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Mohd Khalid Siddiqui

• The mitochondrial respiratory chain consists of NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex-I), succinate:ubiquinone reductase (Complex-II), ubiquinol:cytochrome c reductase (Complex-III), cytochrome c oxidase (Complex-IV) and cytochrome c as an electron mediator between Complex-III and Complex-IV. Paracoccus denitrificans membranes were used as a model system for the association of the mitochondrial respiratory chain. More than 50 years ago, a model was given for a supercomplex assembly formed by stable associations between these complexes. This model gradually shifted by the model of random diffusion given by Hackenbrock et al. 1986 Different independent approaches were used to further analyze this situation in a native membrane environment, thus avoiding any perturbation caused by detergent solubilization: (a) measuring the distance and orientation of the different complexes by multi-frequency EPR Spectroscopy we started to analyze simple system, the interaction between CuA fragment derived from P. denitrificans and various c type cytochrome by Pulsed X band and G band (180 GHz) EPR. Partner proteins for the CuA (excess negative surface charge) were (i) horse heart cytochrome c which contain a large number of positive charges in heme crevice,(ii) the cytochrome c552 soluble fragment (physiological electron donor and have positive charges), and as a control (iii) the cytochrome c1 soluble fragment (negative surface potential, derived from bc1 complex) The measurements were performed at several magnetic field positions varying temperature between 5 to 30 K. Both the X band and the high-field measurements show the existence of a strong relaxation enhancement of the CuA by the specific binding of the P. denitrificans cytochrome c552 and horse heart cytochrome c. This relaxation enhancement is dependent on temperature and provides information about the distance and relative orientation of the two interacting spins within this protein-protein complex. (b) For quantitative information about lateral diffusion of cytochrome c oxidase in the native membrane Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) was used. In this experiment, diffusion coefficients for oxidase differ in the case of supercomplex for wild type membrane and for two deletion mutants lacking either Complex-I or Complex-III. (c) The optical absorption spectroscopy at microsecond level resolution was tried for the translational mobility of oxidase in membrane vesicles. Due to the presence of different hemes in the native membrane, carbon monoxide (CO) used as a probe for the experiment. The optimization of the experimental conditions were carried out to get the optimal signal.
• Die mitochondriale Atmungskette besteht aus vier membrangebundenen, redoxaktiven Proteinkomplexen: der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I), Succinat:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex II), Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase (Komplex III) und Cytochrom c Oxidase (Komplex IV), sowie Cytochrom c als Elektronenüberträger zwischen den beiden letztgenannten Komplexen. Das Bodenbakterium Paracoccus denitrificans wurde bereits in der Vergangenheit häufig als Modellorganismus für Struktur und Funktion der mitochondrialen Atmungskette herangezogen. Die Interaktion zwischen den oben genannten Proteinkomplexen wurde von Hackenbrock et al. 1986 mit dem random diffusion Modell beschrieben. Ein stabiler Superkomplex bestehend aus Komplex III und IV von P. denitrificans konnte erstmals durch Gelfiltration isoliert werden (Berry and Trumpower, 1985). Nachfolgend konnten Superkomplexe auch aus anderen Organismen, wie thermophilen Bakterien (Sone et al., 1987), Hefe- und Säugetiermitochondrien (Schägger und Pfeiffer, 2001) sowie Planzenmitochondrien (Eubel et. al., 2003) isoliert werden. In den Arbeiten von Schägger et al. konnte mittels blue-native Gelelektrophorese nach Digitoninsolubilisierung die Assemblierung stöchiometrischer Superkomplexe in Membranen aus Mitochondrien gezeigt werden. Mittels dieser Methode konnte auch ein Superkomplex bestehend aus Komplex I, Komplex III und Komplex IV mit einer Stöchiometrie von 1:4:4 sowie einer unbestimmten Zahl von Cytochrome c552 -Molekülen aufgereinigt werden (Stroh et al., 2004). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde das Modell des Respirasoms entwickelt, wobei den respiratorischen Superkomplexen eine wichtige Rolle bei der Stabilität der Einzelkomplexe, Substratkanalisierung und Umsatzsteigerung sowie bei der Bildung der Cristae in Mitochondrien zugeordnet wird. Untersuchungen der Superkomplexe in nativen Membranen sind notwendig, da dabei der möglicherweise störende Effekt durch die Solubilisierung von Membranen vermieden wird. Diese Überlegungen bilden die Grundlage dieser Arbeit. Ein Ansatz hierbei ist die Untersuchung der Abstände und Orientierungen zwischen den einzelnen Redoxzentren mittels multi-frequency EPR Spektroskopie. Aufgrund der großen Zahl der Redoxzentren in einem Superkomplex wurde zunächst mit einem einfachen System begonnen, wobei die Interaktionen zwischen dem löslichen CuA Fragment der Cytochrom c Oxidase aus P. denitrificans und verschiedenen c-Typ Cytochromen mittels Pulsed X band (9 GHz) and G-Band (180 GHz) EPR untersucht wurden. Als Bindungspartner für das CuA Fragment mit negativer Oberflächenladung wurden (i) Cytochrom c aus Pferdeherzmitochondrien, (ii) das lösliche Cytochrom c552 Fragment aus P. denitrificans (positive Oberflächenladung) und (iii) als Kontrolle das lösliche Cytochrom c1 Fragment des Komplex III aus P. denitrificans (negative Oberflächenladung) verwendet. Für die Untersuchungen mit Pulsed EPR wurde die logitudinale Relaxation T2 des CuA Fragments gemessen, hierzu wurde eine two-pulse echo Sequenz verwendet und das Signal als Funktion der Zeit τ zwischen den Impulsen aufgezeichnet. Die Messungen erfolgten mit dem CuA Fragment alleine und sequenziell mit den drei oben genannten Bindungspartnern bei verschiedenen Magnetfeldpositionen und in einem Temperaturbereich zwischen 5 und 25 K. Die Untersuchungen zur Orientierung können besser durch high-field EPR Spektroskopie durchgeführt werden, da hier eine höhere Auflösung der Komponenten des anisotropen g-Tensor möglich ist. Die spektralen Komponenten von gx und gy des CuA Fragments können nur im G-Band, jedoch nicht im X-Band aufgelöst werden. Messungen in beiden Bereichen zeigen temperaturabhängige Verstärkungen der Relaxation durch Bindung des Cytochrom c552 Fragments und des Cytochrom c. Das erhaltene Signal beinhaltet Informationen über den Abstand und die relative Orientierung der beiden im transienten Komplex wechselwirkenden Spins. In diesen Experimenten konnten erstmals gepulste EPR Messungen von transienten Komplexen beobachtet werden. Die division method liefert reine dipolare Relaxationsspektren, die quantitativ ausgewertet werden können und so eine Aussage über die Struktur des Proteinkomplexes ermöglichen, ohne dass intramolekulare Wechselwirkungen der untersuchten paramagnetischen Zentren berücksichtigt werden müssen. Die erhaltenen Daten ergaben nach mathematischer Anpassung zwei unterschiedliche Datensätze für den Abstand zwischen den Zentren. Die Werte hierfür lagen einmal im Bereich zwischen 18-23 Å und um 40 Å. Der kleinere Abstand spiegelt die Situation im nativen Komplex wider bei der Elektronentransfer stattfinden kann, aufgrund der Redoxzustände der beiden Bindungspartner kann hier jedoch kein Elektronentransport beobachtet werden. Der größere Abstand wurde in vorangegangenen Modellrechnungen zur Komplexbildung ignoriert und nur die folgenden Parameter wurden in die Rechnungen mit einbezogen: (a) der Abstand zwischen Eisen und Kupfer, der 18 Å für einen erfolgreichen Elektronenübertrag nicht überschreiten darf, (b) die Rolle des Tryptophan 121 (W121) als Elektroneneintrittspunkt und (c) der Abstand zwischen zwischen den Atomen des basischen Bereichs des Cyt c und den Seitenketten des sauren Bereichs des CuA Fragments (Flöck and Helms, 2000; Bertini et al., 2005). Der oben erwähnte Superkomplex aus P. denitrificans beinhaltet auch Cytochrom c552. Natives Cytochrom c552 liegt durch seinen Membrananker ebenfalls in der Membran gebunden vor und besitzt eine weitere geladene Domäne. Diese beiden Elemente tragen wahrscheinlich zur weiteren Stabilisierung des Superkomplexes bei. Um dieser nativen Form Rechnung zu tragen, sollen weitere Experimente folgen, welche mit der vollständigen, in Lipiden rekonstituierten Oxidase und