Investigation of conserved amino acids in the PSST and TYKY subunits of complex I from Yarrowia lipolytica

Proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) transports two electrons from NADH to membranal ubiquinone: in this process protons are translocated across the membrane, producing 40% of the total proton 
Proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) transports two electrons from NADH to membranal ubiquinone: in this process protons are translocated across the membrane, producing 40% of the total proton gradient between matrix side and intermembrane space. Mitochondrial complex I contains at least 46 subunits in mammals, and has a molecular weight of around 1000 kDa. Electronic microscopy analysis showed that complex I has an L-form, which consists of two domains: a peripheral “arm” (hydrophilic domain) and a membrane “arm” (hydrophobic domain). The peripheral domain, which protrudes into the matrix, contains one non-covalently bound flavin mononucleotide (FMN) and the iron-sulfur clusters N1a, N1b, N2, N3, N4 and N5 as redox active groups. They transport electrons from NADH to ubiquinone. Cluster N2 is supposed to be the immediate electron donor to ubiquinone by virtue of its highest and pH dependent redox midpoint potential (Em,7 –150 mV). The exact location of the tetra-nuclear cluster N2 is still object of discussion. The TYKY and the PSST subunits contain three binding motifs for tetranuclear clusters which are formed by twelve cysteins. In an effort to investigate the “ubiquinone reduction module” of complex I, in the first part of this work site directed mutagenesis of the TYKY and PSST subunits has been carried out. Mutant strains were characterised in terms of complex I content, catalytic activity and EPR signature of cluster N2. The second part of this work was aimed at developing a substrate inducible version of the internal alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (NDH2i). A substrate inducible NDH2i is expected to offer a “switch” between complex I activity dependent (no NDH2i activity) and independent (NDH2i activity) cell growth, by changing between activating and non-activating substrates. This strategy would allow the screening for two types of complex I mutants, which is a prerequisite for realising a random PCR mutagenesis of single subunits of complex I, that allows the production of a high number of point mutations in relatively short time. Y. lipolytica complex I deficiency mutant strains could be easily identified, by virtue of their inability to survive under complex I dependent growth conditions (no NDH2i activity). By this way, amino acids that have an important role for complex I structure or function could be identified by subsequent sequence analysis. Each of the twelve cysteines that form the above mentioned three binding motifs for iron-sulfur cluster have been mutagenised. In mutant mitochondrial membranes, no assembled complex I could be detected. From these data one may conclude that the mutagenised 6 SUMMARY 92 cysteines play an important role for complex I stability, or that are a prerequisite for complex I assembly in Y. lipolytica, but there is not direct evidence indicating that any of the four mutagenised residues acts as a ligand. Two aspartates in the PSST subunit, Asp-99 and Asp-115, were found to be essential for complex I catalytic activity. EPR spectroscopic analysis indicated that the electron transfer to N2 cluster was not blocked and implied that this was not the reason for the loss of catalytic activity. From these data it can be concluded that D99 and D115 play a vital role for complex I NADH:ubiquinone reductase activity, but are not ligands for cluster N2 and that their position is not close enough to the cluster to influence directly its electromagnetic environment. Three mutations, identified in the PSST and TYKY homologous subunits of patients affected with Leigh syndrome (V119M in PSST, P78L and R101H in TYKY) were reconstructed in the obligate aerobic yeast Y. lipolytica. This approach may help to understand the aetiology of the Leigh syndrome, in terms of the ability of complex I to oxidize NADH and to transport electrons. In fact, all three mutations showed effects on electron transport, reducing the VMax by about 50%. Mutant V119M in the PSST subunit, which had a lethal effect in two patients that were homozygous for this mutation, affects a fully conserved residue. Overall, the results from site directed mutagenesis carried out so far support the theory that the “catalytic core ” (N2 cluster and quinone binding site) of complex I has been evolved from the electron transfer module of the [Ni-Fe] hydrogenases. In fact, mutagenesis of residues that are fully conserved between complex I and [Ni-Fe] hydrogenases, showed dramatic effects on complex I in terms of assembly (cysteine mutants) or catalytic activity (D99-D115). Differently, changing aspartate 174 and glutamic acid 185 (not fully conserved, Fig 4.1A) had little or no effect on the Michaelis-Menten parameters and N2 EPR signal. In recent years Y. lipolytica has been developed as a yeast genetic system to study mitochondrial complex I. The present work introduced the promoter for the isocitrate lyase (pICL1) as a useful tool for the substrate selective expression of the internal version of the alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (pICL1-NDH2i). This allows to rescue complex I deficiencies “in vivo” selectively by growth on acetate (or ethanol) medium. The integration of the pICL1-NDH2i construct into the genome of Y. lipolytica and subsequent deletion of nuclear-coded subunits like PSST, TYKY and 49 kDa, would contribute to further develop this organism as a useful genetic model for studying subunits of mitochondrial complex I by site directed mutagenesis.
