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Untersuchungen zur Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für die Alterung von Podospora anserina
(2012)
Im Rahmen dieser vorliegenden Doktorarbeit sollte die Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für das Resistenzverhalten und den Alterungsprozess bei P. anserina untersucht werden. Folgende Befunde aus den Analysen konnten erhalten werden:
1. Lokalisationsstudien der drei PaSods: Aus den biochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der drei verschiedenen PaSODs geht hervor, dass PaSOD1, eine Cu/ZnSOD, überwiegend im Cytosol und zu einem geringen Anteil im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert ist. Eine der beiden MnSODs, PaSOD2, wird vermutlich zur Abwehr von exogenem Superoxid sekretiert. Bei PaSOD3 handelt es sich um eine mitochondriale MnSOD.
2. Generierung von verschiedenen PaSod-Mutanten: Im Rahmen dieser Arbeit wurden von jeder PaSod mindestens drei unabhängige Überexpressionsstämme, ein GFP-Stamm- und ein Deletionsstamm hergestellt. Weiterhin wurden alle möglichen Doppel-Deletionsstämme und die Dreifach-Deletionsmutante erzeugt. Alle Stämme wurden auf DNA-Ebene verifiziert, zusätzlich wurde die Proteinmenge bzw. –Aktivität überprüft.
3. Einfluss der PaSODs auf die ROS-Toleranz: Die Analysen der ROS-Resistenzen haben gezeigt, dass PaSODs eine wichtige Rolle in der Entgiftung von Superoxiden spielt. So ließ sich bei den Deletionsstämmen der PaSods eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Paraquat feststellen. Eine Aufsummierung der Sensitivität gegenüber Paraquat ist bei der PaSod-Tripelmutante (ΔPaSod1/2/3) zu erkennen.
Überraschenderweise kann durch die gesteigerten Mengen an aktiver PaSOD in den Überexpressionsstämmen (PaSod1-3_OEx) keine verbesserte Resistenz gegenüber Paraquat erzielt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression des Gens für die mitochondriale SOD, PaSOD3, zu massiven negativen Effekten.
4. Einfluss auf die Lebensspanne: Durch eine fehlende Entgiftung von Superoxid in den PaSod-Deletionsmutanten ist eine Verminderung der Lebensspanne nicht festzustellen. Bei PaSod-Mutantenstämme, die eine erhöhte PaSOD-Aktivität und damit eine gesteigerte Abbaurate des Superoxids aufweisen, kann bei den PaSod1- und PaSod2-Überexpressionsstämmen keine verbesserte Lebensspanne unter den gewählten Standardbedingungen erzielt werden. Vielmehr noch ist die Lebensspanne der PaSod3-Überexpressionsstämme stark reduziert.
5. Einfluss der PaSod-Modulation auf andere Komponenten des ROS-Abbausystems: Die PaSOD-Aktivitäten scheinen miteinander co-reguliert zu werden. Des Weiteren scheint es ein Zusammenhang zwischen den beiden sekretierten Enzymen PaSOD2 und PaCATB zu geben. Deutlich wird auch, dass die Modulation der Superoxid-Dismutasen eine weitreichende Auswirkung auf andere Schutzsysteme hat. Beispielweise konnte gezeigt werden, dass Komponenten des mitochondrialen ROS-Schutzsystems und der Protein-Qualitätskontrolle in den PaSod3-Überexpressionsstämmen verändert sind.
Zusammenfassend lassen die Analysen der PaSod-modulierten Stämme den Schluss zu, dass die Superoxid-Dismutase in P. anserina ein wichtiges Enzym zum Abbau des schädlichen Superoxids darstellt, welches aber nur eine untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der Lebensspanne unter den gewählten Wachstumsbedingungen im Labor ausübt. Des Weiteren haben die Analysen gezeigt, dass es durch die Modulation der PaSod-Gene zu weitreichenden Änderungen, die das ROS-Schutzsystem (PaSOD, PaCATB und PaPRX1) sowie die Protein-Qualitätskontrolle (PaHSP60, PaLON und PaCLPP) betreffen, kommt. Welche Auswirkung dabei diese Veränderungen in Bezug auf die Lebensspanne hat, kann nur schwer abgeschätzt werden und muss mit weiteren Untersuchungen geklärt werden.
