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Während für Immunkompetente eine HCMV-Infektion meist asymptomatisch verläuft, ist sie bei immunsupprimierten Patienten eine der häufigsten Ursachen für eine erhöhte Mortalität und Morbidität. Zur Risikogruppe gehören u.a. Organtransplantierte, AIDS-Patienten, Patienten mit malignen Tumoren und Bluttransfusionsempfänger. Die HCMV-Infektion ist außerdem die häufigste prä- und perinatale Infektion. Im Hinblick auf die besonders bei Immunsupprimierten teilweise schweren HCMV-bedingten Krankheitsbilder und die Effizienz einer rechtzeitigen Therapie mit antiviralen Chemotherapeutika (Ganciclovir, Foscarnet) ist eine frühe, schnelle und zuverlässige Diagnose notwendig. Auch das Blutspenderscreening bedarf einer zuverlässigen HCMV-Immunstatusbestimmung, um einer transfusionsassoziierten Zytomegalieinfektion vorzubeugen. Der Diagnostik einer HCMV-Infektion stehen eine Vielzahl virologischer und serologischer Methoden zur Verfügung. In der Routinediagnostik wird der ELiSA als schnelles, wenig aufwendiges und billiges Nachweisverfahren eingesetzt. Jedes Jahr werden von der Industrie neue Antikörpertests, basierend auf der ELlSA-Technologie, angeboten. Mit dem Ziel der Verbesserung der Technik werden immer neue Testkits entwickelt. In dieser Arbeit wurden neue indirekte HCMV-lgG-ELISAs (Cytomegalovirus IgG EIA (Radim, Italien); CMV IgG ELiSA (GuII, USA); CMV IgG ELiSA (DMD, Deutschland», ein kompetetiver indirekter HCMV-ELiSA (Captia CMV-TA (Mercia, England» und HCMV-lgG-IFT-Testsysteme (VIRGO Cytomegalo-Virus IgG 1FT (Pharmacia-LKB, Deutschland); Cytomegalovirus IgG 1FT (Viramed, Deutschland» untersucht und verglichen. Als Referenztest fungierte der seit mehreren Jahren etablierte und zugelassene ELiSA Enzygnost-Cytomegalie-lgG-EIA (Behring, Deutschland). Es wurden HCMV-lgG positive Seren und Verdünnungsreihen HCMV-lgG positiver Seren untersucht und verglichen. Außerdem wurden HCMV-lgG negative Seren sowie potentiell kreuzreaktive Seren mit Antikörpern gegen andere Herpesviren und antinukleäre Antikörper- bzw. Rheumafaktor-positive Seren untersucht. Nachtestungen wurden mit dem Enzygnost-Cytomegalie-lgG-EIA (Behring), dem Cytomegalovirus IgG 1FT (Viramed) und selten auch mit dem Western Blot durchgeführt. Die Testauswertung der verschiedenen kommerziell erhältlichen EUSAs und IFTs zeigte zum Teil relativ große Unterschiede bei den HCMV-lgG positiven Seren sowie bei den potentiell kreuzreaktiven Seren, während sie bei HCMV-lgG negativen Seren nur geringfügige Abweichungen aufwies. Das Ziel, die ELlSA-Testsysteme weiterhin zu verbessern, wird mit dem Einsatz hochspezifischer, rekombinanter Antigene verfolgt. Die grundsätzliche Entscheidung für eine serologische, molekularbiologische oder virologische Methode zur HCMV-Diagnostik ist sowohl von der klinischen Fragestellung als auch vom Immunstatus des Patienten abhängig. Bei HCMV-Risikopatienten ist für eine zuverlässige Frühdiagnostik eine Kombination aus Virusisolierung, Antigennachweis, möglicherweise PCR und Serologie zu empfehlen (102). Für die Diagnostik einer aktiven oder latenten HCMV-Infektion beim Screening von Blutspendern wird eine sensitive IgG-Antikörperbestimmung mit Hilfe der ELlSA-Technik als ausreichend bewertet. Da bis zu 60% der potentiellen Blutspender HCMV-seropositiv sind, kommt es allerdings zu extremen Engpässen in der Versorgung mit seronegativen Blutspenden. Nur 2-12% der HCMV-lgG positiven Blutspender werden das Virus auf seronegative Empfänger übertragen, so daß es erstrebenswert ist, die humorale Immunität gegen das humane Zytomegalievirus weiter zu erforschen.
