Open Access

Sebastián Alfredo Tamayo Rojas

• A promising strategy to reduce the dependency from fossil fuels is to use the yeast Saccharomyces cerevisiae to bioconvert renewable non-food feedstocks or waste streams, like lignocellulosic biomass, into bioethanol and other valuable molecule blocks. Lignocellulosic feedstocks contain glucose and significant fractions of the pentoses xylose and arabinose in varying proportions depending on the biomass type. S. cerevisiae is an efficient glucose consumer, but it cannot metabolize xylose and arabinose naturally. Therefore, extensive research using recombinant DNA techniques has been conducted to introduce and improve the biochemical pathways necessary to utilize these non-physiological substrates. However, any functional pathway capable of metabolizing D xylose and L arabinose in S. cerevisiae requires the transport of these sugars across the plasma membrane. The endogenous sugar transport system of S. cerevisiae can conduct a limited uptake of D-xylose and L-arabinose; this uptake enables only basal growth when the enzymatic pathways are provided. For this reason, the uptake of D xylose and L-arabinose has been recognized as a limiting step for the efficient utilization of these non-physiological substrates. Gal2, a member of the major facilitator superfamily, is one of the most studied hexose transporters in S. cerevisiae. Although its expression is repressed in the presence of glucose, it also transports this sugar with high affinity when constitutively expressed. Recent efforts to engineer yeast strains for the utilization of plant biomass have unraveled the ability of Gal2 to transport non-physiological substrates like xylose and arabinose, among others. Improving Gal2 kinetic and substrate specificity, particularly for pentoses, has become a crucial target in strain engineering. The main goal of this study is to improve the utilization of xylose and arabinose by increasing the cell permeability of these non physiological substrates through the engineering of the galactose permease Gal2. GAL2 gene expression depends on galactose, which acts as an inducer; nevertheless, even in the presence of galactose, glucose act as a strict repressor; consequently, GAL2 gene is usually placed under the control of a constitutive promoter. However, the presence of glucose additionally triggers the Gal2 degradation, which is mediated by the covalent attachment of the small 76 amino acid protein ubiquitin (Ub) to the targeted transporter; in a multi-step process called ubiquitination. Ubiquitination of hexose permeases involves the activation of the Ub molecule by the E1 Ub-activating enzyme using ATP; then, the activated Ub is transferred to a specific Ub-conjugating enzyme E2, which donates the Ub indirectly through a specific HECT E3 enzyme (Rsp5) to a lysine residue of the substrate, with the aid of an adaptor protein which recognizes the target (Rsp5-adaptor). Ubiquitinated permeases are sent by membrane invagination to early endosomes, where they encounter ESCRTs (endosomal sorting complex required for transport). The targeted permeases are sorted in intralumenal vesicles (ILV) inside of the endosome, which after several cycles, turns into a multivesicular body (MVB) that subsequently fuses with the vacuole to expose the protein content of the ILVs to lumenal hydrolases for degradation. Gal2 contains 30 lysine residues that may accept the ubiquitin molecule, which targets its degradation. It is known that mono-ubiquitination by Rsp5 on multiple lysine residues is necessary to internalize Gal2 (Horak & Wolf, 2001). However, the authors did not identify the specific lysine residues involved in the ubiquitination processes. This study screened several Gal2 variants where lysine residues were mutated or removed from the protein sequence to discover which lysine residues are likely involved in ubiquitination and consequent turnover of the transporter. The results of the screening showed that mutation of the N terminal lysine residues 27, 37, and 44 to arginine (Gal23KR) produced a functional transporter that, when fused with GFP (Gal23KR_GFP), showed an exclusive localization at the plasma membrane in cells growing in galactose or glucose as a sole carbon source (Tamayo Rojas et al., 2021b). This study furthermore evaluated upstream signals caused by phosphorylation which triggers ubiquitination and consequent turnover of the targeted protein; using similar screening approaches to assess the stabilization of Gal2 by lysine residue modifications, it was possible to identify that N terminal serine residues 32, 35, 39, 48, 53, and 55 are likely involved in the internalization of Gal2, since a Gal2 construct where all these serines were mutated to alanine residues and tagged with GFP (Gal26SA_GFP) exhibited practically complete localization at the plasma membrane in cells growing in galactose or glucose as a sole carbon source (Tamayo Rojas et al., 2021b)...
