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Özlem Demirel

• ABCB9 is a peptide transporter belonging to the ATP-binding cassette (ABC) transporter subfamily B. Due to its high sequence identity to the transporter associated with antigen processing (TAP) the protein was named TAP-like (TAPL). The primary aim of this PhD thesis was the functional characterization of the TAPL transport complex. Despite the lack of TAPL function in the classical MHC class I pathway an involvement of TAPL in antigen presentation was still suggested. Apart from the crucial role of TAP for peptide delivery into the ER, TAP-independent translocation pathways in professional antigen presenting cells (pAPC) have been proposed, but not identified so far. Remarkably, TAPL mRNA and protein expression is strongly induced during differentiation of monocytes to immature and mature dendritic cells. This result was confirmed in the promonocytic cell line THP-1, which was used as a model system for monocyte to macrophage differentiation. By using quantitative immunofluorescence microscopy and subcellular fractionation, TAPL was detected in the lysosomal compartment co-localizing with the lysosome associated membrane protein 2 (LAMP-2) thus excluding the ER-localization formerly reported. Furthermore, by in vitro assays, a TAPL-specific and ATPdependent translocation of peptides into isolated lysosomes was demonstrated. Hence, TAPL is a candidate mediating peptide transport in alternative antigen presentation pathways in pAPCs. The presence of an extra N-terminal transmembrane domain (TMD0) lacking sequence homology to any known protein distinguishes TAPL from most other ABC transporters of its subfamily. By dissecting the TAPL translocation complex into its four putative transmembrane helices containing TMD0 and the core complex, distinct functions to the core complex and TMD0 were assigned. The core-TAPL complex composed of six predicted transmembrane helices and the nucleotide-binding domain (NBD) was expressed transiently in HeLa or stably in Raji cells. Crude membranes containing core-TAPL showed the same peptide transport activity as wt-TAPL demonstrating that the six core helices and the NBD are sufficient for peptide transport. This result also shows that the core transport complex is correctly targeted to and assembled in the membrane. Strikingly, in contrast to the wt transporter, the core complex localizes only partially to lysosomes and is mistargeted to the plasma membrane as observed by immunofluorescence microscopy and confirmed biochemically by cell surface biotinylation. Thus, a crucial role for TMD0 in proper subcellular targeting can be postulated. The vast majority of biological processes are mediated by protein complexes, hence characterization of such protein-protein-interactions is essential for understanding protein function on the cellular level. To identify interaction partners of TAPL, the transporter was isolated by tandem affinity purification. By tandem mass spectrometry the membrane proteins LAMP-1 and LAMP-2 were deciphered as specific proteins interacting with wt-TAPL. Notably, core-TAPL lacks these interactions indicating a role for TMD0 in recruiting other proteins. These results were verified for endogenous TAPL by co-immunoprecipitation. Using cells deficient in LAMP-1 and/or in LAMP-2 an escort function for the LAMP proteins was excluded. Very importantly, the physiological function of the LAMP-1and LAMP-2 interaction with TAPL is an increase in stability, since in their absence half-life of TAPL is drastically reduced.