Etablierung und Optimierung eines neuartigen Papillomvirus-Tiermodells für pharmakologische Studien
(2001)
Papillomviren sind kleine nicht umhüllte DNA Viren, welche zu der Gruppe der Papovaviren gehören. Bis heute sind über 80 humanpathogene Papillomviren charakterisiert worden, welche spezifisch die Haut oder Schleimhaut infizieren und dort meist Benigne Tumore, wie z. B. vulgäre Warzen, Larynxpapillome oder genitale Warzen (Kondylome), induzieren. Bei langjähriger Persistenz des viralen Genoms und partieller Expression der viralen Gene können die Warzen jedoch maligne entarten und Karzinome bilden. Hurnane Papillomviren sind die am häufigsten sexuell übertragenen Infektionserreger, daher sind vor allem die malignen genitalen Turnore, wie das Zervixkarzinom, eine der häufigsten malignen Erkrankungen der Frau, mit 500.000 neuen Fällen jährlich weltweit, klinisch relevant. Derzeit wird zudem über eine mögliche Rolle der Papillomviren bei der Entstehung von Hautkrebs diskutiert. Der Vermehrungszyklus aller Papillomviren ist eng mit dem Differenzierungsgrad der infizierten Wirtszelle verknüpft. Die Replikation des viralen Genoms und die Synthese der Kapsidproteine findet bevorzugt in den terminal differenzierten Schichten des Epithels statt. Daher enllöglicht die Monolayer-Zellkultur keine Vermehrung von PV und erlaubt lediglich die Untersuchung begrenzter Ausschnitte im viralen Lebenszyklus. Dieser Umstand erschwert die Analyse später viraler Funktionen und ist auch eine Ursache dafiir, dass bis heute noch keine antiviral wirksame Therapie gegen Papillomviren existiert, ebenso wenig wie ein Impfstoff. Die Behandlung von Warzen beschränkt sich auf physikalische Methoden wie chirurgische Entfernung oder den Einsatz von Kryotherapie oder CO2-Laser, ohne dabei die virale DNA vollständig zu eliminieren. Zusätzlich werden fiir die Behandlung von HPV-Läsionen auch Substanzen mit immunmodulierenden Eigenschaften, wie z. B. Interferone und Imiquimod (Aldara TM), eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Xenograft-Maus-Modell, das SCID-Bo-Modell, etabliert, bei welchem mit Bovinem Papillomvirus Typ 2 (BPV2) infizierte Kälberskrotalhaut auf den Rücken von SCID-Mäusen transplantiert wurde. Dieses Modell kann sowohl der Identifizierung von PV -inhibierenden Substanzen dienen als auch der Untersuchung des viralen Replikationszyklusses. Fünf Monate nach der Infektion bildeten sich Fibropapillome, welche die typische histologische Merkmale einer Papillomvirusinfektion (Akanthose, Papillomatose, Hyperkeratose, Koilocytose und Parakeratose) aufwiesen. Durch den Nachweis von Kapsidproteinen und der Produktion von infektiösen Viruspartikeln konnte zudem gezeigt werden, dass sich die im SCID-Bo-Modell induzierten Tumore nicht von natürlich vorkommenden Rinderwarzen unterschieden. Im Gegensatz zur nativen BPV2-DNA führte die Transfektion von einer gleich großen Menge an rekombinanter BPV2-DNA nur zu der Etablierung einer abortiven Infektion, bei welcher ausschließlich die friihen viralen Gene transkribiert und somit keine Viren produziert wurden. Diese Turnore zeigten außerdem nur einige schwach ausgeprägte morphologische Veränderungen der Epidermis und keine Proliferation der Dermis. Die Tumorbildung mittels rekombinanter virale DNA konnte weder durch die Verwendung eines Transfektions-Reagenzes noch durch die Erhöhung der Input-DNA entscheidend verbessert werden. Das E2-Protein ist das wichtigste Regulatorprotein der Papillomviren. Es ist nicht nur für die Replikation essentiell, sondern es reguliert auch die virale Transkription. Dennoch ist die Funktionen der einzelnen E2-Bindungsstellen (E2BS), welche in mehreren Kopien über das virale Genom verteilt sind, weitgehend unbekannt. Zwei in der nicht kodierenden Region liegende E2BS, E2BSS und E2BS8 wurden mutiert und in Zellkultur sowie im SCID-Bo-Modell getestet. Es konnten jedoch weder in C127-Zellen noch im Tiermodell Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutanten in Hinblick auf die untersuchten Merkmale festgestellt werden. Auch in diesem Versuchsansatz konnte durch die Transfektion der rekombinanten viralen DNA nur eine abortive Virusinfektion etabliert werden. Das SCID-Bo-Modell eignet sich daher nur bedingt für genetische Studien mit in Bakterien synthetisierter Papillomvirus-DNA, da in dem bestehenden Modell nur die Auswirkungen auf frühe Ereignisse der Infektion untersucht werden können. Restriktionsanalysen mit den methylierungssensitiven Euzymen Hpall/Mspl und Hhal ergaben, dass die Unterschiede in der Tumorbildung bei Verwendung von rekombinanter und nativer DNA wahrscheinlich auf ein unterschiedliches Methylierungsmuster der CpG-Motive in den BPV2-Genomen zurückzuführen sind. Diese Annahme wird durch die Beobachtung gestützt, dass auch in Cl27-Zellen passagierte rekombinante BPV2-DNA nur zu der Induktion von Tumoren führt, welche keine Fibrombildung zeigten. Das hier auf Grundlage des Xenograft-Maus-Modells etablierte Tiermodellsystem ermöglicht die Untersuchung des viralen Replikationszyklus und die Produktion von Viren. Außerdem bietet das SCID-Bo-Model wegen seiner hohen Reproduzierbarkeit die idealen Bedingungen für die Identifikation antiviraler Substanzen. Für die Untersuchung von Virusmutanten eignet sich dieses Modellsystem jedoch nur bedingt. Weitere Versuche mit dem Ziel, die Tumorinduktion durch rekombinante DNA zu optimieren, und die Aufklärung der Gen-Regulation sind notwendig, um genetische Studien auch im Tiermodell durchführen zu können.
... Die drei Unternehmen, aus deren Geschichte hier erzählt wird, Bayer, Hoechst und Schering, waren bis zum Ende des Zweiten Weltkrieges Chemiekonzerne, die u.a. auch Arzneimittel herstellten und verkauften. Als erste Firma hat sich Schering nach dem Zweiten Weltkrieg weitgehend auf Pharmazeutika konzentriert und sich wie Hoechst am Ende des Jahrhunderts ganz von seinen Chemieaktivitäten getrennt. Allein Bayer bietet weiterhin eine breite Palette von chemischen Produkten an. ...
Aufgrund der zunehmenden Marktbedeutung und der Fülle pflanzlicher Präparate in Europa und den USA stellte sich die Frage, ob - im Sinne des Patienten und rationaler Phytotherapie - eine ausreichende Qualität der Produkte deren Einsatz rechtfertigt. Die Qualität pflanzlicher Produkte ist aufgrund der Besonderheit eines Vielstoff-Gemisches mit oftmals unbekannten wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffen schwer zu beurteilen. In Europa sind deshalb schon vor Jahren Bestrebungen angestellt worden, pflanzliche Produkte aufgrund von Monographien (Kommission E) zumindest in ihren Ausgangsdrogen und ihrer Extraktspezifikation zu vereinheitlichen. Normierung und Standardisierung von Extrakten wurden gefordert. Während der Diskussion über die Qualität der Extrakte (Normierung/Standardisierung) ist dabei ein wesentlicher Aspekt hinsichtlich der Vergleichbarkeit von Qualität und Wirksamkeit von Fertigprodukten verloren gegangen: der Einfluß der Arzneistoff-Formulierung auf die in vivo-Situation. Ausmaß und Geschwindigkeit der Resorption des enthaltenen Pharmakons (Bioverfügbarkeit) können sowohl von den physiko-chemischen Wirkstoffeigenschaften, wie Löslichkeit und Permeabilität, als auch von Eigenschaften der Darreichungsform abhängen. Entscheidend ist, welcher Prozeß für die Resorption in den Organismus der geschwindigkeitsbestimmende ist: die Freisetzung des Wirkstoffes aus der Darreichungsform oder der Permeationsprozeß durch die Darmmembran. Ist letzterer der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, so sind gewisse Veränderungen der Wirkstofffreisetzung ohne Belang. Das Vergleichen von Extraktqualitäten (Wirkstoffen), wie es durch die Kommission E-Monographie vorgeschlagen wird, ist folglich nicht ausreichend. Einflüsse der Darreichungsform (biopharmazeutische Eigenschaften) sind zu berücksichtigen. Wie bei chemisch-synthetischen Wirkstoffen sollte therapeutische Vergleichbarkeit über Bioäquivalenz-Studien belegt werden. Als bioäquivalent gelten zwei Produkte, wenn sie pharmazeutisch äquivalent sind und wenn ihre Bioverfügbarkeiten bei Gabe gleicher Dosen so ähnlich sind, daß die erzielten Effekte bezüglich Wirksamkeit und Sicherheit praktisch identisch sind. Das Problem des Belegs der pharmazeutischen Äquivalenz (gleiche Mengen gleicher Wirkstoffe in gleicher oder ähnlicher Darreichungsform) bei pflanzlichen Produkten ergibt sich aus der Tatsache, daß sie sich phytochemisch als Vielkomponenten-Gemische nur schwer charakterisieren lassen. Wirksamkeitsbestimmende Substanzen sind häufig nicht bekannt. Die Kenntnis wirksamkeitsmitbestimmender Komponenten ermöglicht nur einen partiellen Beleg der Äquivalenz, und pharmakologisch irrelevante Leitsubstanzen können höchstens Zwecken der Standardisierung dienen. Vergleichende Bioverfügbarkeitsuntersuchungen im Sinne von Analysen einzelner Bestandteile in Körperflüssigkeiten sind nur möglich, wenn die wirksamkeitsbestimmenden Komponenten des pflanzlichen Produktes bekannt sind. Alternativ werden Bestimmungen der Bioverfügbarkeit im Form pharmakodynamischer Ansätze diskutiert. Durch die Bestimmung pharmakodynamischer Parameter soll dabei die Aufnahme und Ausscheidung des gesamten „wirksamen Prinzips“ des pflanzlichen Produktes in den Organismus verfolgt werden. Voraussetzung ist natürlich, daß der untersuchte Effekt graduell quantifizierbar ist, in seiner Ausprägung eine Beschreibung von Ausmaß und Geschwindigkeit der Resorption erlaubt und vor allem mit der klinischen Wirksamkeit des betreffenden Produktes korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Ginkgo biloba-haltige Fertigprodukte des US-amerikanischen Marktes hinsichtlich ihrer therapeutischen Vergleichbarkeit untersucht. Für Ginkgo biloba-Extrakte sind wirksamkeitsmitbestimmende Komponenten benannt worden: Flavonglykoside und Terpenlaktone. Anhand derer wurden Untersuchungen zur pharmazeutischen Qualität der Ginkgo-Präparate durchgeführt. Hinsichtlich der Gehalte an Flavonglykosiden und Terpenlaktonen ergaben sich beachtliche Unterschiede. Als Maßstab wurde die Spezifikation der Kommission E angelegt; viele der untersuchten Extrakte lagen signifikant außerhalb der vorgegebenen Spannen, andere wiederum erfüllten diese Anforderungen. Auch die Begleitstoffmuster und -gehalte der diversen Extrakte unterschieden sich deutlich voneinander. Als Beispiel seien hier die Ginkgolsäure-Gehalte angeführt, deren Spanne von < 5 ppm bis 90.000 ppm reichte. Die untersuchten Extrakte konnten also schon aufgrund der Gehalte an wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffen in der Mehrzahl nicht als miteinander pharmazeutisch äquivalent angesehen werden. Zusätzlich ergaben Untersuchungen zu biopharmazeutischen Qualitäten (in vitro-Freisetzungsverhalten) einiger Produkte deutliche Unterschiede. Da auch für Ginkgo biloba-Extrakt nicht alle wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe bekannt sind, wäre es wünschenswert gewesen, die Produkte in einem pharmakodynamischen Ansatz hinsichtlich ihrer Bioverfügbarkeiten miteinander vergleichen zu können. Allerdings konnte im Rahmen dieser Arbeit kein in vitro-Modell gefunden werden, welches sich als sensitiv genug und als potentieller Bioassay geeignet erwiesen hätte. Deshalb wurde wenigstens eine vergleichende Bioverfügbarkeitsstudie zweier Präparate – im klassischen Sinne - durch Analyse einiger wirksamkeitsmitbestimmender Substanzen (Ginkgolid A, B und Bilobalid) in Körperflüssigkeiten (Blut) durchgeführt. Zwei Produkte mit stark differierendem Freisetzungsverhalten wurden gegeneinander verglichen. Die Studie ergab einen signifikanten Einfluß der Darreichungsform auf die Bioverfügbarkeit und letztendlich Bioinäquivalenz der untersuchten Produkte. Die vorliegende Arbeit zeigt, wie relevant die pharmazeutische Qualität der Produkte, inklusive ihrer biopharmazeutischen Eigenschaften, für die therapeutische Austauschbarkeit von Produkten sein kann. Auf dem Sektor pflanzlicher Produkte sind bis dato sehr wenige Untersuchungen hinsichtlich des Einflusses der Darreichungsform auf in vivo-Verhältnisse und der Bioverfügbarkeit durchgeführt worden. Des weiteren fehlen Kenntnisse zu wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffen oder alternativ pharmakodynamische Modelle, die eine Bestimmung der Bioverfügbarkeit ohne Kenntnis der pharmakologisch relevanten Inhaltsstoffe ermöglichen.
Während der letzten Jahrzehnte hat sich die Totalreflexions-Röntgenfluoreszenzanalyse (TXRF) als eine tragende Methode in der Elementanalytik etabliert. Sie ist eine universelle, auf vielen Gebieten einsetzbare, ökonomische Multielementmethode zur Mikro- und Spurenanalyse. Die Vorteile der TXRF mit ihrer hohenEmpfindlichkeit kombiniert mit einer einfachen Quantifizierung und einem geringen Probenverbrauch prädestinieren sie für Elementbestimmungen in verschiedenen biologischen Matrices - besonders auf dem Gebiet der Protein- und Enzymanalytik. Das Potential der TXRF für die Bestimmung von Übergangsmetallen in diesenMatrices wurde schon in der Literatur beschrieben. Eine bedeutende Rolle kommt hier auch der Analyse leichter Elemente zu, insbesondere der des Schwefels. Als Bestandteil der beiden Aminosäuren Cystein und Methionin erlaubt die quantitative Bestimmung des Schwefelgehaltes eine zur Metall-Cofaktoren-Bestimmung einfache und simultane Bestimmung der Enzym- oder Proteinkonzentration. Die Evaluation dieses Verfahrens mit seinen Möglichkeiten und Grenzen für die TXRF, sowie die Weiterentwicklung von Anwendungsgebieten auf diesem Gebiet waren die vorrangigen Ziele dieser Arbeit. Zuvor erfolgte eine Überprüfung der für die quantitative Auswertung notwendigen und wichtigen relativen Empfindlichkeitsfaktoren (Kalibrierfaktoren). Für die beiden untersuchten leichteren Elemente Schwefel und Phosphor ließen sich im Gegensatz zu den höheren Elementen Abweichungen von > ± 10 % zu den in der Spektrometer-Software bereits vorinstallierten Faktoren feststellen. Die Betrachtung der Matrix- und Konzentrationsabhängigkeit des relativen Empfindlichkeitsfaktors von Schwefel zeigte eine starke Matrixabhängigkeit des Faktors bei höheren Konzentrationen. Hier spielen vorrangig Absorptionseffekte der induzierten Fluoreszenzstrahlung des Schwefels in den unterschiedlich massiven Rückständen der untersuchten Verbindungen Al2(SO4)3, MgSO4 und Na2SO4 eine entscheidende Rolle. Im Zuge der Probenvorbereitung für die Analyse der Protein- und Enzymproben erwies sich die Trocknung an Luft bei Raumtemperatur als eine gut geeignete Methode im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren (Trocknung unter Wärmezufuhr). Bei letzterem Verfahren besteht die Gefahr möglicher Elementverluste von flüchtigen Verbindungen z. B. beim Vorhandensein sulfidischer Bestandteile. Der Einfluss der Matrixbestandteile (Puffer/bio-organische Matrix der Enzyme selbst) und ihre systematischen Zusammenhänge auf die ausgebildeten Trocknungsrückstände zeigten sich deutlich in den zur Evaluation der Schwefelbestimmung durchgeführten Konzentrationsreihen mit schwefelhaltigen anorganischen Standardlösungen. Bei den beiden untersuchten Enzymen Diisopropylfluorophosphatase (DFPase) undCytochrom c Oxidase wurden über die durchgeführten Konzentrationsbereiche sehr gute Wiederfindungen dokumentiert. Bei der Cytochrom c Oxidase trägt vor allem der im Vergleich zur DFPase deutlich höhere Anteil an Pufferkomponenten zur Ausbildung massiverer Trocknungsrückstände (max. 5 μm Dicke) bei. Dennoch traten erst bei der NADH:Q Oxidoreduktase (Komplex I) deutliche, reproduzierbare Minderbefunde bei der Schwefelbestimmung im Verlauf der Konzentrationsreihe auf. Anhand der topologischen Untersuchungen ließen sich hier für die Minderbefunde Schichtdickeneinflüsse und eine damit verbundene Absorption der emittierten Fluoreszenzstrahlung verantwortlich machen. Der Einsatz von sogenannten Filmbildnern zur Minimierung der Schichtdicken von Trocknungsrückständen und der damit verbundenen besseren Elementwiederfindungen brachte dagegen keine deutlichen und reproduzierbaren Verbesserungen, insbesondere nicht für den Schwefel. Eine Erhöhung der Anregungseffizienz durch die Verwendung einer Cr-Kα-Strahlung zeigte in den untersuchten Proben (wässrige Matrix/Enzymmatrix: DFPase) keine deutlichen Vorteile in der Bestimmung des leichten Elementes. Die beiden, in herkömmlichen Spektrometern zur Verfügung stehenden, AnregungsmodenW-Lα und Mo-Kα, sind für die Anlayse von Enzymproben und einer vergleichenden Bestimmung der Enzymkonzentration gut geeignet. Dies zeigten auch Vergleiche mit den biochemisch bestimmten Protein- bzw. Enzymkonzentrationen. Kritische Schichtdicken im Rahmen von Schwefel-Bestimmungen wurden für die verwendeten Anregungsmoden auf etwa 20 μm (Mo-Kα), 3 μm (W-Lα) und rund 2 μm (Cr-Kα) kalkuliert. Eine Beeinträchtigung der Zuverlässigkeit der TXRF-Messungen für die höheren Elemente durch die Matrixbestandteile konnte nicht festgestellt werden. Somit wird in den meisten Fällen die einfache Probenpräparation auf hydrophoben oder hydrophilen (siliconisierten/unsiliconisierten) Probenträgern, ohne die Notwendigkeit eines Verfahrens zur vorherigen Matrixabtrennung, möglich sein. Jedoch muss bei allen künftig zu untersuchenden Protein- oder Enzymproben mit hohen Matrixanteilen mit dem Auftreten von Schichtdickeneffekten und damit verbundenen Absorptionseffekten von leichten Elementen (Schwefel, Phosphor) gerechnet werden. Die in der Arbeit vorgestellten, unterschiedlichen Projekte zeigen deutlich das Potential der TXRF als eine Standardmethode auf diesem Anwendungsgebiet.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Vergleich der Charge Transfer induzierten Prozesse bei der Löschung von Triplett angeregten Sensibilisatoren durch Sauerstoff mit den Charge Transfer induzierten Prozessen bei der Löschung von Singulettsauerstoff durch die gleichen Sensibilisatoren im Grundzustand. Dazu wurden die Geschwindigkeitskonstanten für beide Prozesse in verschiedenen Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität sowie notwendige photophysikalische Parameter wie Triplettenergien und Triplettquantenausbeuten bestimmt. Für eine Reihe von Naphthalin- und Biphenylderivaten kann erstmals gezeigt werden, daß die Geschwindigkeitskonstanten für beide Charge Transfer Prozesse eindeutig durch eine gemeinsame Marcus Abhängigkeit von der Freien Enthalpie für die Bildung eines Ionenpaares beschrieben werden können. Weiterhin wird am Beispiel der Naphthalinderivate gezeigt, daß die Dipolmomente der Übergangszustände der Reaktion von aus Aromat und Sauerstoff gebildeten Encounter-Komplexen zu Charge Transfer-Komplexen bei beiden Prozessen den gleichen Wert besitzen. Diese Ergebnisse werden durch einen gemeinsamen Desaktivierungskanal erklärt: beide Prozesse verlaufen über angeregte Komplexe mit der gleichen supra-supra Struktur. Dabei ergibt sich ein konsistentes Bild. Es wird gezeigt, daß der Charge Transfer Charakter für beide Prozesse im Einklang mit den Erwartungen mit steigernder Lösungsmittelpolarität ansteigt und wesentlich größer ist als bisher in der Literatur vermutet. Die Reorganisationsenergie wird für beide Prozesse in einen lösungsmittelunabhängigen intramolekularen und einen lösungsmittelabhängigen Beitrag aufgeteilt. Dabei stellt sich heraus, daß die leicht höheren Werte für die Naphthalinderivate durch höhere intramolekulare Reorganisationsenergien verursacht werden. Dies wird durch eine größere Delokalisation der aromatischen Elektronen erklärt. Ganz anders verhalten sich Benzophenonderivate. Zwar ist die Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten der Charge Transfer induzierten Löschung von O2(1Δg) durch die Benzophenonderivate im Grundzustand nahezu identisch mit der Abhängigkeit der Naphthalin- und Biphenylderivate. Jedoch weichen die Geschwindigkeitskonstanten der Charge Transfer induzierten Desaktivierung der Triplettzustände der Benzophenonderivate durch O2 enorm von der für ππ* Sensibilisatoren gefundenen gemeinsamen Korrelation ab. Hauptsächlich im endergonischen Bereich liegen die Werte um mehrere Größenordnungen höher. Andererseits wird ein wesentlich geringerer Charge Transfer Beitrag zur Geschwindigkeitskonstante festgestellt. Relativ große intramolekulare Reorganisationsenergien zeigen, daß bei der Desaktivierung der Komplexe von Triplett angeregtem Benzophenon und Sauerstoff große Änderungen der Bindungslängen stattfinden. Dies führt zu einer Verschiebung der Potentialkurve des angeregten Komplexes, verglichen mit der des Grundzustandskomplexes, und somit zu großen Franck-Condon Faktoren und zu hohen Geschwindigkeitskonstanten für die Desaktivierung in die Grundzustände im Bereich hoher Triplettenergien. Es wird gezeigt, daß die räumliche Struktur der angeregten Komplexe aus Keton und Sauerstoff für dieses Verhalten verantwortlich ist. Diese Ergebnisse führen zu einem plausiblen Mechanismus, der die niedrigen Effizienzen der Bildung von Singulettsauerstoff bei der Löschung von nπ* angeregten Ketonen erstmals zwanglos erklärt. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten der Bildung von O2(1Σg+), O2(1Δg) und O2(3Σg-) bei der Löschung von ππ* angeregten Triplettzuatänden durch Sauerstoff von der Freien Enthalpie ΔGCET für die Bildung eines Ionenpaares und von der Überschußenergie ΔE für die Bildung des jeweiligen Zustands von O2 untersucht. Zur Bestimmung dieser Geschwindigkeitskonstanten wird ein Aufbau zur zeitgleichen Detektion der O2(1Σg+ 􀂤 1Δg) Fluoreszenz, der O2(1Σg+ 􀂤 3Σg-) Phosphoreszenz und der O2(1Δg 􀂤 3Σg-) Phosphoreszenz erstellt. Mit diesem Aufbau wird eine Reihe von Sensibilisatoren mit sehr unterschiedlichen Oxidationspotentialen, Triplettenergien und Strukturen in Tetrachlorkohlenstoff untersucht. Es wird gezeigt, daß die Geschwindigkeitskonstanten kT 1Σ, kT 1Δ und kT 3Σ der Bildung von O2(1Σg+), O2(1Δg) und O2(3Σg-) zusammen mit den Werten für alle bisher mit der gleichen Methode untersuchten Sensibilisatoren durch eine gemeinsame Abhängigkeit von ΔGCET und ΔE beschrieben werden können. Dies bedeutet, daß kT 1Σ, kT 1Δ und kT 3Σ hauptsächlich durch die Triplettenergie und das Oxidationspotential des Sensibilisators bestimmt werden, und daß die Variation der molekularen Struktur nur eine untergeordnete Rolle spielt. Damit wird es zum ersten Mal möglich, die Geschwindigkeitskonstanten der Bildung von O2(1Σg+), O2(1Δg) und O2(3Σg-) bei der Löschung von ππ* Triplettzuständen durch Sauerstoff in Tetrachlorkohlenstoff für beliebige Sensibilisatoren mit hinreichender Genauigkeit vorauszusagen.
Im Mittelpunkt des Interesses stehen nämlich verschiedene Erlebnisformen, die noch vielmehr als die oben beschriebenen Aktivitäten im Fokus der öffentlichen Aufmerksamkeit bzw. Kritik stehen und Kirchenvertreter, Pädagogen, Psychologen, Polizei und Politiker, aber auch die bürgerliche Öffentlichkeit wachrufen. Viele Menschen suchen Situationen, in denen außeralltägliche Körpererfahrungen und mentale Grenzgänge in engem Zusammenhang mit gewaltaffinen oder gewalttätigen Handlungen stehen. Exemplarisch werde ich dies an drei Beispielen bzw. emotionalen Erfahrungsräumen erläutern, die seit Beginn der achtziger und neunziger Jahre immer wieder auf sich aufmerksam machen: 1) Sadomasochismus, 2) Paintball/Gotcha und 3) das Phänomen der Hooligans. Die drei Themen bzw. Gruppen mögen auf den ersten Blick wenig Gemeinsamkeiten aufweisen. "Das Auge des Ethnographen" (Leiris 1985) jedoch zeigt, dass es eine Vielzahl motivationaler und struktureller Übereinstimmungen gibt.
Zentraler Stellenwert wird dem Thema Sadomasochismus eingeräumt, mit dem ich mich bereits seit Ende der achtziger Jahre theoretisch und empirisch beschäftige (vgl. Steinmetz 1990). Es nimmt somit den größten Teil der Arbeit ein.
1. Zielsetzung Die menschliche Leber erfüllt im Körper eine Vielzahl von Funktionen. Diese reichen von der Produktion von Blutgerinnugsfaktoren über die Speicherung von Glykogen bis zum Metabolismus von Fremstoffen. Pro Jahr ereignen sich jedoch mehrere tausend Fälle eines akuten oder chronischen Leberversagens, die häufig nicht anders als durch eine Lebertransplantation beherrschbar sind und häufig im „Tod auf der Warteliste“ enden. Eine adjuvante Maßnahme zur Lebertranplantation stellt die Überbrückung der Wartezeit mit Bioreaktoren oder Hepatozytentransplantationen dar, beide jedoch benötigen große Menge an differenzierten Hepatozyten. Hepatozyten dedifferenzieren jedoch schnell in Zellkulturen, so daß zuverlässige Marker zur Bestimmung des Differenzierungsgrades vonnöten sind. 2. Material und Methode Hepatozyten, die aus menschlichen Gewebeproben isoliert worden waren, wurden verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix ausgesetzt, um zu überprüfen, ob sich ein spezifischer Einfluß einer oder mehrerer Komponenten belegen ließe. Als Marker dienten die zytoskelettalen Marker der Zytokeratine sowie die Oberflächenmarker der Integrine, MHC-I und II sowie ICAM-I, da von diesen Markern Veränderungen im Rahmen entzündlicher, neoplastischer und metabolischer Erkrankungen bekannt sind und weiterhin ein unterschiedliches Expressionsverhalten in embryonalen und adulten Geweben bekannt ist. Integrine, MHC-I und II sowie ICAM-I wurden stimuliert, um die Reaktionsfähigkeit im Laufe der Zellkultur zu erfassen. Untersucht wurden diese Marker mittels Durchflußzytometrie, Western Blot und konfokaler Laserscanmikroskopie. 3. Ergebnisse In allen Zellkulturen kam es zu Dedifferenzierungserscheinungen mit dem Auftreten unphysiologischer Zytokeratine und unphysiologischer Integrine. Hierbei war das Ausmaß der Dedifferenzierungserscheinungen eher von der Struktur der extrazellulären Matrix als ihrer Zusammensetzung abhängig, so daß unter dreidimensionalen Kulturbedingungen eine bessere Differenzierung als unter zweidimensionalen Bedingungen erzielt wurde. 4. Schlußfolgerung Humane Hepatozyten dedifferenzieren in Zellkulturen nach Aussaat in verschiedene extra zelluläre Matrices. Dabei ist das Ausmaß an Dedifferenzierung weniger abhängig von der Zusammensetzung der Matrix als mehr von der zwei- respektive Dreidimensionalität. Integrine stellen einen interessanten frühen Marker zur Beurteilung der Differenzierung dar und sollten in ergänzenden Experimenten, z. B. Kokultivierung mit nichtparenchymalen Zellen, weiter evaluirt werden.
