Open Access

Diana Jaqueline Vaca Llerena

• The capacity of pathogenic bacteria to adhere to host cells and to avoid subsequent clearance by the host´s immune response is the initial and most decisive step leading to infections. Human pathogenic bacteria circulating in the bloodstream need to find ways to interact with endothelial cells (ECs) lining the blood vessels to infect and colonise the host. The extracellular matrix (ECM) of ECs might represent an attractive initial target for bacterial interaction, as many bacterial adhesins have reported affinities to ECM proteins, particularly fibronectin (Fn). Trimeric autotransporter adhesins (TAA) have been described as important pathogenicity factors of Gram-negative bacteria. The TAA from human pathogenic Bartonella henselae, Bartonella adhesin A (BadA), is one of the longest and best characterised adhesin and represents a prototypic TAA due to its domain architecture. B. henselae, the causative agent of cat scratch disease, endocarditis, and bacillary angiomatosis, adheres to ECs and ECM proteins via BadA interaction. In this research, it was determined that the interaction between BadA and Fn is essential for B. henselae host cell adhesion. BadA interactions were identified within the heparin-binding domains of Fn, and the exact binding sites were revealed by mass spectrometry analysis of chemically crosslinked whole-cell bacteria and Fn. It turned out that specific BadA interactions with defined Fn regions represent the molecular basis for bacterial adhesion to ECs. These data were confirmed by using BadA-deficient bacteria and CRISPR-Cas FN1 knockout ECs. It was also identified that BadA binds to Fn from both cellular and plasma origin, suggesting that B. henselae binding to Fn might possibly take part in other infection processes apart from bacterial adherence, e.g. evasion from the host cell immune system. Interactions between TAAs and Fn represent a key step for adherence of B. henselae to ECs. Still, Fn-mediated binding is of more significant importance for pathogenic bacteria than broadly recognised. Fn removal from the ECM environment of ECs, also reduced adherence of Staphylococcus aureus, Borrelia burgdorferi, and Acinetobacter baumannii to host cells Interactions between adhesins and Fn might therefore represent a crucial step for the adhesion of human-pathogenic Gram-negative and Gram-positive bacteria targeting the ECs as a niche of infection or as means for persistence. This research demonstrated that combining large-scale analysis approaches to describe protein-protein interactions with supportive functional readouts (binding assays) allows for the discrimination of crucial interactions involved in bacterial adhesion to the host. The herein-described experimental approaches and tools might guide future research for other pathogenic bacteria and represent an initial point for the future generation of anti-virulence strategies to inhibit bacterial binding to host cells.
• Humanpathogene Bakterien, die im Blutkreislauf zirkulieren, müssen einen Weg finden um mit den Endothelzellen (EC) der Blutgefäße zu interagieren um diese nachfolgend infizieren zu können. Dabei können die Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) von EC geeignete Zielstrukturen für eine bakterielle Interaktion darstellen. Fibronektin (Fn) ist ein Bestandteil der ECM und hat nachweislich Bindungsaffinität zu viele bakterielle Adhäsinen. Trimere Autotransporter-Adhäsine (TAA) werden als wichtige Pathogenitätsfaktoren von gramnegativen Bakterien beschrieben die den initialen Kontakt zu Wirtszellen herstellen können. Das Bartonella-Adhäsin A (BadA) ist eines der längsten und am besten charakterisierten TAAs und stellt aufgrund seiner Domänenarchitektur ein prototypisches TAA dar. BadA ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von B. henselae, dem Erreger der Katzenkratzkrankheit und vaskuloproliferativen Erkrankungen bei immunsupprimierten Patienten. Das Vorhandensein von BadA ist entscheidend für die Adhäsion von B. henselae an EC und ECM-Proteine, einschließlich Fn. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion von BadA und Fn und die Bedeutung von Fn als allgemeine Zielstruktur für die bakterielle Adhärenz zu untersuchen. Mit Hilfe von Bindungsassays wurde nachgewiesen, dass B. henselae an gereinigtes Fn sowohl aus Plasma als auch aus zellulären Quellen bindet. Die Bindungsstellen zwischen BadA und Fn konnten unter Verwendung von Crosslinking-Massenspektrometrie identifiziert werden und befinden sich bei zellulärem Fn innerhalb der Hep I-Bindungsdomäne, während sich die Interaktionen mit plasmatischem Fn auf die Hep I- und Hep II-Bindungsdomäne sowie auf den C-Terminus verteilen. Die Ergebnisse deuten auf eine Domänen-spezifische Interaktion von BadA mit plasmatischen Fn bzw. zellulären Fn hin. Aufgrund der unterschiedlichen Beschaffenheit von plasmatischen und zellulären Fn kann spekuliert werden, dass BadA an Regionen im zellulären Fn bindet, die aufgrund der Molekularstruktur von plasmatischen Fn nicht exponiert sind und daher kein Bindungsmotiv darstellen können. Um diese Ergebnisse bestätigen zu können, wurden unterschiedliche Fragmente aus Fn (die in ihrer Gesamtheit die volle Länge von Fn abdecken) in Bindungsversuchen mit BadA eingesetzt. Die stärkste Bindungsaffinität mit BadA zeigten die Fragmente mit den Heparin-bindenden Domänen und zwar in ähnlichen Ausmaß wie Fn in voller Länge. Diese Beobachtung belegt, dass die Heparin-bindenden Domänen von Fn die Zielstrukturen bei der TAA-vermittelten Adhäsion von B. henselae darstellen. Infektionsexperimente mit Wildtyp-HUVEC und FN1-Knockout-HUVEC (Fn-defiziente Mutanten) wurden mit gramnegativen und grampositiven Bakterien (Acinetobacter baumannii, B. henselae, Borrelia burgdorferi und Staphylococcus aureus) durchgeführt. Die an EC gebundenen Bakterien wurden durch absolute Quantifizierung der bakteriellen und menschlichen Genkopien bewertet. Bei Verwendung von FN1-Knockout-Zellen war die Zahl der an HUVEC haftenden Bakterien bei allen Bakteriengattungen deutlich reduziert (A. baumannii: um 25 %; B. henselae: um 58%, B. burgdorferi: um 34%, S. aureus: um 79%). Die bakterielle Adhäsion an Wirtszellen ist ein komplexes Zusammenspiel, das mehrerer Faktoren beinhaltet. Das Vorhandensein selektiver Adhäsionsmechanismen in Abhängigkeit vom Wirtszelltropismus, der ECM-Zusammensetzung und der Redundanz der Interaktion zwischen Adhäsinen und zellulären Rezeptoren beinflussen allesamt – wahrscheinlich im gegenseitigen Wechselspiel - die bakterielle Adhärenz. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Interaktion von grampositiven oder gramnegativen Bakterien mit Endothelzellen-Fn eine wesentliche Rolle bei der bakteriellen Adhäsion an den Wirt spielt. Die Erforschung molekularer Mechanismen, die an den Interaktionen zwischen Bakterien und EC beteiligt sind, liefern wichtige Informationen über das komplexe Zusammenspiel zwischen Bakterium und Wirt und stellen die Grundlage für die Entwicklung neuer Strategien zur Beeinflussung dieser Interaktionen dar. In Zukunft könnten, durch Modulation der Adhärenz mit sog. anti-Liganden, bakterielle Infektionen therapeutisch behandelt werden.