Aufgrund wachsender Evidenz zu guten Langzeitergebnissen und geringen Komplikationsraten gewinnt die Prostataarterienembolisation (PAE) in der Therapie des Benignen Prostatasyndroms an Bedeutung. Durch ihren hohen technischen Anspruch bedarf es im Vorfeld einer umfassenden Untersuchung der Beckengefäßanatomie. Das Vorliegen eines zum Teil jungen Patientenkollektivs rückt zudem das Einsparen von Strahlung in den Fokus. In diesem Rahmen gewinnt die Magnet-Resonanz-Angiografie (MRA) an Aufmerksamkeit. Obwohl bereits erste Studien Erfolg versprechen, wird die MRA zur PAE-Planung zum Teil kritisch betrachtet, da sie aufwändiger und in der Auflösung unterlegen sei. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Vorteile die MRA im Zuge der PAE-Planung bietet und ob die klinische Effektivität der PAE unbeeinträchtigt bleibt. Weiterhin wurde untersucht, ob eine erfolgreiche MRA-geführte Planung die benötigte Strahlendosis reduziert.
In diese retrospektive Analyse wurden 56 Patienten, die zwischen Januar 2017 und April 2018 im Frankfurter Institut für Diagnostische und Interventionelle Radiologie eine PAE erhielten und bei denen ein vollständiger, die Interventionszeit und Strahlungsparameter umfassender Datensatz sowie eine MRA vor der PAE vorlagen, eingeschlossen. Zusätzlich wurden mittels International Prostate Symptom Score (IPSS), Quality of Life (QoL) und International Index of Erectile Function (IIEF) klinische Daten vor und nach der PAE erhoben. In der Magnet-Resonanz-Tomografie (MRT) vor der PAE wurden das Prostatavolumen, die Intravesical Prostatic Protrusion (IPP) und der Prostatic Urethral Angle (PUA) untersucht. Zur Analyse der Prostataarterie wurden Maximum Intensity Projection (MIP) und ein dreidimensionales Modell verwendet. Um die Auswirkungen einer erfolgreichen Urspungsanalyse auf Interventionszeit und Strahlungsparameter zu untersuchen, wurden diese Faktoren zwischen zwei Gruppen verglichen. In der ersten Gruppe konnte die Prostataarterie mittels MRA ermittelt werden, in der zweiten Gruppe war dies v.a. aufgrund von technischen Mängeln der Bildakquisition nicht möglich.
Der Nachweis des Ursprungs gelang bei 84,73% (111 von 131) der Prostataarterien, davon entsprangen 52,25% der A. pudenda interna, 18,92% zusammen mit der A. vesicalis superior, 13,51% seltenen Ursprüngen, 10,81% der A. obturatoria und 4,51% der vorderen Division der A. iliaca interna unterhalb der A. vesicalis inferior. Die Gruppe mit erfolgreicher Ursprungsanalyse mittels MRA zeigte signifikant geringere Werte in Fluoroskopiezeit (-26,96%, p = 0,0282), Dosisflächenprodukt (-38,04%, p = 0,0025) und Eingangsdosis (-37,10%, p = 0,0020). Die PAE bedingte eine signifikante Verbesserung in IPSS (p < 0,0001), Lebensqualität (p < 0,0001) und IIEF (p = 0,0016), dabei konnte der von den Patienten angegebene IPSS-Wert um durchschnittlich 9,42 Punkte (-43,37%) und der QoL-Wert um 2 Punkte (-50,00%) reduziert werden. Das Prostatavolumen (p < 0,0001), IPP (p = 0,0004) und PUA (p < 0,0001) zeigten sich ebenfalls signifikant reduziert. Das Volumen der Prostata schrumpfte um 4,92 ml (-8,35%), die IPP um 1,2 mm (-9,2%) und der PUA um 5,5° (-8,10%). Signifikante Zusammenhänge konnten zwischen IPSS- und QoL-Reduktion (p < 0,0001, r = 0,7555), sowie zwischen Höhe des IPSS vor der PAE und der absoluten IPSS-Reduktion (p = 0,0041, r = -0,4434) nachgewiesen werden.
