend durch einen Western-blot weiter untersucht. Danach wurden mehr als 75 % aller untersuchten GPCRs erkennbar in P. pastoris produziert, wobei die Expressionsmengen sehr unterschiedlisch waren. Die größte Menge Protein lieferte der Adenosin-A2A-Rezeptor des Menschen, welcher eine wohl definierte, klar erkennbare einzelne Bande bei der erwarteten Größe des Rezeptors (mit "tags" um 55 kDa) lieferte, und folglich näher charakterisiert wurde. Um die Funktionsfähigkeit des Rezeptors nachzuweisen, wurde mit dem radioaktiv markierten Liganden [3H]-ZM241385, einem spezifischen und hochaffinen Adenosin-A2A-Rezeptorantagonisten, ein Bindingstest in den Membranen durchgeführt. Unter Standardkulturbedingungen (Inkubationszeit 24 h bei 30° C) wurde ein Bmax-Wert von 56 +/- 3 pmol/mg Gesamtprotein und ein KD-Wert von 0.40 +/- 0.02 nM sowohl für frisch geerntetes als auch für eingefrorenes Material bestimmt. Die erhaltene Bindungsaffinität entspricht früher publizierten Daten. Die anfängliche Produktionsmenge wurde gesteigert, in dem Faktoren wie die Temperatur, die Zeit von der Induktion bis zur Ernte und die Menge an DMSO während der Expression verändert wurden. Bei einer Temperatur von 22° C und 18 Stunden Inkubationszeit nach der Induktion wurden doppelt so viel Rezeptor gebunden wie unter Standardbedingungen. Zusätzlich führte die Zugabe von DMSO zum Medium zu einer erhöhten spezifischen Bindung, jedoch auch zu einer geringeren Zelldichte. Die Zugabe von 3 % (v/v) DMSO führte zu einer optimalen Rezeptorproduktion. Unter den genannten optimalen Bedingungen – +22° C, 18 h Inkubationzeit nach der Induktion, 3 % DMSO im BMMY-Medium – konnten rund 180 pmol Rezeptor / mg Membranprotein produziert werden. Bei der Produktion im Großmaßstab wurden im Fermenter 300 g Zellen (Nassmasse)/L Kultur erhalten. Der Bmax-Wert von 95 pmol/mg ist zwar nur halb so groß wie derjenige, für Rezeptoren, die aus den Schüttelkolben exprimiert wurden, stellt jedoch noch immer ein sehr hoher Wert für GPCRs dar. Unter Berücksichtigung der Zelldichte ergibt sich daraus eine Ausbeute von 43 mg Rezeptor/L Kultur, und für die Gesamtfermentation sogar ein Wert von 300 mg funktionaler Rezeptor in den Membranen. Solubilisierungsversuche wurden mit 17 verschiedenen Detergentien durchgeführt und die erhaltenen Proteinmengen im Western-Blot abgeschätzt. Obwohl sich der Rezeptor in der Regel schlecht solubilisieren ließ, konnte eine Ligandenbindung für die geeignetesten Detergentien Digitonin und Dodecyl-β-D-Maltosid (β-LM) nachgewiesen werden. β-LM wurde für weitere Optimierungsversuche ausgewählt. Die Ausbeute an funktionsfähigem Rezeptor in der Detergenzmizelle im Vergleich zum Rezeptor in der Membran wurde noch von 50 auf 70-80 % gesteigert, in dem die Ionenstärke erhöht und Cholesterylhemisuccinat zugefügt wurde. Die Reinigung des in β-LM solubilisierten Rezeptors wurde mit mehreren Strategien in Angriff genommen. Ansatz 1 verwendete die Affinitäts-"tags", die im Genkonstrukt für den Adenosin-A2A-Rezeptor enthalten sind. Ein Ni-NTA- und ein nachfolgendes Avidin-affinitätschromatographie-Experiment (welche den N-terminalen Decahistidin-tag bzw. die C-terminal angehängte Biotinylierungsdomäne zur Bindung ausnutzten) führten zu einem reinen, gleich wohl heterogenen Protein, was sich in einem breiteren Gelfiltrationsprofil ausdrückte. Ansatz 2 beruhte auf der Bindung des Rezeptors an einen Liganden, der vorab an einen Säulenträger gebunden wurde. Ein Xanthinamin-Analogon diente als Ligand für die Affinitätschromatographie, die nach der Ni-NTA-Chromatographie eingesetzt wurde. Das erhaltene Protein war relativ rein, zeigte aber bei einem nachfolgenden