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Julia Michaela Bauer

• For thousands of years, S. cerevisiae has been employed by humans in brewing and baking. Nowadays, this budding yeast is more than that: it is a well investigated model organism and an established workhorse in biotechnology. S. cerevisiae serves as a production host for various applications such as i) bioethanol production ii) the biosynthesis of hormones including insulin or iii) cannabinoid biosynthesis. Hereby, the robustness of S. cerevisiae and its high tolerances regarding pH and salt concentrations qualifies it for a wide range of industrial applications. Moreover, products of S. cerevisiae are generally recognised as safe (GRAS), enabling diverse biotechnological applications. Various mechanisms for genetic engineering of S. cerevisiae are applicable and the engineering process itself is straightforward since methods are established and widely known. Due to the wide range of industrial applications of S. cerevisiae, this organism is an ideal candidate for applied research and implementation of the recombinant biosynthesis of tocochromanols in this study. Tocochromanols encompass tocotrienols and tocopherols, which are lipid-soluble compounds that are commonly associated with vitamin E activity. Hereby, α-tocopherol is the most prevalent form, as it is an essential nutrient in the diet of humans and animals. Naturally, tocochromanols are almost exclusively synthesised by photoautotrophic organisms such as plants or cyanobacteria. They consist of an aromatic head group and a polyprenyl side chain which is saturated in tocopherols and 3-fold unsaturated in tocotrienols. The methylation status of the chromanol ring distinguishes α-, β-, γ- and δ-tocochromanol. All forms of tocochromanols represent a group of powerful antioxidants, scavenging reactive oxygen species (ROS) and preventing the propagation of lipid oxidation in lipophilic environments. Recently, attention has been drawn to tocotrienols, due to their benefits in neuroprotection as well as cholesterol-lowering and anti-cancer properties. Consequently, tocochromanols are valuable additives in the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries. The metabolic engineering strategy of S. cerevisiae to enable tocochromanol biosynthesis was started in a preceding master thesis with the provision of the aromatic moiety, homogentisic acid (HGA), from the aromatic amino acid biosynthesis. Hereby, the upregulation and redirection of the native pathway was essential. Therefore, a strain with an engineered aromatic amino acid pathway for improved 4 hydroxyphenylpyruvate (HPP) production (MRY33) was utilised from Reifenrath and Boles (2018). Furthermore, a heterologous hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) was required to convert HPP into HGA. Thus, several heterologous HPPDs were expressed and characterised regarding their HGA production within the previous study. The best variant originated from Yarrowia lipolytica, YlHPPD, and was integrated into the genome of MRY33. The resulting strain JBY2, produced 435 mg/L HGA in a shake flask fermentation. This work was started with the genetically highly modified strain JBY2, whose genome already contained a large number of genes artificially expressed behind strong promoters. For further strain development, it was advantageous to maintain a high degree of sequence variability in order to prevent genomic instabilities due to sequence homologies. Thus, 17 artificial promoters (AP1-AP17) were characterised regarding their strength of expression by the yellow fluorescent protein (YFP). These sequences were also part of a patent that was filed during this work (WO2023094429A1). The key point of this study was the development of a metabolic engineering strategy for the strain JBY2. First, the sufficient supply of the second precursor, the polyprenyl side chain, was investigated. Natively, S. cerevisiae produces the precursor, geranylgeranyl diphosphate (GGPP), from the isopentenyl diphosphate pathway. However, without further engineering, GGPP was barely detectable in JBY2 (< 0.1 mg/L). Thus, engineering of the isopentenyl diphosphate biosynthesis was necessary. The limiting enzyme of the mevalonate pathway was the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR), which is encoded by HMG1. Therefore, a truncation for feedback-resistance and its overexpression by a promoter exchange was performed. Furthermore, the promoter of the gene for the squalene synthase (pERG9) was exchanged by the ergosterol sensitive promoter pERG1 to limit the metabolic flux of the mevalonate pathway into the ergosterol pathway. The native GGPP synthase (BTS1) was another limitation that was observed throughout this study. To overcome this bottleneck, plasmid-based and integrative overexpression of the native BTS1 and a codon optimised BTS1 were investigated. Other strategies to improve GGPP production were the deletion of the gene for the diacylglycerol pyrophosphate phosphatase (DPP1) to prevent excessive dephosphorylation of GGPP to geranylgeraniol (GGOH), and the overexpression of the farnesyl pyrophosphate synthetase, encoded by ERG20. However, the best improvements of the GGPP biosynthesis, inferred through GGOH measurements, were achieved from the screening of several heterologous GGPP synthases in S. cerevisiae. The best performing strain was JBY61 (JBY2, hmg1Δ::pTDH3-HMG1tr[1573–3165], pERG9Δ::pERG1, ChrIV-49293-49345Δ::pTDH3-XdcrtE-tSSA1_LEU2), bearing the heterologous GGPP synthase crtE of Xanthophyllomyces dendrorhous and produced 64.23 mg/L GGOH. Consequently, this engineering strategy improved the GGOH production by a factor of 642 compared to the parent strain JBY2.