• TAPL-Like (TAPL) oder ABCB9 ist ein kürzlich entdecktes Mitglied der ABC-(ATP-binding cassette) Proteinfamilie. Die von Archaeen bis hin zum Menschen hoch konservierten ABC-Proteine bilden eine der wichtigsten Transporterfamilien in der Zelle. ABC-Transporter nutzen die chemische Energie des ATP um verschiedenste Substrate (z. B. Ionen, Aminosäuren oder große Proteine) über eine Membran zu transportieren. TAPL ist ein Peptidtransporter, dessen Name aus der sehr auffälligen Ähnlichkeit zu dem Transporter assoziiert mit Antigenprozessierung (TAP) herrührt. TAP, bestehend aus den Untereinheiten TAP1 und TAP2, transportiert proteasomal generierte Peptide in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, die anschließend auf MHC Klasse I Moleküle beladen werden. Sequenzvergleiche weisen auf eine ~ 40%ige Identität von TAPL und den beiden TAP Untereinheiten hin, die untereinander eine 39%ige Übereinstimmung in ihrer Aminosäuresequenz besitzen. TAPL ist ein stark konserviertes Protein unter den Säugetieren, 95% der Aminosäurereste des humanen Proteins sind identisch mit dem murinen Protein und dem Rattenprotein. TAPL ist ein homodimerer Transportkomplex, wobei jede Untereinheit aus einer N-terminalen Transmembrandomäne (TMD) und einer C-terminalen Nukleotidbindedomäne (NBD) besteht. Hydrophobizitätsanalysen und Sequenzvergleiche mit TAP ergaben zehn putative Transmembranhelices für jede TMD von TAPL. Basierend auf Sequenzanalysen kann die TMD weiter in eine C-terminale Kernregion (core) und eine einzigartige N-terminale Domäne aufgeteilt werden. Für die Kerndomäne werden sechs Transmembranhelices, die allen ABCExportern gemein sind, und für die N-Domäne vier Helices, die TMD0 genannt werden, vorhergesagt. Die Funktion von TAPL als Peptidtransporter wurde in Insektenzellen anhand von Translokationsexperimenten mit markierten Peptiden aufgeklärt. Die Analyse von Peptiden unterschiedlicher Länge zeigte, dass die optimale Länge der unter ATP Verbrauch transportierten Peptide bei etwa 23 Aminosäuren liegt. Im Vergleich dazu transportiert TAP Peptide von 8-12 Aminosäuren am effizientesten. Die Substrate beider Transporter müssen für eine effiziente Translokation über die Membran freie N- und C-Termini besitzen. Die Peptidspezifität von gereinigtem und rekonstituiertem TAPL wurde mit Hilfe von kombinatorischen Peptidbibliotheken untersucht. Hierbei wurde eine Präferenz für positiv geladene, aromatische und hydrophobe Aminosäuren an beiden Termini festgestellt. Eine hohe Promiskuität zwischen den Termini gewährleistet, dass ein einziger Transporter eine große Vielfalt an unterschiedlichen Peptiden translozieren kann. Die hohe Sequenzidentität zu TAP und auch die Funktion als Peptidtransporter führten zwangsläufig zu der Frage, ob TAPL auch in die Antigenprozessierung über MHC Klasse I Moleküle involviert ist. Durchflusszytometrieanalysen in TAP1 und TAP2 defizienten Fibroblasten zeigten, dass heterolog exprimiertes TAPL die MHC Klasse I Oberflächenexpression in diesen Zellen nicht restaurieren kann. Folglich spielt TAPL in der klassischen Antigenpräsentation von endogenen Peptiden via MHC Klasse I Moleküle keine Rolle. Das primäre Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es den Peptidtransporter TAPL funktionell zu charakterisieren. Hierbei sollte die subzelluläre Lokalisation und der zugrunde liegende Mechanismus adressiert werden. Desweiteren war die Analyse der Interaktionspartner und die Bestimmung ihrer Funktion ein wichtiger Aspekt bei der Charakterisierung des Transporters. Auch wenn eine Beteiligung von TAPL im klassischen MHC I Präsentationsweg ausgeschlossen war, wurde aufgrund der