Bei der Analyse der Diffusion von Gallensäuren durch Lipiddoppelmembranen (SUV´s, LUVET´s) erweisen sich die lipophilen Gallensäuren als besonders diffusionsfreudig. Zu diesen können die LC, CDC und die DC gezählt werden. Die deutlich hydrophilere und therapeutisch bedeutende UDC permeiert ebenfalls durch Liposomenmembranen, hat jedoch eine geringere Geschwindigkeitskonstante. Konjugierte Gallensäuren zeigen dagegen nur eine minimale Diffusionsrate. Weiterhin wurde nachgewiesen, daß eine deutliche Abhängigkeit der Permeation von der Gallensäurenkonzentration besteht. Mit steigender Konzentration erhöht sich die Geschwindigkeit. Auch bei diesen Experimenten sind die lipophileren Substanzen die schnelleren. Zudem kann festgehalten werden, daß auch eine Temperaturerhöhung bis auf 37 °C und ein Abfall des pH- Wertes auf 5,4 einen positiven Einfluß auf die Permeabilitätsrate von Gallensäuren haben. Umgekehrt verhält es sich bei einer Temperaturminderung auf 10 °C und einer pH- Erhöhung auf 9,4. Eine gleichzeitige pH- Minderung und Temperaturerhöhung hat einen additiven Effekt auf die Diffusion. Geschwindigkeitssteigernd erweist sich auch die Verwendung größerer Liposomen. Eine Steigerung des Liposomendurchmessers geht mit einer Zunahme der Permeabilität einher. Auch die Zugabe von Ethanol bewirkt eine Zunahme der Diffusion durch Liposomenmembranen. Eine herabgesetzte Diffusionsrate kann bei Änderungen in der Lipidkomposition von Lipiddoppelmembranen beobachtet werden. Ein Einbau von Cholesterin führt eine deutliche Minderung der Permeation aller Gallensäuren herbei, wobei die lipophilen Gallensäuren auch weiterhin rascher permeieren. Ein Cholesteringehalt von 20% (w/w) wirkt dabei stärker hemmend als ein Gehalt von 10% (w/w). Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit konzentrieren sich die Beobachtungen auf den Einfluß von Ethanol auf Lipiddoppelmembranen. Es kann gezeigt werden, daß Ethanol einen membrandestabilisierenden Effekt hat, der um so stärker ist, je höher die Ethanolkonzentration gewählt wird. Die DPH- Fluoreszenzversuche lassen zudem erkennen, daß Ethanol zu einer Reduktion der Membranordnung führt und damit zu einer Zunahme der Membranfluidität. Ein Einbau von UDC in die Liposomenmembran hat dagegen einen membran-stabilisierenden Effekt und reduziert die Ethanolwirkung. Dieser Effekt ist zu der Menge der in der Membran eingebauten UDC proportional. Der Cholesterineinbau in die Membran zeigt ähnliche Effekte wie der Einbau von UDC. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern zusätzliche Erklärungen für Phänomene beim therapeutischen Einsatz von Gallensäuren, die bisher nur mangelhaft zu verstehen waren. So kann aus den Diffusionsstudien die Erkenntnis gewonnen werden, daß bei der Diffusion von mehr apolaren Gallensäuren, wie z.B. der CDC, eine leichtere Diffusion durch Membranen möglich ist als für die mehr polaren Moleküle. In der PBC sind vor allem die mehr apolaren Gallensäuren nachweisbar und stellen somit einen vielleicht wichtigen pathophysiologischen Faktor dar, der sich eventuell durch Einbau von Cholesterin in Membranen oder durch Applikation von UDC mindern läßt. UDC scheint jedoch auch gegen andere schädigende Substanzen eine protektive Wirkung zu haben. Ethanolinduzierte Schädigungen an Membranen konnten z.B. durch die Anwendung von UDC deutlich reduziert werden. Eine wenig geschädigte oder sogar intakte Membran kann ihren vielfältigen Funktionen gerecht werden, z.B. die Funktion von Transportsystemen aufrechterhalten. Dies könnte erklären, warum UDC bei primär biliären Leberkrankheiten eine Cholestase vermindert oder sogar aufheben kann, die heute weitgehend mit einer Schädigung membranständiger Carriersysteme erklärt wird.