dem membrangebundenen Cytochrom c552 durchgeführt werden, so dass auch größere Komplexe untersucht werden können. Die oben genannten Experimente und Untersuchungen mit solubilisierter Oxidase haben gezeigt, dass die division method alle störenden Signale anderer, integraler, paramagnetischer Zentren entfernen kann. Ergebnisse in einem rekonstituierten System sind derzeit noch in der Durchführung und Auswertung. Ein weitere Methode zur Untersuchung des Superkomplexes in nativen Membranen ist die laterale Diffusion des Komplexes in der Membranebene mittels fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) oder fluorescence correlation spectroscopy (FCS) zu messen. Reits and Neefjes (2001) konnten zeigen, dass der laterale Diffusionskoeffizient von der Masse abhängig ist. Die Diffusionskoeffizienten von mehreren der Redoxkomponenten der mitochondrialen Atmungskette (Ubichinon, Komplex I, Komplex III, Cytochrom c und Cytochrom c Oxidase) konnten bereits mittels FRAP ermittelt werden (Hochli et. al., 1985). Das zur Kristallisation der Cytochrom c Oxidase aus P. denitrificans verwendete Antikörperfragment (Fv ; Ostermeier et al., 1995; Ribrioux et al., 1995) bindet ebenfalls die in die Membran eingebettete Oxidase, so dass es zur Anfärbung der Oxidase in zwei Schritten wie folgt verwendet werden kann: (a) Ein Fluoreszenzfarbstoff (Cy5 or FITC) der an die Lysinseitengruppen auf der Oberfläches des Fv kovalent bindet wird mit dem Fv gemischt. (b) Das gereinigte, angefärbte Fv wird mit nativen Membranen gemischt und bindet an Komplex IV, wodurch dieser indirekt angefärbt wird. So kann die Diffusionskonstante bestimmt werden, da die Masse des Superkomplex erine Größenordnung höher sein sollte als die des Komplex IV alleine. Dies soll mittels FCS im Wildtyp und in Deletionsstämmen, die entweder Komplex I oder Komplex III defizient sind, gemessen werden. Die ersten Ergebnisse mit einem rekonstituierten System sind viel versprechend, jedoch ist die Vesikelgröße der nativen Membranen mit 150 nm zu klein. Verschiedene Methoden der Membranfusion, wie Kalziuminduktion, niedriger pH-Wert und niedrige Temperatur oder Elektrofusion wurden im Rahmen der Optimierung durchgeführt. Die Membranfusion unter Zusatz von Asolectin bei pH 6,0 lieferte Vesikel mit einer Größe von 800 nm, wie im Elektronenmikroskop mittels negative stain gezeigt werden konnte. Im Anschluß wurden die Experimente zur Bestimmung des lateralen Diffusionskoeffizienten mittels FCS durchgeführt. Die ermittelten Daten befinden sich momentan noch in der Bearbeitungsphase. In einem weiteren Ansatz wurde ebenfalls versucht, quantitative Informationen über die Diffusionskonstante der Cytochrom c Oxidase in nativen Membranen zu erhalten. Hierzu wurde die Absorptionsspektroskopie genutzt, um mittels Kohlenmonoxid (CO) als Mobilitätssonde für die flash Photolyse die laterale Beweglichkeit der Cytochrom c Oxidase in Membranvesikeln (Kawato and Kinosita, 1981) zu bestimmen. Während der Optimierungsphase konnte eine Verbesserung der Aufnahme des Signals während der Oxidase Reorientierung erreicht werden. CO bindet an das binukleäre Zentrum der Cytochrom c Oxidase im reduzierten Zustand, was anhand der Soret-Bande im Spektrum verfolgt werden kann. Die ersten Versuche wurden mit in Phospholipiden rekonstituierter Cytochrom c Oxidase durchgeführt, wobei Temperatur, Kohlenmonoxid- und Dithionitkonzentrationen, welches zur Reduktion des Häm-Liganden dient, variiert wurden. Die erhaltenen Daten wurden wie bei Chizhov et al., 1996 beschrieben analysiert, und die Kinetik der Rückbindung des CO liefert zwei Zeitkonstanten, 1 µs und 20 ms. Die zweite wird für die Rotationsmessungen der Cytochrom c Oxidase in nativen Membranen verwendet. Diese Messungen wurden ebenfalls mit nativen Membranen wiederholt, jedoch war der Cytochrom c Oxidasegehalt zu niedrig, so dass das Hintergrundrauschen eine Auswertung nicht möglich machte. Um dieses Problem zu lösen, wurde P. denitrificans auf Methylaminmedium angezogen und die daraus gewonnen Membranen in einem Saccharosegradienten weiter ankonzentriert. Im nächsten Schritt sollen diese nativen Membranen mit polarisiertem Licht untersucht und die Diffusionseigenschaften des Komplexes bestimmt werden, um weitere Aussagen über die Organisationsstruktur treffen zu können.