hohen Ähnlichkeit zu TAP dennoch eine Rolle von TAPL in der Antigenpräsentation vermutet. Folglich wurde im Rahmen dieser Arbeit zuerst die Expression von TAPL in professionellen Antigen präsentierenden Zellen (pAPC), die neben MHC Klasse I auch MHC Klasse II Moleküle exprimieren, untersucht. Die Expression von TAPL auf Transkriptions- und Translationsebene wurde zunächst in dendritischen Zellen (DC) analysiert. DCs stellen die wichtigsten pAPCs dar, da hauptsächlich sie primäre Immunantworten einleiten. Unreife DCs wurden aus CD14 positiven, humanen Monozyten generiert und anschließend eine weitere Differenzierung zu reifen Zellen ausgelöst. Sowohl in den unreifen als auch in den reifen Zellen wurde eine Induktion der TAPL-Expression auf mRNA- und Proteinebene beobachtet. Übereinstimmend mit diesem Ergebnis konnte in der promonozytären Zelllinie THP-1 nach Stimulation zu Makrophagen, einer weiteren Population von pAPCs, eine starke Induktion der TAPL-Expression im Western-Blot detektiert werden. Basierend auf diesen Beobachtungen wird eine Rolle für TAPL in der Kreuzpräsentation mittels MHC Klasse I oder in der alternativen Präsentation von cytosolischen Antigenen durch MHC Klasse II spekuliert. Da die Lokalisation von TAPL in der Literatur widersprüchlich beschrieben war, wurde dessen subzelluläre Lokalisation in mit TAPL retroviral transduzierten THP-1 Zellen mit Hilfe der quantitativen Immunfluoreszenz analysiert. Die Experimente demonstrierten eine eindeutige lysosomale Lokalisation und schlossen eine Anwesenheit im ER oder in frühen Endosomen aus. Die lysosomale Lokalisation von endogen exprimiertem TAPL konnte außerdem durch eine subzelluläre Fraktionierung von stimulierten, nicht transduzierten THP-1 Zellen nachgewiesen werden. Durch die Etablierung eines in vitro Transportassays an isolierten Lysosomen konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass TAPL einen lysosomalen Peptidtransporter darstellt. Hierfür wurde die humane Blymphoblastoide Zelllinie Raji mit Wildtyp-TAPL (wt-TAPL) oder einer inaktiven Mutante (K545A/H699A), die nicht mehr in der Lage ist ATP zu hydrolysieren, retroviral transduziert. Eine subzelluläre Fraktionierung wies für beide Konstrukte eine Anreicherung in der lysosomalen Fraktion auf. Eine ATP-abhängige Peptidaufnahme in Lysosomen, die wt-TAPL enthielten, konnte gezeigt werden, während in Lysosomen mit der inaktiven Mutante keine Peptidaufnahme erfolgte. Um die funktionelle Einheit des Transporters zu adressieren, wurde die TMD0 von TAPL deletiert und die Kerndomäne, bezeichnet als core-TAPL, in HeLa Zellen transient oder in Raji Zellen stabil exprimiert. Core-TAPL wurde in HeLa Zellen überexprimiert, was bereits auf eine richtige Faltung des Proteins deutete. In Gesamtmembranen von Raji Zellen, die mit wt-TAPL oder core-TAPL transduziert wurden, wurde die gleiche Aktivität für beide Proteine gemessen. Folglich ist die Funktion von TAPL in Bezug auf die Peptidtranslokation durch die Deletion von TMD0 nicht beeinflusst. Um einen möglichen Einfluss der TMD0 Deletion auf die subzelluläre Lokalisierung zu bestimmen, wurde die Lokalisation von core-TAPL mittels Immunfluoreszenz analysiert. Im Gegensatz zu wt-TAPL zeigte core-TAPL nur eine partielle Kolokalisation mit dem lysosomalen Marker LAMP-2. Core-TAPL war an der Plasmamembran und in intrazellulären Kompartimenten, die mit Markerproteinen für ER und frühe Endosomen nicht überlappten, zu finden. Die Lokalisation von core-TAPL an der Plasmamembran wurde biochemisch über eine Oberflächenbiotinylierung verifiziert. Desweiteren zeigte das verkürzte TAPL Protein ein verändertes Migrationsverhalten in einem