Die MRA ermöglicht eine strahlungsfreie Analyse des Abgangs der Prostataarterie. Durch diese Auswertung konnte die benötigte Strahlendosis signifikant reduziert werden. Die MRA-geplante PAE erzielte eine deutliche Verbesserung der Symptomatik und der Lebensqualität. Die erektile Funktion konnte signifikant verbessert werden. Prostatavolumen, IPP und PUA zeigten zwar signifikante Veränderungen, wiesen jedoch keinen Zusammenhang zu klinischen Entwicklungen auf. Zwischen dem Ausgangsvolumen der Prostata und dem klinischen Ergebnis konnte ebenfalls keine signifikante Korrelation festgestellt werden, jedoch scheint der Ausgangswert des IPSS eine prädiktive Funktion zu haben.
Die MRA-geplante PAE ist klinisch effektiv und ermöglicht durch die Analyse der Prostataarterie eine Reduktion der benötigten Strahlung. Zusammen mit der MRT unterstützt sie die Indikationsstellung und Planung der PAE.
Alle lebenden Organismen sind in der Lage, sich an den re-gelmäßigen Wechsel von Licht und Dunkelheit und den zeitli-che Veränderungen im Takt der Jahreszeiten anzupassen. Die-se Synchronisierung der Aktivitäts- und Ruhephasen, sowie von physiologischen Stoffwechselprozessen an die vorgegebe-nen tageszeitlichen und saisonalen Zyklen findet beim Säu-getier in der inneren Uhr im Nucleus Suprachiasmaticus (SCN) statt. Das Licht, als wichtigster Zeitgeber für die Synchronisation der inneren Uhr, findet Eingang zum SCN über die Retina und den retinohypothalamischen Trakt (RTH), der Glutamat als Neurotransmitter nutzt. Ist dieses System fehlerhaft, führt dies zu Störung der oben beschriebenen Anpassungsprozesse. Dies hat eine gestörte Homöostase des Organismus zu Folge, aus denen sich wiederum Veränderungen im Tag/Nacht- Rhythmus, Schlafstörungen und depressive Ver-stimmungen ergeben können. Die genannten Symptome decken sich mit den Frühsymptomen den neurodegenerativen Erkran-kung Morbus Parkinson.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Störungen im photoneu-roendokrinen System, insbesondere Veränderungen in der Re-tina an den photosensitiven Ganglienzellen mit dem Photo-pigment Melanopsin und dem SCN bei transgene Mäuse mit dem humanen alpha-Synuclein zu untersuchen. Hierbei wurden transgene Mäuse mit dem gesunden humanen alpha-Synuclein (Wildtyp) und transgene Mäuse mit der für Parkinson spezi-fischen Mutation im alpha-Synuclein Ala53Thr (A53T) vergli-chen.
Die immunochemischen Untersuchungen an Retina und SCN zei-gen einen signifikanten Anstieg der alpha-Synuclein Immun-reaktion bei der A53T Maus im Vergleich zum Wildtyp.
Parallel dazu wurden Unterschiede in Bezug auf das Photo-pigment Melanopsin zwischen den beiden Gruppen untersucht. Melanopsin ist lichtsensitiv und trägt, durch Übermittlung der aktuellen Lichtverhältnisse über den retinohypothalami-schen Trakt zum SCN, zur Synchronisation der circadianen Rhythmik bei. Durch den in dieser Arbeit nachgewiesene Me-lanopsindefizit und des deutlich reduzierten Vglut2 im hy-pothalamischen Trakt der A53T Maus lässt sich die Hypothese ableiten, dass möglicherweise die Überexpression des mu-tierten alpha-Synuclein in der Retina einen Untergang von melanopsinhaltigen Ganglienzellen herbeiführt und dadurch die Synchronisation der inneren Uhr durch Licht gestört ist. Diese Hypothese wird durch die Aktivitätsprofile ge-stützt, die durch die Aufzeichnung der lokomotorischen Ak-tivität der Tiere erstellt wurden.
