Open Access

Franziska Therese Arlinghaus

• In the past century, scientists have realized that venoms are a source of a number of natural substances presenting a wide range of pharmacological properties and often displaying a high specificity for their targets. Thus, the field of toxinology came into being, which is defined as the study of toxic substances of biological origin. Toxins are found in a wide variety of animals, including fish, cone snails, scorpions, snakes, and even some mammals. To be classified as venom, these must contain substances, i.e. toxins, which disturb physiological processes and must be deliberately delivered to the target animal. Snakes have evolved one of the most sophisticated mechanisms for venom delivery. Envenomation by snakebite can induce and inhibit aggregation/agglutination of platelets as well as inhibit/activate hemostasis, but also disrupt other physiological functions via neurotoxins and angioneurin growth factors. Snake venoms contain a substantial amount of C-type lectin-related proteins (CLRPs) which are known to function, notably, as integrin inhibitors. CLRPs are heterodimers composed of homologous α and β subunits which can assemble either covalently or noncovalently to oligomers, resulting in αβ, (αβ)2 and (αβ)4 structures. Some of the main targets of CLRPs are membrane receptors, coagulation factors, and proteins essential to hemostasis. The platelet collagen receptors GPVI and α2β1 integrin as well as the von Willebrand factor receptor GPIb play important roles in platelet activation and aggregation and are considered main targets of antithrombotic drugs. In this thesis, the integrin α2β1 is particularly considered as it is the sole collagen-binding integrin on platelets. Reduced expression of this platelet receptor results in dysfunction of platelet responses. Equivalently, overexpression of α2β1 integrin results in an increased risk of thrombosis. As a result, selective inhibitors of the collagen-α2β1 interaction could give rise to effective antithrombotic drugs. Integrins are large receptors which mediate cell-cell contacts and the binding of cells to the extracellular matrix (ECM). Therefore, they play a role in physiological processes, e.g. hemostasis and immunity, as well as in pathological processes, e.g. tumor angiogenesis and atherosclerosis. 18 α and 8 β integrin subunits, with nine α subunits containing an additional A domain, associate non-covalently to form 24 heterodimers with distinct binding specificities. Integrin collagen receptors are a subclass of four receptors which all utilize the β1 subunit. The α2β1 integrin is a collagen-binding receptor expressed not only on platelets, but also on endothelial and epithelial cells. Consequently, this integrin is also essential for cell adhesion and migration playing a role in angiogenesis as well as tumor metastasis. To date, there are five known antagonists of α2β1 integrin: EMS16, rhodocetin, vixapatin, and most recently rhinocetin and flavocetin-A. The first four have been shown to be specific for the integrin α2A domain, the major collagen-binding domain. All these antagonists are CLRPs and present new leads for drug design. In the past few years, many insights into the structure and function of rhodocetin were obtained. Monoclonal antibodies proved to be advantageous in disclosing this information, making them not only useful as therapeutic agents, but also as tools for protein characterization. The venom of the Vipera palaestinae snake was recently shown to contain an α2β1 integrin inhibitor, which prevented the integrin from binding collagen. This inhibitor, called vixapatin, was the initial focus of this dissertation. Vixapatin’s interaction with the α2β1 integrin needed further characterization on a molecular and cellular level to assess its medical potential and monoclonal antibodies were to be used as a tool. Originally, vixapatin had been isolated by reversed-phase high-performance liquid chromatography. To avoid the stringency of this method, for this study, it was replaced with gentler chromatographic methods. First, the