Percollgradienten, in dem es im Gegensatz zu dem Wildtyp Protein nicht in der dichten, lysosomalen Fraktion, sondern in den leichten Plasmamembran/ER-Fraktionen vorzufinden war. Zudem stellte sich heraus, dass in isolierten Percollfraktionen core-TAPL in der leichten Fraktion aktiv war, während für wt-TAPL eine Transportaktivität in der dichten Fraktion detektiert wurde. Diese Beobachtung ist im Einklang mit der veränderten subzellulären Lokalisation von core-TAPL. Aus diesen Daten folgt, dass core-TAPL, bestehend aus einer Transmembrandomäne mit sechs putativen C-terminalen Helices und der Nukleotidbindedomäne, in der Lage ist einen dimeren, aktiven Peptidtransportkomplex zu bilden. Weiterhin verdeutlichen die oben dargestellten Ergebnisse, dass die Aktivität von TAPL unabhängig von dem sauren pH der Lysosomen ist, da core-TAPL mit einer veränderten Lokalisation die gleiche Aktivität aufweist wie wt-TAPL. Die überwältigende Mehrzahl biologischer Prozesse wird durch Proteinkomplexe vermittelt, die auf Protein-Protein-Interaktionen beruhen. Deshalb ist die Identifikation der Interaktionspartner für das Verständnis der Funktionsweise eines Proteins essentiell. Um die Interaktionspartner von TAPL zu bestimmen wurden zwei Techniken eingesetzt, zum einen die so genannte tandem affinity purification (TAP) und zum anderen die klassische Co-Immunpräzipitation. Die Reinigung über die TAP-Methode mit anschließender Massenspektrometrie führte zur Identifizierung der lysosomalen Membranproteine LAMP-1 und LAMP-2 als Interaktionspartner von TAPL. Dieser Befund konnte über Co-Immunpräzipitationen mit endogen exprimiertem TAPL bestätigt werden. Die Interaktionen zu LAMP-1 und LAMP-2 sind aufgehoben, wenn die TMD0 von TAPL deletiert wird. Um die physiologische(n) Funktion(en) dieser Interaktionen zu verstehen, wurden LAMP-1 und/oder LAMP-2 defiziente murine embryonale Fibroblasten (MEF) mit humanem TAPL transduziert. Unabhängig von einer LAMP-1 und/oder LAMP-2 Anwesenheit zeigte TAPL in allen MEFs eine lysosomale Lokalisation, was eine Rolle dieser Proteine im targeting ausschloss. Mittels Co-Immunpräzipitationen wurde demonstriert, dass die murinen LAMP-Moleküle mit humanem TAPL interagieren, was aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit von humanen und murinen LAMP-Proteinen nicht unerwartet ist. Zudem konnte in semi-permeabilisierten MEF-Zellen die Aktivität von TAPL über einen Peptidtransportassay demonstriert werden. Dennoch fiel auf, dass die Aktivität von TAPL in LAMP-1/LAMP-2 knock-out Zellen ca. 70% reduziert war, was mit der im Western-Blot beobachteten reduzierten Expression gut korrelierte. Wie sich über pulse-chase Experimente feststellen ließ, war die stark reduzierte Halbwertszeit des Proteins in Abwesenheit der LAMP-Proteine die Ursache für die reduzierte Expression von TAPL in diesen Zellen. Folglich sind LAMP-1 und LAMP-2 für die Stabilität von TAPL essentiell und verhindern eine schnelle Degradation des Transporters. Zusammenfassend konnte in dieser Doktorarbeit demonstriert werden, dass die Expression des lysosomalen Peptidtransporters TAPL in pAPCs induziert wird. Das Signal für die lysosomale Lokalisation befindet sich in der TMD0, wobei das genaue Motiv noch nicht identifiziert ist. Core-TAPL ist für die Bildung eines aktiven, dimeren Transportkomplex ausreichend, auch wenn die ausschließliche lysosomale Lokalisation nicht mehr gegeben ist. Wt-TAPL interagiert mit den lysosomalen Membranproteinen LAMP-1 und LAMP-2. Die physiologische Funktion dieser Interaktionen besteht darin, die Stabilität von TAPL zu erhöhen und somit den Transporter vor einer schnellen Degradation schützen.