Da in beiden Gruppen unter Dauerdunkel (DD) ein endogener zirkadianer Rhythmus beobachtet werden konnte, lässt dies auf die Funktionstüchtigkeit der inneren Uhr im SCN schlie-ßen. Im anschließenden Versuch die endogene Rhythmik an exogenen Reize anzupassen, zeigte sich bei dem A53T Stamm eine fehlende Synchronisierung an vorgegebene Lichtverhält-nisse mit gesteigerter Tagaktivität und reduzierten Schlaf-phasen. Somit trägt der fehlerhaft verarbeitete Lichtreiz bei A53T Mutanten zur Destabilisierung des zirkadianen Rhythmus der Lokomotion bei. Trotz des gestörten glutama-tergen Signalweges im retinohypothalamischen Trakt konnten keine Unterschiede in der Expression der Homerproteine zwi-schen Wildtyp und A53T unter Standard-Photoperiode und nach Schlafdeprivation nachgewiesen werden.
Die vorliegenden Befunde liefern Erkenntnisse zur Entste-hung der Frühsymptome bei Morbus Parkinson. Dies könnte neue Ansatzpunkte für die Therapie und Linderung von Schlafstörungen sowie Veränderungen im Tag/Nachtrhythmus liefern.
Zelluläre Zytotoxizität ist ein Phänomen, das für die Wirkung allogener Stammzelltransplantationen verantwortlich gemacht wird. Sie wird zudem genutzt im Rahmen zellulärer Immuntherapien mit Spenderlymphozyten, angereicherten, aktivierten und z.T. gentechnisch veränderten T- und NK-Zellen, Targeting der Antitumor-Immunantwort mit bispezifischen Antikörpern und der Vakzinierung mit dendritischen Zellen. Ihre Messung ist von großer Bedeutung bei der Weiterentwicklung und Validierung solcher Verfahren. In der Klinik für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität werden gegenwärtig mehrere solcher Verfahren entwickelt und eingesetzt. Eine Zytotoxizitätsmessung insbesondere gegen patienteneigene Leukämieblasten ist daher unerlässlich. Proben von Leukämieblasten aus peripherem Blut oder Knochenmark von Patienten sind heterogen und enthalten in der Regel restliche gesunde Zellen. Diese Zellen verzerren die Messung einer spezifischen Zytotoxizität gegen die Blasten, wenn sie nicht gezielt aus der Auswertung ausgeschlossen werden. Effektorzellen bestehen ebenfalls aus Subpopulationen, die in unterschiedlichem Ausmaß mit den Blasten interagieren. Um solche komplexen Proben adäquat analysieren zu können, sollte ein durchflusszytometrischer Assay unter Ausnutzung des Potenzials monoklonaler Antikörper zur differenziellen Markierung von Zellpopulationen entwickelt werden. Die Auswertung der Leukämietypisierungen von 47 Patienten und Austestung in Frage kommender Antikörper ergab, dass eine Wahl der Antikörper aufgrund des immunologischen Subtyps einer Leukämie nur mit Einschränkung möglich ist, so dass eine Vorabtestung der Antikörper erfolgen muss. Bei Einsatz der Markierung von Proben mit FITC- und PEkonjugierten Antikörper in einem konventionellen durchflusszytometrischen Assay, der die PI positiven Zielzellen an den Gesamtzielzellen als Korrelat der zytotoxischen Aktivität der Effektorzellen maß, traten Diskrepanzen in den Anteilen der Zellpopulationen einer Probe auf. Diese legten den Schluss nahe, dass tote Zellen durch vollständige Fragmentierung einer Messung entgehen. In einer neu konzipierten Assayvariante wurde daher das gegenteilige Konzept gewählt, die Messung des Überlebens der Zellen. Dies wurde ermöglicht durch die Einführung eines internen Standards, der eine durchflusszytometrische Konzentrationsmessung erlaubt. Mit diesem Verfahren wurde gezeigt, dass die Zunahme der mit PI erfassten toten Zellen nur gering mit der Abnahme lebender Zellen korreliert. Die Validierung anhand des Europium-Release-Assays ergab übereinstimmende Ergebnisse dieser zweiten Assayform mit diesem bei signifikantem (P ≤ 0,01, Wilcoxon-Rangtest) Unterschied der ersten Variante. Der