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Jennifer Alisa Amrhein

• This thesis comprises the usage of two commonly known hinge-binding moieties in drug discovery. First, the quinazoline scaffold of gefitinib (5) was utilized in a macrocyclization strategy to introduce selectivity. In general, the quinazoline hinge-binding moiety is a commonly used scaffold which can be found in 14% of approved kinase inhibitors. The most familiar applications are EGFR inhibitors such as gefitinib (5), erlotinib (6), afatinib, or dacomitinib for the treatment of NSCLC. But other kinases like CDK2, CDK4, or p38 are reported targets as well. The N-phenylquinazolin-4-amine moiety of gefitinib (5) was conserved however, the residues at the aromatic ring in the linker were modified, the residue targeting the solvent-exposed region was varied, and the linker at the C6 position of the quinazoline was adjusted to enable the macrocyclization. An overview of the structural modifications is shown in Figure 35A. Kinome-wide screening of gefitinib (5) revealed several off-targets besides EGFR (Figure 35B), making it an excellent starting point for a macrocyclization strategy. Introducing a linker to the N phenylquinazoline-4-amine scaffold and retaining the residues on the aromatic ring as well as the methoxy group targeting the solvent-exposed region improved the selectivity profile and the efficacy towards EGFR WT and its mutants. Truncation of the linker moiety led to the mutant selective macrocycle 26f with an excellent kinome-wide selectivity profile (Figure 35B). An inhibitor that is effective on EGFR mutations while ineffective on the EGFR WT could represent an enhancement of patient treatment, as it potentially causes less side effects. Further studies could determine the effect of the most promising macrocycles in lung cancer cell lines. Additionally, the pharmacokinetic properties could be optimized, e.g. by introducing solubilizing groups, targeting the solvent-exposed region. The second scaffold comprises the 3-aminopyrazole-based hinge-binding moiety. It is a privileged scaffold in medicinal chemistry for the development of kinase inhibitors. Previous publications report the anti-proliferative and anti-cancer potential of pyrazole-based molecules. They play a crucial role in the treatment of various diseases and cancer types like inflammation disorders, lymphoma, or breast cancer. This scaffold can be found e.g. in the aurora kinase inhibitor tozasertib or in the promiscuous kinase inhibitor 23, published by Statsuk et. al. Rescreening compound 23 in a comprehensive kinase panel against 468 human protein kinases confirmed the unselective behavior with a selectivity score of S35 = 0.56 (Figure 36B), making it a great starting point for further optimizations. The N-(1H-pyrazol-3-yl)pyrimidin-4-amine scaffold was conserved however, the residues targeting the solvent-exposed region were varied and different linkers were attached. The introduction of different residues at the pyrazole dramatically influenced the selectivity profile of the desired kinases. Ester moieties caused to a favorable combination of selectivity and potency towards the kinase of interest CDK16. The removal of additional residues at the pyrimidine, targeting the solvent-exposed region, increased the efficiency towards CDK16. Further optimization led to the highly potent and selective CDK16 inhibitor 98d (IC50 = 33 nM). NanoBRETTM screening against the complete CDK family revealed a preferred inhibition of the PCTAIRE and PFTAIRE subfamily with cellular IC50 values of 20 nM – 120 nM and 50 nM – 180 nM, respectively. A FUCCI cell cycle assay and viability assessment of 98d confirmed previously published results, reporting a G2/M cell cycle arrest followed by apoptosis and accumulation of p27 through knockout of CDK16 in SCC cells. Consequently, further studies could evaluate the anti-tumor activity of 98d in SCC and NSCLC or elucidate the effect of 98d in AMPK-related macroautophagy. 98d represents a novel tool compound to investigate the understudied kinases of the PCTAIRE family and enable to enlighten the biological role of those kinases. Macrocyclization of the N-(1H-pyrazol-3-yl)pyrimidin-4-amine core resulted in the selective BMPR2 inhibitor 110a. It showed a good binding affinity towards BMPR2 with a KD value of 205 nM as well as a good potency with an IC50 value of 506 nM. A comprehensive selectivity screen against 468 kinases revealed an excellent selectivity profile with S35 = 0.01. As no BMPR2 inhibitors have been published so far, 110a represents a novel compound that may provide further insights into the canonical BMP pathway, noncanonical signaling, or its impact on BMPR2-associated diseases like PAH. The introduction of additional residues targeting the solvent-exposed region shifted the selectivity towards the MST kinases. The exchange from the pyrimidine to a quinazoline moiety resulted in the highly potent and selective macrocyclic MST3 inhibitor 113c. NanoBRETTM measurements demonstrated the preferred inhibition of MST3 with IC50 values of 210 nM and 30 nM for intact and lysed cells, respectively. A weaker activity could be seen for MST4 with 1.8 µM and 510 nM, while MST1 and MST2 were not affected. To date, no selective MST3 inhibitors have been published, making 113c a valuable tool compound for further functional studies. As MST3 is influencing the cell cycle progression, 113c could be tested in a further cell cycle assay to elucidate the inhibitory effect of 113c on MST3 and consequently on the cell cycle. Furthermore, the anti-tumor activity of 113c in breast cancer could be determined, as Madsen et. al. reported a high MST3 and MST4 activity triggered by FAM40B mutations.
