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Sabine Meurer

• Nitric oxide (NO) is a potent mediator with pleiotropic functions such as inhibition of platelet aggregation, smooth muscle relaxation and regulation of neuronal transmission. These effects are mostly mediated by intracellular NO-sensitive guanylyl cyclases (GCs) which convert GTP into the second messenger, cGMP. This messenger in turn activates multiple downstream effectors such as cGMP-dependent protein kinases, cGMP-regulated ion channels and cGMPdependent phosphodiesterases. Mammalian NO-sensitive GCs are obligate heterodimers of an α and β subunit each. Given that these enzymes play a key role in cGMP-mediated pathways, one may anticipate that mechanisms other than allosteric activation via NO may exist to regulate the production and turnover of cGMP. In this thesis, novel aspects of the regulation of the most abundantly expressed GC heterodimer α1β1 are presented. A possible mechanism of regulation that was tested here, is tyrosine phosphorylation. Using anti-phosphotyrosine antibodies, the phosphorylation of the β1 subunit was detected after incubation of β1-overexpressing COS-1 cells with protein tyrosine phosphatase (PTP) inhibitors such as pervanadate and bpV(phen). β1 phosphorylation on tyrosines was also observed in PC-12 cells which endogenously express GC and in rat aorta after inhibition of PTPs. Furthermore, hydrogen peroxide was found to be a physiological stimulus for the induction of reversible β1 tyrosine phosphorylation in intact cells. Using phenylalanine mutants of different tyrosines, residue 192 (Y192) of β1 was identified as the major phosphorylation site. Consistent with this finding, sequence analyses showed that Y192 forms part of a motif that resembles a preferential target site for Src-like kinases. When tyrosine-phosphorylated, this motif exposes a typical SH2 docking site for members of the Src kinase family. Experiments with inhibitors of Src kinases, PP1 and PP2, clearly showed that phosphorylation of Y192 is Src-dependent. Preincubation of β1-expressing cells with these inhibitors significantly reduced the level of phosphorylated β1 after bpV(phen) treatment. Furthermore, co-expression of β1 with Src led to a strong phosphorylation of this subunit. Co-precipitation experiments showed that Src interacts with GC. Interestingly, kinases of the Src family are recruited to β1 via the SH2 domain upon phosphorylation of Y192. Together, these results indicate that Src kinases phosphorylate tyrosine 192 thereby creating a docking site for their own SH2 domains. Kinase bound to GC may then catalyze phosphorylation of GC or other downstream effectors. Inhibition of PTPs altered GC activity in two ways: it increased both the basal activity and the YC-1- and BAY 41-2272-stimulated activity two-fold, and it reduced the sensitivity of the enzyme towards NO. The detailed mechanism of action is still unknown, but experiments using the mutant β1[Y192F] demonstrated that residue 192 is not responsible for these effects. Another major focus of this thesis was the identification of novel GC binding proteins. Using the yeast two-hybrid approach, the carboxy-terminal portion of a protein named AGAP1 (amino acid (aa) 399-804) was found to interact with the catalytic domain of α1 (aa 466-690) and with the regulatory domain of β1 (aa 1-348). Human AGAP1 is a multidomain protein of 804 amino acids with a calculated molecular mass of 89,1 kDa comprising an Arf-GAP (GAP:GTPase activating protein), a putative GTPase domain, two Ankyrin repeats and a PHdomain. Co-precipitation experiments using lysates from mammalian cells overexpressing both binding partners confirmed the interaction of AGAP1 with the GC subunits. Immunofluorescence analyses demonstrated that AGAP1 co-localizes with GC in the cytoplasm of COS-1 cells. In Northern blots, AGAP1 mRNA was detected in various human and murine tissues showing a comparable expression pattern described for the mRNA of α1 and β1. Using an AGAP1-specific antibody, endogenous protein was precipitated from lysates of HEK-293 cells derived from human embryonic kidney. The same antibody efficiently cross-reacted with the rat homologue (rAGAP1) and immunoprecipitated endogenous rAGAP1 from lysates of PC-12 cells, aorta and heart. The molecular mass of rAGAP1 is larger than that of the human protein, possibly due to an additional exon present in the rat genome. Like β1, AGAP1 is a substrate for tyrosine kinases. Phosphorylation of AGAP1 was detected after inhibition of PTPs or by coexpression of Src. Furthermore, the kinase inhibitor PP2 strongly impaired phosphorylation of AGAP1 after pervanadate treatment suggesting that tyrosine kinases of the Src family are involved. Measurements of cGMP production showed that AGAP1 has no influence on the activity of NO-sensitive GC. Interestingly, inhibition of PTPs potently increased the complex formation between AGAP1 and GC indicating that the interaction between these two proteins is modulated by reversible tyrosine phosphorylation. Whether this effect is due to the phosphorylation of AGAP1 or GC is still unknown. AGAP1 associates with endosomes and exposes Arf-GAP activity towards Arf1 and Arf5 which are involved in vesicular transport. Thus, one may hypothesize that binding of α1β1 to AGAP1 targets GC to distinct subcellular compartments in close proximity to cGMP-dependent effectors, thereby optimizing cGMP generation and fostering cGMP-driven actions. Taken together, these results demonstrate that beside the modulation of GC by NO the enzyme is regulated by tyrosine phosphorylation and interaction with AGAP1.