Gelfiltrationschromatographie-Experiment erneut heterogene Eigenschaften. Ansatz 3 umfasste die genannte Affinitätschromatographie als einzigen Reinigungsschritt. Wie eine anschließendes SDS-PAGE-Analyse zeigte, bindet in diesem Fall der Rezeptor sehr unspezifisch an die Säulenmatrix. Ansatz 4 liegt die Vorstellung zugrunde, dass der Rezeptor stabilisiert und in einer funktional aktiven Konformation eingefroren werden könnte, wenn bereits bei der Solubilisierung ein Ligand zugegeben wird. Als Ligand wurde der stark bindende Antagonist ZM241385 und als Reinigungsverfahren wieder ein Ni-NTA- und ein monomere Avidinaffinitätschromatographie-Experiment verwendet. Mit Hilfe dieses Ansatzes wurde wie bei Ansatz 1 nicht nur reiner Rezeptor erhalten, sondern auch (abgeleitet von Gelfiltrationsprofilen) homogenes und über zwei Wochen stabiles Protein. Bindungsstudien an gereinigtem Rezeptor ergaben eine spezifische Aktivität von 4.8 nmol/mg. Die davor durchgeführte Entfernung des Liganden während eines Gelfiltrationslaufes änderte die aktive Konformation des Rezeptors nicht. Die Ausbeute an Rezeptor nach der Solubilisierung und Reinigung belief sich auf etwa 20 %, so dass eine Reinigung ausgehend von 2 g Membranen zu etwa 4 mg reinem Rezeptor führte. Die Menge und Qualität des gereinigten Rezeptors ist ausreichend für Kristallisationsversuche, welche derzeit durchgeführt werden. Der nächste Schritt bei der Strukturlösung des Adenosin-A2A-Rezeptors wäre die Herstellung gut streuender Kristalle. Die Kristallisation von GPCRs gilt als äußerst schwierig unter anderem deswegen, weil nur ein sehr kleiner Teil der Oberfläche hydrophil ist. Dieses Problem kann teilweise durch die Bindung spezifischer Antikörperfragmente als Ko-Kristallisationspartner behoben werden. Daher wurde mit Hilfe der "Phage display"-Methode nach Antikörpern gegen den Rezeptor gesucht. Diese Technik beruht auf der Fusion eines Antikörperfragmentgens mit einem Hüllenproteingen des Phagen, wodurch nach der Expression das Antikörperfragment auf der Oberfläche des Phagen für ein Antigen zugänglich wird. Um möglichst viele Antikörper auf ihre Eignung zu testen, wird eine vorgegebene Phagenbibliothek verwendet, die eine Vielzahl von Spezifitäten zur Verfügung stellt. Für diese Arbeit wurden Antikörper in der Einzelketten Fv (scFv) - Form verwendet. ScFv’s bestehen nur aus den beiden Antigenbindingsdomänen der Antikörper, welche zu einer Kette miteinander verknüpft sind. Wir benutzten die Tomlinson I - und J - Bibliotheken (MCR, Cambridge, UK), die auf einem einzigen menschlichen Polypeptidkettenkonstrukt beruhen und eine große Seitenkettenvielfalt an den Stellen haben, die in Kontakt mit dem Antigen stehen. Die Verwendung der "Phage display"-Technik bot sich aus mehreren Gründen an. Diese Technik erlaubt die Bindung von Antikörperfragmenten an das gefaltete Protein, wohingegen eine bei der Hybridoma-Technik notwendige Proteininjektion zur Immunisierung von Tieren Proteinentfaltung auslösen und folglich zu Antikörperbildung gegen denaturiertes Protein führen könnte. Ohne den Immunisierungsschritt ist die "phage display" - Methode auch viel schneller und das Gen eines erfolgsversprechenden scFv-Fragments darüberhinaus leicht zugänglich. (In den verwendeten Bibliotheken liegt jedes scFv-Fragment bereit geklont mit "tags" vor, wodurch die nachfolgenden Schritte der Proteinproduktion erleichtert werden.) Dennoch erwies sich die Anwendung der "phage-display"-Methode auf Membranproteine und insbesonders auf GPCR als schwierig. Aufgrund des Einbaus in eine Lipiddoppelschicht bzw. in eine Detergenzmizelle ist die Proteinoberfläche relativ klein und bietet daher nur eine begrenzte