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Francesca Rapino

• Protein quality control systems (PQC), i.e. UPS and aggresome-autophagy pathway, have been suggested to be a promising target in cancer therapy. Simultaneous pharmacological inhibition of both pathways have shown increase efficacy in various tumors, such as ovarian and colon carcinoma. Here, we investigate the effect of concomitant inhibition of 26S proteasome by FDA-approved inhibitor Bortezomib, and HDAC6, as key mediator of the aggresome-autophagy system, by the highly specific inhibitor ST80 in rhabdomyosarcoma (RMS) cell lines. We demonstrated that simultaneous inhibition of 26S proteasome and selective aggresome-autophagy pathway significantly increases apoptosis in all tested RMS cell lines. Interestingly, we observed that a subpopulation of RMS cells was able to survive the co-treatment and, upon drug removal, to recover similarly to untreated cells. In this study, we identified co-chaperone BAG3 as the key mediator of this recovery: BAG3 is transcriptionally up-regulated specifically in the ST80/Bortezomib surviving cells and mediates clearance of cytotoxic protein aggregates by selective autophagy. Impairment of the autophagic pathway during the recovery phase, both by conditional knock-down of ATG7 or by inhibition of lysosomal degradation by BafylomicinA1, triggers accumulation of insoluble protein aggregates, loss of cell recovery and cell death similarly to stable short harpin RNA (shRNA) BAG3 knock-down. Our results are the first demonstration that BAG3 mediated selective autophagy is engaged to cope with proteotoxicity induced by simultaneous inhibition of constitutive PQC systems in cancer cell lines during cell recovery. Moreover, our data give new insights in the regulation of constitutive and on demand PQC mechanisms pointing to BAG3 as a promising target in RMS therapy.
• Proteinqualitätskontrollsysteme (PQK) sind ein interessanter Ansatzpunkt für die Weiterentwicklung von Krebstherapien [1]. In eukaryotischen Zellen sind zwei konstitutive Hauptkontrollsysteme bekannt, das unfolded protein response system (UPS) und das Aggresome/Autophagie System. Das UPS vermittelt die Ubiquitinierung und Degradierung linearer falsch-gefalteter Proteine durch das 26S Proteasom [2]. Das Aggresome/Autophagie System ist ein selektiver Autophagieprozess in welchem unlösliche und potentiell toxische Proteinaggregate degradiert werden. Hier wird die Autophagiemaschinerie zusammen mit spezifischen Proteinadaptoren, welche die Erkennung und die spezifische lysosomale Degradierung der Zielporteine vermitteln, verwendet [3]. Histondeacetylase 6 (HDAC6) ist eine zytosolische Deacetylase welche die Deacetylierung von α-Tubulin vermittelt. Weiterhin spielt HDAC6 eine vorherrschende Rolle in PQK, da es verschiedene Funktionen innerhalb des Aggresome/Autophagie Systems innehat. Einerseits erkennt HDAC6 Ubiquitin-markierte Proteine durch seine BUZ Domäne (Ubiquitin-bindende Domäne), und ermöglicht deren Aggregation durch Dynein-vermittelten retrograden Transport entlang der Mikrotubuli in Richtung der Mikrotubulus organisierenden Zentrums (MTOC) [4]. Andererseits rekrutiert HDAC6 ein Cortactin Netzwerk, welches für die Autophagosom-Lysosom-Fusion während der Autophagie von Proteinaggregaten benötigt wird, aber für Nährstoffentzug-induzierte Autohagie erlässlich ist [5]. In beiden Fällen wird die katalytische deacetylierende Aktivität von HDAC6 benötigt. Proteasominhibitoren des 26S Proteasoms, wie z.B. Bortezomib, und katalytische