α2β1 integrin inhibitor was isolated from the crude snake venom with affinity chromatography using the α2A domain as bait, establishing a method to quickly screen venoms for α2β1-binding proteins which affect the collagenintegrin interaction. The applicability of this method to other snake venoms was shown by isolating an α2A domain-specific toxin from the venom of Trimeresurus flavoviridis. To allow further characterization of both these toxins, gel filtration and ion exchange chromatography were employed to purify the protein without the α2A domain. These classical protein purification methods resulted in similar separation patterns of both the V. palaestinae and T. flavoviridis venom proteins. Purified proteins exhibiting the potential of inhibiting integrinbinding to collagen were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Both VP-i and flavocetin-A, the integrin inhibitors from V. palaestinae and T. flavoviridis, respectively, were shown to have more complex structures than was evident from the purification. Each consisted of four low-molecular-weight proteins which assembled into two bands (for VP-i) or one single band (for flavocetin-A) under non-reducing conditions. Mass spectrometry analyses revealed VP-i to belong to the family of CLRPs, just like vixapatin does. However, these two proteins differed in their primary sequences and only showed homology to one another. The toxin purified from T. flavoviridis revealed this toxin to be flavocetin-A, a heterodimeric CLRP which had so far only been shown to have GPIb-binding activity. At the time of flavocetin-A’s purification, flavocetin-B was co-purified; flavocetin-B consists of the same two α and β subunits, plus an additional γ subunit. As no sequence information is known to date for the γ subunit, it may be one of the additional proteins purified here, along with an additional δ subunit. Therefore, the toxin isolated here may actually consist of four different subunits forming a tetramer of two different heterodimers, generating an (αβ)2(γδ)2 structure. This proposed (αβ)2(γδ)2 flavocetin-A structure has binding sites for both α2β1 integrin and GPIb, with no sterical overlap, as shown by affinity chromatography using the α2A domain and the extracellular domain of the GPIb receptor. The potential of VP-i and flavocetin-A to inhibit integrin-binding to type I collagen was shown during purification: Both toxins efficiently bind to the integrin α2A domain; also, VP-i and vixapatin bind to the A domain with the same affinity. Surface plasmon resonance showed the interaction of flavocetin-A with the α2β1 integrin to be extremely strong and association to be very fast. Furthermore, both toxins were shown to inhibit binding of the wildtype integrin to collagen: VP-i and flavocetin-A acted antagonistically on cell adhesion and cell migration. Initially, the interaction between VP-i and α2β1 integrin was to be further characterized with the help of monoclonal antibodies. However, this proved problematic, the procedure requiring various optimizations. Although, after expert consultation, some monoclonal antibodies could be obtained, the cells were extremely sensitive and gave unsatisfactory results when tested as detection tools in Western blot and immunoassays. Concluding, two novel α2β1 integrin inhibitors were discovered: VP-i and flavocetin-A, which were purified using the same procedure and which have similar functions. Both are Ctype lectin-related proteins which effectively inhibit cell adhesion and migration. This underlines that nature has instrumentalized CLRPs to specifically inhibit α2β1 integrin. Further characterization of VP-i and flavocetin-A will be able to provide leads for future drug development.
