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Kaushik Sengupta

• The transcriptional regulator RcsB controls the expression of a minimum of 20 different genes having diverse functionalities and biosynthetic operons in the family of Enterobacteriaceae. While in the heterodimeric complex with the co activator RcsA, the RcsAB box consensus is recognized, DNA binding sites for RcsB without RcsA have also been identified. The conformation of RcsB might therefore be modulated upon interaction with various co activators, resulting in recognition of different DNA targets. In this study the interaction of RcsB with some of these DNA targets have been analysed by a diverse array of techniques including gel shift assay and SPR. The solution structure of the C-terminal DNA-binding domain of RcsB from Erwinia amylovora spanning amino acid residues 129-215 has been solved in this study by heteronuclear NMR spectroscopy. The C-terminal domain is composed of four α-helices where the two central helices of the H-T-H motif are similar to the structures of the regulatory proteins GerE, NarL and TraR. The DNA-binding activity of the C-terminal domain alone is established for the first time in this study and was specified by fluorescence spectroscopy, SPR and NMR titration experiments. The molecular interaction between the individual RcsB domains was analysed by cross-linking experiments and heteronuclear NMR spectroscopy and the amino acid residues of the C-terminal domain involved in this interaction were identified precisely. Another important part of this project was the cell-free production of different Trp analogue labelled RcsB protein. RcsB protein was produced in quite a good yield with different Trp analogue having spectrally enhanced properties. The isolated RcsB alloproteins proved to be ideal for protein interaction studies by fluorescence spectroscopy and the very first evidence of an oligomerization of RcsB due to molecular association has been put forth from these studies. The phosphorylated state of the RcsB protein was mimicked by a beryllofluoride complex in order to study its role in transcriptional regulation. It was found that RcsB alone could bind to DNA targets upon this modification by the beryllofluoride complex. Thus the phosphorylation of the protein that involves the Asp 56 residue induces a structural change of the protein followed probably by a domain movement also, so that the C-terminal domain having the H-T-H DNA binding motif that was previously eclipsed by the N-terminal domain is relieved of this constraint.
• Ein Teil der vorliegenden Arbeit war die Lösung der Struktur der C-terminalen DNABindungsdomände des RcsB Proteins aus Escherichia coli (C-RcsB) durch NMR-Spektroskopie. Die Strukturrechnung wurde mit Hilfe von Dr. Primoz Pristovsek an der Universität Ljubljana durchgeführt. Proteine mit homologer Struktur sind der zur FixJ Familie zählende Regulator für Nitrataufnahme NarL aus E. coli (McCleary et al, 1996), der Sporulations-Regulator GerE aus Bacillus subtilis (Birck et al., 1999) sowie der Autoinduktor-abhängige Regulator TraR aus Agrobacterium tumefaciens (Amster-Choder et al., 1992, 1997). Das C-RcsB Protein zeigt die beste Übereinstimmung mit den Proteinen NarL und GerE. Die Struktur der C-RcsB Domäne beginnt mit der Helix α7 und des zentrale DNA-bindende Helix-Turn-Helix (HTH) Motiv wird aus der Helix α8 sowie der mutmaßlichen Erkennungshelix α9 gebildet. Die ersten 12 Aminosäuren der C-RcsB Domäne konnten nur teilweise zugeordnet werden. Gründe hierfür waren starke Signalüberlappungen in der Poly(His)6-Region sowie eine hohe Beweglichkeit die nur zu sehr schwachen Signale in allen Spektren führte. Einige Resonanzen aus der ProteinHauptkette von den Aminosäureresten Thr-131, Val-136, Ile-141, Leu-151, Asn-197 und Asp-198 konnten nicht zugeordnet werden. Das 15N-HSQC (Heteronuclear-Single-Quantum-Correlation) Spektrum zeigte eine durchschnittliche spektrale Dispersion und Überlappung in der AmidRegion. Zur sequentiellen Zuordnung der Resonanzen wurden daher Triple-Resonanz Spektren mit doppelt markierten Proben aufgenommen. Auf einer Basis von 1618 NOESY Signalen wurden mit dem Programm DYANA 100 Strukturen kalkuliert. Eine Gruppe von 20 Energie-minimierten Strukturen wurde letztlich ausgewählt um die Lösungsstruktur des C-RcsB Proteins im nativen Zustand darzustellen. Die komplette Struktur besteht aus einem Bündel von vier Helices das aus den Helices α7 bis α10 besteht. Die Aminosäuren 143 bis 152 stellen einen beweglichen Linker zwischen der strukturell analysierten C-Terminalen DNA-Bindungsdomäne und der N-terminalen Phosphorylierungsdomäne von RcsB dar. Ähnlich zu den Proteinen NarL und TraR bildet die Helix α6 eine strukturelle Komponente innerhalb dieser Linkerregion. Das bearbeitete C-RcsB Protein umfasst daher die komplette Effektor-Domäne inklusive des Linkerbereiches. Das C-RcsB Protein bildet vermutlich ein Monomer in Lösung und Titrationen in DNA-Bindungsversuchen lassen eine aktive Konformation vermuten. Die beobachtete Inhibierung der Bildung eines RcsAB/DNA Komplexes ist vermutlich auf eine Interaktion des C-RcsB HTH Motivs mit dem DNA-Target zurückzuführen. Zusätzliche Wechselwirkungen mit dem RcsA oder RcsB Protein können jedoch nicht ausgeschlossen werden. Für die Proteine GerE und TraR wird eine Beteiligung der Helix α10 bei der Bildung von Homodimeren beschrieben (Birck et al., 1999; Amster-Choder et al., 1997). Es könnten sich daher auch inaktive Komplexe durch Dimerisierung von C-RcsB mit RcsA oder RcsB bilden...