• Heutzutage besteht eine große Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen wie Erdöl, Kohle und Erdgas. Diese spielen sowohl im Energiesektor als auch bei der Synthese von Massen- und Feinchemikalien eine entscheidende Rolle. Die Verfügbarkeit fossiler Brennstoffe ist jedoch auf einige wenige Vorkommen weltweit beschränkt, sodass eine Nutzung durch die Erschöpfung der Vorkommen sowie aus wirtschaftlichen und geopolitischen Gründen begrenzt ist. Außerdem trägt die Nutzung fossiler Brennstoffe aufgrund der hohen Treibhausgasemissionen, die bei der Verarbeitung oder Verbrennung in die Atmosphäre gelangen, zum Klimawandel bei. Eine vielversprechende Strategie zur Verringerung der Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen ist die Verwendung der Hefe Saccharomyces cerevisiae zur Biokonvertierung erneuerbarer Non-Food-Rohstoffe oder Abfallströme, wie beispielsweise lignozellulosehaltiger Biomasse, in Bioethanol und andere wertvolle Moleküle. Lignozellulosehaltige Rohstoffe bestehen aus Glukose und – je nach Biomasseart in unterschiedlichen Anteilen – den Pentosen Xylose und Arabinose. S. cerevisiae ist ein effizienter Glukoseverbraucher, kann aber Xylose und Arabinose nicht auf natürliche Weise verstoffwechseln. Daher wurden umfangreiche Forschungsarbeiten mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken durchgeführt, um die biochemischen Stoffwechselwege, die für die Nutzung dieser nichtphysiologischen Substrate erforderlich sind, in S. cerevisiae einzubringen und zu verbessern. Jeder funktionelle Stoffwechselweg, der D-Xylose und L-Arabinose in S. cerevisiae verwerten kann, erfordert jedoch den Transport dieser Zucker durch die Zellmembran. Das endogene Zuckertransportsystem von S. cerevisiae kann D-Xylose und L-Arabinose nur in begrenztem Umfang aufnehmen; diese Aufnahme ermöglicht nur ein basales Wachstum, sofern die enzymatischen Stoffwechselwege zur Verfügung stehen. Aus diesem Grund wurde die Aufnahme von D-Xylose und L-Arabinose als limitierender Schritt für die effiziente Nutzung dieser nicht-physiologischen Substrate, insbesondere bei niedrigen Konzentrationen, erkannt. In S. cerevisiae wird die Aufnahme von Zuckern durch die Plasmamembran von der Familie der „Sugar Porter“ (SP) vermittelt, die zur „Major Facilitator Superfamily“ (MFS) gehört, der größten und vielfältigsten Superfamilie sekundärer Carrier, die in allen Reichen des Lebens zu finden ist. Die SP-Familie besteht aus einer Vielzahl von Membrantransportproteinen, die je nach Substrat oder Bandbreite der transportierten Substrate in verschiedene phylogenetische Cluster zusammengefasst werden können. Hefe-Hexosetransporter haben, wie viele Mitglieder der MFS, 12 mutmaßliche Transmembrandomänen (TM), die in zwei Bündeln von 6 TM organisiert sind. Die beiden Bündel sind durch eine lange und flexible intrazelluläre Schleife verbunden, die strukturelle Elemente enthalten kann. Jedes Bündel von 6 TM besteht aus einem Paar invertierter 3 TM, was nahelegt, dass drei TM-Wiederholungen eine grundlegende Struktureinheit für MFS-Proteine bilden. In S. cerevisiae gibt es 17 funktionelle Hexose-Transporter, die von den Genen HXT1 bis HXT17 und GAL2 kodiert werden (abgesehen von HXT12, einem Pseudogen). Die große Anzahl von Hexose-Transportern in S. cerevisiae ermöglicht die Anpassung an eine Umgebung mit schwankenden Zuckerkonzentrationen, wie sie während einer Fermentation üblicherweise auftreten. Unter physiologischen Bedingungen scheinen die wichtigsten Hexose-Transporter Hxt1 bis Hxt4, Hxt6 und Hxt7 zu sein. Die Expression des GAL2-Gens erfolgt nur in Galaktose-limitierten Kulturen. Gal2 ist jedoch einer der am besten untersuchten Hexose-Transporter in S. cerevisiae. Obwohl seine Expression in Gegenwart von Glukose unterdrückt wird, transportiert er diesen Zucker auch bei konstitutiver Expression mit hoher Affinität. Jüngste Versuche Hefestämme für die Verwertung pflanzlicher Biomasse zu entwickeln, haben die Fähigkeit von Gal2 entschlüsselt nicht-physiologische Substrate wie Xylose und Arabinose zu transportieren. Die Verbesserung der kinetischen Eigenschaften und der Substratspezifität von Gal2, insbesondere für Pentosen, ist zu einem wichtigen Ziel bei der Hefe-Stammentwicklung geworden. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, die Verwertung von Xylose und Arabinose zu verbessern, indem die Zellpermeabilität für diese nicht-physiologischen Substrate durch die gentechnische Veränderung der Galaktose-Permease Gal2 erhöht wird. Wie bereits erwähnt, hängt die Expression des GAL2-Gens von Galaktose ab, die als Induktor wirkt. Doch selbst in Gegenwart von Galaktose wirkt Glukose als strenger Repressor. Daher wird das GAL2-Gen normalerweise von einem konstitutiven Promotor kontrolliert. Die Anwesenheit von Glukose löst allerdings zusätzlich den Abbau von Gal2 aus. Der Abbau von Gal2 wird durch die kovalente Bindung des kleinen 76-Aminosäure-Proteins Ubiquitin (Ub) an den Zieltransporter in einem mehrstufigen Prozess, der Ubiquitinierung genannt wird, vermittelt...