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Alexander Domnick

• The peptide loading complex (PLC) is a central machinery in adaptive immunity ensuring antigen presentation by major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules to immune cells. If nucleated cells present foreign antigenic peptides from various origins (e.g., viral infected or cancer cells) on their cell surface they are targeted and eliminated by effector cells of the immune system to protect the organism against the hazard. The antigen presentation process starts with proteasomal degradation. Peptide loading and quality control of most, if not all, MHC I is performed by the PLC. Despite the main components, architecture, and general functions of this labile and multi-subunit assembly have been described, knowledge about the inner mechanics of MHC I loading and quality control in the PLC is limited. Detailed structural insights into the interactions and functions of key elements are lacking. In this PhD thesis, structural and functional aspects of the PLC in peptide loading and quality control of MHC I are unraveled, and the PLC was analyzed from an evolutionary perspective. First, composition and architecture of native PLC isolated from different mammalian species was analyzed. Comparison of detergent-solubilized PLC from cow and sheep spleens with PLC isolated from human source showed a compositional conservation in mammals, with the central components TAP, ERp57, tapasin, calreticulin, and the MHC I heterodimer were conserved in these species. Negative-stain electron microscopy (EM) analyses revealed an identical overall architecture of PLCs from human, sheep, and cow with two major densities at opposing sides of the plane of the detergent micelle corresponding to endoplasmic reticulum (ER) luminal and cytosolic domains. Interestingly, the glucose-regulated protein 78 (GRP78) was associated only with the PLC from sheep and cow as revealed by mass spectrometry. This ER chaperone is involved in initial folding steps of MHC I but was not co-purified with human PLC, rendering it an interesting target for future functional and in-depth structural studies. The human PLC was stabilized by reconstitution in membrane mimicking systems that replace the detergent, which is necessary to solubilize the complex. This stabilization allowed detailed structural analysis by single-particle cryogenic electron microscopy (cryo-EM). The structure of the MHC I editing module in the PLC, composed of tapasin, ERp57, calreticulin, MHC I, and β-2-microglobulin (β2m), was solved at an overall resolution of 3.7 Å. Within the structure, two important features were visualized: (i) the editing loop of tapasin, which is directly involved in peptide proofreading of MHC I; (ii) the A-branch of the Asn86 tethered N-linked glycan on MHC I. Both features are crucial elements in the quality control and peptide editing process on MHC I. The editing loop interacts with the peptide binding groove in MHC I. It disturbs the interaction between a cargo peptide C terminus and the F-pocket in the binding groove by displacing Tyr84 and the helices α1 and α2. The helix displacement widens the F-pocket which allows a faster peptide exchange on MHC I. The glycan is bound in its monoglucosylated form (Glc1Man9GlcNAc2) by the lectin domain of calreticulin. The A-branch of this glycan is stretched between MHC I Asn86 and the lectin domain, leading to the hypothesis that the glycan will be released from calreticulin once MHC I is loaded with a favored peptide (pMHC I). For investigation of the glycan status of MHC I, intact protein liquid chromatography coupled mass spectrometry (LC-MS) was performed under denaturating conditions. An allosteric coupling between peptide loading and removal of the terminal glucose by α-Glucosidase II (GluII) was discovered. In addition, the PLC remained fully intact after peptide loading, which demonstrated GluII action on the PLC once MHC I is loaded. With establishing GluII as transient interaction partner, this work deepens the knowledge of the molecular sociology of the PLC and how the PLC is involved in the endoplasmic reticulum quality control (ERQC). Further investigation of the ER aminopeptidases ERAP1 and ERAP2 showed that these enzymes neither alone nor together stably interact with the PLC. In contrast, both work independent from the PLC on free peptides in the ER. LC-MS analysis of the PLC components revealed a very unusual glycosylation pattern of tapasin. Tapasin was observed with N-linked glycans ranging from the full glycan (Man9GlcNAc2) to heavily trimmed glycans, where only a single GlcNAc remained attached to Asn233. In the PLC, tapasin is probably shielded from degradation by ERQC and can remain functional and intact without a full N-linked glycan.