im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelte Assay erlaubte zusätzlich die Beurteilung auch des Verhaltens der Effektorzellkonzentrationen. Es wurde gezeigt, dass diese sich bei vorhandener zytotoxischer Aktivität gegen die Zielzellen änderten im Sinne einer initialen Abnahme insbesondere in den geringen Effektor:Zielzell-Ratien und einer erneuten Zunahme bei längerer Kokulturdauer im Sinne einer Proliferationsinduktion durch den Zielzellstimulus. In einem letzten Schritt wurde eine modifizierte Zytometersteuerung und die Markierung CD4 und CD8 positiver T-Zellen in der gleichen Fluoreszenz unter Ausnutzung der unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten eingeführt. Dadurch wurde es möglich, bei vier Fluoreszenzbereichen simultan bis zu fünf verschiedene monoklonale Antikörper zuzüglich Propidiumjodid in einem einzigen Ansatz zu verwenden und so nicht nur lebende Ziel- und Effektorzellen zu differenzieren, sondern durch entsprechende Kombination der Antikörper auch Effektorzellsubpopulationen wie CD4+ und CD8+ T-Zellen in ihrem Verhalten zu beurteilen. Über die gleichzeitige Auswertung von Ziel- und Effektorzellen in verschiedenen Effektor:Zielzell-Ratien erlaubt dieser neue Assay differenzierte Aussagen über das Verhalten und die Reaktivität von Zellen in Kokultur bei einfacher Handhabung, minimaler Zellmanipulation im Verlauf des Assays durch Markierung erst nach Kokultur und hoher Flexibilität in der bearbeiteten Fragestellung.
Die Neurowissenschaften sind in Forschungsarbeiten für Schüler und Studierende immer wieder als eines der schwierigsten Teilgebiete der Biologie angeführt. Die Inhalte werden überwiegend nicht verstanden. Als mögliche Ursache gelten die seltenen praktischen Zugänge für die Lernenden aufgrund limitierter Ressourcen. Diese Ursache konnte in der vorliegenden Arbeit durch eine Befragung der Lehrkräfte zu ihren Praxisumsetzungen bestätigt werden. 70 % der Lehrkräfte gaben an, dass sie keine Experimente in der Schule zum Thema Nervenzellen anbieten. Experimente zur Verhaltensbiologie führen 65 % der Lehrkräfte nicht durch.
Um Schülern die Möglichkeit zu geben, sich experimentell mit den Themenfeldern der Neuro- und Verhaltensbiologie auseinanderzusetzen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Schülerlabortage auf dem Feld der Neurowissenschaften konzipiert. Die Konzepte wurden schülerorientiert umgesetzt und neurowissenschaftliche Forschung durch den eigenen Umgang mit modernen Forschungsapparaturen erfahrbar gemacht. Die drei Labortage für die Sekundarstufe II wurden wissenschaftlich begleitet: 1) Verhaltensbiologie, 2) systemische Ebene der Elektrophysiologie, 3) elektrophysiologische Forschungsmethoden. Um die Qualität und Wirksamkeit der Labortage beurteilen zu können, wurden sie mit Feedbackerhebungen begleitet. Die drei Labortage wurden sowohl von den Lehrkräften als auch von den Schülern bezüglich ihrer Qualität positiv bewertet. Für die Schüler konnte gezeigt werden, dass die Beurteilung weitgehend unabhängig von einem zugrunde liegenden Interesse an Biologie und Forschung ausfällt. Anhand einer retrospektiven Erhebung wird außerdem gezeigt, dass alle drei Labortage eine höchst signifikante, selbsteingeschätzte Steigerung des „Wissens“, der „Anwendungszuversicht“ und des „Interesses“ bewirken. Schüler mit niedrigen Ausgangswerten zeigen einen besonders hohen Anstieg. Für das Interesse kann weiter gezeigt werden, dass auch Schüler mit hohem Ausgangswert eine große Interessenssteigerung durch den Labortag aufweisen. Das Interesse für den verhaltensbiologischen Labortag liegt etwas niedriger – die Labortage mit elektrophysiologischen Inhalten zeigen dagegen für die Anwendungszuversicht etwas niedrigere Werte.