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Die protonentranslozierende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) überträgt zwei Elektronen von NADH auf das membranständige Ubichinon. Dieser Prozess, bei dem Protonen über die mitochondriale Membran transportiert w
Die protonentranslozierende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) überträgt zwei Elektronen von NADH auf das membranständige Ubichinon. Dieser Prozess, bei dem Protonen über die mitochondriale Membran transportiert werden, trägt zu 40% des gesamten Gradienten zwischen Matrixseite und Zwischenmembranraum bei. Bei Säugetieren beinhaltet der mitochondriale Komplex I 46 Untereinheiten (Rinderhertzmitochondrien) und hat eine Masse von ungefähr 1000 kDa. Elektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass der Komplex I eine L-förmige Gestalt aufweist, welche aus zwei Subkomplexen besteht: Einem peripheren Arm (hydrophiler Bereich) und einem Membranarm (hydrophober Bereich). Der periphere Arm, der in die Matrix hereinragt, enthält ein nicht kovalent gebundenes FMN und die Eisen-Schwefel Zentrum N1, N2, N3, N4, N5 und N6 als Redoxgruppen. Diese transportieren Elektronen von NADH zu Ubichinon. Zentrum N2 ist vermutlich der unmittelbare Elektronendonor für Ubichinon, weil es das höchste Mittelpunktpotential aufweist. Die genaue Lokalisation des 4Fe-4S Zentrums N2 ist nach wie vor umstritten. Die Untereinheiten TYKY und PSST enthalten 3 putative Bindungsstellen für 4Fe-4S Zentrum, welche von jeweils vier Cysteinen gebildet werden. Um die N2 Liganden zu identifizieren, wurden im ersten Teil dieser Arbeit alle zwölf Cysteine der drei oben-genannten Bindungsmotive in der obligat aeroben Hefe Y. lipolytica mutiert. Mutanten wurden in Bezug auf Komplex I Gehalt und katalytische Aktivität charakterisiert und die EPR Spektren des Zentrums N2 aufgenommen. Der zweite Teil dieser Arbeit hatte die Entwicklung eines Stammes mit einer substrat-induzierten Version der inneren NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH2i) zum Ziel. Die substrat-induzierte NDH2i soll es ermöglichen, durch die Wahl unterschiedlicher Kohlenstoff-Quellen, zwischen Komplex I abhängigem und unabhängigem Zellwachstum umzuschalten. Diese Strategie würde eine weitläufige Untersuchung im Hinblick auf zwei Kategorien von Komplex I Mutanten ermöglichen. Komplex I defiziente Mutanten von Y. lipolytica könnten somit leicht aufgrund ihres Unvermögens unter Komplex I abhängigen Wachstumsbedingungen zu überleben, identifiziert werden. Auf diese Art könnten Aminosäurereste, die eine wichtige Rolle für Struktur und Funktion des Komplex I spielen, bestimmt werden. Ein derartiger Stammhintergrund würde es weiterhin ermöglichen eine große Anzahl durch ungerichtete PCR erzeugte Mutanten in relativ kurzer Zeit zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten alle 12 oben erwähnten Cysteinreste mutiert werden. Bei den mitochondrialen Membranen aus Mutanten konnte kein assemblierter Komplex I detektiert werden. Daraus kann gefolgt werden, dass Cysteine entweder eine wichtige Rolle für die Stabilität des Komplex I spielen oder, dass sie für die Assemblierung des Komplex I von Y. lipolytica von Bedeutung sind. Es gibt allerdings keine Beweise dafür, dass irgendein der zwölf mutierten Reste als Ligand agiert. Weiterhin