Bindungsfläche für das Antikörperfragment. Ein weiteres Problem besteht darin, den Rezeptor während des "phage display"-Experiments in seiner nativen Konformation zu halten. Bei unseren Untersuchungen wurde gereinigter Rezeptor mittels seiner Biotinylierungdomäne an die Oberfläche von Streptavidinpartikeln ("beads") gebunden. Seine Funktionalität wurde dabei mit Hilfe von Ligandenbindungsstudien nachgewiesen. Nach zwei Selektionsrunden wurden 40 Phagen in jeder Bibliothek sequenziert. In der Bibliothek I wurden bei mehr als 50 % der Phagen Sequenzen mehrere Male gefunden und sechs davon waren signifikant angereichert. Die angereicherten scFv-Fragmente wurden in E. coli in unterschiedlichen Ausbeuten produziert. Eine Einschrittreinigung mittels Ni-NTA Chromatographie ergab für vier scFv-Fragmente eine ausreichende Menge zur Durchführung eines ELISA-Test. Im ELISA-Test wird der Rezeptor an eine Platte mit 96 Streptavidin bedeckten Vertiefungen gebunden. Nach Zugabe von verschiedenen scFv-Fragmenten und einem nachfolgenden Waschschritt wurden die bindenden Antikörper durch Färbung mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Protein L ermittelt. Eines der gebundenen scFv-Fragment zeigte eine besonders starke Bindung; seine optische Absorption lag zehnmal über der des Hintergrunds. Eine Titration dieses scFv-Fragments mit dem Rezeptor unter den gleichen Bedingungen zeigte eine spezifische und vollständige Bindung. Eine Umkehrung des Experiments, bei welchem der Rezeptor in Lösung zum immobilisierte scFv-Fragment zugegeben wurde, lieferte ebenfalls eine spezifische Bindung wenngleich mit niedrigerer Bindungsstärke. Gibt man das scFv-Fragment und den Rezeptor in Lösung zusammen, konnte im Rahmen eines Gelfiltrationsexperiments keine Komplexbildung nachgewiesen werden. Um die Affinität des scFv-Fragments an den Rezeptor näher zu untersuchen, wurde das Antiköperfragment mit Fluorescein markiert. Damit konnte eine Bindung zwischen dem markiertem ScFv-Fragment und dem Trägerfixierten Rezeptor auf einer Streptavidinplatte und im Rahmen eines Gelfiltrationexperiments nachgewiesen werden. Jedoch bildeten in einem Kontrollversuch zufällig herausgesuchte scFv-Fragmente, die mit Fluorescein markiert waren, und Rezeptor ebenfalls einen Komplex. Offenkundig ist die Bindung der markierten scFv-Fragmente zum Rezeptor unspezifisch. Weitere Experimente unter Anwendung der Biacore Technologie werden erforderlich sein, um die genaue Bindungsstärke zwischen dem angereicherten scFv-Fragment und dem Rezeptor herauszufinden. Zufallsmutationen an den scFv-Fragmentgenen und weitere „phage display“-Selektionsrunden könnten die Bindungsstärke soweit verbessern, dass eine Ko-Kristallisation zwischen Rezeptor und Antikörperfragment möglich wird. Zusammenfassend führte diese Arbeit auf der Grundlage eines Hochdurchsatzansatzes zu der Identifikation eines vielversprechenden Rezeptors. Der Adenosin A2a-Rezeptor aus H. sapiens konnte in großen Mengen in Pichia pastoris produziert und in aktiver Form solubilisiert werden. Es gelang, ein Expressions- und Reinigungsprotokoll auszuarbeiten, womit reiner, homogener und stabiler Rezeptor mit einer Ausbeute erhalten wurde, die für Strukturstudien ausreicht. Kristallisationsversuche wurden bereits gestartet. Darüberhinaus wurde der gereinigte Rezeptor dazu verwendet, spezifische scFv-Fragmente mit Hilfe der "phage display"-Methode zu finden. Ein geeignetes scFv-Fragment, das spezifisch und relativ stark bindet, wurde identifiziert. Weitere Experimente sind notwendig, um die Affinität der scFv-Fragments zu überprüfen und eventuell zu verbessern, um es für die Ko-Kristallisationsversuche einsetzen zu können.
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G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest membrane protein family and play an essential role in signal transduction through the cell membrane. They are currently the targets of approximately 50 % of the ph
G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest membrane protein family and play an essential role in signal transduction through the cell membrane. They are currently the targets of approximately 50 % of the pharmaceuticals on the market (Klabunde and Hessler, 2002). However, only one high-resolution GPCR structure has been determined up to now, that of bovine rhodopsin (Palczewski et al., 2000). The GPCR activation and regulation mechanisms are still unknown and other GPCR structures are thus required. MePNet (Membrane Protein Network) was a European consortium dedicated to structural studies of GPCRs. The approach was to produce 100 GPCRs in three expression systems (Escherichia coli, Pichia pastoris and Semliki Forest Virus infected mammalian cells) in order to select at each step of the process (production, solubilization, purification) the constructs that fulfilled quantity and quality (functionality) requirements for crystallization trials. In our team, we screened 38 of the 100 targets in P. pastoris. For each receptor, the clone with the highest production level was identified by dot-blot. The size and homogeneity of each receptor were then analyzed by Western-blot. The human adenosine A2A receptor showed a well-defined and pronounced single band and was thus selected for further characterization. The adenosine A2A receptor is a GPCR mainly localized in the central nervous system and, as it antagonizes dopaminergic activity, it has great potential as a drug target for the treatment of Parkinson’s disease. Functional characterization by binding assays with the specific antagonist [3H]-ZM241385 demonstrated a Bmax of 56 +/- 3 pmol/mg i.e. pmol of binder per milligram of total membrane protein, and a KD of 0.40 +/- 0.02 nM. Receptor production was then improved by lowering the induction temperature, decreasing the induction time and adding DMSO to the medium. For large-scale production, fermention reached around 300 g cells (wet weight)/L culture, which provided 43 mg of functional receptor in membranes per liter of culture. Functional solubilization was achieved with dodecyl-β-D-maltoside and the soluble yield was increased to 70-80 % of the membrane content by addition of cholesteryl hemisuccinate and increasing the ionic strength. The receptor was successfully purified via Ni-NTA and monomeric avidin chromatography in the presence of the antagonist ZM241385. This strategy produced a pure, homogeneous and stable receptor preparation with functionality demonstrated by radioligand binding assays. The total receptor yield after purification was routinely around 20 % of the membrane functional receptor content and 2 g of membranes provided 4 mg of pure receptor for crystallization trials. GPCRs are very difficult targets for crystallization, and co-crystallization with antibody fragments has been shown to be a successful method for crystallization of membrane proteins. In order to develop such a tool for the adenosine A2A receptor, a single-chain Fv (scFv) fragment specific to the purified receptor was selected by phage display. The receptor was functionally immobilized on the surface of streptavidin beads and after two rounds of selection, 6 different phages were identified several times. After production in E. coli and purification via Ni-NTA affinity chromatography, 4 out of the 6 scFv fragments were sufficiently enriched to be tested by ELISA. For the ELISA, the receptor was functionally immobilized via the biotinylation domain of the construct in a 96-well streptavidin-coated plate. The antibody fragments binding to the receptor were identified based on interaction with HRP-conjugated protein L. One scFv fragment gave a positive ELISA signal 10 fold above background and titration of the scFv fragment binding to the receptor was specific and saturable. However no complex of scFv fragment and receptor was observed on gel filtration. In order to have a more sensitive detection method, the scFv fragment was labeled with fluorescein: a complex was then observed up on gel filtration but the binding appeared to be non-specific. A pull-down assay with immobilized non-labeled scFv fragment finally confirmed the specificity of the binding, but also the low affinity of the interaction. Affinity maturation of this specific scFv fragment by a random mutagenesis and selection process should improve this parameter in order to obtain an adapted tool for co-crystallization.
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Metadaten
Author:Cécile Prual
URN:urn:nbn:de:hebis:30-45596
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2007/06/19
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2006/10/17
Release Date:2007/06/19
Pagenumber:136
Note:
Diese Dissertation steht leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext im WWW zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS PPN:323008453
Institutes:Pharmazie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Weitere biologische Literatur (eingeschränkter Zugriff)
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

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