Der Fokus der fachdidaktischen Forschung lag auf der Betrachtung des experimentellen Zugangs zur Elektrophysiologie über ein entwickeltes „EPhys-Setup“. Dabei handelt es sich um einen quasi-realen Messaufbau. Die Umsetzung kombiniert dazu Komponenten eines realen Elektrophysiologie-Setups (Hands-on Komponenten) mit einer speziell entwickelten schülerfreundlichen Software (Neurosimulation) und einem virtuellen Nervensystem in Form einer Platine. Als Modellnervensystem werden für diese Umsetzung Ganglien von Hirudo medicinalis verwendet – der Neurosimulation liegen originale elektrophysiologische Messspuren des Ganglions zugrunde. Experimentelle Vermittlungsansätze für die Elektrophysiologie finden sich kaum für den Schulbereich. Dem Bedarf einer entsprechenden Beforschung wurde mit verschiedenen Testinstrumenten nachgegangen, um den Vermittlungsansatz mit dem EPhys-Setup bewerten zu können. Dafür fand eine Wirksamkeitsanalyse über die Erhebung der Motivation der Schüler statt (Lab Motivation Scale; Dohn et al. 2016). Von Bedeutung war auch, inwiefern gegenüber der Umsetzung eine Technologieakzeptanz vorliegt (Technology Acceptance Model; Davis 1989), die im Schulkontext ausgehend von der steigenden Einbindung von Technologien einen entsprechenden Forschungsbedarf aufweist. Weiter wurde untersucht, ob sich die Bewertung des EPhys-Setups von der Bewertung einer Kontrollgruppe unterscheidet. Für die Kontrollgruppe wurde die Neurosimulation von den Hands-on Komponenten gelöst und die Schüler arbeiteten ausschließlich PC-basiert. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Umsetzungen die Motivation förderten und eine Technologieakzeptanz bei den Schülern aufwiesen. Der Unterschied der Untersuchungsgruppen fällt gering aus. Die Abhängigkeiten, die für die verwendete Simulationsumsetzung gefunden wurden, beziehen sich ausschließlich auf Komponenten der „Freude“. Somit wird der intrinsische Bereich von den Schülern die am EPhys-Setup gearbeitet haben höher bewertet. Zur weiteren Analyse der Testinstrumente wurde auch eine Abhängigkeit der Bewertung vom zugrunde liegenden Biologieinteresse sowie von den Computerfähigkeiten vergleichend betrachtet. Der Einfluss auf die Bewertungen der drei Testskalen ist in vielen Fällen höher als der Einfluss der verwendeten Simulation. Vom individuellen Biologieinteresse der Schüler zeigen alle untersuchten Komponenten eine Abhängigkeit. Die größeren Effekte beziehen sich auf die Komponenten der „Lernwirksamkeit“ oder der „Freude“. Von den individuellen Computerfähigkeiten der Schüler zeigen Komponenten zur „Zuversicht bezüglich der Methoden und der Inhalte“ eine Abhängigkeit.
Theater der Spur
(2014)
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wichtigste NO-produzierende Enzym im kardiovaskulären System ist die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und Acylierung, durch Interaktionen mit regulatorischen Proteinen wie Ca2 /Calmodulin und Caveolin sowie durch differentielle subzelluläre Lokalisation reguliert wird. Dabei sind die Faktoren, welche die (Trans-)Lokation der eNOS zwischen subzellulären Kompartimenten wie den Caveolae der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat dirigieren, weitgehend unbekannt. Zur Identifizierung neuer Interaktionspartner wurde humane eNOS im "yeast two-hybrid"-System als "Köderprotein" eingesetzt und dabei das Fragment eines neuen humanen Proteins identifiziert, das vorläufig NOSTRIN (für: eNOS traffic inducer) genannt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang nun die Klonierung der kompletten NOSTRIN-cDNA, der Nachweis einer spezifischen Interaktion von eNOS und NOSTRIN in Säugerzellen sowie die Charakterisierung von NOSTRIN als Modulator der subzellulären Lokalisation und Aktivität von eNOS. Nach der kompletten Klonierung der NOSTRIN-cDNA mit Hilfe einer 5'-RACE resultierte ein offenes Leseraster von 506 Aminosäuren entsprechend einer Größe von ca. 58 kDa für NOSTRIN. Eine Datenbankrecherche zum Vergleich der NOSTRIN-Sequenz mit Sequenzen bekannter Proteinmotive ergab die Vorhersage einer N-terminalen Cdc15-Domäne sowie einer C-terminalen SH3-Domäne. Die direkte Interaktion zwischen eNOS und NOSTRIN konnte durch