• Seit Jahrtausenden wird die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae vom Menschen zur mikrobiellen Herstellung von Bier, Wein und Backwaren verwendet. Heutzutage ist S. cerevisiae aber weit mehr: ein gut erforschter Modellorganismus und etablierter Produktionswirt in der Biotechnologie. S. cerevisiae wird als Produktionsorganismus für verschiedenste Anwendungen wie zum Beispiel i) Bioethanolproduktion ii) Biosynthese von Hormonen wie Insulin oder iii) Biosynthese von Cannabinoiden, genutzt. Dabei hat sich S. cerevisiae durch eine ausgeprägte Toleranz gegenüber niedrigen pH-Werten und hohen Salzkonzentrationen, sowie Robustheit gegenüber industriellen Prozessen für ein breites Spektrum industrieller Anwendungen qualifiziert. Darüber hinaus hat die FDA (Food and Drug Administration) Produkte aus S. cerevisiae als GRAS (generally regarded as safe) eingestuft, wodurch eine Vielzahl an biotechnologischen Anwendungen durchführbar wurden. Es gibt verschiedenste Mechanismen zur gezielten gentechnischen Veränderung von S. cerevisiae, deren Methoden leicht zugänglich und etabliert sind. Des Weiteren sind Veränderungen mittels CRISPR/Cas9 durch native DNA- Reparaturmechanismen hoch effizient. Aufgrund des breiten industriellen Anwendungsspektrums von S. cerevisiae ist dieser Organismus ein idealer Kandidat für die angewandte Erforschung der rekombinanten Biosynthese von Tocochromanolen im Rahmen dieser Arbeit. Tocopherole und Tocotrienole sind den Tocochromanolen zugehörige, lipophile Verbindungen, welche allgemein mit der Vitamin E Aktivität assoziiert werden. Deren prominentestes Beispiel, α Tocopherol, ist ein essenzieller Bestandteil der menschlichen und tierischen Ernährung. Natürlicherweise werden Tocochromanole fast ausschließlich von photoautotrophen Organismen wie Pflanzen oder Cyanobakterien synthetisiert. Tocochromanole bestehen aus einem Chromanring und einer isoprenoiden Seitenkette, welche in Tocopherolen gesättigt und in Tocotrienolen dreifach ungesättigt ist. Der Methylierungsgrad des Chromanrings unterscheidet hierbei zwischen α-, β-, γ- und δ Tocochromanol. In lipophilen Umgebungen, wie Membranen, wirken Tocochromanolverbindungen stark antioxidativ, indem sie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) eliminieren und die Ausbreitung von Lipidoxidationen an freien Fettsäuren verhindern. In der aktuellen Forschung ist das Interesse an Tocotrienolen gestiegen, da ihnen neuroprotektive, cholesterinsenkende und krebshemmende Eigenschaften zugeschrieben werden. Folglich sind Tocochromanole wertvolle Verbindungen, welche in der Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie eingesetzt werden. Die Metabolic Engineering Strategie zur Biosynthese von Tocochromanolen in S. cerevisiae umfasst die gezielte genetische Modifizierung von drei Hauptsynthesewegen: dem aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg, dem Mevalonatweg und nachgeschaltetem Isopentenyldiphosphatstoffwechselweg, sowie dem heterologen Tocochromanol-biosyntheseweg. Der native Biosyntheseweg der aromatischen Aminosäuren wird hierbei zur Gewinnung der ersten Vorstufe, der Homogentisinsäure (HGA), genutzt. Wesentlich ist hierbei die Hochregulierung bestimmter Schlüsselenzyme und die gezielte Direktion des metabolischen Flusses in den Tyrosinbiosyntheseweg. Durch einen optimierten aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg wurde von Reifenrath und Boles (2018) ein Hefestamm (MRY33) mit einer gesteigerten 4 Hydroxyphenylpyruvat (HPP) Produktion entwickelt. Die heterologe HPP Dioxygenase (HPPD) konvertiert HPP in HGA. In meiner vorangegangenen Masterarbeit wurde MRY33 als Ausgangsstamm zur Charakterisierung verschiedener heterologer für die HPPD kodierende Gene genutzt. Fünf verschiedene HPPD Genvarianten wurden in S. cerevisiae exprimiert und hinsichtlich ihrer HGA-Produktion evaluiert. Die vielversprechendste Variante stammte aus Yarrowia lipolytica (YlHPPD) und wurde daraufhin in das Genom von MRY33 integriert. Der resultierende Stamm, JBY2, produzierte 435 mg/L HGA in einer Schüttelkolbenfermentation.