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Selina Christen

• Type 1 diabetes (T1D) is a chronic T cell-mediated autoimmune disorder that results in the destruction of insulin-producing pancreatic ß cells leading to life-long dependence on exogenous insulin. Attraction, activation and transmigration of inflammatory cells to the site of ß-cell injury depend on two major molecular interactions. First, interactions between chemokines and their receptors expressed on leukocytes result in the recruitment of circulating inflammatory cells to the site of injury. In this context, it has been demonstrated in various studies that the interaction of the chemokine CXCL10 with its receptor CXCR3 expressed on circulating cells plays a key role in the development of T1D. Second, once arrived at the site of inflammation adhesion molecules promote the extravasation of arrested cells through the endothelial cell layer to penetrate the site of injury. Here, the junctional adhesion molecule (JAM) JAM-C expressed on endothelial cells is involved in the process of leukocyte diabedesis. It was recently demonstrated that blocking of JAM-C efficiently attenuated cerulein-induced pancreatitis in mice. In my thesis I studied the influence of the CXCL10/CXCR3 interaction on the one hand, and of the adhesion molecule JAM-C on the other hand, on trafficking and transmigration of antigen-specific, autoaggressive T cells in the RIP-LCMV mouse model. RIP-LCMV mice express the glycoprotein (GP) or the nucleoprotein (NP) of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) as a target autoantigen specifically in the ß cells of the islets of Langerhans and turn diabetic after LCMV-infection. In my first project I found that pharmacologic blockade of CXCR3 during development of virus-induced T1D results in a significant delay but not in an abrogation of overt disease. However, neither the frequency nor the migratory properties of islet-specific T cells was significantly changed during CXCR3 blockade. In the second project I was able to demonstrate that JAM-C was upregulated around the islets in RIP-LCMV mice after LCMV infection and its expression correlated with islet infiltration and functional ß-cell impairment. Blockade with a neutralizing anti-JAM-C antibody slightly reduced T1D incidence, whereas overexpression of JAM-C on endothelial cells did not accelerate virus-induced diabetes. In summary, our data suggest that both CXCR3 as well as JAM-C are involved in trafficking and transmigration of antigen-specific autoaggressive T cells to the islets of Langerhans. However, the detection of only a moderate influence on the onset of clinical disease during CXCR3 or JAM-C blockade reflects the complex pathogenesis of T1D and indicates that several different inflammatory factors need to be neutralized in order to achieve a stable and persistent protection from disease.
• Type 1 Diabetes (T1D) ist eine chronische T Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung, welcher die Zerstörung der ß Zellen der Langerhans'schen Inseln im Pankreas zugrunde liegt. Da die ß Zellen für die Insulinproduktion verantwortlich sind, führt dies zu einem absoluten Insulin-Mangel. Es wird angenommen, dass die Kombination von genetischer Veranlagung und Umweltfaktoren, wie Infektionen durch Pathogene oder Xenobiotika, die Entstehung von Autoimmunerkrankungen herbeiführen kann. Eine Entzündung in den ß Zellen, wird durch eine Rekrutierung von aktivierten Leukozyten, wie T Zellen, B Zellen und dentritische Zellen, ausgelöst. Für die Rekrutierung, Aktivierung und Transmigration von Leukozyten sind Interaktionen zwischen Oberflächenrezeptoren von zirkulierenden Leukozyten und endothelialen Entzündungsfaktoren oder Adhäsionsmolekülen verantwortlich. Obschon viel über die Immunpathogenese von T1D bekannt ist, gibt es immer noch Unklarheiten mit welchen Mechanismen und Interaktionen die antigen-spezifischen T Zellen zu den ß Zellen gelangen und wie sie durch die Endothelzellschicht der Inselzellen wandern. In meinem Projekt habe ich mich mit Hilfe des RIP-LCMV Maus-Modell für T1D mit dem Thema der gerichteten Zellwanderung und Extravasation detaillierter auseinandergesetzt. Unter der Kontrolle des Ratten-Insulinpromotors (RIP) exprimieren transgene RIP-LCMV-Mäuse das Glycoprotein (GP) oder das Nucleoprotein (NP) des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) spezifisch in den ß Zellen. In den RIPLCMV Mäusen werden die Antigene (GP/NP) als körpereigen erkannt. Da die antigen-spezifischen Vorläufer T Zellen die GP oder NP Moleküle "tolerieren" oder "ignorieren" werden die ß Zellen nicht zerstört und die transgenen Mäuse entwickeln keinen T1D. Eine Infektion von RIP-LCMV Mäusen mit LCMV hingegen verursacht eine Entzündung im Pankreas, die zu einer Anlockung und Aktivierung von Leukozyten und antigenspezifischen Vorläufer T Zellen führt. Die aktivierten LCMV-spezifischen T Zellen eliminieren nicht nur das Virus sondern beginnen auch die auf den ß Zellen exprimierten (viralen) Zielantigene anzugreifen. Dieser autoimmune Vorgang verursacht die Zerstörung der ß Zellen und endet in T1D in nahezu 100% der infizierten RIP-LCMV-Mäuse. 