Copräzipitation in vivo und in vitro bestätigt werden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die SH3-Domäne von NOSTRIN essentiell für die Bindung an eNOS ist. Zur Untersuchung des Einflusses von NOSTRIN auf die eNOS-Lokalisation wurden stabil transfizierte CHO-Zellen, die eNOS überexprimierten ("CHO-eNOS") eingesetzt. In der Immunofluoreszenz war eNOS vornehmlich in Assoziation mit der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat zu sehen. Mit Hilfe des Semliki-Forest-Virussystems (SFV) wurde nun NOSTRIN transient überexprimiert; dabei zeigte sich für NOSTRIN eine vesikelartige Verteilung im Cytoplasma. Die NOSTRIN-Überexpression führte zu einer drastischen Umverteilung von eNOS, die nun in charakteristischen vesikelartigen Strukturen mit NOSTRIN colokalisierte. Die Verwendung von NOSTRIN-Konstukten, bei denen die SH3- Domäne deletiert war ("NOSTRIN.SH3"), veränderte zwar die typische NOSTRIN-Lokalisation nicht, ließ aber auch die subzelluläre Verteilung von eNOS unverändert, so dass NOSTRIN.SH3 und eNOS in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert waren. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte ebenfalls eine Colokalisation von NOSTRIN und Caveolin-1, einem inhibitorisch wirkenden Interaktionspartner von eNOS, nachgewiesen werden. Die Analyse von Copräzipitationen mit NOSTRIN bzw. NOSTRIN.SH3 zeigte, dass Caveolin-1 in eNOS-unabhängiger Weise an NOSTRIN bindet, so dass ein ternärer Komplex aus NOSTRIN, eNOS und Caveolin-1 resultiert. Zur Klärung der Frage, ob NOSTRIN neben der subzellulären Lokalisation auch die Aktivität von eNOS beeinflusst, wurde die NO-Freisetzung von CHO-eNOS-Zellen analysiert. Dabei ergab sich, dass die transiente Überexpression von NOSTRIN in CHO-eNOS-Zellen die eNOS-Aktivität um 62 % im Vergleich zu Kontrollzellen reduzierte. In humanen primären Endothelzellen konnte mittels Immunoblotting und Immunofluoreszenzmikroskopie das Vorkommen von endogenem NOSTRIN sowie dessen Colokalisation mit endogener eNOS an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation führen zur Hypothese, dass NOSTRIN als "molekulare Klammer" zwischen eNOS und Caveolin-1 dient, eine dynamische Umverteilung von eNOS innerhalb der Zelle vermittelt und damit das Enzym - direkt und/oder indirekt - inhibiert. Somit dürfte NOSTRIN als Modulator der Aktivität und Lokalisation von eNOS eine wichtige Rolle bei der Regulation der endothelialen NO-Produktion spielen.
Bei weltweit steigender Inzidenz von Krebserkrankungen in Verbindung mit den beträchtlichen Kosten für die Therapie und limitierten finanziellen Ressourcen ist eine wirtschaftlich sinnvolle Verteilung der Geldmittel die erstrebenswerteste Strategie um für ein Maximum an Patienten eine den Umständen entsprechend maximal wirksame Therapieform zu ermöglichen. Zur Beurteilung der Kostenentstehung und verteilung bei Krebstherapien wurde eine retrospektive Analyse hinsichtlich der Dauer der verschiedenen Abschnitte der Therapie bei 30 Patienten (13 Frauen, 17 Männer) durchgeführt und die Kosten der unterschiedlichen Behandlungsabschnitte betrachtet. Am Beginn stand dabei die Frage nach der Definition der Start und Endpunkte der einzelnen zeitlichen Intervalle und am Schluß die Ermittlung der Kosten pro Zeiteinheit, um Vergleiche der einzelnen Therapieintervalle auf ökonomischer Basis zu ermöglichen. Dabei ergab sich schon für die relativ kleine Stichprobe mit verschiedensten Anamnesen und Therapiezeiten ein verlängertes kuratives Behandlungsintervall im Gegensatz zu einer im Vergleich kürzeren palliativen Behandlungsdauer. Dabei konnte gezeigt werden, daß die Kosten pro Behandlungstag in der Regel für die kurative Behandlung geringer ausfielen als für die palliative, wobei sich der stationäre Aufenthalt in jedem Fall als maßgeblicher Kostenfaktor herausstellte. Generell scheinen die Ergebnisse darauf hinzudeuten, daß, während sich die kurativen Kosten in gewissen Grenzen prognostizieren lassen, dies bei den palliativen Kosten so nicht vorhersagbar ist. Aufgrund der Qualität der retrospektiv gewonnenen Daten und ihrer eingeschränkten Übertragbarkeit sollte die Wertigkeit dieser Aussage jedoch auch mit der nötigen Kritik betrachtet werden.