• Der menschliche Körper ist ständig inneren und äußeren Bedrohungen ausgesetzt. Daher ist er auf ein effizientes System zur Abwehr dieser Bedrohungen angewiesen. Dabei spielt das adaptive Immunsystem eine wichtige Rolle, da es sich flexibel an eine Vielzahl von Erregern und Bedrohungen anpassen kann, um diese anschließend zu neutralisieren. Der Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (MHC I) ist ein elementarer Bestandteil der adaptiven Immunantwort und erlaubt Effektorelementen des Immunsystems alle kernenthaltenden Zellen zu überwachen und Bedrohungen zu identifizieren. MHC I wird innerhalb der Zellen mit kurzen Proteinbruchstücken – Peptiden – beladen und repräsentiert so den aktuellen Zustand der Zelle. Sind in der Zelle Gefahren für Zelle und Organismus (z.B. Krebs, Viren) vorhanden, so werden auch Bestandteile dieser Bedrohungen mittels MHC I auf der Zelloberfläche präsentiert. Anschließend kann das Immunsystem Zellen, die eine Bedrohung präsentieren, identifizieren und eliminieren und so den gesamten Organismus schützen. Körpereigene Bestandteile werden nicht als Gefahren erkannt, da Effektorelemente des Immunsystems einer strengen Kontrolle unterliegen. Zusätzlich muss jede individuelle Zelle sicherstellen, dass sie ihren aktuellen Zustand repräsentativ auf der Zelloberfläche wiedergibt. Der MHC I Peptide Loading Complex (PLC) ist ein zentraler Bestandteil der Antigenpräsentation durch MHC I und ist entscheidend in die Beladung und Qualitätskontrolle von MHC I involviert. Dadurch ist er direkt an adaptiven Immunprozessen zur Bekämpfung interner oder externer Gefahren beteiligt. Trotz dieser wichtigen Funktionen ist das Wissen über die innere Mechanik der MHC I-Beladung und der Qualitätskontrolle im PLC begrenzt. Die Hauptkomponenten, Architektur und die allgemeinen Funktionen dieses labilen Multi-Proteinkomplexes wurden bereits beschrieben1–3. Es fehlen jedoch detaillierte strukturelle Einblicke in die Interaktionen und Funktionen einiger Schlüsselelemente. In dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Analysen durchgeführt, um strukturelle und funktionelle Aspekte des PLC, der Peptidbeladung und der Qualitätskontrolle von MHC I aufzuklären. Der PLC wurde erstmals von anderen Säugetierspezies als dem Menschen gereinigt und analysiert. Dazu wurde PLC aus Milzen von Schaf und Rind mithilfe des viralen TAP Inhibitors ICP47SBP und Affinitätschromatographie, analog zur Reinigung von humanem PLC, isoliert. Die Reinigung von PLC aus Kuh- und Schafsmilz ergab, dass der PLC in diesen Spezies ähnlich zusammengesetzt ist wie menschlicher PLC. Die Identität der isolierten Proteine wurde durch Vergleiche in SDS-PAGE, sowie direkter Analyse per Massenspektrometrie bestätigt. Dieses Ergebnis deutet auf eine konservierte Zusammensetzung des PLC in Säugetieren hin. Die anschließende strukturelle Analyse der Architektur dieser PLCs mittels Elektronenmikroskopie (EM) ergab eine ähnliche räumliche Architektur wie beim menschlichen PLC. Beide Merkmale machen den PLC der untersuchten Spezies zu einem interessanten Ziel für zukünftige funktionelle und strukturelle Studien. Zusätzlich wurde das Glukose-regulierte Protein 78 (GRP78) mit dem PLC aus Schaf und Rind isoliert. Dieses Chaperon ist an den ersten Faltungsschritten von MHC I im ER beteiligt, wurde bisher aber nicht als Interaktionspartner des menschlichen PLC identifiziert. Zukünftige Studien müssen zeigen, ob dieser Befund eine Funktion von GRP78 im PLC darstellt. Um das Wissen über die Funktion des menschlichen PLCs zu vertiefen, wurde in dieser Dissertation ein Fokus auf die Strukturaufklärung gelegt. Bisher musste der labile PLC für die Strukturaufklärung mittels chemischer Quervernetzung stabilisiert werden, um die Architektur mittels kryogener Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) aufzuklären. Daher wurde der humane PLC zunächst durch Rekonstitution in membrannachbildenden Systemen stabilisiert, die das Detergens ersetzten, das zum Solubilisieren des Komplexes verwendet wurde. Das hier verwendete System heißt Nanodisc und schließt innerhalb eines Rings aus amphiphilen Proteinen Lipide und den PLC ein. Durch Rekonstitution des PLC in diesem System konnte der PLC stabilisiert werden. Diese Stabilisierung ermöglichte eine detaillierte Strukturanalyse mittels Cryo-EM, wobei die erreichte Auflösung deutlich verbessert werden konnte. Für den gesamten PLC bestehend aus zwei Editiermodulen (jeweils bestehend aus Tapasin, ERp57, Calreticulin, MHC I hc und β2m) und einem Membrananteil (bestehend aus TAP1, TAP2, sowie Transmembranhelices von Tapasin und MHC I) wurde eine gemittelte Auflösung von 4.0 Å erreicht. Allerdings zeigte sich, dass die beiden Editiermodule und der in der Membran enthaltene Anteil zueinander flexibel sind. Daher konnten die Membranbestandteile des PLCs strukturell nicht aufgelöst werden. Des Weiteren stellte sich in einer intensiven Analyse heraus, dass immer ein Editiermodul im PLC komplett assembliert ist und alle oben genannten Proteine enthält. Das zweite Editiermodul liegt in verschiedenen Assemblierungszuständen vor. Diese reichen von einem ebenfalls vollständig assemblierten Modul bis zu einer vollständigen Abwesenheit dieses Moduls. Dabei ist aktuell unklar, ob es sich bei allen Zuständen um natürliche Assemblierungen handelt oder ob diese durch Beschädigung während der Cryo-EM-Probenpräparation der hoch-fragilen PLCs entstanden sind. Durch Fokussierung der Strukturaufklärung auf eines der vollständig assemblierten Editiermodule konnte dieses mit einer Auflösung von 3.7 Å gelöst werden.