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Anshu Bhattacharya

• Lysosomes are major degradative organelles that contain enzymes capable of breaking down proteins, nucleic acids, carbohydrates, and lipids. In the last decade, new discoveries have traced also important roles for lysosomes as signalling hubs, affecting metabolism, autophagy and pathogenic infections. Therefore, maintenance of a healthy lysosome population is of utmost importance to the cell to respond to both stress conditions and also homeostatic signalling. For example, for minor perturbations to the lysosomal membrane, the cell activates repair processes which seal membrane nicks. For more extensive damage, autophagy is activated to remove damaged organelles from the cell. on the other hand, during pathogen invasion host cells have also evolved mechanisms to hijack the endolysosomal pathway to facilitate their own growth and replication in host cells. The first part of the thesis work focuses on a lysosomal regeneration program which is activated under conditions where the entire lysosomal pool of the cell is damaged. Upon extensive membrane damage induced by the lysosomotropic drug LLOMe, the cell activates a regeneration pathway which helps in the formation of new functional lysosomes by recycling damaged membranes. I have identified the molecules important for this novel pathway of lysosomal regeneration and showed how the protein TBC1D15 orchestrates this process to regenerate functional organelles from completely damaged membrane masses in the first 2 hours following lysosomal membrane damage. This process resembles the process of auto- lysosomal reformation (ALR)- involving the formation of lysosomal tubules which are extended along microtubules and cleaved in a dynamin2 dependent manner to form proto-lysosomes which develop into fully functional mature lysosomes. These lysosomal tubules are closely associated with ATG8 positive autophagosomal membranes and require ATG8 proteins to bind to the lysophagy receptor LIMP2 on damaged membranes. This process is physiologically important under conditions of crystal nephropathy where calcium oxalate crystals induce damage to lysosomal membranes in nephrons in kidney disease. The second part of the thesis shows how the endolysosomal system of the cell is hijacked by the bacteriaLegionella pneumophila. During Legionella infection the formation of conventional ATG8 positive autophagosomes are blocked due to the protease activity of the bacterial effector protein RavZ which cleaves lipidated ATG8 proteins from autophagosomal membranes. The SidE effectors of Legionella modify STX17 and SNAP29 by the process of non-canonical ubiquitination called phosphoribose-linked serine ubiquitination (PR-Ub). These proteins are essential for the formation of the autophagosomal SNARE complex which is used for fusion of the autophagosome with the lysosome. Upon Legionella infection, PR-UB of STX17 aids in formation of autophagosome-like replication vacuoles. ThesevacuolesdonotfusewiththelysosomebecauseSNAP29isalsoPR-Ubmodified. PR-UbofSTX17 and SNAP29 sterically blocks the formation of the autophagosomal-SNARE complex thereby preventing fusion of the autophagosome with the lysosome. As a result, Legionella can replicate in autophagosome- like vacuoles which do not undergo lysosomal degradation. In absence of PR-Ub modified STX17, bacterial replication is compromised when measured by bacterial replication assays in lung epithelial (A549) cells. Taken together, this thesis highlights two important aspects of the autophagy-lysosomal system- how it responds to extensive membrane damage and its importance in Legionella pneumophila infection. Extensive damage to lysosomal membranes triggers a rapid regeneration process to partially restore lysosomal function before the effects of TFEB dependent lysosomal biogenesis becomes apparent. On the other hand, Legionella pneumophila infection segregates the lysosomes from the rest of the endo-lysosomal system by blocking autophagosome-lysosome fusion. Though lysosomes remain active, they are incapable of degrading pathogens since pathogen containing vacuoles do not fuse with the lysosome.
• Autophagie ist ein konservierter zellulärer Prozess, welcher sich aus dem griechischen Wort „autóphagos“, der für selbst-verdauend steht, ableitet. In vereinfachter Form entspricht dies dem Prozess bei welchem ungebräuchlichen Material, z.B.: beschädigte Organelle oder Proteinaggregate, durch Lysosomen abgebaut wird. Lysosomen sind hierbei der Endpunkt dieses Signalwegs und sind dafür zuständig empfangene Fracht abzubauen. Aktuell gibt es drei verschiedene Arten von Autophagie Signalwegen, welche sich darin unterscheiden wie das abzubauende Material zu den Lysosomen transportiert wird. Diese drei Arten werden als Makroautophagie, Mikroautophagie und Chaperonen-abhängige Autophagie bezeichnet. Im Falle von Makroautophagie werden zum Abbau bestimmte Frachten in speziellen vesikulären Strukturen namens Autophagosomen verpackt. Normalerweise sind Autophagosomen nicht sehr zahlreich in der Zelle vertreten, sondern werden unter Konditionen von zellulärem Stress durch eine komplexe Kaskade von molekularen Signalen gebildet. Gefüllte Autophagosomen verschmelzen dann mit Lysosomen zu Autolysosomen und übertragen damit ihren Inhalt, welcher durch lysosomale Hydrolasen zu essentiellen molekularen Bausteinen degradiert und zur Wiederaufnahme ins Zytosol freigesetzt wird. Hierbei funktionieren Lysosomen also als Recycling Einheit und bestimmen dabei die metabolische Zusammensetzung der Zelle. Im Vergleich zur Makroautophagie, ist Mikroautophagie nicht mit der Formation von Autophagosomen verbunden. Stattdessen können Lysosomen die Fracht direkt durch Membraneinstülpung einnehmen. Bei der dritten Art, der Chaperonen- abhängigen Autophagie oder CAA werden zytosolische Proteine mit einem speziellen Aminosäurenmotiv (KFERQ) identifiziert und durch Kooperation von HSPA80 und LAMP2A für den lysosomalen Abbau vorbestimmt. Autophagie spielt eine essentielle Rolle bei der Erhaltung der zellulären Homöostase und kann sich selbst verschiedenen Situationen anpassen, die von der Zerstörung von beschädigten Organellen bis hin zu Beseitigung von intrazellulären Pathogenen reichen können. Aufgrund der essentiellen zellulären Schutzfunktion dieses Prozesses ist es von fundamentaler Bedeutung diesen Prozess und die damit verbundenen Mechanismen im genauen Detail zu untersuchen um zu verstehen wie er zur Pathogenese verschiedener Krankheiten beiträgt (Elazar and Dikic 2018, Levine and Kroemer 2019)...