Inhibitoren von HDAC6 können synergistisch Zelltod in Tumoren, wie z.B. Ovarialkarzinom [6] induzieren. Durch die simultane Inhibition von zwei Hauptsystemen der PQK entsteht erhöhter proteotoxischer Stress welcher letztendlich zur Induktion von Apoptose führt. Rhabdomyosarkome (RMS), die häufigsten Weichgewebe Tumore bei Kindern, sind sensitiv gegenüber Bortezomib Behandlung [7]. Diese Arbeit beruht auf der Hypothese, dass die Inhibition des Aggresome/Autophagie Systems, durch einen HDAC6 spezifischen katalytischen Inhibitor ST80 [8], zusammen mit Bortezomib Behandlung den Zelltod in RMS verstärken kann. Wie erwartet konnte durch die gleichzeitige Inhibtion beider Systeme die DNA Fragmentierung in allen getesteten RMS Zelllinien erhöht werden. Allerdings konnte eine resistente Subpopulation identifiziert werden, welche die Behandlung überlebte und sich vergleichbar zu unbehandelten Zellen erholte. Unser Ziel war es den molekularen Mechanismus, der dieser Resistenz zugrunde liegt, zu identifizieren. Hier konnten wir das Co-Chaperon BAG3 als Hauptmediator dieser Erholung nach der Bortezomib/ST80 Behandlung identifizieren. BAG3 vermittelt die Degradation von zytotoxischen Proteinaggregaten durch die Induktio von selektiver Autophagie. Dieser Effekt konnte auf verschiedenen Ebenen bewiesen werden. Einerseits zeigen überlebende Zellen erhöhte BAG3 Spiegel, sowohl auf transkriptioneller als auch translationeller Ebene, beginnend 30 Stunden nach der Behandlung. Dieser Effekt wird bis zu drei Tagen während der Erholungsphase aufrechterhalten. Zudem werden die innerhalb dieser drei Tage durch die Doppelbehandlung entstandenen Ubiquitin-positiven zytotoxischen Aggregate nicht abgebaut falls BAG3 durch RNA-Interferenz depletiert wird. Weiterhin zeigen die BAG3-depletierten Zellen keine Anzeichen von Erholung nach der Entfernung der Behandlung, sondern sterben vermehrt apoptotisch und zeigen vermindertes klonogenes Überleben. BAG3 wurde bisher im Zusammenhang mit der Induktion von selektiver Autophagie durch verminderte proteasomale Aktivität beschrieben [9]. BAG3 vermittelt die Erkennung und Aggregation falsch-gefalteter Proteine und ermöglicht deren autophagosomale Erkennung durch direkte Interaktion mit p62 [10]. Überlebende Zellen der Bortezomib/ST80 Behandlung zeigen erhöhte Spiegel an unlöslichen Proteinaggregaten welche mit p62 Spiegeln positiv korrelieren. Wir vermuteten, dass de BAG3-vermitteltern Abbau der p62-Ubiquitin-positiven Proteinaggregate durch autophagosomale-lysosomale Degradierung vermittelt wird. Daher regulierten wir die Autophagieinduktion durch konditionelle RNAi-vermittelte Depletion des Autophagie-Schlüsselproteins ATG7 oder durch die Inhibition der Autophagosom-Lysosom Fusion, durch den Lysosomeninhibitor BafilomycinA1, bis zu drei Tage während der Erholungsphase. Diese Inhibition resultierte in einem vergleichbaren Phänotyp wie die permantente BAG3 Depletion: Die überlebenden Zellen waren nicht mehr in der Lage weiter zu proliferieren, starben vermehrt apoptotisch ab und wiesen Defekte im Abbau von Proteinaggregaten auf. Unsere Daten unterstützen die Annahme, dass die Induktion proteotoxischen Stress, welcher durch die Interferenz mit den konstitutiven PQK Systemen entsteht, einen Überlebensmechanismus aktiviert der durch die transkriptionelle Regulation des Co-Chaperons BAG3 gekennzeichnet ist. BAG3 reaktiviert die Erkennung Ubiquitin-positiver Proteinaggregate durch die Autophagie-Maschinerie, gefolgt vom Abbau der Aggregate und anschließender Zellproliferation.