• Die NO-sensitive Guanylat-Cyclase (GC), ein Heterodimer aus den Untereinheiten (UE) α und β, ist der wichtigste physiologische Rezeptor für den gasförmigen Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO). Durch Bindung von NO an die Hämgruppe des Enzyms wird eine Konformationsänderung induziert und damit die cGMP-Synthese stimuliert. Als Bindeglied zwischen NOSynthasen und cGMP-abhängigen Effektorproteinen, wie zum Beispiel Phosphodiesterasen, Proteinkinase G und cGMP-regulierten Ionenkanälen, ist die GC an der Regulation kardiovaskulärer und neuronaler Prozesse beteiligt. Der Mechanismus, der zur Aktivierung des Enzyms durch den endogenen Aktivator NO führt, ist gut untersucht, jedoch ist wenig über Regulationsmechanismen bekannt, die zur Feinregulation des Enzyms beitragen, wie etwa die Bindung an regulatorische Proteine, posttranslationale Modifikationen oder subzelluläre Translokationen. In der vorliegenden Arbeit sind neue Aspekte der Regulation der α1β1-Isoform der humanen GC beschrieben. Neben der direkten Tyrosin-Phosphorylierung des Enzyms konnte erstmals eine Modulation der Aktivität durch Hemmung von Protein-TyrosinPhosphatasen (PTP) gezeigt werden. Weiterhin wurde eine durch Tyrosin-Phosphorylierung regulierte Interaktion zum neuartigen Multidomänenprotein AGAP1 gezeigt. Die Tyrosin-Phosphorylierung der Guanylat-Cyclase konnte in GC-überexprimierenden COS1-Zellen und mit endogenem Protein in PC-12-Zellen und Rattenaorten nach Inkubation mit den PTP-Inhibitoren Pervanadat oder bpV(phen) unter Verwendung von anti-PhosphotyrosinAntikörpern nachgewiesen werden. Hierbei erwies sich stets die β1-UE nicht aber die α1-UE als Substrat für Tyrosin-Kinasen. Als physiologischen Stimulus für die reversible β1-Phosphorylierung wurde Wasserstoffperoxid, ein Vertreter der reaktiven Sauerstoffspezies, gefunden. Durch Kartierungsexperimente konnte Tyrosin 192 (Y192) der β1-UE als dominante Phosphorylierungsstelle identifiziert werden. Die genaue Analyse des Sequenzbereichs um Y192 ergab, dass diese Stelle einer von Src-Kinasen bevorzugten Substratsequenz entspricht und nach Phosphorylierung als Adapterstelle für SH2-Domänen der Src-Kinasen fungieren kann. Die Phosphorylierung der GC wird durch Src-Kinasen vermittelt: Zum einen bewirkten die SrcKinasen-Inhibitoren PP1 und PP2 eine deutliche Reduktion der durch Inkubation mit PTPInhibitoren induzierten Phosphorylierung, zum anderen konnte durch Coexpression der Tyrosin-Kinase Src die GC-Phosphorylierung stimuliert werden. Eine Interaktion von Src mit β1 wurde mittels Coimmunpräzipitationen gezeigt. Zusammen mit Experimenten, welche die Bindung der Src SH2-Domäne nach Phosphorylierung der β1-UE an Y192 zeigen, kann nun folgende Hypothese aufgestellt werden: Src-Kinasen phosphorylieren den Tyrosinrest 192 und generieren so eine Adapterstelle für die eigene SH2-Domäne. Die gebundene und aktivierte Kinase bewirkt darauf die Phosphorylierung von weiteren Substraten. Neben der direkten Tyrosin-Phosphorylierung der GC konnte eine Modulation der GC-Aktivität in Anwesenheit von PTP-Inhibitoren gezeigt werden: Die Hemmung von Tyrosin-Phosphatasen hatte sowohl eine Verdopplung der basalen und der mit den Aktivatoren YC-1 und Bay 41-2272 stimulierten GC-Aktivität wie auch eine Erhöhung des EC50-Werts für NO zur Folge. Die für diese Effekte verantwortlichen Faktoren sind derzeit noch unbekannt. Experimente mit der Mutante β1[Y192F] zeigten aber, dass diese Veränderungen der GCAktivität unabhängig von der Phosphorylierung an Y192 sind. Zur Identifizierung von neuen GC-Interaktionspartnern wurde das yeast-two-hybrid-System eingesetzt. Hierbei konnte erstmals AGAP1, ein Mitglied der Arf-GAP-Familie (GAP: GTPase activating protein), als neuer Bindungspartner der GC identifiziert werden. AGAP1 ist ein Multidomänenprotein mit einer Arf-GAP-, einer GTPase-, zwei Ankyrin- und einer PHDomäne. Es besteht aus 804 Aminosäuren (AS), was einer Größe von 89,1 kDa entspricht. In der Hefe konnte die Interaktion von AGAP1-C (AS 399-804) mit der katalytischen Domäne der α1-UE (AS 466-690) und der regulatorischen Domäne der β1-UE (AS 1-348) gezeigt werden. Coimmunpräzipitationen bestätigten die Bindung von AGAP1 an beide Untereinheiten der GC in Säugerzellen. Mittels der Immunfluoreszenzmikroskopie konnte eine Colokalisation von transient exprimierten AGAP1 und GC im Cytoplasma von COS-1-Zellen gezeigt werden. Die AGAP1-mRNA wurde mittels Northern-Blot-Analyse in mehreren humanen und murinen Geweben nachgewiesen, wobei das Expressionsmuster gut mit der für GC publizierten mRNA-Gewebeverteilung übereinstimmt. Unter Verwendung eines AGAP1-spezifischen Antikörpers konnte das endogene humane Protein aus HEK-293-Zelllysaten sowie das homologe Protein der Ratte (rAGAP1) aus Lysaten von PC-12-Zellen, Aortengewebe bzw. Herzmuskel immunpräzipitiert werden. Hierbei zeigte sich, dass rAGAP1 eine größere molekulare Masse als das humane Protein besitzt, was möglicherweise auf ein zusätzliches Exon im Gen der Ratte zurückzuführen ist. AGAP1 ist wie die GC ein Substrat für Tyrosin-Kinasen. Die Phosphorylierung von AGAP1 konnte sowohl durch Hemmung von Tyrosin-Phosphatasen als auch durch Coexpression von Src induziert werden. Des Weiteren bewirkte die Hemmung von Src-Kinasen durch PP2 eine deutliche Reduktion der AGAP1-Phosphorylierung. Aktivitätsmessungen mit der GC zeigten, dass AGAP1 keinen Einfluss auf die cGMP-Syntheserate ausübt. Es konnte aber gezeigt werden, dass die Interaktion von AGAP1 mit beiden GC-Untereinheiten in Anwesenheit von PTP-Inhibitoren deutlich verstärkt wurde, was eine Regulation der Interaktion durch reversible Tyrosin-Phosphorylierung impliziert. Ob die Phosphorylierung von AGAP1 oder der GC hierbei involviert ist, wurde bisher nicht geklärt. AGAP1 wurde beschrieben, als ein Protein, das mit Endosomen assoziiert und die GTPase-Aktivität von Arfs, die am Vesikeltransport beteiligt sind, stimulieren kann. Durch Interaktion mit AGAP1 könnte also die subzelluläre Lokalisation der GC reguliert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Feinregulation der GC-Aktivität und möglicherweise auch Lokalisation über Tyrosin-Phosphorylierung sowie Interaktion mit AGAP1 erfolgt.