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Lohitesh Kovooru

• Epithelial cells enable essential physiological functions, including absorption, morphogenesis, secretion, and transport. To execute these functions, epithelial cells often form three-dimensional shapes that include curved sheets of cells surrounding a pressurized fluid-filled lumen. These three-dimensional tissues (called domes) are essential for organ function, but when they are not working properly, developmental defects, inflammation, and cancer can ensue. Recently, it has been shown that the cells that form domes show active superelasticity on micropatterned plates. We show here that the immortalized renal proximal tubule epithelial cell line, LLC-PK1, stereotypically forms tubules in 10 days. Tubule formation takes place in 4 stages. When cells are plated on a culture dish, they form a monolayer on the 1st day; on the 3rd day, three-dimensional structures are formed, called domes; and after the 4.5th day, these domes start fusing to begin the transition stage and transit to the tubule stage. At the end of the 10th day, differentiated, elongated, and matured tubes form (Figure 3.1). Therefore, tubule formation is a self-organized, stereotypic morphogenetic program under long-term, unperturbed tissue culture conditions. We propose that tubulogenesis is a two-step process in proximal tubules by doming and wrapping. The process begins with dome formation, and as the cell layers come together in the transition stage at the edge of the dome, this leads to the formation of the lumen of the eventual tubule. We also found that F-actin provides the mechanical strength during the formation of these three-dimensional structures during tubule formation. To better understand this 4-step process on a molecular level, we performed proteomics of tubule formation to identify the different proteins that play a significant role in proximal tubule development. Importantly, we identified proximal tubule markers like synaptopondin, angiotensin 1-10, collectrin, polycystin 1, and polycystin 2. These proteins play an important role in renal tube formation and differentiation. Cell division is carried out by highly conserved cyclin-CDK complexes, which phosphorylate various cellular components. Cyclin-CDKs act differently depending on the cell cycle phase and work cooperatively to create DNA replication and cytokinesis. Therefore, we identified that cyclin-B1, marker of proliferation Ki-67, the RAD51 recombinase, and proliferating cell nuclear antigen (PNCA) are upregulated in the monolayer stage, and the expression decreases as tubule formation takes place. The proximal tubule reabsorbs 60-65% of the glomerulus filtrate. Therefore, it requires a lot of energy generated by using the fatty acid oxidation (FAO) pathway. In our model, we found FAO expression is higher than that of the other metabolic pathways. We found expression of an intricate protein network in mitochondria, which we interpret as a sign of mitochondrial homeostasis being vital for the FAO pathway to work. Furthermore, we also identified different types of transporters at each stage of proximal tubule formation, and we could recognize different cytoskeletal components playing a significant role in each stage of proximal tubule formation, for instance, at the monolayer stage, vimentin expression is high, and its expression is reduced as tubules form. Hence, this 2D system, at this step of characterization, seems suitable to use to study differential transport protein expression and how this might relate to physiological functions and syndromes. Next, we inhibited different transporters using specific inhibitors and analyzed the effect on dome and tubule formation. We identified that Na+/K+ ATPase and vacuolar H+ ATPase play a significant role in the process of epithelial dynamics. Digoxin (a Na+/K+ ATPase inhibitor) treatment inhibits dome and tubule formation. Bafilomycin (a v-ATPase inhibitor) treatment demonstrated a delay in dome and tube formation. Therefore, this study shows that this 2D proximal tubule novel system can be used for screening of pharmacological leads in the context of specific aspects of kidney physiology. Despite the recent success in growing kidney organoids, they are not well suited to investigate various pathophysiological conditions in vitro for several reasons: They grow in 3D and form a tissue that later needs to be dissected/cleared and stained to investigate pathophysiological changes. Moreover, organoids require complex and expensive protocols for generation and are challenging to use in screening approaches. Therefore, we set out to demonstrate feasibility for our 2D system using normal renal epithelial cells, which are the origin of various pathological conditions, to study pathophysiological conditions.
• Epithelzellen übernehmen essentielle physiologische Funktionen, die die Absorption, Morphogenese, Sekretion und den Transport einschließen. Um diese Funktionen auszuführen, bilden Epithelzellen oft eine dreidimensionale Form, welche eine gekrümmte Zellschicht umfasst, die ein mit Flüssigkeit gefülltes Lumen umgibt. Diese dreidimensionalen Gewebeteile, Halbzysten (englisch dome) genannt, sind für Organfunktionen unerlässlich. Wenn sie nicht richtig arbeiten, kann dies zu Entwicklungsstörungen, Entzündungen und Krebs führen. Kürzlich wurde gezeigt, dass dome-bildende Zellen auf mikrostrukturierten Platten eine aktive Superelastizität aufweisen. Wir zeigen hier, dass die immortalisierte Epithelzelllinie des proximalen Nierentubulus, LLC-PK1, stereotypisch innerhalb von 10 Tagen Tubuli, (Geweberöhrchen) ausbildet. Die Röhrenbildung oder Tubulogenese erfolgt in vier Stufen: (1) Wenn die Zellen auf eine Kulturschale plattiert werden, bilden sie am ersten Tag eine eine Zelle dicke Schicht (monolayer); (2) am dritten Tag bilden sich dreidimensionale Strukturen, Halbzysten (domes); und (3) nach dem vierten bis fünften Tag beginnen diese Halbzysten zu verschmelzen, was ein Übergangsstadium darstellt, dass in (4) die Tubulogense übergeht. Am Ende des zehnten Tages bilden sich differenzierte, verlängerte und ausgereifte Röhren aus. Daher ist die Tubulogenese ein selbstorganisiertes, stereotypisch morphogenetisches Programm unter langfristigen, ungestörten Gewebekulturbedingungen. Die Tubulogenese könne wir in diesem Zusammenhang als einen zweistufigen Prozess beschrieben, der aus Halbzystenbildung (doming) und Einfaltung (wrapping) besteht. Der Prozess beginnt mit einer Halbzystenbildung und sobald die Zellschichten in der Übergangsphase am Rande der Halbzyste zusammenkommen, führt dies zur Bildung des Lumens des späteren Tubulus. Die Zellen erstrecken sich über die gesamte Länge des Epithels, das eine apikale Verengung erfährt. Dies führt zu einer Einstülpung, welche sich vertieft bevor sich aus den Zellen eine neue Röhre formt. Durch eine Proteomanalyse der vier Stadien der proximalen Tubulusbildung , konnten die verschiedenen Proteine identifiziert werden, die bei der Entwicklung der proximalen Tubuli eine wichtige Rolle spielen. Dabei konnten wir proximale Tubulusmarker wie synaptopondin, angiotensin 1-10, collectrin, polycystin 1 und polycystin 2 in einer Stufenabhängigen Muster nachweisen. Diese Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Bildung und Differenzierung der Nierenkanäle, was die physiologische Relevanz des hier dargestellten zellulären Systems unterstreicht. Bei der hier verwendeten Zelllinie handelt es sich um eine nicht viral oder durch Onkogene immortalisierte Linie. Daher wurde untersucht, wie sich die Regulation des Zellzyklus während der vier Stufen der Morphogenese ändern. Wir konnten zeigen, dass Cyclin-B1, der Proliferationsmarker Ki-67, die Rekombinase RAD51 und das proliferating cell nuclear antigen (PCNA) im Einzellschicht-Stadium hochreguliert sind und deren Expression mit der Tubulusbildung abnimmt, somit verlassen die Zellen während der Morphogenese kontinuierlich den Zellzyklus in eine gap phase. In der Niere reabsorbieren die proximalen Tubuli 60-65 % des Glomerulusfiltrats. Daher benötigen sie viel Energie, die über den Fettsäureoxidationsweg (FAO) gewonnen wird. In unserem Modell ist die FAO-Expression höher als die der anderen Stoffwechselwege. Im Vergleich zu anderen zytosolischen Organellen fanden wir in den Mitochondrien außerdem ein kompliziertes Proteinnetzwerk, da die mitochondriale Homöostase für die Funktion des FAO-Stoffwechselwegs unerlässlich ist. Neben der Expression organspezifischer Marker, dem Verlassen des Zellzyklus ist dies ein dritter Indikator für das Nachvollziehen eines entwicklungsbiologisch regulierten Vorgangs in Form eines selbstorganisierten Prozesses in vitro. Zudem konnten wir als vierten Indikator verschiedene Arten von Transportern in jedem Stadium der proximalen Tubulusbildung identifizieren, die für die Nierenphysiologie von Bedeutung sind. Das Zytoskelett spielt eine wesentliche Rolle bei der Bildung des proximalen Tubulus. Wir haben festgestellt, dass verschiedene Zytoskelette in jeder Phase der Bildung des proximalen Tubulus eine wichtige Rolle spielen. Zum Beispiel ist die Expression von Vimentin im Einzellschicht-Stadium hoch und nimmt mit der Bildung des Tubulus ab. In unseren Augen kann dieses 2D-System daher verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Transporter und die mit der Transporteraktivität verbundenen Krankheiten zu untersuchen.