• Kinaseinhibitoren spielen in der Erforschung neuer Medikamente eine zentrale Schlüsselrolle, welche sich in der Zahl der klinisch zugelassenen Arzneistoffe widerspiegelt. Seit der Zulassung des ersten Kinaseinhibitors Fasudil im Jahr 1995 in Japan wurden bislang insgesamt 72 niedermolekulare Inhibitoren von der FDA zugelassen. Allein in den letzten fünf Jahren hat sich deren Zahl verdoppelt. Verschiedene Krankheiten, wie Entzündungsreaktionen oder Autoimmunerkrankungen werden dadurch adressiert, wobei mit 89% die Mehrzahl der zugelassenen Kinaseinhibitoren für onkologische Indikationen eingesetzt wird. Die hoch konservierte ATP-Bindetasche stellt für die Entwicklung neuer und selektiver ATP-mimetischer Inhibitoren jedoch eine große Herausforderung dar. Die Makrozyklisierung bietet eine Möglichkeit zur Erzeugung von Selektivität durch die Einschränkung der Flexibilität des Moleküls. Solche Makrozyklen bestehen aus einem linearen Pharmakophor, der durch einen Linker verbunden ist. Diese konformationelle Einschränkung kann durch Minimierung der entropischen Kosten während des Bindens an die Kinase zudem zu einer gesteigerten Affinität gegenüber der Zielkinase führen. Des Weiteren können durch diesen Ansatz die pharmakokinetischen Eigenschaften, wie die metabolische Stabilität oder Löslichkeit des Moleküls optimiert werden. Diese Arbeit umfasst die Verwendung von zwei allgemein bekannten Scharnier (englisch hinge) Bindemotiven in der Arzneimittelforschung. Im Rahmen des ersten Projekts wurde das Chinazolin Grundgerüst verwendet, welches in 14 % der zugelassenen Kinaseinhibitoren zu finden ist. Die bekanntesten Anwendungen sind EGFR Inhibitoren wie Gefitinib (5), Erlotinib (6), Afatinib und Dacomitinib, die für die Behandlung von nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen zugelassen sind. Die transmembrane Tyrosinkinase EGFR spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase von Erwachsenen und in der embryonalen Entwicklung. Kanonische Signalwege sind für verschiedene biologische Funktionen, wie die Zellproliferation, das Überleben, die Differenzierung oder die Motilität von Zellen verantwortlich. Eine Dysregulation von EGFR wird mit verschiedenen Tumorarten wie Glioblastomen, Brust- oder Lungenkrebs in Verbindung gebracht. Nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome bilden mit 85% der Patienten die Mehrheit aller Fälle von Lungenkrebs, wobei EGFR häufig überexprimiert oder mutiert vorliegt. Die Punktmutation L858R und die Deletionsmutante Del19 stellen die am häufigsten vorkommenden Mutationen dar. Die erste Generation der EGFR Inhibitoren besteht aus Molekülen mit einem Chinazolin Grundgerüst wie Gefitinib (5) oder Erlotinib (6). Beide sind nach wie vor die erste Wahl für die Behandlung von mutierten nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen, adressieren jedoch auch weitere Kinasen und können somit zu unerwünschten Nebenwirkungen führen.194 Dieses Bindemotiv stellt daher einen hervorragenden Ausgangspunkt dar, um eine Selektivität innerhalb des gesamten Kinoms durch Makrozyklisierung zu verbessern. Die Makrozyklen 39d und 39f wurden durch einen 2-(2-(2-Chlorethoxy)ethoxy)ethanol-Linker zyklisiert, um die pharmakologischen Eigenschaften, ausgehend von Gefitinib (5), zu verbessern. Beide Verbindungen zeigten eine hohe zelluläre Potenz für EGFR WT, L858R, L858R/C797S, Del19 und Del19/C797S mit IC50 Werten im niedrigen ein- bis zweistelligen nanomolaren Bereich. Die Gatekeeper Mutation T790M wurde von den Makrozyklen nicht adressiert, was analog zu den bereits publizierten EGFR Inhibitoren der ersten und zweiten Generation auf das Chinazolin Bindemotiv zurückzuführen ist. Ein DSF Assay, der 101 Kinasen beinhaltet, die über das gesamte Kinom verteilt sind, zeigte eine sehr gute Selektivität für 39d und 39f mit fünf bzw. zwei stabilisierten Kinasen > 5 °C. Die Verkürzung des Linkers erhöhte die Selektivität und 26f stabilisierte lediglich eine Kinase über 5 °C. Zusätzlich wurde dadurch die Bindungsaffinität gegenüber EGFR WT geschwächt (IC50 > 10 μM) und führte zu einer Mutantenselektivität mit IC50 Werten von 385.6 nM, 197.5 nM, 749.6 nM und 147.9 nM für EGFR L858R, Del19 und die entsprechenden Doppelmutanten mit C797S. Das Entfernen der Methoxygruppe, die die lösungsmittelzugewandte Region adressiert, führte überraschenderweise zu der inaktiven Verbindung 48. Die Selektivität von 26f wurde durch ein kinomweites Selektivitätsscreening unter Verwendung der KINOMEscan® Plattform validiert. Auch in diesem erweiterten Assayformat zeigte 26f eine hohe Selektivität von S35 = 0.026 bei einer Screening Konzentration von 1 μM. Western Blotting bestätigte die Aktivität von 26f gegenüber den Mutanten (L858R, L858R/C797S, Del19 und Del19/C797S), während EGFR WT nicht inhibiert wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss auf die PI3K/AKT/mTOR und RAS/MAPK Signalwege untersucht. 26f zeigte erneut eine Mutantenselektivität, indem es die nachgeschalteten (englisch downstream) Kinasen AKT und ERK1/2 bei den getesteten EGFR Mutanten hemmte, während 26f auf EGFR WT keine Wirkung zeigte. Verbindung 26f stellt somit einen wichtigen Inhibitor für die häufigsten EGFR Mutanten L858R, Del19 und die Doppelmutationen L858R/C797S und Del19/C797S dar.