3.1 Blockierung von CXCR3 während T1D: Die virusinduzierte Entzündung wird begleitet durch den Ausstoß von Chemokinen, die mit Rezeptoren, welche von Leukozyten exprimiert werden, interagieren und die eine gerichtete Zellwanderung zu der beschädigten (virusinfizierten) Stelle vermitteln. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass das Chemokin CXCL10 eine wesentliche Rolle in der Anlockung von autoaggressiven T Zellen zu den Langerhans'schen Inseln spielt. In unserem RIP-LCMV Maus-Modell beeinflusst die Neutralisation oder die Überexprimierung von CXCL10 die Entwicklung von virusinduziertem T1D signifikant. Der Rezeptor CXCR3, welcher mit CXCL10 interagiert, wird vorwiegend durch die aktivierten TH1-typ T Zellen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass in CXCR3-defizienten RIP-LCMV Mäusen die Entwicklung des T1D signifikant verzögert ist. Ferner wurden in einem Patienten mit T1D preproinsulin-spezifische CD8+ T Zell Klone gefunden, die CXCR3 auf ihrer Oberfläche exprimierten. Diese CD8+ T Zellen konnten tatsächlich menschliche ß Zellen zerstören. Da in mehreren Studien nachgewiesen wurde, dass die Interaktion von CXCL10 mit CXCR3 eine wichtige Rolle in Autoimmunerkrankungen spielt, haben wir den CXCR3 Rezeptor mit einem Antagonist, NIBR2130, blockiert und dessen Einfluss auf die Entstehung von virusinduziertem T1D im RIP-LCMV Maus-Modell untersucht. Die pharmakologische Blockade von CXCR3 während der Entwicklung des T1D führte zu einem milden aber dennoch signifikant verlangsamten Auftreten der Erkrankung. Die Blockade von CXCR3 war allerdings nur vorübergehend wirksam. Die behandelten Mäuse entwickelten einen T1D sobald die Antagonisttherapie abgesetzt wurde. Die Blockierung von CXCR3 hatte keine offensichtliche Auswirkung auf die Pathogenese des T1D. Weder die Funktion der ß Zellen noch die Frequenz und das Migrationsverhalten der Inselspezifischen aggressiven und regulatorsichen T Zellen wurden durch die Therapie signifikant beeinträchtigt. Unsere Resultate zeigen, dass eine Blockade eines wichtigen Chemokinrezeptors nur zu einem moderaten therapeutischen Effekt führt. In Anbetracht der gegebenen Komplexität der T1D Pathogenese einerseits und des Chemokin/Zytokin-Netzwerks andererseits, müssten wohl mehrere zentrale Entzündungsfaktoren blockiert werden, um eine verbesserte therapeutische Wirkung zu erreichen. 3.2 Der Einfluss von JAM-C auf T1D: Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich mich mit der gerichteten Zellwanderung von Leukozyten auseinandergesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich einen weiteren Schritt in der Immunpathogenese des T1D, nämlich die Transmigration der zirkulierenden Zellen durch die Endothelzellschicht, analysiert. Viele verschiedene Adhäsionsmoleküle (Selektine, Integrine und Immunglobulinsuperfamillien Proteine) werden durch Endothelzellen exprimiert und sind in das Rollen, die Aktivierung, die Adhäsion, und dem parazellulären oder transzellulären Durchwandern von Leukozyten involviert. Das junktionale Adhäsionsmolekül C (JAM-C) ist an der parazellulären Transmigration von Leukozyten beteiligt. Es konnte gezeigt werden, dass JAM-C in verschiedenen inflammatorischen Krankheiten, wie Peritonitis, Arthritis oder Pankreatitis in Mäusen eine wichtige Rolle spielt. In einem Maus-Modell für akute Pankreatitis ausgelöst durch die Injektion von Cerulein, konnte eine erhöhte JAM-C Expression im Pankreas beobachtet werden. Ferner wurde mit Hilfe eines neutralisierenden Antikörpers JAM-C blockiert und dabei konnte die Pankreatitis reduziert werden. Die Immunpathogenese im Cerulein-Modell entspricht nicht exakt der des T1D im Menschen. Dennoch wurde in diesem Maus-Modell nachgewiesen, dass die Blockade von JAM-C im Pankreas zu einer reduzierten Zellwanderung und Extravasation von Leukozyten führte. Dies hatte eine Verminderung der lokalen Entzündung der Inselzellen zur Folge. Aufgrund dieser Erkenntnisse haben wir die Rolle von JAM-C im virusinduzierten T1D im RIP-LCMV Maus-Modell untersucht. Wir haben einerseits JAM-C mit einer Antikörperbehandlung blockiert und andererseits JAM-C auf den Endothelzellen überexprimiert. Nachdem RIP-LCMV Mäuse mit LCMV infiziert wurden, konnten wir eine erhöhte Expression von JAM-C beobachten. Diese Zunahme korrelierte gut mit dem Ausmaß der Leukozyteninfiltration und der ß Zell-Zerstörung. Die Neutralisation von JAM-C resultierte in einem leicht reduzierten und teilweise revertierten T1D. Dennoch konnte nur eine moderate Auswirkung auf die Frequenz und das Migrationsverhalten der Inselspezifischen T Zellen festgestellt werden. Die Überexprimierung von JAM-C hatte hingegen keinen Einfluss auf die Entwicklung der Krankheit. Unsere Beobachtungen zeigen, dass JAM-C in der Pathogenese des T1D eine eher untergeordnete Rolle zukommt. Die Funktion von JAM-C wird bei einer Blockade möglicherweise von anderen Adhäsionsmolekülen kompensiert. Somit ist die Infiltration der Langerghans'schen Inseln durch aggressive T Zellen auch bei JAM-C Neutralisierung weiterhin gewährleistet.