• Im vergangenen Jahrhundert haben Wissenschaftler entdeckt, dass tierisches Gift eine reichhaltige Quelle natürlicher Substanzen ist, welche zahlreiche pharmakologische Eigenschaften mit hoher Zielspezifität aufweisen. So entstand das Forschungsgebiet der Toxinologie, welche die Erforschung toxischer Substanzen natürlichen Ursprungs ist. Toxine trifft man in den verschiedensten Tieren an, unter anderem in Fischen, Kegelschnecken, Skorpione, Schlangen und sogar in Säugetieren. Um als Gift eingeordnet zu werden, muss dieses Substanzen enthalten, d.h. Toxine, welche physiologische Prozesse stören. Außerdem muss das Gift dem Opfertier vorsätzlich injiziert werden. Schlangen haben eines der fortschrittlichsten Mechanismen für die Giftzustellung entwickelt. Die durch ein Schlangenbiss hervorgerufen Vergiftung kann die Aggregation/Agglutination von Thrombozyten sowohl auslösen, als auch hemmen; außerdem kann die Blutstillung aktiviert oder gehemmt werden. Weiterhin führt eine Vergiftung zur Störung anderer physiologischer Prozesse mittels Neurotoxinen und Wachstumsfaktoren. Schlangengifte bestehen zum Großteil aus C-Typ Lektin-artigen Proteinen (CLRP), welche u.a. als Integrin-Inhibitore fungieren. Die CLRP sind Heterodimere, die aus homologen α und β Untereinheiten zusammengesetzt werden. Diese können wiederum, durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen, Oligomere bilden mit αβ, (αβ)2 und (αβ)4 Strukturen. Die überwiegenden Bindungspartner der CLRP sind Membranrezeptoren, Koagulationsfaktoren sowie Proteine, die für die Blutstillung essenziell sind. Die Kollagenrezeptoren GPVI und α2β1 der Thrombozyten sowie der von Willebrand Faktor Rezeptor GPIb spielen entscheidende Rollen während der Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten. Daher betrachtet man diese als wichtigsten Angriffspunkt antithrombotischer Medikamente. In dieser Arbeit wird insbesondere das Integrin α2β1 untersucht, da es das einzige kollagenbindende Integrin auf Thrombozyten ist. Eine verringerte Expression dieses Rezeptors führt zu einer Fehlfunktion der Thrombozytenreaktionen. Gleichermaßen resultiert eine Überexpression des α2β1 Integrins in ein erhöhtes Thromboserisiko. Demzufolge würden selektive Inhibitoren der Kollagen-α2β1 Wechselwirkung die Entwicklung effektiver antithrombotischer Medikamente ermöglichen. Integrine sind Rezeptoren, welche Zell-Zell-Kontakte sowie die Wechselwirkung zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix vermitteln. Folglich haben sie eine bedeutende Funktion in physiologischen Prozessen, z.B. bei der Blutstillung und Immunität, sowie in pathologischen Prozessen, z.B. in der Tumorangiogenese und Arteriosklerose. 18 α und 8 β Untereinheiten assoziieren nicht-kovalent zu 24 Heterodimeren mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten. Die Kollagenrezeptoren bilden eine Untergruppe der Integrine, bestehend aus vier Rezeptoren, welche alle die β1 Untereinheit besitzen. Das α2β1 Integrin ist eines der kollegenbindenden Rezeptoren, welches nicht nur auf Thrombozyten exprimiert wird, sondern auch auf Endothel- und Epithelzellen. Demzufolge ist dieses Integrin auch für die Zelladhäsion und –migration essenziell und spielt demnach eine Rolle in der Angiogenese und der Entstehung von Metastasen. Bis heute sind fünf Antagonisten des α2β1 Integrins bekannt: EMS16, Rhodocetin, Vixapatin und neuerdings Flavocetin-A und Rhinocetin. Mit Ausnahme von Rhinocetin wurde es gezeigt, dass diese Antagonisten alle spezifisch für die Integrin α2A Domäne sind, welche vorrangig für die Kollagenbindung verantwortlich ist. Jeder dieser Antagonisten ist ein CLRP und bietet sich als Vorreiter zur Entwicklung neuer Pharmaka an. In den vergangenen Jahren wurden viele Erkenntnisse zur Struktur und Funktion von Rhodocetin gewonnen. Hierbei erwiesen sich monoklonale Antikörper als großen Vorteil und zeigt auf, dass diese nicht nur als therapeutisches Mittel nützlich sind, sondern auch als Werkzeug für die Charakterisierung von Proteinen eingesetzt werden können. Vor kurzem wurde gezeigt, dass das Gift der Vipera palaestinae Schlange einen α2β1 Inhibitor enthält, welcher die Bindung von Kollagen an Integrin verhindert. Dieser Inhibitor, genannt Vixapatin, war der ursprüngliche Fokus dieser Dissertation. Um das medizinische Potenzial von Vixapatin zu bewerten, sollte seine Wechselwirkung mit dem α2β1 Integrin auf einer molekularen und zellulären Ebene charakterisiert werden. Hierzu sollten