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Priti Regmi

• Xylose, an abundant sugar fraction of lignocellulosic biomass, is a five-carbon skeleton molecule. Since decades, utilization of this sugar has gained much attention and has been in particular focus as a substrate for production of biofuels like ethanol by microbial hosts, including Saccharomyces cerevisiae. In this yeast, xylose is naturally not used as a carbon source, but its utilization could be achieved by metabolic engineering either via the oxidoreductive route or through the isomerase pathway. Both pathways share xylulose as a common intermediate that must be phosphorylated before entering the endogenous metabolism via the non-oxidative pentose phosphate pathway (noxPPP). Besides this, in some bacteria a non-phosphorylating oxidative pathway for xylose degradation exists, known as Weimberg pathway, where a molecule of xylose is converted by a series of enzymes - xylose dehydrogenase (XylB), xylonate dehydratase (XylD), 3-keto-2-deoxy-xylonate dehydratase (XylX) and α-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase (KsaD) - to form α-ketoglutarate (AKG). Besides having several useful properties as a product, AKG could also be used for cell growth as an intermediate of the tricarboxylic acid (TCA) cycle. One target of the present study is to establish a functional Weimberg pathway in S. cerevisiae. Previous studies have shown that this task is not trivial, for instance due to the toxicity of xylonate (the first metabolite of the pathway) and the involvement of an iron-sulfur cluster dependent enzyme, the D-xylonate dehydratase. The assembly of iron-sulfur clusters on a heterologous protein in yeast is known to be challenging. To establish the Weimberg pathway in yeast, the genes xylB, xylD, and xylX were obtained from Caulobacter cresentus and ksaD was from Corynebacterium glutamicum. In a variant, the dehydratase xylD was replaced with orf41 from Arthrobacter nicotinovorans, which is believed to be independent of iron-sulfur clusters. Growth of yeast cells on xylose as a sole carbon source was expected as an indicator of a functional Weimberg pathway. However, the heterologous expression of the codon optimized genes was not sufficient to reach this goal. Due to the complexity of the interactions of the heterologous pathway with the endogenous cellular processes, it was assumed that potential limitations could be overcome by adaptive laboratory evolution, using xylose as a sole source of carbon. Increasing selection pressure was applied on a strain with Weimberg pathway genes integrated into the genome over several generations. As a variant of the evolutionary engineering approach, mutator strains were generated. For this, RAD27 and MSH2 genes were deleted, which are involved in nucleotide excision and mismatch repair mechanisms, respectively. Some of the resulting strains PRY24, PRY25, PRY27 and PRY28 were able grow in xylose as a sole carbon source after evolutionary engineering. As a control, a non-mutator strain PRY19 was also included. Strikingly, only the mutator strains were able to consume xylose as a sole carbon source, which shows the feasibility of the approach. In addition to the mutator strain strategy, a further approach employed in the present study was the simultaneous expression of the Weimberg pathway in the cytosol and mitochondria. This was based on the reasoning that the iron-sulfur cluster biogenesis on XylD may be improved in the organelle and that the AKG is an intermediate of the TCA cycle. In the strain AHY02, all enzymes of the pathway were tagged with mitochondrial targeting signals in addition to a full cytosolically localized pathway. The localization of the mitochondrial variants was confirmed by fluorescence microscopy. Together with AHY02, CEN.PK2-1C wild type strain was also included as a control for evolution. When a selection pressure on xylose was applied, both strains - AHY02 and CEN.PK2-1C - were able to grow in the course of evolution. Deletion of the xylulokinase (XKS1) gene was found to be detrimental for both evolved strains in xylose-containing media. This suggests that the evolution of the endogenous oxidoreductive and noxPPP genes is responsible for growth of the evolved cells. For the evolved strain AHY02, it could also be possible that the Weimberg pathway genes supported to growth in addition to the oxidoreductive route. To elucidate the underlying molecular mechanisms, genome sequencing and reverse engineering approaches would be necessary in future. In addition to screening for growth on xylose as a sole carbon source, a less stringent screening system was created to examine even a minor flux of xylose towards AKG. For this, all genes necessary for conversion of isocitrate to AKG where deleted, yielding a glutamate auxotrophic strain. In this system, the cells can grow on other carbon sources, whereas xylose is only provided as a source of AKG for the synthesis of glutamate...