wurde eine ganze Reihe von konservierten Aminosäurereste ausgetauscht. Es wurde herausgefunden, dass zwei Aspartatreste in der PSST Untereinheit essentiell für die katalytische Aktivität des Komplex I sind. EPR spektroskopische Analysen deuteten darauf hin, dass der Verlust der katalytische Aktivität nicht auf einen blockierten Elektronentransfer zurückzuführen ist. Aus diesen Daten kann man schließen, dass D99 und D115 eine grundlegende Rolle in der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase Aktivität des Komplex I spielen, allerdings nicht Liganden für das Eisen Schwefel Zentrum N2 sind. Auch kann ihre Position nicht nahe genug am Zentrum sein, um seine elektromagnetische Umgebung direkt zu beeinflussen. Der Austausch von D174 gegen das entsprechende Amid hatte keine oder nur eine geringe Auswirkung auf die Michaelis Menten Parameter und auf das N2 EPR Signal. Die Mutante E185Q zeigte zwar eine signifikante Reduktion von VMax hatte aber keine Effekte auf die EPR Spektren. Drei Mutationen, die in den PSST und TYKY homologen Untereinheiten von Patienten mit Leigh-Syndrom identifiziert wurden (V119M in PSST, P78L und R101H in TYKY), wurden in der obligat aeroben Hefe Y. lipolytica rekonstruiert und ihre Auswirkungen auf die Komplex I Aktivität untersucht. Tatsächlich zeigten alle drei Mutationen Auswirkungen auf den Elektronentransport, indem sie VMax um etwa 50% reduzierten. Die Mutation V119M in der PSST Untereinheit hatte eine tödliche Wirkung bei zwei Patienten, die für diese Mutation homozygot waren. Die Ergebnisse der bisher durchgeführten Punktmutation unterstützen die Theorie, dass der „catalytic core“ (N2 Zentrum und Chinon-Bindungsstelle) des Komplex I aus dem Elektronentransfermodul der [Ni-Fe] Hydrogenasen entwickelt worden ist. Tatsächlich zeigte die Mutagenese von Aminosäureresten, welche zwischen Komplex I und [Ni-Fe] Hydrogenasen hoch konserviert sind, dramatische Auswirkungen auf den Komplex I im Hinblick auf Assemblierung (Cystein-Mutanten) oder katalytische Aktivität (D99-D115). In den letzten Jahren wurde Y. lipolytica als ein Hefegenetisches Modellsystem zur Erforschung des mitochondrialen Komplex I entwickelt. Die vorliegende Arbeit führte den Promotor für die Isocytrat lyase (pICL1) als ein nützliches Instrument für die substratselektive Expression der inneren Version der alternativen NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (pICL1-NDH2i) ein. Dieses Konstrukt ermöglicht es Komplex I inaktive Mutanten, selektiv Wachstum auf Acetat Medium zu wachsen. Die Integration des pICL1-NDH2i Konstrukts in das Y. lipolytica Genom und die darausfolgende Deletion der kernkodierten Untereinheiten, wie PSST, TYKY und 49 kDa würde dazu beitragen, diesen Organismus als ein brauchbares genetisches Instrument für die Erforschung von Untereinheiten des mitochondrialen Komplex I mit Hilfe von Punktmutationen zu entwickeln.
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Metadaten
Author:Aurelio Garofano
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000004990
Referee:Bernd Ludwig, Ulrich Brandt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2005/01/19
Year of first Publication:2004
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2004/11/05
Release Date:2005/01/19
HeBIS PPN:12592495X
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $