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Plastics contain a complex mixture of chemicals including polymers, additives, starting substances and side-products of processing. These plastic chemicals are prone to leach into the packaged goods, in the case of food contact materials (FCMs), or into the natural environment, in the case of plastic debris. Thus, plastics represent an exposure source of chemicals for humans and wildlife alike. While it is widely known that individual plastic chemicals, such as bisphenol A and phthalates, are hazardous, little is known on the overall chemical composition and toxicity of plastics. When fragmented into smaller particles, referred to as microplastics (< 5 mm), the plastic itself can be ingested by many species. It is well established that microplastic ingestion can have negative consequences for a wide range of organisms including invertebrates, but the contribution of plastic chemicals to the toxicity of microplastics is unclear.
Given the above, the present thesis aimed at a comprehensive toxicological, ecotoxicological and chemical characterization of everyday plastics. For a comparative evaluation, 77 plastic products were selected covering 16 material types (e.g., polyethylene) made from petroleum or renewable feedstocks. These products included biodegradable products, FCMs and non-FCMs, as well as raw materials and final products, respectively. In the first two studies, the chemical mixtures contained in the 77 products were extracted with methanol and extracts were analyzed in a set of four in vitro bioassays and by non-target high-resolution gas or liquid chromatography mass spectrometry. Since an exposure only occurs if chemicals actually leach under realistic conditions, in a third study migration experiments with water were conducted for 24 out of the 77 products. The aqueous migrates were assessed in the same way as the methanolic extracts. In addition, the freshwater invertebrate Daphnia magna was exposed chronically to microplastics made of polyvinylchloride (PVC), polyurethane (PUR) and polylactic acid (PLA) to investigate the contribution of chemicals in microplastic toxicity, in a fourth study.
The experimental findings demonstrate that a wide variety of chemicals is present in plastics. A single plastic product can contain up to several thousand chemical features, most of which unique to that product and at the same time unknown. The results also indicate that the majority of these chemical mixtures are toxic in vitro. Accordingly, 65% of the plastic extracts induced baseline toxicity and 42% an oxidative stress response, while 25% had an antiandrogenic and 6% an estrogenic activity. This implies that chemicals causing unspecific toxicity are more prevalent in plastics than such with endocrine effects. These chemicals can also leach from plastics under realistic conditions. Between 17 and 8936 chemical features were detected in a single migrate sample and all 24 tested migrates induced in vitro toxicity. This means that humans and wildlife can actually be exposed to toxic plastic chemicals under realistic conditions. Generally, each product has its individual toxicological and chemical fingerprint. Thus, neither material type, feedstock, biodegradability nor the food contact suitability of a product can serve as a predictor for the toxicity, the chemical composition or complexity of a product. Likewise, this means that bio-based and biodegradable materials are not superior to their petroleum-based counterparts from a toxicological perspective despite being promoted as sustainable alternatives to conventional plastics.
Moreover, the present thesis demonstrates that plastic chemicals can be the main driver for microplastic toxicity. Irregular microplastics made of PVC, PUR and PLA adversely affected life-history traits of D. magna in a polymer type- and endpoint-dependent manner at concentrations between 100 and 500 mg L-1 and with a higher efficiency than natural kaolin particles. While the toxicity of PVC was triggered by the chemicals used in the material, the effects of PUR and PLA were induced by the physical properties of the particle.
In addition, in the fifth study, results and observations made during this thesis were integrated inter- and transdisciplinarily with the perspectives of a social scientist and a product manufacturer. This elucidated that knowledge on plastic ingredients is often concealed, is lacking or not applicable in practice. These intransparencies hinder the safety evaluation of plastic products as well as the choice and sale of the least toxic packaging material.
Overall, the present thesis highlights that the chemical safety of plastics and their bio-based and biodegradable alternatives is currently not ensured. Thus, chemicals require more consideration in the toxicity and risk assessment of plastics and microplastics. Product-specific and complex chemical compositions, including unknown compounds, pose a challenge here. Two essential steps towards non-toxic products are to increase transparency along the product life cycle and to reduce the chemical complexity of plastics by communication and regulation. The results of the present thesis indicate that products exist which do not contain toxic chemicals. These can serve to direct the design of safer plastics. Since toxicity and chemical complexity seem to increase with processing, the integration of toxicity testing during the production steps would further support the safe and sustainable production and use of plastic products.
Stressorinduzierte ökotoxikologische Effekte und Genexpressionsveränderungen bei Chironomus riparius
(2008)
Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.
Algae as primary producers are highly important in aquatic ecosystems and provide a variety of environmental and anthropogenic services. In small lotic ecosystems in agriculturally influenced landscapes, algae are often the main constituent of the base of the food web and they contribute considerably to biodiversity. Within these small lotic ecosystems, algae are influenced by both natural stressors, such as flow regime and dry-out events, and anthropogenic factors. Agricultural practices especially influence algal communities by introducing plant protection products (PPP) and fertilizers into the water. The impacts of these exposures and how they affect planktonic algae in particular are not yet well studied in small lotic ecosystems. However, the protection of algae as primary producers is of high relevance and was thus included in official biomonitoring programs such as the European Water Framework Directive (WFD) or in risk assessment of e.g. PPPs. Hence, this thesis addresses this knowledge gap and links new information on algal communities in small lotic ecosystems with biomonitoring and risk assessment.
Data was gathered from small ditches and streams in central Germany as well as from laboratory algal assays. A technique to rapidly classify and quantify planktonic and benthic algae based on their photopigment concentration (measured via delayed fluorescence - DF) in ecological and ecotoxicological studies was assessed, both in the laboratory and in the field. This research provides insight into planktonic and benthic algal communities in small streams and ditches in order to improve management and protection strategies in the face of increased agricultural chemical input. ...
Stechmücken (Dipteren: Culicidae) sind weltweit mit über 3500 Arten und mit Ausnahme der arktischen Regionen ubiquitär vertreten. Die medizinische Relevanz dieser Tiergruppe, begründet durch die hämatophage Lebensweise der Weibchen, erschloss sich bereits Ende des 19. Jh. und hat bis heute Bestand. Jedes Jahr sterben rund 600.000 Menschen an den Folgen der Malaria und fast 100 Mio. Menschen infizieren sich mit dem Denguefieber. Zwar beziehen sich diese Zahlen fast ausschließlich auf die Entwicklungsländer, aber im Zuge des Klimawandels und des immer stärkeren Welthandels kommt es auch in Europa und den USA immer wieder zu Ausbrüchen vorher nicht relevanter Krankheiten. So hat sich das West-Nil- Virus seit 1999 in Nordamerika rasant verbreitet. Im Jahr 2013 gab es dort rund 2500 Fälle, von denen 119 zum Tod führten. In Europa traten hingegen Krankheiten wie das Chikungunyafieber (Italien 2007) oder das Denguefieber (Frankreich 2010/2013) auf. Die Gründe für diese Ausbrüche sind vor allem in der Einschleppung neuer Vektorspezies und Krankheitserreger sowie in den veränderten Wirtspräferenzen einheimischer Stechmückenarten zu suchen. Das Wissen um das Vektorpotential der in Deutschland heimischen Stechmücken konnte vor allem durch die seit 2009 initiierten Monitoring-Programme stetig erweitert werden. Auch die Veränderung der heimischen Fauna durch invasive Arten wie Ochlerotatus japonicus japonicus oder Aedes albopictus wird intensiv erforscht. Dennoch ist hinsichtlich der Biologie, Ökologie sowie Genetik vieler Arten noch immer wenig bekannt.
Die vorliegende Dissertation, welche auf Basis von vier (ISI-) Einzelpublikationen kumulativ angefertigt wurde, beschäftigte sich mit der Analyse der genetischen Variabilität sowie der Zoogeographie der untersuchten Arten und der Etablierung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur Artdiagnostik. Besonderes Augenmerk wurde bei den Analysen auf die beiden heimischen Arten Culex pipiens und Culex torrentium sowie die invasive Art Ochlerotatus japonicus japonicus gelegt. Ziel war es, die noch bestehenden Wissenslücken zu füllen, um zukünftige Monitoring-Programme besser koordinieren sowie Analysen zur Vektorkompetenz und Genetik dieser Arten gezielter durchführen zu können.
Es konnte gezeigt werden, dass Cx. pipiens und Cx. torrentium deutliche Unterschiede in ihren Populationsstrukturen aufwiesen welche auf verschiedene evolutive Prozesse hindeuten. Die geringere genetische Variabilität in Cx. pipiens lässt auf positive Selektion durch z.B. Insektizidresistenz im Zuge durchgeführter Bekämpfungsmaßnahmen oder die Infektion mit Wolbachien schließen. Die analysierte Populationsstruktur von Cx. torrentium spricht hingegen für eine geringe Ausbreitung, wodurch der genetische Austausch reduziert wurde und so die untersuchten Populationen genetisch stärker voneinander abwichen. Des Weiteren ließen die Analysen des Cytochrom c Oxidase Untereinheit 1-Fragmentes (cox1) Rückschlüsse auf die Zoogeographie dieser Arten in Deutschland zu - wobei beide Arten über das Untersuchungsgebiet verteilt waren, Cx. torrentium jedoch in den neuen Bundesländern weniger häufig nachgewiesen wurde als in den alten und eine geringere gefangene Individuenzahl aufwies. Basierend auf der ökologischen Nischenmodellierung konnten potentiell neue Verbreitungsgebiete für die Art Ochlerotatus japonicus japonicus identifiziert werden. Als klimatisch besonders günstig zeigten sich dabei Südhessen, das Saarland sowie nördliche Teile Nordrhein-Westfalens. Mit Hilfe der etablierten Methode der direct-PCR wird in Zukunft eine schnellere und kostengünstigere Identifizierung von Stechmücken erfolgen können, welche aufgrund bestimmungsrelevanter Merkmale nicht mehr morphologisch zu identifizieren sind.
Um das Wissen über die Stechmücken in Deutschland fortlaufend zu intensivieren, ist sowohl das Weiterführen der Monitoring-Programme als auch die molekularbiologische Aufarbeitung der Proben nötig. Durch die Anwendung neuer Techniken und weiterer molekularer Marker wird es möglich sein, weitere Krankheitserreger sowie genetische Besonderheiten der heimischen Stechmückenfauna nachzuweisen. Aber auch die Überwachung invasiver Stechmückenarten durch die Modellierung potentieller Verbreitungsgebiete und die Anwendung molekularbiologischer Analysemethoden zum Detektieren der Arten und möglicher Krankheitserreger wird ein wichtiger Bestandteil der weiteren Forschung sein.
Seit den 1950er Jahren hat sich Plastik als unverzichtbare Ressource im menschlichen Alltag etabliert. Als negative Folge dieses Booms wird seit einigen Jahrzehnten jedoch eine zunehmende Belastung aquatischer Ökosysteme mit Plastikmüll bzw. dessen Degradationsprodukten, sogenanntes „Mikroplastik“ (MP, < 5 mm) bzw. „Nanoplastik“ (NP, < 1 µm), beobachtet. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des aktuellen Vorkommens von MP in limnischen Gewässern, die Analyse der Interaktion zwischen MP und limnischen Wirbellosenarten und der daraus resultierenden Toxizität sowie eine erste Risikoabschätzung.
Das Vorkommen von Mikroplastik in limnischen Gewässern wurde exemplarisch anhand der Elbe als großes Fließgewässer in Deutschland untersucht. Durch die Auswertung von elf Probestellen entlang des Verlaufs der Mittel- und Unterelbe konnte gezeigt werden, dass die MP-Konzentrationen im Sediment (2,26x10^4 – 2,27x10^7 P m^-3) im Mittel fast 150.000-fach höher sind als in der Wasserphase (0,88–13,24 P m^-3). Sedimente sind somit eine Senke für MP. Die Zusammensetzung der Polymerarten sowie MP-Formen deuten zudem an, dass die Partikel sowohl aus diffusen wie auch aus Punktquellen (z.B. Industrieabwässer) stammen. Im globalen Vergleich können die MP-Konzentrationen in deutschen Fließgewässern z. Z. als durchschnittlich betrachtet werden. Allerdings muss insgesamt davon ausgegangen werden, dass die bisher bestimmten MP-Umweltkonzentrationen die realen Konzentrationen möglicherweise unterschätzen. So zeigte die Elbestudie, dass die Sedimentfeinfraktion < 100 µm einen bedeutenden Polymeranteil enthielt. Die meisten bisher durchgeführten Studien zur Bestimmung von MP-Partikeln in Flüssen haben Partikel < 100 µm jedoch nicht in ihrer Analyse berücksichtigt.
Die Interaktion von MP mit limnischer Biota wurde anhand der Artgruppen der Muscheln (Bivalvia), Schnecken (Gastropoda) sowie Krebstiere (Crustacea) näher untersucht. Die Intensität der Interaktion ist maßgeblich von der Aufnahme von MP durch die verschiedenen Arten abhängig. Anhand von zahlreichen Aufnahmestudien mit verschiedenen limnischen Arten, darunter den Muschelarten Dreissena polymorpha, Sinanodonta woodiana und Anodonta anatina, der Lungenschnecke Lymnaea stagnalis sowie der Amphipodenart Gammarus pulex, wurde nachgewiesen, dass die MP-Aufnahme von den Eigenschaften der exponierten Arten bzw. Individuen, den MP-Charakteristika sowie den Expositionsbedingungen abhängt. Die Experimente mit Muscheln verdeutlichten die rasche Aufnahme, aber auch Exkretion von MP-Partikeln innerhalb weniger Stunden. In allen drei Artgruppen war die Aufnahme konzentrationsabhängig mit zunehmender Aufnahme bei steigenden MP-Konzentrationen. Die Muschelexperimente zeigten jedoch auch, dass eine gleichzeitige Exposition mit anderen Partikeln (z.B. Nahrung) zu einer reduzierten Aufnahme führt. Auch die Größe der Testorganismen beeinflusste die Aufnahme: So nahmen im Fall der Muscheln und Krebse kleinere Individuen (bzw. im Fall der Muscheln auch Arten) relativ pro Körpermasse mehr MP-Partikel auf als größere Individuen bzw. Arten. Für alle untersuchten Arten wurde darüber hinaus gezeigt, dass die MP-Größe relevanten Einfluss auf die Menge an aufgenommenen Partikeln hat.
Ein Vergleich zwischen den Artgruppen zeigte, dass Muscheln als filtrierende Organismen in den Laboruntersuchungen bei gleicher Expositionskonzentration mehr MP aufnahmen als Krebse (Zerkleinerer) und Schnecken (Weidegänger). Im Gegensatz zu Muscheln nutzen Krebstiere und Schnecken allerdings die Grenzschicht zwischen Wasser- und Sedimentphase als Suchraum für ihre Nahrung und sind in der Umwelt (auf Grund des höheren MP-Vorkommens in Sedimenten) somit möglicherweise gegenüber höheren MP-Konzentrationen exponiert als Muscheln. Die Extrapolation der gewonnenen Labordaten sowie der Vergleich mit publizierten Umweltdaten legen allerdings nahe, dass das MP-Vorkommen in Individuen aller drei Artgruppen bisher auf einige wenige MP-Partikel begrenzt ist. Ausgeprägte Unterschiede zwischen den Artgruppen sind bisher nicht erkennbar.
MP-Toxizitätsstudien mit G. pulex, L. stagnalis sowie D. polymorpha konnten trotz der Berücksichtigung einer Vielzahl an Endpunkten (Mortalität, Reproduktion, Nahrungsaufnahme, oxidativer Stress, Energiereserven, Immunzellaktivität) und trotz des Einsatzes zum Teil sehr hoher MP-Konzentrationen weit oberhalb aktueller Umweltkonzentrationen nur sehr wenige MP-induzierte Effekte nachweisen, darunter eine Steigerung der Filtrationsaktivität (D. polymorpha) bzw. Veränderung der Immunfunktion von Hämolymphzellen (L. stagnalis).
Zur weiteren Risikoabschätzung wurden diese Studienergebnisse mit publizierten Daten für marine und limnische Muschel- und Krebsarten in Artenempfindlichkeitsverteilungen (Species Sensitivity Distributions, SSD) zusammengeführt und jeweils eine SSD für Muscheln und Krebstiere erstellt. Die Erstellung einer SSD nur für limnische Arten ist zum jetzigen Zeitpunkt auf Grund der geringen Datenlage noch nicht möglich.
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Surface water can contain a complex mixture of organic micropollutants (i.e. residues of pharmaceuticals or biocides). Conventional wastewater treatment plants (WWTPs) do not completely remove a broad range of anthropogenic chemicals and therefore represent a leading point source. To upgrade WWTPs, technical solutions based on oxidative and sorptive processes have been developed and successfully implemented. Acknowledging these substantial advances, this thesis focuses on another key topic and aims to investigate whether improved biological treatment processes likewise effectively remove anthropogenic micropollutants from wastewater. The work conducted on this topic was part of two European research projects (ATHENE, ENDETECH).
The ATHENE project aimed to go beyond the state-of-the-art by developing biological wastewater treatment processes that exploit the full potential of biodegradation. With the objective to explore the potential of complementary strictly anaerobic conditions within the biological wastewater treatment, combinations of aerobic and anaerobic treatments on site of a WWTP were implemented. Based on pre-experiments, two promising treatment combinations were selected for a more comprehensive evaluation. An aerobic treatment was paired with an anaerobic pre-treatment under iron-reducing conditions, and an activated sludge treatment was combined with an anaerobic post-treatment under substrate-limiting conditions. For the evaluation of these processes, an effect-based assessment was applied and combined with chemical data of 31 selected target organic micropollutants as well as ten metabolites. To assess the removal of endocrine disrupting chemicals (EDCs), yeast based reporter gene assays covering seven receptor-mediated mechanisms of action including (anti-)estrogenicity, (anti-) androgenicity, retinoid-like, and dioxin-like activity were conducted. Furthermore, the removal of unspecific toxicity (Microtox assay) and oxidative stress response as a marker for reactive toxicity (AREc32 assay) were analyzed to cover micropollutants acting via a non-specific mechanism of action. Moreover, to assess toxicity of the whole effluent in vivo, standardized in vivo bioassays with four aquatic model species (Desmodesmus subspicatus, Daphnia magna, Lumbriculus variegatus, Potamopyrgus antipodarum) were performed.
The combination of aerobic and anaerobic treatments resulted in a low additional removal of the selected target organic micropollutants (by 14-17%). In contrast, the removal of endocrine and dioxin-like activities (by 17-75%) and non-specific in vitro toxicities (by 27-60%) was significantly enhanced. Compared to technical solutions (i.e. ozonation), the combination with an anaerobic pre-treatment under iron-reducing conditions was likewise effective in removing the estrogenic activity as well as the unspecific toxicity, whereas anti-androgenic activity and dioxin-like activity were less effectively removed. Exposure to effluents of the conventional activated sludge treatment did not induce adverse in vivo effects in the investigated aquatic model species. Accordingly, no further improvement in water quality could be observed. In conclusion, the combination of aerobic and anaerobic treatment processes significantly enhanced the removal of specific and non-specific in vitro toxicities. Thus, an optimization of the biological wastewater treatment can lead to a substantially improved detoxification. These capacities of a treatment technology can only be uncovered by complementary effect-based measurements.
The global objective of the ENDETECH project was to develop a biotechnological solution to eliminate recalcitrant pharmaceuticals in wastewater direct from sites, where high loads are expected (i.e. hospitals). For this purpose, laccase, an enzyme mainly found in wood decaying fungi, was immobilized on ceramic membranes for application in bioreactors. In a proof of principle experiment, the performance of immobilized laccase in removing a mixture of 38 antibiotics without and in combination with a natural mediator (syringaldehyde; SYR) was investigated. For the evaluation of the enzymatic membrane bioreactors, chemical data on the elimination of the selected target antibiotics was combined with the outcomes of two in vitro bioassays. Growth inhibition tests with an antibiotic sensitive Bacillus subtilis strain were conducted to assess the residual antibiotic activity of the effluents, and Microtox assays were performed to detect a potential formation of toxic by-products.
The treatment by laccase without SYR did not reduce the load of antibiotics significantly. In contrast, in combination with a SYR concentration of 10 µmol L-1, 26 out of 38 antibiotics were removed by >50% after 24 h treatment. Moreover, increasing the SYR concentration to 1000 µmol L-1 resulted in a further improvement of the antibiotic removal. 32 out of 38 antibiotics were removed by over 50%, whereby 17 were almost completely eliminated (>90%). However, the treatment with laccase in combination with SYR resulted in a time-dependent increase of unspecific toxicity. While SYR alone did not affect B. subtilis, the combination of laccase with SYR led to a strong time-dependent growth inhibition up to 100%. Similar to that, a time-dependent increase of unspecific toxicity in the Microtox assay was observed. In conclusion, the laccase-mediator process successfully degrades a broad spectrum of antibiotics and thus represents a promising technology to treat wastewater from sites, where high loads are expected. However, further research is required to reduce the formation of unspecific toxicity before an implementation of this technology can be considered.
Obwohl für eine Vielzahl von Chemikalien Ergebnisse aus Standardtest vorliegen, gibt es relativ wenige Erkenntnisse über generationsübergreifende Substanzeffekte und die Auswirkungen von Chemikalien auf die genetische Diversität. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden generationsübergreifende Effekte des Modellschadstoffes Tributylzinn (TBT) bei drei subakuten Konzentrationen (4,46; 6,69 und 8,93 mikro g Sn/kg TG) auf Life-Cycle-Parameter und genetische Diversität der Zuckmücke Chironomus riparius untersucht. Dabei wird eine genetisch variable (GEN+) und eine genetisch verarmte (GEN-) Populationen betrachtet. Darüber hinaus wird das Anpassungspotential an den Stressor TBT abgeschätzt. Die genetische Variabilität von C. riparius wird mittels neu entwickelter Mikrosatellitenmarker bestimmt. Dabei werden geringfügige Längenunterschiede zwischen hochvariablen DNA-Fragmenten detektiert. Weiterhin werden Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht bestimmt. Für die Ermittlung von potentiellen Anpassungsprozessen an den Stressor TBT werden nach ausgewählten Generationen akute und chronische Anpassungstest durchgeführt. Um der Fragestellung nachzugehen, ob eine TBT-Vorexposition zu einer veränderten Sensitivität gegenüber einem Zweitstressor führt, werden Experimente mit Cadmium durchgeführt. Auch in den Zweitstressorstudien wird der Multigenerationsansatz gewählt, und es werden Life-Cycle-Experimente über drei weitere Generationen durchgeführt. Für die Experimente werden die mit 4,46 und 8,93 mikro g Sn/kg TG vorexponierten Tiere anschließend nach unterschiedlicher Generationenzahl einer umweltrelevanten Cadmiumkonzentration (1,2 mg/kg TG) ausgesetzt. Im Verlauf der Multigenerationsstudie mit 4,46 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf die Entwicklung und Reproduktion beobachtet. In den ersten Generationen ist der Schlupfzeitpunkt der Larven bei TBT-Exposition signifikant (p < 0,05, t-Test) verzögert. Die Reproduktion scheint ebenso ein sensitiver Parameter zu sein, wobei die Weibchen der genetisch variableren Population signifikant (p < 0,05, t-Test) größere Gelege in den späteren Generationen produzieren. Die niedrige TBT-Konzentration hat in beiden Populationen keinen signifikanten Effekt auf die durchschnittliche Populationswachstumsrate. In den letzten Generationen der Studie wird für die genetisch variablere Population eine Veränderung des Lebenszyklus festgestellt, wobei die Weibchen eine erhöhte Reproduktionsleistung aufweisen. Es werden keine Effekte auf die Heterozygotie festgestellt. Allerdings treten in beiden Populationen zahlreiche Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht auf. Weiterhin werden signifikante (Pearson-Korrelation, p < 0,05) Effekte der genetischen Diversität auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter (Gelegeanzahl pro Weibchen, Gelegegröße) ermittelt. In den chronischen und akuten Anpassungsexperimenten gibt es deutliche Hinweise auf Adaptationsprozesse gegenüber dem Stressor TBT. In der TBT-Studie mit 8,93 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter festgestellt, wobei die Entwicklung und Reproduktion der Tiere negativ beeinflusst wird. Darüber hinaus werden in der genetisch variableren Population signifikante (p < 0,05, X2-Test) Effekte von TBT auf die genetische Diversität beobachtet. Diese nimmt im Verlauf der Studie ab. Nach der vierten Generation gibt es in der genetisch variableren Population Hinweise auf Anpassungsprozesse, die allerdings in den letzten Generationen nicht mehr nachzuweisen sind. Ähnlich wie in der ersten Multigenerationsstudie wird auch in dieser Studie ein signifikant (Pearson-Korrelation, p < 0,05) positiver Zusammenhang zwischen der genetischen Diversität und der Populationswachstumsrate bei TBT-Exposition festgestellt. In den Zweitstressorexperimenten wird der Effekt der Vorbelastung bei der genetisch variableren Population deutlich. Die mit 8,93 mikro g Sn/kg TG über neun Generationen exponierte Population reagiert dabei empfindlicher auf den Stressorwechsel als die dazugehörige Referenzpopulation. Innerhalb der Multigenerationsstudien werden zahlreiche Effekte der Organozinnverbindung TBT auf Life-Cycle-Parameter und die genetische Diversität von C. riparius deutlich. Diese Dissertation zeigt die hohe Bedeutung von Mehrgenerationenstudien für die Abschätzung und Bewertung eines Risikopotentials von Schadstoffen.
Wastewater treatment plants (WWTPs) do not eliminate micropollutants completely and are thus important point sources for these substances. In particular, concerns about en-docrine disrupting compounds in WWTP effluents give rise to the implementation of advanced treatment steps for the elimination of trace organic contaminants. The present study investigated ozonation (O3) and activated carbon treatment (AC) at two WWTPs. For an ecotoxicological assessment at WWTP Regensdorf, conventionally treated wastewater, wastewater after ozonation, and ozonated wastewater after sand filtration were evaluated in parallel via the fish early life stage toxicity test (FELST) using rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Additionally, a comparative toxicity evalu-ation of ozonated and activated carbon treated effluents was performed at the pilot scale treatment plant in Neuss (WWTP Neuss). For this purpose, four invertebrate tests and one higher plant toxicity test were selected to assess potential biological effects on or-ganisms [Lemna minor growth inhibition test, chironomid toxicity test with Chironomus riparius, Lumbriculus variegatus toxicity test, comet assay with haemolymph of the zebra mussel (Dreissena polymorpha), reproduction test with Potamopyrgus antipo-darum]. All in vivo assays were performed on site at the treatment plants in flow-through test systems. Furthermore, the present study investigated the effects of ozona-tion and activated carbon treatment on endocrine activities [estrogenicity, anti-estrogenicity, androgenicity, anti-androgenicity, aryl-hydrocarbon receptor (AhR) agonistic activity] with yeast based bioassays using solid phase extracted water samples. To evaluate the removal of in vitro non-specific toxicity, a cytotoxicity assay using a rat cell line was applied. The FELST at WWTP Regensdorf revealed a considerable developmental retardation of test organisms exposed to ozonated WW. This was accompanied by a significant decrease in body weight and length compared to reference water, to the conventionally treated WW, and to the ozonated water after sand filtration. Hence sand filtration obvi-ously prevents from adverse ecotoxicological effects of ozonation. An additional test – starting with yolk-sac larvae – resulted in a significant reduction of vitellogenin levels in fish exposed to ozonated wastewater compared to fish reared in conventionally treat-ed wastewater. This demonstrates the effective removal of estrogenic activity by ozonation. At WWTP Neuss, the reproduction test with the mudsnail P. antipodarum exhibited a decreased reproductive output after advanced treatment compared to conventional treatment. This indicates an effective estrogenicity removal by ozonation and activated carbon treatment and is confirmed by results of the yeast estrogen screen with a reduc-tion of in vitro estrogenic activity by > 75%. The L. variegatus test revealed a signifi-cantly enhanced toxicity after ozonation compared to conventional treatment, whereas this effect was reduced following subsequent sand filtration. When ozonation was applied, a significantly increased genotoxicity was observed, detected with the comet assay using haemolymph of the zebra mussel. Again, this effect was removed by subsequent sand filtration to the level of conventional treatment. Activated carbon treatment even resulted in a significant reduction of genotoxicity. At both treatment plants, adverse effects after ozonation may have been a result of the formation of toxic oxidation by-products. However, sand filtration reduced toxication effects, indicating that these oxidation by-products are readily degradable or adsorbable. The results point out that, in any case, ozonation should not be applied without subsequent biologically active post treatment appropriate for oxidation by-products removal (e.g. sand filtration). However, only activated carbon achieved a toxicity reduction compared to the conventional treated wastewater. Thus, it cannot be excluded that po-tential beneficial effects due to ozonation might be masked by residual toxic oxidation by-products passing the sand filter or ozonation is not as effective in toxicity removal as PAC treatment. The yeast based assays with solid phase extracted samples revealed an effective endo-crine activity removal during ozonation and activated carbon filtration (estrogenicity: 77 – 99%, anti-androgenicity: 63 – 96%, AhR agonistic activity: 79 – 82%). The cyto-toxicity assay exhibited a 32% removal of non-specific toxicity after ozonation com-pared to conventional treatment. Ozonation in combination with sand filtration reduced cytotoxic effects by 49%, indicating that sand filtration contributes to the removal of toxicants. Activated carbon treatment was the most effective technology for cytotoxici-ty removal (61%). Sample evaporation reduced cytotoxic effects by 52% (after activated carbon treatment) to 73% (after ozonation), demonstrating that volatile substances contribute considerably to toxic effects, particularly after ozone treatment. These results confirm an effective removal or transformation of toxicants with receptor mediated mode of action and non-specific toxicants during both investigated treatment steps. However, due to the limited extractability, polar ozonation by-products were neglected for toxicity analysis, and hence non-specific toxicity after O3 is underestimated. In the long run, only on-site comparisons at WW receiving water bodies (e.g. communi-ty analysis of fish, macroinvertebrates, plants, microorganisms) – before and after up-grading WWTPs – allow drawing environmentally relevant conclusions regarding bene-fits and risks of advanced WW treatment methods. Conclusively, the benefits and possible negative impacts have to be carefully evaluated to prove that not more environmental impact will be induced than removed by advanced treatment technologies as each additional treatment requires considerable amounts of energy, resources, and infrastructure facilities. Accordingly, comprehensive sustainable approaches for pollution prevention and wastewater treatment (e.g. source control and source separation) are preferable compared to end-of-pipe treatment systems.
The environmental impact of climate change is meanwhile not only discussed in the scientific community but also in the general public. However, little is known about the interaction between climate change and pollutants like pesticides. A combination of multiple stressors (e.g. temperature, pollutants, predators) may lead to severe alterations for organisms such as changes in time of reproduction, reproductive success and growth performance, mortality and geographic distribution. The questions if aquatic organisms tend to react more sensitive towards incidents under climate change conditions remains. Therefore, within the present thesis the aquatic ecotoxicological profile of the fungicide pyrimethanil, as an exemplarily anthropogenic used contaminant, was examined.
A large test battery of ecotoxicological standard tests and supplement bioassays with non-model species was conducted to investigate if species-specific or life stage-specific differences occur or if temperature alteration may change the impact of the fungicide. Two of the most sensitive species (Chironomus riparius and Daphnia magna) were used to investigate the acute and chronic thermal dependence of pyrimethanil effects. The results clearly depict that the ecotoxicity of pyrimethanil at optimal thermal conditions did not depend on the trophic level, but was species-specific. With regard to EC10 values the acute pyrimethanil toxicity on C. riparius increased with higher temperature (6.78 mg L-1 at 14°C and 3.06 mg L-1 at 26°C). The chronic response of D. magna to the NOEC (no observed effect concentration) of the fungicide (0.5 mg L-1) was examined in an experiment which lasted for several generations under three simulated near-natural temperature regimes (‘cold year, today’ (11 to 22.7°C), ‘warm year, today’ (14 to 25.2°C) and ‘warm year, 2080’ (16.5 to 28.1°C)). A pyrimethanil-induced mortality increase was buffered by the strongly related increase of the general reproductive capacity, while population growth was stronger influenced by temperature than by the fungicide. At a further pyrimethanil concentration (LOEC – lowest observed effect concentration: 1 mg L-1), a second generation could not be established by D. magna under all thermal regimes.
Besides daphnids, the midge C. riparius was used for a second multigeneration study. In a bifactorial test design it was tested if climate change conditions alter or affect the impact of a low fungicide concentration on life history and genetic diversity. The NOAEC/2 (half of the no observed adverse effect concentration derived from a standard toxicity test) was used as a low pyrimethanil concentration to which laboratory populations of the midges were chronically exposed under the mentioned temperature scenarios. During the 140-day-multigeneration study, survival, emergence, reproduction, population growth, and genetic diversity of C. riparius were analyzed. The results reveal that high temperatures and pyrimethanil act synergistically on life history parameters of C. riparius. In simulated present-day scenarios, a NOAEC/2 of pyrimethanil provoked only slight to moderate beneficial or adverse effects. In contrast, an exposure to a NOAEC/2 concentration of pyrimethanil at a thermal situation likely for a summer under the future expactations uncovered adverse effects on mortality and population growth rate. In addition, genetic diversity was considerably reduced by pyrimethanil in the ‘warm year, 2080’ scenario, but only slightly under current climatic conditions. The multigeneration studies under near-natural thermal conditions indicate that not only the impact of climate change, but also low concentrations of pesticides may pose a reasonable risk for aquatic invertebrates in the future. This clearly shows that thermal and multigenerational effects should be considered when appraising the ecotoxicity of pesticides and assessing their future risk for the environment.
In addition to temperature further multiple abiotic and biotic stressors alterate pollutant effects. Moreover, to better discriminate and understand the intrinsic and environmental correlates of changing aquatic ecosystems, it was experimentally unraveled how the effects of a low-dose of pyrimethanil on daphnids becomes modified by different temperatures (15°C, 20°C, 25°C) and in the presence/ absence of predator kairomones of Chaoborus flavicans larvae. The usage of a fractional multifactorial test design provided the possibility to investigate the individual growth, reproduction and population growth rate of Daphnia pulex via different exposure routes to the fungicide pyrimethanil at an environmentally relevant concentration (0.05 mg L-1) - either directly (via the water phase), indirectly (via algae food), dually (via water and food) or for multiple generations (fungicide treated source population).
The number of neonates increased with increasing temperatures. At a temperature of 25°C no significant differences between the individual treatment groups were observed although the growth was overall inhibited due to pyrimethanil. Besides, at 15 and 20°C it is obvious that daphnids which were fed with contaminated algae had the lowest reproduction and growth rate. The obtained results clearly demonstrate that multiple stress factors can modify the response of daphnids to pollutants. The exposure routes of the contaminant are of minor importance, while temperature and the presence of a predator are the dominant factors impacting the reproduction of D. pulex. It can be concluded that low concentrations of pyrimethanil may disturb the zooplankton community at suboptimal temperature conditions, but the effects will become masked if chaoborid larvae are present. Therefore it seems necessary to observe prospectively if the combination of several stress factors like pesticide exposure and suboptimal temperature may influence the life history and sensitivity of several aquatic invertebrates differently.
Besides standard test organisms it is inevitable to conduct test with aquatic invertebrate which are not yet considered regularly in ecotoxicological experiments. For example molluscs represent one of the largest phyla of macroinvertebrates with more than 100.000 species, being ecologically and economically important. Therefore, within the present study embryo, juvenile, half- and full-life cycle toxicity tests with the snail Physella acuta were performed to investigate the impact of pollutants on various life stages. Different concentrations of pyrimethanil (0.06-0.5 or 1.0 mg L-1) assessed at three temperatures (15°C, 20°C, 25°C) revealed that pyrimethanil caused concentration-dependent effects independent of temperature. Interestingly, the ecotoxicity of pyrimethanil was higher at lower temperature for the embryo hatching and F1 reproduction, but its ecotoxicity for the growth of juveniles and the F0 reproduction increased with increasing temperature. More specifically, it could have been observed that especially during the reproduction test high mortality rates occurred at the highest concentration of 1 mg L-1 at all temperatures. Due to high mortality rates no snails were available for the F1 at the highest concentrations (0.5 and 1.0 mg L-1). Compared to the F0, overall more egg masses were produced in the F1, being all fertile and no mortality occurred. For the F1-generation the strongest pyrimethanil effects were detected at 15°C. A comparison of effect concentrations between both generations showed that the F1 is more sensitive than the F0.
These results indicate that an exposure over more than one generation may give a better overview of the impact of xenobiotics. With the establishment of an embryo and reproduction test under different temperatures and various concentrations of pyrimethanil with P. acuta we could successfully show that molluscs can respond more sensitive than model organisms and that both, chemical and thermal stressor strongly influence the behaviour of the pulmonates. It can be concluded that the high susceptibility for the fungicide observed in gastropods clearly demonstrates the complexity of pesticide-temperature interactions and the challenge to draw conclusions for the ecotoxicological risk assessment of pesticides under the impact of global climate change.
Tissue translocation, multigenerational and population effects of microplastics in Daphnia magna
(2021)
The last century saw the widespread adoption of plastic materials throughout nearly every aspect of our lives. Plastics are synthetic polymers that are made up of monomer chains. The properties of the monomer in conjunction with chemical additives allow plastics to have a sheer endless variety of features and use cases. They are cheap, lightweight, and extremely durable. Plastic materials are often engineered for single-use and in conjunction with high production volumes and insufficient waste management and recycling across the globe, this leads to a large number of plastics entering the environment. Marine ecosystems are considered sinks. However, freshwater ecosystems as entry pathways are highly affected by plastic waste as well. Throughout the past decade, the impact of plastic waste on human and environmental health has received a lot of attention from the ecotoxicological community as well as the public. Small plastic fragments (< 1 mm called microplastics) are a large part of this emerging field of research. Within this, the water flea Daphnia magna is probably the most common organism that is used to assess microplastics toxicity. As a filter-feeding organism, it indiscriminately ingests particles from the water column and is thus highly susceptible to microplastics. For this thesis, we identified some gaps in the available data on the ecotoxicity of microplastics to daphnids. To illuminate some of those gaps the present thesis was aimed at five main aspects:
(1) Tissue translocation of spherical microplastics in Daphnia magna
(2) Investigation of the toxicity of irregularly shaped microplastics
(3) Multigenerational and population effects of microplastics
(4) Comparison of the toxicity of microplastics and natural particles
(5) Effects of particle-aging on microplastics toxicity
The thesis is comprised of three peer-reviewed articles and one so-far unpublished study as “additional results”. The first study was aimed at understanding tissue translocation of spherical microplastics to lipid storage droplets of daphnids. The crossing of biological membranes is discussed as a prerequisite to eliciting tissue damage and an inflammatory response. Previously, researchers reported the translocation of fluorescently labeled spherical microplastics to lipid storage droplets of daphnids, even though no plausible biological mechanism to explain this occurrence. Therefore, in order to learn more about this process and potentially illuminate the mechanism we replicated the study. We were able to observe a fluorescence signal inside the lipid droplets only after increasing the exposure concentrations. Nonetheless, it appeared to be independent of particles. This led to the hypothesis, that the lipophilic fluorescent dye uncoupled from the particles and subsequently accumulated in lipid storage droplets. The hypothesis was further confirmed through an additional experiment with a silicone-based passive sampling device showing that the fluorescence occurred both independent of particles and digestive processes. Accordingly, we concluded that the reported findings were a microscopic artifact caused by the uncoupling of the dye from the particles. Therefore, a fluorescence signal alone is not a sufficient proxy to assume that particles have translocated. It needs to be coupled with additional methods to ensure that the observation is indeed caused by the translocation of particles.
It is still unclear whether the toxicity profile of microplastics is different from that of naturally occurring particles or if they are “just another particle”, as there are innumerable amounts in the natural environment surrounding an organism. The goal of the second study was to compare the toxicity of irregularly shaped polystyrene microplastics to that of the natural particle kaolin. The environment is full of natural non-food particles that daphnids ingest more or less indiscriminately and therefore are well adapted to deal with. Daphnids have a short generation time and usually experience food limitation in nature. Therefore, short-term studies only looking at acute toxicity with ad libitum food availability are not representative of the exposure scenario in nature. For a more realistic scenario, we, therefore, used a four-generation multigenerational design under food limitation to investigate how effects translate from one generation to the next. We observed concentration-dependent effects of microplastics but not of natural particles on mortality, reproduction, and growth. Some of the effects increased from generation to generation, leading to the extinction of two treatment groups. Here, microplastics were more toxic than natural particles. At least part of this difference can be explained by physical properties leading to the quick sedimentation of the kaolin, while microplastics remained in the water column. Nonetheless, buoyancy and sedimentation would also affect exposure in the environment and are likely different for most microplastics than for most naturally occurring particle types.
...
In almost all parts of the world the industrialisation grows continuously and thus, the chemical pollution of natural waters has become a major public concern. A major consequence and one of the key environmental problems we are facing today is the increasing contamination of freshwater systems with chemicals. The chemicals are detected in wastewater, surface (river) water, ground water and drinking water ubiquitously in natural waters and not only in industrialised areas. The main point sources for water pollution and the release of these synthetic organic substances of human origin, so called micropollutants (MPs), are wastewater treatment plants (WWTPs). These MPs such as pharmaceuticals, personal care products, disinfectant chemicals, chemicals used in the industry and in households, contraceptives, hormones, food additives, artificial sweeteners, pesticides, biocides, and many emerging contaminants are only incompletely removed by the existing conventional wastewater treatment technologies. The MPs end up in the water cycle and have adverse effects on wildlife aquatic ecosystems and human health even at very low concentrations. Therefore, advanced wastewater treatment (AWWT) technologies, such as ozonation, treatment with activated carbon, biofiltration, membrane bioreactors (MBRs) or exposure to ultraviolet light are investigated as options to upgrade conventional WWTPs. However, several studies show that especially the ozonation of wastewater generates diverse transformation products (TPs) with unknown properties. These TPs could be more toxic than the mother compound. Thus, a post-treatment after the ozonation process is required.
The present thesis was part of the BMBF-funded TransRisk project dealing with “the characterisation, communication, and minimisation of risks of emerging pollutants and pathogens in the water cycle”. One main objective was the investigation of conventional treated wastewater after a full-scale ozonation with four post-treatments (each non-aerated and aerated granular activated carbon (GAC) filtration and biofiltration) in comparison to a MBR treatment of raw (untreated) wastewater separately and in combination with an additional ozonation on a pilot WWTP. For this purpose, the wastewater samples were characterised with a comprehensive battery of in vitro and in vivo bioassays. The in vitro bioassays were performed to detect endocrine activities (such as (anti)estrogenic and (anti)androgenic activities), genotoxicity, and mutagenicity. The results showed a decreased estrogenic activity due to the conventional wastewater treatment as well as the ozonation, but a distinct increase of the anti-estrogenic activity and the mutagenicity in the ozonated wastewater, possibly caused by new formed TPs, that were reduced after the post-treatments whereas the GAC filtration performed better than the biofiltration. The in vivo bioassays included for example the impact of the wastewater on mortality, reproduction, development, and energy reserves of the test organisms. The in vivo on-site tests with the mudsnail Potamopyrgus antipodarum and with the amphipod Gammarus fossarum indicated a major impact of conventional treated wastewater, ozonated wastewater, and MBR treated wastewater. The flow channel experiments in the laboratory with Gammarus pulex pointed to a serious impact of an estrogenic effluent on life-history traits of the amphipod. Finally, an ozonation of the wastewater with subsequent GAC filtration represented the most promising option. In addition, chemical analyses of 40 selected MPs, so called tracer substances, performed in parallel to the in vitro and in vivo bioassays underlined this assumption.
A second main objective was the optimisation of the preparation of water and wastewater samples for ecotoxicological in vitro bioassays because common sample preparation techniques are predominantly adapted for chemical analyses. Therefore, the impact of sample filtration, long-term acidification with following neutralisation as well as the enrichment with solid phase extraction (SPE) in combination with short-term acidification were investigated using amongst others raw (untreated) wastewater, hospital wastewater, conventional treated and ozonated wastewater, surface water, and ground water. Overall, eleven in vitro bioassays were performed for the detection of endocrine activities, genotoxicity, and mutagenicity. The results show that sample filtration and acidification/neutralisation significantly affected the outcome of the bioassays especially the anti-estrogenic activity and the mutagenicity whereas the sample filtration had a minor impact than the acidification. Thus, the testing of untreated (waste)water samples is advisable because the sample is minimally processed. Furthermore, the SPE extracts showed in parts high cytotoxic effects whereby no conclusions on the results of the bioassays were possible. However, the enrichment of endocrine activity and mutagenicity was predominantly effective but depended on the used SPE cartridge and the pH value of the (waste)water samples. Based on the results the use of a Telos C18/ENV cartridge and an acidified sample is recommendable. In the end, there is a need to optimise the sample preparation for in vitro bioassays to reach their maximum outcome for the best possible assessment of the water quality.
To date, chemicals are used ubiquitous in everyday life and an increasing consumption of pharmaceuticals and personal care products and industrial chemicals results in an increased water pollution. Conventional wastewater treatment plants are not able to completely remove the variety of (polar) organic compounds from today’s wastewater and thus serve as constant key point sources for the unintentional release of (micro-)pollutants into the aquatic environment. Anthropogenic micropollutants are detectable in very low concentrations in almost every aquatic compartment and may cause adverse effects on aquatic organisms. Considering the current situation of water pollution and to enhance water quality with regard to environmental and human health, the implementation of advanced wastewater treatment technologies, such as ozonation and activated carbon filtration was extensively discussed and investigated in recent years. Yet, besides their advantages regarding the efficient removal of a variety of recalcitrant, organic compounds as well as pathogens from the wastewater, it is known that especially the treatment with ozone may lead to the formation of largely unknown ozonation by-products with often unknown toxicity and unknown threats to human and the environment. To address these topics the joint research project TransRisk aimed at the “characterization, communication and minimization of risks originating from emerging contaminants and pathogens in the water cycle”. Within this research project the present thesis focuses on the ecotoxicological investigation of emerging waterborne contaminants, including their potential transformation products (TPs). Additionally, focus was laid on the investigation of combined effects of anthropogenic contaminants and pathogens with effects especially on aquatic invertebrate organisms.
The potential ecotoxicological effects of the antiviral drug acyclovir and two of its structurally identified TPs, were investigated on three aquatic organisms (Raphidocelis subcapitata, Daphnia magna and embryos of Danio rerio). While the parent compound acyclovir caused no acute toxicity up to a tested concentration of 100 mg/l on any of the investigated organisms, both TPs were shown to exhibit an increased aquatic toxicity. Carboxy-acyclovir, the biodegradation product of acyclovir, significantly reduced reproduction of D. magna by 40% at 102 mg/l, and the ozonation product COFA significantly inhibited growth of green algae R. subcapitata (EC10 = 14.1 mg/l). In the present case, advanced wastewater treatment was shown to lead to the formation of TPs, that reveal a higher toxicity towards investigated organisms, than the parent compound. Results highlight the necessity of further research related to the topic of identification and characterization of TPs, formed during advanced wastewater treatment processes.
To investigate the potential reduction or enhancement of toxic effects of nine differently treated wastewater effluents, selected bioassays with Daphnia magna, Lumbriculus variegatus and Lemna minor were conducted in flow-through test systems on a pilot treatment plant. The different treatment processes included ozonation of conventional biological treatment, with subsequent filtration processes as well as membrane bioreactor treatment in combination with ozonation. While exposure to the conventionally treated wastewater did not result in significant impairing effects on D. magna and L. minor, a reduced abundance of L. variegatus (by up to 46%) was observed compared to the medium control. Subsequent ozonation and additional filtration of the wastewater enhanced water quality, visible in an improved performance of L. variegatus. In general, direct evidence for the formation of toxic TPs due to the advanced wastewater treatments was not found, at least not in concentrations high enough to cause measurable effects in the investigated test systems. Additionally, no evidence for immunotoxic effects of the investigated wastewater effluents were observed. Yet, study-site- and species-specific effects hindered the definite interpretation of results. That underline the importance of a suitable test battery consisting of representatives of different taxonomic groups and trophic levels, to ensure a comprehensive evaluation of the complex matrix of wastewater and to avoid false-negative or false-positive results.
With aim to improve knowledge regarding immunotoxicity in invertebrates, the potential immunotoxic effects of the immunosuppressive pharmaceutical cyclosporine A (CsA) were investigated by applying the host-parasite model system Daphnia magna – Pasteuria ramosa in an adapted host resistance assay. Co-exposure to CsA and Pasteuria synergistically affected long-term survival of D. magna. Additionally, the enhanced virulence of the pathogen upon chemical co-exposure was expressed in synergistically increased infection rates and an increased speed of Pasteuria-induced host sterilization. In conclusion, results provide evidence for a suppressed disease resistance in a chemically stressed invertebrate host, highlighting the importance of investigating the conjunction of environmental pollutants and pathogens in the environmental risk assessment of anthropogenic pollutants.
Das Vorkommen von Kunststoffmaterialien <5 mm, sogenanntem Mikroplastik
(MP), in marinen Ökosystemen wurde bereits eingehend untersucht. Im Gegensatz dazu existieren erhebliche Wissenslücken hinsichtlich der Abundanz und der Auswirkung von MP in limnischen Ökosystemen. Vor diesem Hintergrund steht das Umweltvorkommen, mögliche Eintragspfade und die Auswirkungen von MP auf aquatische Invertebraten im Fokus dieser Arbeit. Zur Bestimmung der MP-Abundanz in Fließgewässern sind Sedimente der Elbe untersucht worden. Hierfür wurde zunächst eine Methode zur Extraktion und Identifizierung von MP aus Umweltproben entwickelt, optimiert und validiert. In der anschließenden Analyse konnten in elf Probenahmestellen 55–17400 MP kg-1 in den Sedimenten nachgewiesen werden. Der Einfluss der Gezeitenströmung wurde anhand der abnehmenden MP-Abundanz in der Tideelbe deutlich. Insgesamt weisen die Ergebnisse darauf hin, dass Sedimente von Fließgewässern eine Senke für MP darstellen. Für die Evaluation von Eintragspfaden von MP in Oberflächengewässer wurden die
Einleiter von fünf Kläranlagen beprobt und 240–897 MP m-3 in den Einleitern detektiert. Die Detailuntersuchung einer Kläranlage zeigte, dass >99% der MP-Fracht im Verlauf der Abwasseraufbereitung entfernt wird. Hierbei erfolgte die Hauptentfernung
bereits in der Vorklärung. Somit stellen Kläranlagen effektive Barrieren für den Eintrag von MP dar.
Insgesamt wird ersichtlich, dass die getesteten Arten C. riparius und G. pulex relativ insensitiv gegenüber einer MP-Exposition sind. So konnten bei G. pulex keine und bei C. riparius erst bei sehr hohen MP-Konzentrationen adverse Effekte detektiert werden. Hierbei ist die Autökologie der Spezies eine mögliche Erklärung für die Toleranz gegenüber partikulären Stressoren. Auf Basis dieser Daten sowie der ermittelten MPAbundanz kann das Umweltrisiko von MP in limnischen Ökosystemen vorläufig als
gering eingeschätzt werden. Hierbei gilt es jedoch zu beachten, dass eine abschließende
Bewertung aufgrund der nach wie vor existierenden Unsicherheiten nicht möglich ist. Diese Unsicherheiten betreffen die Umweltkonzentration von MP <80 μm, das Verhaltensowie das Wirkpotential dieser heterogenen und dynamischen Stressorenklasse
in umweltrelevanten Szenarien.
Auf den Einsatz von Tieren im Rahmen der (Umwelt-)Risikobewertung von Stoffen kann nach wie vor nicht verzichtet werden. Dabei führen die Überprüfungen einer zunehmenden Anzahl neu entwickelter Stoffe, aber auch die gestiegenen Anforderungen der Gesetzgebungen zu einem hohen Verbrauch von Versuchstieren. Diese Untersuchungen sind wichtig, da viele der in Gebrauch befindlichen und in allen Bereichen genutzten Chemikalien potentiell endokrin wirksam sind, auf unterschiedlichen Wegen in die Umwelt gelangen und sich potentiell negativ auf die Gesundheit von Mensch und Tier auswirken können.
Bei den bisher verwendeten Methoden werden vor allem juvenile oder adulte Tiere, aber auch Tiere zur Untersuchung des kompletten Lebenszyklus über eine oder mehrere Generationen für die Beurteilung von Substanzen eingesetzt. Dabei ist bekannt, dass die Entstehung reproduktiver Störungen in der Embryonalphase der jeweiligen Individuen auftritt. Um den Tierverbrauch zu reduzieren, werden teilweise In-vitro-Testsysteme angewendet. Es zeigt sich aber, dass diese Tests lediglich einen bestimmten Zelltyp in einem bestimmten Entwicklungsstadium abbilden können, was die Aussagekraft über die tatsächliche Wirkung auf ein komplexes Gewebe und dessen Entwicklung, erst Recht für den kompletten Organismus, stark einschränkt. Die Aussagekraft dieser Methoden ist daher in bestimmten eingeschränkten Grenzen zu sehen. In der vorliegenden Arbeit wird eine alternative Ersatzmethode vorgestellt mit dem Ziel einer stärkeren Aussagekraft bei toxikologisch und ökotoxikologisch relevanten Endpunkten. Im Fokus stehen hierbei die Effekte von androgenen und estrogenen Substanzen auf die Geschlechtsentwicklung von Hühnerembryonen (Gallus gallus domesticus) auf Ebene der Expression der mRNA, vereint mit Effekten auf Ebene der Organhistologie und – morphologie, verglichen mit den Normalzuständen unbehandelter Individuen. Die neu entwickelte Methode zur Beurteilung solcher Substanzen kann im Rahmen der human- und umwelttoxikologischen Risikobewertung von Stoffen eingesetzt werden und ist ein geeignetes Werkzeug, um die notwendigen Untersuchungen mit der gefordert hohen Beurteilungsqualität durchzuführen. Gleichzeitig kann mit dieser Tierversuchsersatzmethode bei hoher Aussagekraft auch der Verbrauch an weiter und höher entwickelten Versuchstieren verringert werden, was auch einem gesellschaftlich-ethischen Bedürfnis gerecht wird.
1. Halobacillus halophilus akkumuliert zum Ausgleich geringer, extrazellulärer Wasserpotentiale kompatible Solute. Bei Anzuchten in Gegenwart von 0,4 – 1,5 M NaCl wurden Glutamin und Glutamat als die dominierenden kompatiblen Solute identifiziert, während zwischen 2,0 und 3,0 M NaCl Prolin das dominierende Solut darstellt. Außerdem wurde Ectoin als zweites kompatibles Solut gefunden, das spezifisch bei hohen Salzgehalten akumuliert wird. Die Konzentrationen während der exponentiellen Wachstumsphase war jedoch um den Faktor 6 – 7 geringer im Vergleich zu Prolin. 2. Aus Wachstumsexperimenten in Gegenwart unterschiedlicher Anionen war bekannt, dass Glutamat, im Gegensatz zu Gluconat und Nitrat, in der Lage ist, das Wachstum von H. halophilus auch in Abwesenheit von Chlorid zu ermöglichen. Um der Frage nachzugehen, ob die wachstumsfördernde Wirkung von unphysiologisch hohen Glutamat-Konzentrationen im Medium auf die Verwendung von Glutamat als kompatiblem Solut in den Zellen zurückzuführen ist, wurden Gesamtsolutepools von Chlorid-, Nitrat-, Gluconat- und Glutamat-gezogenen Zellen gemessen. In NaCl-gezogenen Zellen zeigte sich Glutamat als dominantes Solut, während Prolin und Glutamin einen geringeren Teil am Gesamtpool ausmachten. In Nitrat-gezogenen Zellen betrug der Gesamtpool nur noch 83% und in Gluconat-gezogenen Zellen nur noch 27% im Vergleich zu Chlorid-gezogenen Zellen. Zellen, die mit Glutamat gezogen wurden, zeigten jedoch eine Gesamtkonzentration an Soluten, die ca. 100% über dem Vergleichswert aus Chlorid-gezogenen Zellen lag. Die Konzentration an Glutamin in den Zellen stieg dabei um 168%, die Konzentration an Glutamat sogar um 299%. Die Prolinkonzentration verringerte sich um 32%. Diese Daten belegen, dass der wachstumsstimulierende Effekt von Glutamat auf die Verwendung als kompatibles Solut zurückzuführen ist. 3. Zur Untersuchung der molekularen Grundlage der Salzadaptation sowie der Abhängigkeit von Chlorid in H. halophilus wurde in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. D. Oesterhelt (MPI für Biochemie, Martinsried) die Sequenzierung des Genoms begonnen. Das Projekt ist zur Zeit noch nicht abgeschlossen und befindet sich in der „Lückenschluß-Phase“. Die bisherigen Sequenzdaten konnten dennoch für die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen herangezogen werden. Das Genom besitzt eine Größe von ca. 4,1 Mbp mit einem ungefähren GC-Gehalt von 40%. Außerdem wurden 2 Plasmide identifiziert mit einer Größe von 16047 und 3329 bp. 4. Die Schlüsselgene bekannter Biosynthesewege für Glutamin und Glutamat konnten identifiziert werden. Darunter befinden sich zwei Isogene für eine Glutamatdehydrogenase (gdh1 und gdh2), ein Gen für die große Untereinheit einer Glutamatsynthase (gltA), zwei Gene für die kleine Untereinheit einer Glutamat-Synthase (gltB1 und gltB2) und zwei Isogene für eine Glutaminsynthetase (glnA1 und glnA2). glnA1 befindet sich in einem Cluster zusammen mit einem Gen, das für einen Regulator kodiert (glnR), wie er auch aus B. subtilis bekannt ist. Über reverse Transkription von mRNA und anschließender PCR-Analyse konnte gezeigt werden, dass sowohl gltA/gltB1 als auch glnA1/glnR in einem Operon organisiert sind. 5. Wurde die Transkriptmenge der in Punkt 4 erwähnten Biosynthesegene in Zellen quantifiziert, die in Gegenwart unterschiedlicher Salzkonzentrationen (0,4 – 3,0 M NaCl) gezogen wurden, so zeigte sich keine Abhängigkeit von der Salzkonzentration für die Gene gltA, glnA1 und gdh1. Über die Transkriptmengen von gdh2 ließ sich keine abschließende Aussage treffen, da die gefundenen Transkriptmengen sehr gering waren und daher zu sehr großen Varianzen bei der Quantifizierung führten. Eine klare Abhängigkeit der Transkriptmenge von der im Medium zugesetzten Salzkonzentration konnte für glnA2 gezeigt werden. Die glnA2 mRNA-Menge stieg dabei mit steigender Salzkonzentration an und erreichte bei 1,5 – 2.0 M NaCl ein Maximum. Bei diesen Salzkonzentrationen war die Menge an mRNA ca. 4 mal höher als der Vergleichswert bei 0,4 M NaCl. Bei höhern Salzkonzentrationen sank die Menge an Transkript wieder leicht und war dann ca. nur noch 3 mal so hoch wie bei 0,4 M NaCl. 6. Die zelluläre Konzentration der glnA2-Transkripte in Abhängigkeit unterschiedlicher Anionen im Anzuchtmedium wurde untersucht. Die Quantifizierung der glnA2–mRNA ergab eine 2 mal höhere Transkriptmenge in Gegenwart von Chlorid verglichen mit Nitrat oder Gluconat. 7. Es wurde nach Enzymaktivitäten der bekannten Schlüsselenzyme im Glutamat und Glutamin-Biosyntheseweg gesucht. Eine Glutamatdehydrogenase und eine Glutamatsynthase – Aktivität konnte nicht oder nur in vernachlässigbarem Maße nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnt eine Glutaminsynthetase – Aktivität eindeutig belegt werden. Diese Aktivität erwies sich abhängig von der Art und der Konzentration des angebotenen Anions im Medium. Maximale Aktivitäten wurden mit NaCl in einer Konzentration von 2,5 – 3,0 M erreicht. Interessanterweise erwies sich die Glutaminsynthetase – Aktivität auch abhängig von der Art des im Testpuffers verwendeten Anions. Hier zeigte sich eine deutliche Stimulierung der Aktivität durch das Anion Chlorid. [Die für diesen Punkt zugrunde liegenden Daten wurden im Rahmen einer von mir mitbetreuten Diplomarbeit von Jasmin F. Sydow erhoben und sind aus Gründen der vollständigen Darstellung des Projektverlaufes mitaufgeführt!] 8. Wie im Punkt 1 dargelegt, wird Prolin vor allem bei hohen Salzkonzentrationen in H. halophilus - Zellen akkumuliert. Neben der Abhängigkeit von der Salzkonzentration wurde außerdem die Abhängigkeit von der Wachstumsphase untersucht. Die Analyse der Prolinkonzentrationen während verschiedener Wachstumsphasen in Kulturen, die bei 1,0 bzw. 2,5 M NaCl angezogen wurden, zeigte, (i) dass die Prolinkonzentration während der frühen exponentiellen Phase ca. 2,5-fach erhöht war im Vergleich zu Niedrigsalz-Zellen, (ii) dass die Prolinkonzentration beim Übergang von der frühen in die späte exponentielle Phase dramatisch abnahm (um 64% bei 2,5 M NaCl) und dass (iii) in der stationären Phase Prolin praktisch nicht mehr nachzuweisen war. 9. Die Biosynthesegene für die Herstellung von Prolin aus Glutamat konnten im Genom von H. halophilus identifiziert werden. Es handelt sich dabei um ein Cluster von 3 Genen, die für eine putative Pyrrolin-5-carboxylatreductase (proH), eine Glutamat-5-kinase (proJ), und eine Glutamat-5-semialdehyd-dehydrogenase (proA) kodieren. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließenden PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene ein Operon bilden. 10. Eine Quantifizierung der Transkriptmengen der Biosynthesegene proH, proJ und proA mittels quantitativer PCR in Zellen, die bei unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen gezogen wurden, zeigte einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Salinität des Mediums und der Menge an Transkript. Diese war umso höher, je höher die Salinität des Mediums war. Die maximale Transkriptmenge (6-fach) wurde bei einer Salzkonzentration von 2,5 M NaCl erreicht. Bei noch höherer Salzkonzentration sank die Transkriptmenge auf die ca. 5-fache Menge des Kontrollwertes ab. 11. Um die Regulation und Dynamik der Osmoregulation unabhängig vom Wachstum untersuchen zu können, wurde ein Zellsuspensions-System für H. halophilus etabliert, bei dem eine konzentrierte Zellsuspension direkt von geringen auf hohe Salzkonzentrationen überführt wurde und bei dem die Prozesse der Transkription, Translation und Solut-Biosynthese erhalten blieben. Beispielhaft wurde dieses System an der Produktion von Prolin nach einem Salzschock von 0,8 auf 2,0 M NaCl getestet. Es zeigte sich bei der Analyse, dass sich die Transkriptmengen unmittelbar nach dem Salzschock deutlich erhöhten und bereits nach 1,5 Stunden ein Maximum erreicht wurde. Verglichen mit dem Wert zu Beginn des Versuches waren die Transkriptmengen ca. 13-fach erhöht, sanken im weiteren Verlauf jedoch wieder ab und blieben bei einer 4-fachen Transkriptmenge konstant. Mit der Erhöhung der Transkriptmenge ging auch eine Erhöhung der Prolinkonzentration einher, die ein Maximum von ca. 6 μmol/mg Protein nach 6 Stunden erreichte. Auch diese Konzentration verringerte sich im weiteren Verlauf wieder und erreichte nach 20 Stunden den Ausgangswert. 12. Um den Einfluß diverser Anionen bzw. Osmolyte im Medium auf die Produktion von Prolin zu untersuchen, wurden Zellsuspensionen von H. halophilus einer Erhöhung der Osmolarität von 0,8 M auf 2,0 M unterzogen. Es zeigte sich dabei, dass die maximale Akkumulation von Prolin in Anwesenheit von Chlorid am höchsten war. Nitrat und Glutamat führten zu ähnlichen, aber leicht geringeren maximalen Konzentrationen (92 bzw. 83% des Chloridwertes). Gluconat führte noch zu einer Akkumulation von ca. 51%, während die anderen Osmolyte zu keiner Akkumulation führten. Eine Analyse der Transkriptmengen zeigte jedoch ein völlig anderes Bild. Während Chlorid, Nitrat und Gluconat zu vergleichbaren Anstiegen der Transkripmengen führten, war die maximale Transkriptmenge der Glutamatinkubierten Zellen 3-9 mal höher als in Vergleichszellen mit Chlorid. In anschließenden Titrationsexperimenten mit verschiedenen Glutamatkonzentrationen konnte gezeigt werden, dass eine minimale Konzentration von 0,2 M Glutamat ausreichend ist, um eine 90-fache Steigerung der Transkriptmenge herbeizuführen. 13. Als Antwort auf Hochsalz-Bedingungen akkumuliert H. halophilus neben Prolin auch Ectoin. Die Ectoinkonzentration bei 2,5 M NaCl war ca. 2-3 mal höher als in Zellen, die bei 1,0 M gezogen wurden. Die Bestimmung der intrazellulären Ectoin-Konzentrationen während des Wachstums zeigte außerdem, dass die Produktion von Ectoin wachstumsphasenabhängig ist. Die Konzentration in der stationären Phase war ca. 5-fach höher als in der exponentiellen Phase. Die Entwicklung der Ectoin- Konzentration verhielt sich somit reziprok zur Entwicklung der Prolin-Konzentration während des Wachstums. 14. Es wurde ein Cluster von drei Genen im Genom von H. halophilus identifiziert, deren Genprodukte die Biosynthese von Ectoin aus Aspartatsemialdehyd katalysieren. ectA kodiert dabei für eine putative Diaminobutyrat-Acetyltransferase, ectB für eine putative Diaminobutyrat-2-oxoglutarat-Transaminase und ectC für eine putative Ectoin-Synthase. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließenden PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene ein Operon bilden. 15. Die Transkription der ect-Gene war abhängig von der Salinität des Mediums. Ab 2,0 M stieg die Menge an RNA um das 10-fache an und erreichte bei 3,0 M ein Maximum mit der 23,5-fachen Menge. 16. Nach einem osmotischen Schock stieg die Konzentration an ect-mRNA signifikant und erreichte ein Maximum nach 3 - 4 Stunden. Das Maximum wurde somit 1,5 – 2,5 Stunden später erreicht als bei anderen Genen der Solute-Biosynthese wie etwa gdh1, das für eine Glutamatdehydrogenase, glnA2, das für eine Glutamin-Synthetase oder proH, das für eine Pyrrolin-5-Carboxylase kodiert. Die maximal erreichten Wert lagen 13-fach (ectA), 6,5-fach (ectB) und 3-fach (ectC) über dem Wert vor dem Salzschock. Gegen EctC wurden polyklonale Antikörper generiert. Western-Blot Analysen mit diesem Antikörper zeigten, dass die EctC-Menge nach 4 Stunden um das 2,5-fache stieg, dann aber wieder abfiel auf das 1,6 – 1,7-fache des Ausgangswertes. Der Rückgang an EctC fand keine Entsprechung in der gemessenen Ectoin-Konzentration, welche über einen Zeitraum von 18 Stunden kontinuierlich anstieg. Die maximale Konzentration nach 18 Stunden betrug das ca. 6,3-fache des Ausgangswertes. 17. Wurden H. halophilus Zellen mit anderen Osmolyten außer NaCl geschockt, so ergab sich folgendes Bild der Regulation der Ectoin-Biosynthese: (i) die Transkription der ect-Gene zeigte keine Chlorid-abhängige Regulation. Die maximale Transkriptmenge wurde in Gegenwart von Nitrat erreicht, wohingegen Gluconat zu vergleichbachen mRNA-Mengen führte wie Chlorid. Glutamat führte nur zu schwacher Stimulierung der Transkription. (ii) auf Ebene der Proteinmenge war zu sehen, dass die Menge an EctC nach osmotischem Schock vergleichbar war in Zellen, die mit Chlorid oder Nitrat inkubiert wurden. Gluconat führte nur zu einer 40%-igen Zunahme während andere Osmolyte nahezu wirkungslos auf die Menge an EctC blieben. (iii) die höchste Akkumulation an Ectoin nach einer plötzlichen Erhöhung der Osmolarität wurde erreicht mit Chlorid (6-fache Zunahme) gefolgt von Nitrat (5,6-fache Zunahme). Gluconat führte lediglich zu einer 3,3-fachen und Glutamat nur noch zu einer 2-fachen Steigerung der Ectoinkonzentration. Glutamat hat somit ähnliche Effekte wie Tartrat, Saccharose oder Sulfat. Succinat führte zu keiner Akkumulation und Glycin sogar zu einer deutlichen Abnahme. Die Produktion von Ectoin ist somit hauptsächlich abhängig vom Anion/Osmolyt und nur untergeordnet von der Osmolarität.
Municipal wastewater contains nutrients valuable for a reuse in agriculture and can be the source of a multitude of chemicals used in private households and industry, too. As many of these chemicals are incompletely degraded during wastewater treatment, their residues remain partly in sewage sludge and partly in treated wastewater. Concerns are linked particularly to the so called micropollutants, i.e. anthropogenic organic substances such as personal care products, pharmaceuticals and biocides, for which scarce data on their degradability and environmental fate and particularly on their ecotoxicity are available. Thus, when reusing treated wastewater and sewage sludge for irrigation or as soil amendment for a sustainable land and water management, these wastewater-borne pollutants may enter soil, groundwater and surface water. The present work therefore aimed at assessing potential ecotoxic effects on aquatic and terrestrial organisms of reusing treated wastewater and sewage sludge. To this end, established as well as newly developed experimental approaches were used to investigate the problem on several levels. Individual wastewater-borne substances, samples from field study sites and samples from a soil column experiment simulating prolonged wastewater irrigation were examined.
At the start of the experimental work, the ecotoxicity of climbazole was characterised towards five aquatic and five terrestrial test organisms. Climbazole is an azole antimycotic agent applied in cosmetics and anti-dandruff shampoos and was recently detected in relatively high concentrations in treated wastewater and sewage sludge. In the present work climbazole was found to be particularly toxic towards plants such as water lentils with effective concentrations comparable to those of agricultural azole fungicides. Dwarfism, that is reduced shoot elongation observed in plants, pointed at a specific, phytohormone inhibiting mode of action of climbazole. Furthermore, the expected influence of the soil pH on the phytotoxicity of climbazole was experimentally confirmed.
Based on the findings for climbazole, two additional azole antimycotics, ketoconazole and fluconazole, and the regularly in sewage sludge detected biocide benzyldimethyldodecyl-ammonium chloride (BDDA) were investigated for their toxicity towards plants.
In aqueous medium, an increasing phytotoxicity from fluconazole to BDDA, ketoconazole and climbazole was observed, while in soil, phytotoxicity increased from BDDA to ketoconazole, climbazole and fluconazole. The relatively low terrestrial toxicity of BDDA and ketoconazole probably resulted from their strong binding to soil as well as their good biodegradability. To render the exposure scenario more realistic, sewage sludge was co-applied with the four test substances in a parallel test run. However, as no detectable influence on their effective concentrations was found, it can be assumed that the current practice of assessing sewage sludge borne substances with biotests in standard soil is sufficiently realistic. In a further study, different advanced sludge-treatment technologies were assessed for their efficacy in reducing pollutants. Results from the present work indicated that effects assessed in terrestrial short term biotests only seldom correlated with the concentrations of certain pollutants. Rather, a negative correlation of the stability of the sludges, determined by the ratio of volatile to total solids, to their ecotoxicity was seen.
Another aspect of the present work was the design and performance of an experimental approach to assess the environmental risk of a long-term irrigation with treated wastewater concerning the quality of soil and water in a prospective way, i.e. before the installation at field scale. For the simulation of a continuous irrigation corresponding to approximately 30 years, a percolation apparatus was developed and four different soils were percolated with treated wastewater for three months. Acute and chronic biotests with nine test organisms from different trophic levels (green algae, water lentils and water fleas as well as oilseed rape, oats, bacteria, spring tails, enchytraeids and earthworms) were used to assess the soil percolates as well as the soils with and without percolation. These investigations were accompanied by a comprehensive chemical monitoring conducted by project partners. Results indicated that the soil passage, that is the percolation through the soil, generally improved the quality of the treated wastewater as habitat for aquatic organisms which was visible by a reduction of its phytotoxicity. However, in some cases it deteriorated the water quality, probably resulting from the leaching of metals from pre-contaminated soil. A deteriorated habitat quality of the soil after the percolation with treated wastewater was observed for several test organisms and soils. In the same, mainly peaty soils, the highest accumulation of wastewater-borne micropollutants and of zinc was measured. Yet, their concentrations did not correlate to the observed biological effects. Moreover, data on ecotoxicity were only available for a small fraction of the detected substances so that their concentrations could not successfully be used to predict expected biological effects.
The experimental approach used in the present work demonstrated to be an adequate tool to support the prospective evaluation of environmental risks of treated wastewater irrigation. Overall, it can be concluded that the reuse of treated wastewater on soil can improve the quality of treated wastewater but that this can come at the cost of deteriorating the quality of the soil. As these risks cannot be generalised, a comprehensive biotest battery as well as chemical analysis should be used to assess them on a case-specific basis for each respective wastewater and the respective soil.
Derzeit breiten sich gebietsfremde Stechmücken (Diptera: Culicidae) aufgrund von Globalisierung und Klimawandel auf der ganzen Welt aus und bilden neue, stabile Populationen. Wegen ihrer hämatophagen Ernährungsweise sind sie Überträger von Pathogenen, die teilweise schwere bis tödliche Krankheiten beim Menschen, seinen Haustieren oder auch Wildtieren auslösen können. Mit den Stechmücken treten daher auch Infektionskrankheiten vermehrt in Gebieten auf, in denen sie vorher nicht vorkamen oder als bereits ausgerottet galten. Da die meisten im Menschen wirksamen Pathogene nicht durch Impfungen kontrolliert werden können, bleibt als eine der wenigen Möglichkeit der Krankheitsprävention die Dezimierung der Stechmückenpopulation. Daher sind Stechmücken momentan im Fokus von biologischer und epidemiologischer Forschung. Diese hat zum Ziel epidemische Krankheitsausbrüche vektorübertragener Krankheiten in der menschlichen Population zu verhindern. Eine Verringerung der lokalen Stechmückenpopulation bis hin zum Aussterben kann durch die Verwendung von Insektiziden, die Vernichtung von Bruthabitaten oder anderen Kontrollmaßnahmen erreicht werden. Jedoch sind diese Maßnahmen unterschiedlich effektiv, haben zum Teil unerwünsch-te ökologische und gesundheitsschädigende Folgen und sind unterschiedlich aufwendig und kostenintensiv in der Anwendung. Für die Entwicklung eines integrierten, effektiven, zielgerichteten und kostengünstigen Vektormanagements fehlen bislang jedoch die populationsbiologischen Grundlagen.
Ziel dieser Arbeit ist daher die Schaffung der Datengrundlage eines Integrierten Stechmückenmanagements für die Asiatische Buschmücke (Aedes japonicus japonicus THEOBALD 1901), die am weitesten verbreitete exotische Stechmücke in Deutschland. Schwerpunkte dafür wurden auf das zeitliche und räumliche Vorkommen, die Temperaturabhängigkeit des Lebenszyklus, sowie die Wirksamkeit von Kontrollmethoden gelegt.
Die Kenntnis der räumlichen Verbreitung und saisonalen Häufigkeit der Stechmücken ist notwendig, um befallene Standorte und Zeitpunkte des größten Populationszuwachses definieren zu können. Die Verbreitung und die Häufigkeit der endothermen Stechmücken sind stark von der Umgebungstemperatur abhängig, die beispielsweise deren Entwicklungsdauer und Sterblichkeit beeinflusst. Dabei entwickeln sich die verschiedenen Stadien (Ei, Larven, Puppe, Imago), die eine Stechmücke während ihres Lebens durchläuft, in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur unterschiedlich und haben jeweils andere Temperaturpräferenzen. Lebenszyklustabellen geben die Entwicklungsdauer und Mortalität pro Stadium in Abhängigkeit von der Temperatur an. Mit ihrer Hilfe können somit die räumlichen und zeitlichen Vorkommen und Häufigkeiten einer Stechmückenart berechnet werden. Dies ist insbesondere für Stechmücken in Gebieten mit jahreszeitlichen Temperaturveränderungen wichtig. Um Daten für eine solche Lebenszyklustabelle aufnehmen zu können, ist es notwendig Laborexperimente bei festgelegten Temperaturen durchzuführen. Die Voraussetzung dafür ist, dass die Stechmückenart im Labor optimale Bedingungen erhält, um ihren Lebenszyklus abschließen zu können. In dieser Arbeit wurde daher ein Laborprotokoll entwickelt, mithilfe dessen der Lebenszyklus der Asiatischen Buschmücke im Labor untersucht werden kann. Dazu wurden systematisch die Fütterung, die innerartliche Konkurrenz und das Wasservolumen des Brutge-fäßes für die aquatischen Stadien erprobt. Auf Basis dieses Protokolls wurden anschließend die Temperatureinflüsse auf die Entwicklung aller Stadien aufgenommen. Diese Daten dienten der Parametrisierung eines populationsdynamischen Modells. Dieses wurde verwendet, um Standorte mehrjähriger Populationen zu definieren, saisonale Häufigkeiten für Deutschland zu berechnen, durch Temperaturveränderungen hervorgerufene zukünftige Verbreitungsgebiete vorherzusagen, sowie Effekte von Kontrollmaßnahmen auf die Häufigkeit der Asiatischen Buschmücke zu modellieren.
Um eine dauerhafte Kontrolle der Stechmückenvektoren zu gewährleisten, ist weiterhin die permanente Neuentwicklung von wirksamen Kontrollmethoden notwendig. Dazu gehört die präventive Vermeidung von Bruthabitaten der aquatischen Stadien von Stechmücken. Die exotischen Stechmücken, die in Deutschland etabliert sind, gehören mehrheitlich der Gattung Aedes an und sind sogenannte Gefäßbrüter. Ihre bevorzugten Bruthabitate sind kleine Was-seransammlungen wie sie in Baumhöhlen, Gesteinsauswaschungen, Gießkannen, Regentonnen und Blumenuntersetzern vorkommen. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Farben und Volumina von Plastikbechern die Asiatische Buschmücke zur Eiablage bevorzugt, um präferierte Bruthabitate gezielt zu identifizieren und verringern zu können. Auch die Bereitstellung von Insektiziden wird durch in Stechmücken auftretende Insektizidresistenzen erschwert. Insektizide sollen dabei umweltfreundlich, spezifisch für den Zielorganismus und nicht gesundheitsschädlich für den Menschen sein. Weiterhin sind eine gute Anwendbarkeit, geringe Kosten und eine hohe Effizienz wünschenswert. Eine Quelle für potentielle Insektizide sind pflanzliche Stoffe, zum Beispiel ätherische Öle. Diese sind leicht erhältlich, natürlichen Ursprungs und wirksame Vergrämungsmittel gegen stechbereite Stechmückenweibchen. In dieser Arbeit wurde nach einer Literaturrecherche Nelkenöl ausgewählt und als Insektizid gegen Larven der Asiatischen Buschmücke getestet. Dafür wurden die akute toxische Wirkung von Nelkenöl bei drei Temperaturen untersucht und zusätzlich die Wirkung von Nelkenöl auf die Eiablage im Freiland. Nelkenöl zeigte dabei sowohl eine larvizide als auch eine eiablagehemmende Wirkung. Weiterhin wurde Kupfer in Form von kupferhaltigen Euromünzen als Larvizid untersucht. Kupfer ist ein wirksamer Stoff gegen die aquatischen Stadien von Stechmücken. Allerdings wurde der Stoff noch nicht in Form der einfach zu handhabenden, leicht erhältlichen Kupfermünzen getestet. Dazu wurden Vorexperimente durchgeführt, um herauszufinden, wieviel Kupferionen sich aus den Münzen lösen lassen. Anschließend wurde der akut toxische Effekt auf Larven der Asiatischen Buschmücke untersucht.
Ein Integriertes Stechmückenmanagement hat zum Ziel, die lokale Stechmückenpopulation zu kontrollieren, um so Stichen und daraus resultierender Krankheitsübertragung vorzubeugen. Dies erfolgt über die Aufklärung von Betroffenen, der Überwachung der Stechmückenpopulation, dem Testen auf Pathogenbefall und der direkten Kontrolle von Stechmücken. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zu den Kenntnissen über die Laborhaltung einer exotischen Stechmückenart, zur Identifizierung von Bruthabitaten, zur zeitlichen und räumlichen Festlegung von Kontrollmaßnahmen und zur Anwendung von Larviziden und eines Vergrämungsmittels. Mit dieser Arbeit wurde die Grundlage eines faktenbasierten Integrativen Stechmückenmanagements für die Asiatische Buschmücke entwickelt, das eventuell auch auf weitere Aedes-Arten übertragbar ist, und als Handlungsempfehlung für politische Entscheidungstragende dienen kann.
Therapy of hemorrhagic shock with following resuscitation-induced liver injury : in vivo study
(2010)
Shock resulting from life-threatening blood-loss (hemorrhagic shock) represents the most frequent injury pattern after a traumatic insult. Hemorrhagic shock induces inflammatory changes, characterized by highly complex pathophysiological pathways often resulting in death. In this study, we establish an experimental in vivo model of H/R in rats and study the mechanisms which determine the hepatic injury after H/R. Furthermore, we show that hemorrhagic shock with following resuscitation is accompanied with release of systemic and local pro-inflammatory mediators, increased infiltration of hepatic neutrophils in the liver, increased oxidative and nitrosative stress, enhanced cell death of both types, apoptosis and necrosis, conspicuous cytoskeletal rearrangements, loss of hepatic integrity and finally high general mortality rates, up to 80%. In addition, the effects of two potential therapeutic interventions to prevent the H/R induced liver injury are explored in a model of H/R in rats. First, the role of JNK and its inhibition by D-JNKI-1 in preservation of hepatic integrity following H/R was analyzed. Second, we investigated the potential of simvastatin to prevent the disturbed inflammatory response and hepatic injury after H/R. The effects of both therapeutic interventions were studied by looking at several inflammatory parameters, markers of oxidative and nitrosative stress, cytoskeleton integrity, microcirculatory parameters, underlying signaling cascades, liver damage and mortality. Highly specific blockade of JNK with the potent, inhibitory peptide D-JNKI-1 revealed the crucial role of the JNK signaling pathway in the H/R induced pathophysiology and strong protective effects of DJNKI- 1 in H/R induced liver injury, when the peptide was applied before and even after hemorrhagic shock. The other therapeutic intervention tested in this study was the use of simvastatin which also revealed protective effects after H/R and even a remarkable improvement in survival after H/R. We show that H/R induced release of pro-inflammatory cytokines, hepatic PMNL infiltration, increased oxidative and nitrosative stress, apoptosis and necrosis can be diminished by treatment with D-JNKI-1 but also with simvastatin in vivo. Furthermore, simvastatin reduces H/R induced cytoskelatal rearrangements, loss of liver integrity and the mortality rate after H/R. The key pathway which underlies these beneficial effects of simvastatin is the Rho kinase pathway. Identification of both mechanisms as well as the effectiveness of both substances provide new insights in the close interaction between hypoxia and the immune system and present a promising basis for the anti-inflammatory, hepatoprotective treatment after H/R.
Regulatory required, classical toxicity studies for environmental hazard assessment are costly, time consuming, and often lack mechanistic insights about the toxic mode of action induced through a compound. In addition, classical toxicological non-human animal tests raise serious ethical concerns and are not well suited for high throughput screening approaches. Molecular biomarker-based screenings could be a suitable alternative for identifying particular hazardous effects (e.g. endocrine disruption, developmental neurotoxicity) in non-target organisms at the molecular level. This, however, requires a better mechanistic understanding of different toxic modes of action (MoA) to describe characteristic molecular key events and respective markers.
Ecotoxicgenomics, which uses modern day omic technologies and systems biology approaches to study toxicological responses at the molecular level, are a promising new way for elucidating
the processes through which chemicals cause adverse effects in environmental organisms. In this context, this PhD study was designated to investigate and describe MoA-characteristic
ecotoxicogenomic signatures in three ecotoxicologically important aquatic model organisms of different trophic levels (Danio rerio, Daphnia magna and Lemna minor).
Applying non-target transcriptomic and proteomic methodologies post chemical exposure, the aim was to identify robust functional profiles and reliable biomarker candidates with potential
predictive properties to allow for a differentiation among different MoA in these organisms. For the sublethal exposure studies in the zebrafish embryo model (96 hpf), the acute fish embryo toxicity test guideline (OECD 236) was used as conceptual framework. As different test compounds with known MoA, the thyroid hormone 3,3′,5-triiodothyronine (T3) and the thyrostatic 6-propyl-2-thiouracil (6-PTU), as well as six nerve- and muscle-targeting insecticides (abamectin, carbaryl, chlorpyrifos, fipronil, imidacloprid and methoxychlor) were evaluated. Furthermore, a novel sublethal immune challenge assay in early zebrafish embryos (48 hpf) was evaluated for its potential to assess immuno-suppressive effects at the gene expression level. Therefore, toxicogenomic profiles after an immune response inducing stimulus with and without prior clobetasol propionate (CP) treatment were compared. For the aquatic invertebrate D. magna, the study was performed with previously determined low effect concentrations (EC5 & EC20) of fipronil and imidacloprid according to the acute immobilization test in water flea (OECD 202). The aim was to compare toxicogenomic signatures of the GABA-gated chloride channel blocker (fipronil) and the nAChR agonist (imidacloprid). With similar low effect concentrations, a shortened 3 day version of the growth inhibition test with L. minor (OECD 221) was conducted to find molecular profiles differentiating between photosynthesis and HMG-CoA reductase inhibitory effects. Here, the biological interpretation of the molecular stress response profiles in L. minor due to the lack of functional annotation of the reference genome was particularly challenging. Therefore, an annotation workflow was developed based on protein sequence homology predicted from the genomic reference sequences.
With this PhD work, it was shown how transcriptomic, proteomic and computational systems biology approaches can be coupled with aquatic toxicological tests, to gain important mechanistic insights into adverse effects at the molecular level. In general, for the different investigated adverse effects for the different organisms, biomarker candidates were identified, which describe a potential functional link between impaired gene expressions and previously reported apical effects. For the assessed chemicals in the zebrafish embryo model, biomarker candidates for thyroid disruption as well as developmental toxicity targeting the heart and central nervous system were described. The biomarkers derived from nerve- and muscletargeting insecticides were associated with three major affected processes: (1) cardiac muscle cell development and functioning, (2) oxygen transport and hypoxic stress and (3) neuronal development and plasticity. To our knowledge, this is the first study linking neurotoxic insecticide exposure and affected expression of important regulatory genes for heart muscle (tcap, actc2) and forebrain (npas4a) development in a vertebrate model. The proposed immunosuppression assay found CP to affect innate immune induction by attenuating the response of genes involved in antigen processing, TLR signalling, NF-КB signalling, and complement activation ...
Snake bite envenoming often results in disability or death of breadwinners of poor families in the rural tropics and the subtropics of Nepal. Identification of the medically relevant snake species, circumstances of venomous snake bites, prehospital care of their bites and human responses to snakes and snake bite is, therefore, crucial to enable victims or first aider to select the appropriate first aid measures, physicians to anticipate complications and to use appropriate treatment protocols as well as the local community to implement prevention strategies. Inadequate educational gaps exist in Nepal and hinder identification of snakes involved in bites. To fill this gap, I aim to provide an evidence-based list of medically relevant snake species. Snake specimens brought by patients bitten or their attendants from the tropical and subtropical regions in southeastern, southcentral, and southwestern Nepal to snake bite treatment centres over a period from 2010 through 2014, were taxonomically identified and medical records of envenoming were evaluated.
In Nepal, the epidemiology of snake bite is poorly known. Here I describe the ecological circumstances of proven krait (Bungarus spp.) and Russell´s Viper (Daboia russelii) bites to elucidate and examine, whether environmental circumstances or human behaviour contributed to envenoming. In a cross-sectional study, data about prehospital care, environmental circumstances of 46 krait and 10 Russell´s Viper bites were evaluated. Patients were interviewed using structured interview forms. Snake bite prone communities were surveyed to test people´s knowledge on snakes and their attitude towards venomous snakes in general.
Of 349 snakes involved in bites, 199 (57%) specimens were found to be medically relevant venomous snakes that included 11 species belonging to six genera and two families. Among them, Naja naja (n = 76, 22%), Bungarus caeruleus (n = 65, 19%) and Trimeresusurs albolabris (n = 10, 3%) were the most widely distributed snakes. Daboia russelii (n = 10, 3%) was found to be restricted to the southwestern part of Nepal. For B. walli, a previously poorly known species, 13 voucher specimens represent the first country records of this species as well as the first documented cases of involvement in snake bite envenoming by this species in Nepal.
Numerous snake bites (33%) occurred at night, during the rainy season, and are mainly due to Bungarus species, particularly B. caeruleus. Bites of cobras and Russell’s Vipers are a risk at daytime. Evaluation of data regarding the place where the bite happened, indicates that the snake bite risks appear to be as high in residential areas, in and around houses, as in rural areas. In cases of kraits (n = 46), 61% of the bites occurred while the victim was sleeping indoors, those of Russell´s Vipers mainly during agricultural activities in the fields. Analysis of socio-demographic data revealed that both krait and viper bites predominantly affected farmers or their family members. However, snake bites involved also people of higher socio-economic status, which suggests that it is not a health problem of poor people only living in the rural areas of Nepal.
A small number of snake bite victims (n = 7) sought help from traditional healers, but most patients went to hospitals for medical treatment using motorbikes (65%) or were transferred by ambulance cars (22%). As a first aid measure, most patients (78%) had used a tourniquet, which is of doubtful value and has often severe sequelae, instead of applying the WHO recommended pressure immobilisation bandage or local compression pad. The overall case fatality rate was calculated to be 10%, but up to 17% in cases of Bungarus spp. bites.
Rural community people were found to be extremely afraid of snakes, a major reason for indiscriminate killing of even harmless snakes, e.g., Lycodon aulicus, which were wrongly considered to be venomous. This is mainly due to the poor knowledge on snakes in general and on their role in providing ecological services, which may eventually lead to a decline in snake populations and even the extinction of rare species.
The results of the present study strongly emphasize that snake bite is an important public health issue in Nepal. There is an urgent need to improve the knowledge of people on snakes and to try changing their attitudes towards these reptiles, in addition to documenting the biodiversity and distribution of medically relevant snakes, the epidemiology and circumstances of their bites. Avoiding high-risk behaviour (e.g., killing of snakes), using screened doors and windows are some of the suggested measures preventing snake bite. Early and accurate identification of the snakes involved should help physicians to apply timely treatment, eventually referring the patient to the appropriate hospital. This also has important implications in developing public health and conservation strategies, to the benefit of the people of Nepal.