• Xylose, ein mengenmäßig großer Zuckeranteil von lignocellulosehaltiger Biomasse, ist ein Molekül mit einem Fünf-Kohlenstoff-Skelett. Seit Jahrzehnten wird die Verwendung dieses Zuckers, insbesondere als Substrat für die Produktion von Biokraftstoffen wie Ethanol durch mikrobielle Wirtsorganismen wie Saccharomyces cerevisiae, intensiv beforscht. In dieser Hefe wird Xylose natürlicherweise nicht als Kohlenstoffquelle verwendet, aber ihre Verstoffwechselung konnte durch Metabolic Engineering - entweder über den oxidoreduktiven Weg oder mit Hilfe einer Isomerase - erreicht werden. Beide Wege enthalten Xylulose als gemeinsames Zwischenprodukt, das vor dem Eintritt in den endogenen Stoffwechsel über den nicht-oxidativen Pentosephosphatweg (noxPPP) phosphoryliert werden muss. Außerdem existiert in einigen Bakterien ein nicht-phosphorylierender oxidativer Weg für den Xyloseabbau, bekannt als Weimberg-Stoffwechselweg, bei dem ein Molekül Xylose durch eine Reihe von Enzymen - Xylose-Dehydrogenase (XylB), Xylonat-Dehydratase (XylD), 3-Keto-2-deoxy-Xylonat-Dehydratase (XylX) und α-Ketoglutarat-Semialdehyd-Dehydrogenase (KsaD) - in α-Ketoglutarat (AKG) umgewandelt wird. Neben mehreren nützlichen Eigenschaften als Produkt, könnte AKG durch seine Verstoffwechselung im Citratzyklus für das Wachstum der Zellen genutzt werden. Ein Ziel der vorliegenden Studie ist es, einen funktionellen Weimberg-Stoffwechselweg in S. cerevisiae zu etablieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass dies keine triviale Aufgabe ist, unter anderem aufgrund der Toxizität von Xylonat (dem ersten Zwischenprodukt) und der Beteiligung eines Eisen-Schwefel-Cluster abhängigen Enzyms, der D-Xylonat-Dehydratase. Die Assemblierung von Eisen-Schwefel-Clustern an heterologen Proteinen in Hefezellen hat sich in früheren Arbeiten häufig als schwierig erwiesen. Um den Weimberg-Stoffwechselweg in Hefe zu etablieren, wurden die Gene xylB, xylD und xylX von Caulobacter cresentus und ksaD von Corynebacterium glutamicum gewählt. In einer Variante wurde die Dehydratase xylD durch orf41 von Arthrobacter nicotinovorans ersetzt; es wird angenommen, dass Orf41 unabhängig von Eisen-Schwefel-Clustern ist. Das Wachstum von Hefezellen auf Xylose als einziger Kohlenstoffquelle wurde als Indikator für einen funktionellen Weimberg-Stoffwechselweg erwartet. Die heterologe Expression der codonoptimierten Gene reichte jedoch nicht aus, um dieses Ziel zu erreichen. Aufgrund der Komplexität der Interaktionen des heterologen Stoffwechselweges mit den endogenen zellulären Prozessen wurde angenommen, dass potenzielle Limitationen durch gerichtete Evolution (Evolutionary Engineering) überwunden werden könnten, unter Verwendung von Xylose als einziger Kohlenstoffquelle. Über zahlreiche Generationen hinweg wurde ein Stamm mit genomisch integrierten Genen des Weimberg-Weges einem steigenden Selektionsdruck ausgesetzt. Als eine Variante des Evolutionary Engineering-Ansatzes wurden Mutatorstämme erzeugt. Dafür wurden Gene deletiert, die an Nukleotid-Exzisionreparatur- (RAD27) und Mismatch Repair-Mechanismen (MSH2) beteiligt sind. Einige der resultierenden Stämme - PRY24, PRY25, PRY27 und PRY28 - konnten nach gerichteter Evolution auf Xylose als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Als Kontrolle wurde auch der Stamm PRY19 ohne Mutatorphänotyp einbezogen. Bemerkenswerterweise konnten nur die Mutatorstämme Xylose als alleinige Kohlenstoffquelle nutzen, was die Plausibilität des Ansatzes zeigt. Neben der Mutatorstamm-Strategie wurde im Rahmen dieser Studie ein weiterer Ansatz verfolgt, bei dem der Weimberg-Stoffwechselweg gleichzeitig im Zytoplasma und in den Mitochondrien exprimiert wurde. Die zugrundeliegende Überlegung war, dass die Biogenese von Eisen-Schwefel-Clustern auf XylD im Organell effizienter stattfinden könnte und dass AKG im endogenen Stoffwechsel ein Zwischenprodukt des Citratzyklus ist. In dem Stamm AHY02 wurden alle Enzyme des Weimberg-Weges mit mitochondrialen Zielsteuerungssequenzen versehen und zusätzlich zytoplasmatisch exprimiert. Die Lokalisation der mitochondrialen Varianten wurde durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Zusammen mit AHY02 wurde auch der CEN.PK2-1C Wildtypstamm als Kontrolle für die Evolution einbezogen. Nachdem eine Selektion auf Xylose-haltigen Medien stattgefunden hat, konnten beide Stämme - AHY02 und CEN.PK2-1C - im Laufe der gerichteten Evolution wachsen. Die Deletion des Xylulokinase (XKS1)-Gens war für beide evolvierte Stämme in Xylose-haltigen Medien letal. Dies legt die Möglichkeit nahe, dass die Evolution der endogenen Gene des oxidoreduktiven Weges und des noxPPP für das Wachstum der selektierten Zellen verantwortlich ist. Für den evolvierten Stamm AHY02 könnte es auch möglich sein, dass der Weimberg-Stoffwechselweg zusätzlich zur oxidoreduktiven Route zum Wachstum beigetragen hat. Um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen aufzuklären, wären in Zukunft Genomsequenzierungs- und Reverse Engineering-Ansätze erforderlich...