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Die Erhaltung des Muskeltonus, der die Grundlage für die aufrechte Körperstellung und die Feinabstimmung von Bewegungsabläufen bildet, erfordert ein Gleichgewicht der inhibitorischen und exzitatorischen Impulse, die in den neuronalen Regelkreisen des Rückenmarks verarbeitet werden. Im Rückenmark und Stammhirn von Wirbeltieren wird die synaptische Inhibition vom Strychnin-sensitiven Glyzinrezeptor (GlyR) vermittelt. Dieser liganden-gesteuerte Ionenkanal ist ein pentamerer Proteinkomplex aus drei a- und zwei ßUntereinheiten, der durch ein peripheres Membranprotein, das Gephyrin, in der neuronalen Membran verankert ist. Für die ligandenbindende a-Untereinheit konnten eine Vielzahl von Varianten isoliert werden, die für die Bildung verschiedener GlyR-Isoformen verantwortlich sind. Mutationen, die die Gene für die GlyR-Untereinheiten betreffen, sind stets mit chronischen Bewegungsstömngen assoziiert. So sind Punktmutationen im Gen für die GlyR al-Untereinheit für die Hyperekplexie (Startle Disease) verantwortlich, eine humane Erbkrankheit, die durch ausgeprägte Schreckreaktionen und episodische Muskelsteifheit charakterisiert ist. Die spontanen Mausmutanten spastic (spa), spasmodic (spd) und oscillator (ot), die vergleichbare Bewegungsstömngen manifestieren, tragen ebenfalls Mutationen in den Genen für die GlyR-Untereinheiten. Bei der Mausmutante spa führt eine Transposoninsertion, die im Gen für die GlyR ß-Untereinheit lokalisiert ist, zu einer Störung der GlyR ßExpression. Bei den Mausmutanten spd und ot wurden, wie bei Hyperekplexiepatienten, Mutationen im Gen für die a 1-Untereinheit identifiziert. Diese Mutation führt bei der spasmodischen Maus zu veränderten Rezeptoreigenschaften und bei oscillator zum völligen Verlust der al-Untereinheit. Die Analogie der murinen und humanen Erbkrankheiten ermöglicht die Verwendung der Mausmutanten bei der Entwicklung von in vivo Tiermodellen, die zur Erforschung der molekularen Grundlagen der Glyzinrezeptorfunktion und zur Untersuchung von GlyR-Defekten des Menschen geeignet sind. Für die Entwicklung solcher Tiermodelle wurde in der vorliegenden Arbeit versucht, die hereditären Bewegungsstörungen der Mausmutanten spa, spd und ot durch therapeutischen Gentransfer zu komplementieren. Hierbei sollten die in den Mausmutanten defekten Rezeptorstmkturgene durch solche fremder Spezies ersetzt werden.
Für die genetische Rettung der spastischen Mausmutante wurden transgene Mäuse entwickelt, die die ß-Untereinheit der Ratte in ihrem Nervensystem überexprirnieren. Durch Einbringen der Transgenallele in den genetischen Hintergrund der spastischen Maus konnte deren Menge an funktionellen GlyR ß-Transkripten vergrößert werden. Hierdurch konnte eine Zunahme an funktionellen GlyR-Molekülen erreicht und die Manifestierung ihres mutanten Phänotyps verhindert werden. Dies liefe11e zum einen den formalen Beweis für den Zusammenhang von identifiziertem Gendefekt und mutantem Phänotyp und zeigte, daß GlyR-Untereinheiten über Speziesbarrieren hinweg wirksam sind. Zum anderen wurde deutlich, daß das Erscheinen der adulten GlyR-Isoform (GlyRA) an der Membranoberfläche in vivo direkt von der Verfügbarkeit funktioneller ß-Untereinheiten abhängig ist. Darüber hinaus konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß die normale Funktion des glyzinergen Systems bereits dann gewährleistet ist, wenn nur 25% an funktionsfähigen ß-Transkripten gebildet werden bzw. wenn nur ca. die Hälfte der im Wildtyp vorhandenen GlyRA-Moleküle die neuronale Membranoberfläche erreichen.
Zur genetischen Rettung der Mausmutanten spasmodic und oscillator wurden, in analogen Versuchsansätzen, transgene Mauslinien etabliert, die die GlyR al-Untereinheit des Menschen in ihrem Nervensystem überexprimieren. Nach Einbringen der Transgenallele in den genetischen Hintergrund der ot Maus konnte deren Phänotyp partiell komplementiert werden. Eine vollständige Rettung dieser Mausmutante bzw. eine Komplementation des spasmodischen Phänotyps konnte, vermutlich aufgrund zu niedriger Transgenexpressionsrate, nicht erreicht werden. Dennoch zeigte das Ergebnis, daß die humane al-Untereinheit in der Maus Funktion übernehmen kann, eine Grundvoraussetzung für die Entwicklung von Mausmodellen, die zur Untersuchung des Pathomechanismus mutierter GlyR-Untereinheiten des Menschen geeignet sind.
Zweites Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von transgenen Mäusen, die die rekombinante GlyR-Untereinheit "Chl" in ihrem Nervensystem exprimieren, für die in vitro gezeigt wurde, daß sie eine dominant negative Wirkung auf die GlyR-Aktivität entfaltet. Durch den Einsatz dieser Untereinheit sollte die GlyR-Aktivität in vivo gezielt reduziert werden und damit der Pathomechanismus der al-Untereinheit in Hyperekplexiepatienten, die ebenfalls als dominant negative GlyR-Untereinheit wirkt, simuliert werden. Die molekularbiologischen Analysen der etablierten Chl-transgen Linien zeigten, daß die transgene Untereinheit, anders als erwartet, die Expression der ligandenbindende al-Untereinheit beeinflußt. Diese Erkenntnis steht im Gegensatz zu den Ergebnissen aus entsprechenden Experimenten mit in vitro Systemen und macht deutlich, daß in vitro Modelle die in vivo Situation nicht unbedingt repräsentieren müssen. Dies unterstreicht die Bedeutung von Tiermodellen bei der Untersuchung der molekularen Grundlagen der glyzinergen Nervenübertragung und bei der Erforschung von humanen Glyzinrezeptordefekten.
Ein transgenes Mausmodell zur Untersuchung der Zink-vermittelten Modulation des Glyzinrezeptors
(2002)
Zink (Zn2+) ist ein im Zentralnervensystem der Säuger weitverbreitetes Metallion, das in kleinen synaptischen Vesikeln hoch angereichert wird. Zink-reiche Vesikel sind besonders gut dokumentiert in exzitatorischen Synapsen, z.B. im Hippocampus, sie werden jedoch auch in inhibitorischen Synapsen von Neuronen des Rückenmarks oder der Retina gefunden. Nach exozytotischer Freisetzung dieser Vesikel in den synaptischen Spalt können Zink-Konzentrationen von bis zu zehn mikromolar erreicht werden. In vitro hat Zink modulatorische Effekte auf eine Vielzahl von Neurotransmitter-Rezeptoren, so u.a. auf Glutamat-Rezeptoren vom AMPA-, NMDA-, oder Kainat-Typ, aber auch auf GABAA- und Glyzinrezeptoren (GlyR). Zink wurde daher als endogener Neuromodulator vorgeschlagen. Der modulatorische Effekt von Zink auf den GlyR ist biphasisch: Niedrige mikromolare Konzentrationen bewirken eine Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme, höhere mikromolare Konzentrationen dagegen deren Inhibition. Dieser potenzierende Effekt von Zn2+ kann in transfizierten HEK 293 Zellen oder cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten durch eine Punktmutation im N-terminalen Bereich des α1-Polypeptids aufgehoben werden (D80A (Lynch et al., 1998), oder D80G (Laube et al., 2000)). Ein revers-genetischer Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit benutzt, um Rückschlüsse auf die physiologische Relevanz der Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme durch Zn2+ zu gewinnen: In einem „Knock-In“ Mausmodell wurde durch homologe Rekombination in ES-Zellen eine Mutation in der kodierenden Sequenz des GlyRα1-Genlocus eingeführt, die den o.g. AS Austausch (D80A) in der adulten ligandenbinden Untereinheit des GlyR bewirkt. Um die Veränderung des Genlocus zu minimieren war die als Selektionsmarker bei der Einführung der Mutation benötigte Neor-Kassette von zwei loxP-Sequenzen flankiert, und konnte so nach dem Nachweis des homologen Rekombinationsereignisses durch Wirkung der Cre-Rekombinase wieder entfernen werden. Nach Blastozysteninjektion homolog rekombinierter ES-Zellen zur Herstellung chimaerer Tiere und Keimbahntransmission der Mutation in einem Teil dieser Chimaeren konnten so Mauslinien mit zwei verschiedenen mutierten Allelen generiert werden: In zwei Linien wurde das intronisch miteingeführte Neor-Element bereits in ES-Zellen in vitro deletiert, wonach lediglich eine der loxP-Sequenzen verbleibt; in einer dritten Linie wurde der Selektionsmarker als intronische Insertion belassen. Während heterozygote Tiere aller drei Linien keinerlei offensichtliche Auffälligkeiten zeigen, findet sich bei homozygot-mutanten Tieren aller Linien ein mit der zweiten postnatalen Woche eintretender Phänotyp, dessen auffälligste Symptome eine verstärkte akustisch oder taktil induzierbare Schreckreaktion, ein erhöhter Muskeltonus, taktil induzierbarer Tremor und generalisierter Myoklonus sowie ein verlangsamtes Wiederaufrichten sind. Dieser Symtomkomplex ähnelt stark dem der spontanen Mutationen des GlyRs spasmodic, spastic oder oscillator und weist auf einen Verlust glyzinerger Inhibition als Ursache hin. Die verschiedenen Allele verursachen unterschiedlich starke Phänotypen: Das mutierte Allel, in welchem die Neor–Kassette deletiert ist, bewirkt einen schwachen Phänotyp, wohingegen das Verbleiben des intronischen Neor-Elements einen schwerwiegenderen Phänotyp zur Folge hat, und homozygote Tiere bis auf wenige Ausnahmen bis zur achten Lebenswoche sterben. Die Immunoblot-Analyse zeigt, daß bei homozygot mutanten Tieren dieser stärker betroffenen Linie ein partieller Verlust der Proteinexpression der GlyRα -Untereinheit auftritt. Dagegen ist in Tieren, in denen die Neor-Kassette deletiert ist, keine Verringerung der GlyRα-Expression durch Immunoblot nachweisbar. Der milde Phänotyp ist demnach am einfachsten durch den spezifischen pharmakologischen Effekt der Mutation, d. h. den Verlust der Zn2+-induzierten Potenzierung des GlyR, erklärbar. Hiermit wurde erstmals ein Hinweis daraufhin gewonnen, daß niedrige mikromolare Konzentrationen von Zn2+ für die physiologische Funktion des adulten GlyR notwendig sind. Darüberhinaus unterstreichen die Ergebnisse das Potential des GlyR als Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Muskel-relaxierender oder sedativer Substanzen, die - ähnlich der Wirkung von Zn2+ - einen potenzierenden Effekt auf die glyzinerge Inhibition haben.
In dieser Arbeit wurde erstmals ein monokolonaler Antikörper gegen die GlyRbeta-Untereinheit (GlyRbeta) hergestellt. Zur Immunisierung der Mäuse wurde die 120 AS lange große cytoplasmatische Schleife (engl. loop) zwischen den transmembranen Domänen 3 und 4 von GlyRbeta gewählt, da diese nur geringe Sequenzhomologie zu GlyRalpha-Untereinheiten aufweist. Diese Schleifenregion wurde als GST-Fusionsprotein in Bakterien exprimiert und affinitätsgereinigt. Sowohl die Immunisierung der Mäuse als auch die Herstellung der Hybridoma-Klone wurde in Zusammenarbeit mit Synaptic Systems GmbH (Göttingen) durchgeführt. Die Spezifität der Antikörperbindung an GlyRbeta wurde zunächst in Western Blot-Experimenten mit affinitätsgereinigtem GlyR aus Rattenrückenmark demonstriert. Eine nachfolgende Untersuchung der Antikörperbindestelle führte zur Identifikation der ersten 20 AS des beta-loop (GlyRbeta336-355) als Epitop. Ein 20 AS kurzes, synthetisches Peptid, welches die Epitop-Sequenz enthielt, war ausreichend, um Färbungen von Western Blots und Gewebeschnitten durch den Antikörper effizient zu verhindern. Außerdem wurden Protokolle für die Antikörperfärbung von GlyRbeta in transfizierten Zelllinien und primären Neuronen aus Rattenrückenmark etabliert. Weiterhin ermöglichte die Herstellung dieses Antikörpers erstmals die direkte immunhistochemische Färbung von GlyRbeta-Protein im ZNS von Mäusen. GlyRbeta konnte hierbei im Hirnstamm, Rückenmark, dem Bulbus olfactorius und der Retina von Mäusen nachgewiesen werden, was zeigt, dass GlyRbeta-Protein weit weniger verbreitet ist als aufgrund von in situ Hybridisierungs-Studien vermutet. Die gefundene Verteilung von GlyRbeta-Protein unterscheidet sich demnach stark von der Verteilung der GlyRbeta-mRNA, was für eine posttranskriptionelle Regulation der GlyRbeta-Proteinmenge spricht. Weiterführende immunhistochemische Untersuchungen an der Retina von Mäusen zeigten, dass GlyRbeta in diesem Gewebe wie erwartet mit Gephyrin an inhibitorischen Synapsen kolokalisiert ist. In Bezug auf GlyRalpha-Untereinheiten geht man bislang davon aus, dass sie an Synapsen des adulten ZNS immer mit GlyRbeta assoziiert sind, und somit indirekt mit Gephyrin verbunden werden, wodurch das Clustering der Rezeptoren gewährleistet wird. Entgegen dieser Hypothese wurde in Doppelfärbungen von GlyRbeta und GlyRalpha-Untereinheiten gefunden, dass eine Ansammlung von GlyRalpha4-Clustern in der Retina adulter Mäuse vermutlich eine Ausnahme hierzu bildet. Für GlyRalpha4-Cluster in Stratum 3 und 4 der IPL konnte gezeigt werden, dass sie teilweise nicht mit GlyRbeta, und zu ebenso großem Teil nicht mit Gephyrin kolokalisiert sind. Dennoch scheinen diese GlyRalpha4-Untereinheiten in Clustern angereichert und zudem synaptisch lokalisiert zu sein. Der Mechanismus, durch den GlyRalpha4 in Abwesenheit dieser beiden Proteine an Synapsen immobilisiert wird, ist bislang völlig unklar. Funktionell wäre denkbar, dass derartige Rezeptorkomplexe den synaptischen Eingängen von ON-Starburst-Amakrinzellen besondere Leitungseigenschaften verleihen und somit maßgeblich an der Verarbeitung richtungsselektiver Signale in der Retina beteiligt sein könnten. In dieser Arbeit wurden außerdem Mutagenesestudien durchgeführt, um zu klären, über welchen Mechanismus die Inhibition der Proteinphosphatasen 1 und 2A (PP1 und PP2A) zum Verlust von synaptischem Gephyrin führt. Es konnte gezeigt werden, dass eine direkte Dephosphorylierung von Gephyrin durch PP1 hierfür wahrscheinlich nicht verantwortlich ist, da die Mutation etablierter Phosphorylierungsstellen von Gephyrin keinen, oder nur einen marginalen Einfluss auf dessen synaptische Lokalisation und das Clustering von GABAARs hatte. Dies spricht dafür, dass PP1/PP2A abhängige Dephosphorylierungs-/Phosphorylierungsprozesse wahrscheinlich andere Gephyrin- oder Cytoskelett-assoziierte Proteine beeinflussen, jedoch nicht direkt an Gephyrin wirken. Die Erstellung von genomweiten Expressionsprofilen ist eine effiziente Methode zur Identifikation neuer Regulationsmechanismen und potentieller Interaktionspartner von Genprodukten und wurde in dieser Arbeit auf Vorderhirnproben von WT- und Gephyrin-KO-Mäusen vergleichend angewendet. Hierbei wurde gefunden, dass die Transkription bekannter Gephyrin-Interaktionspartner durch den Verlust des Gephyrin-Gens nicht messbar verändert wird. Weil die ermittelten Unterschiede in Transkriptmengen generell sehr gering waren, ist zu vermuten, dass Gephyrin keine wesentlichen genregulatorischen Funktionen im Mausgehirn ausübt. Andererseits ergab die Expressionchip-Analyse Hinweise auf neue Genprodukte, für die in WT- und Gephyrin-KO-Mäusen signifikant verschiedene Transkriptionsmengen gefunden wurden. Die Validierung dieser Daten mit anderen Methoden steht jedoch noch aus.