u.a. monoklonale Antikörper gegen Vixapatin eingesetzt werden. Zuvor wurde Vixapatin mittels reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) aufgereinigt, jedoch wurden während dieser Arbeit mildere chromatographische Techniken eingesetzt, um die Stringenz der RP-HPLC zu umgehen. Zunächst wurde der α2β1 Inhibitor mittels Affinitätschromatographie mit der α2A Domäne aus dem Rohtoxin isoliert, wodurch eine Methode etabliert wurde mit der Gifte schnell nach α2β1-bindenden Proteinen untersucht werden konnten. Durch die Isolierung eines weiteren α2A-spezifischen Toxins aus dem Gift der Trimeresurus flavoviridis Schlange wurde gezeigt, dass diese Methode auch für andere tierische Gifte Anwendung findet. Zur weiteren Charakterisierung dieser Toxine wurden Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie eingesetzt, um diese ohne die α2A Domäne aufzureinigen. Diese klassischen Aufreinigungsmethoden ergaben ähnliche Muster für sowohl das V. palaestinae, als auch das T. flavoviridis Toxin. Die aufgereinigten Proteine wurden mittels zwei-dimensionaler Gelelektrophorese untersucht und zeigten beide komplexere Strukturen auf als bei der Aufreinigung erkennbar waren. Beide Toxine bestehen aus jeweils vier Proteinen mit geringem Molekulargewicht und bilden zwei Proteinbanden (für VP-i) oder ein einzige Proteinbande (für Flavocetin-A) unter nichtreduzierenden Bedingungen. Die massenspektrometrische Analyse zeigte, dass VP-i zur Familie der CLRP gehörte, genauso wie Vixapatin, jedoch unterscheiden sich die Primärsequenzen dieser Toxine und zeugen nur von einer Homologie. Das Toxin aus T. flavoviridis entpuppte sich als Flavocetin-A, ein heterodimeres CLRP, dem bisher nur GPIbbindende Aktivität nachgewiesen wurde. Zusammen mit Flavocetin-A wurde Flavocetin-B aufgereinigt; Flavocetin-B besteht aus den gleichen zwei α und β Untereinheiten des Flavocetin-A und einer zusätzlichen Untereinheit γ. Da keine Sequenzdaten der γ Untereinheit bis dato bekannt sind, könnte es eines der zusätzlichen, hier aufgereinigten Proteine sein, zusammen mit einer weiteren Untereinheit δ. D.h. das hier aufgereinigte Flavocetin-A könnte möglicherweise aus vier verschiedenen Untereinheiten bestehen, welche aus zwei Heterodimeren ein Tetramer bildet, wodruch sich eine (αβ)2(γδ)2 Struktur ergibt. Die vorgeschlagene (αβ)2(γδ)2 Flavocetin-A Struktur hat nicht sterisch überlappende Bindungsstellen für α2β1 Integrin und GPIb, gezeigt durch eine Affinitätschromatographie mit der α2A Domäne und der extrazellulären Domäne des GPIb Rezeptors. Während der Aufreinigung von VP-i und Flavocetin-A, wurde gezeigt, dass diese die Bindung von Integrin an Kollagen hemmen: Beide Toxine binden an die α2A Domäne; außerdem binden VP-i und Flavocetin-A mit derselben Affinität an die A Domäne. Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie offenbarte, dass die Wechselwirkung zwischen Flavocetin-A und α2β1 äußerst stark ist und die Assoziation äußerst schnell stattfindet. Weiterhin haben beide Toxine die Eigenschaft die Bindung des Wildtyp-Integrins an Kollagen zu hemmen: VP-i und Flavocetin-A wirken antagonistisch auf Zelladhäsion und –migration. Es war ursprünglich geplant gewesen die Wechselwirkung zwischen VP-i und α2β1 Integrin mit Hilfe monoklonaler Antikörper weiter zu untersuchen. Dieses erwies sich als problematisch und das Prozedere der Herstellung monoklonaler Antikörper erforderte verschiedene Optimierungen. Obwohl einige monoklonale Antikörper nach professioneller Beratung und Anpassung der Methode erhalten wurden, waren diese dennoch instabil und mangelhaft als Detektionsmittel in Western Blot und Immunoassays. Zusammenfassend, es wurden zwei neue α2β1 Integrin-Inhibitoren entdeckt: VP-i und Flavocetin-A, welche mit derselben Methode isoliert wurden und ähnliche Funktionen aufzeigen. Beide Toxine sind CLRP und hemmen effizient die Zelladhäsion und –migration. Dieses hebt hervor, dass die Natur die CLRP einsetzt, um α2β1 Integrin spezifisch zu hemmen. Weitere Charakterisierung von VP-i und Flavocetin-A wird Ausgangsprodukte für die zukünftige Medikamentenentwicklung hervorbringen.