Um die Rolle von potentiell schmerzauslösenden Substanzen bei der Entstehung von menschlichem Muskelschmerz und von muskulärer Hyperalgesie zu beurteilen, wurde bei dieser Arbeit das DOMS Muskelschmerzmodell und das hypertone NaCl Muskelschmerzmodell in Kombination mit der Mikrodialysetechnik verwendet. Dabei wurden bei 10 gesunden, untrainierten Probanden metabolische Änderungen im Glucosestoffwechsel (Glucose, Laktat) und Fettstoffwechsel (Glycerol), Änderung der Glutamat Freisetzung und Änderungen von inflammatorischen Mediatoren (PGE2, NO, Substanz P) in den schmerzhaften und in den Kontrollmuskeln untersucht. Studienbegleitend erfolgte zur Beurteilung der Effektivität der Übungen und des dabei entstandenen Muskelschadens die Bestimmung von Serum CK, Serum Laktat, des Muskelumfangs und der Muskeldruckschmerzschwelle (PPT). Die Probanden gaben regelmäßig die Schmerzintensität auf einer visuellen Analogskala (VAS) an. Die DOMS Muskelschmerzen wurden 24 Stunden vor dem Beginn der Mikrodialyse durch konzentrisch/ exzentrische Kontraktionen der Wadenmuskulatur im Verum Bein ausgelöst. Während der Mikrodialyse erfolgte die Schmerzstimulation der Wadenmuskulatur durch Plantar- und Dorsalflexion des Fußes. Die Schmerzauslösung beim hypertonen NaCl Modell geschah während der Mikrodialyse durch sequentielle Injektionen von hypertoner NaCl Lösung ( 5 ∗ 200 µl 5.8% NaCl Lösung in 2 Minuten Intervallen) in den Bizepsmuskel am Oberarm. Die Zuordnung der Behandlung (Verum vs. Kontrollmuskel) erfolgte jeweils nach dem Zufallsprinzip.
Direkt nach den DOMS Übungen kam es zu einem signifikanten Anstieg von Laktat im Serum, nach 24 Stunden zu einem signifikanten Ansteigen der CK Aktivität und einer Zunahme des Muskelumfangs. Mit beiden Modellen konnte zuverlässig ein Muskelschmerz erzeugt werden, wobei die Schmerzintensität bei wiederholter Stimulierung abnahm und dies im DOMS Modell stärker ausgeprägt war. Eine mechanische Hyperalgesie konnte nur an den Waden beobachtet werden, die dort aber beidseitig auftrat und damit eine Art „zentraler Übererregbarkeit“ vermuten lässt. Die Dialysatkonzentrationen von Glutamat, PGE2 und Substanz P zeigten aufgrund der Schmerzstimulation im DOMS Bein einen lokalen Anstieg (Glutamat 125 ± 20 µM [p=0.005], PGE2 239 ± 45 pg/ml, Substanz P 64 ± 11 pg/ml). Dabei traten im Kontrollbein keine signifikanten Änderungen auf. Während der Mikrodialyseperiode war die NO Konzentration im DOMS Bein signifikant geringer als im Kontrollbein (p = 0.02), zeigte dabei aber keine Beeinflussung durch die Schmerzstimulation. Gleichzeitig war dabei die Laktatkonzentration im DOMS Bein im Vergleich zum Kontrollbein erhöht. Die Glucose- und Glycerolkonzentrationen wiesen durch die Schmerzauslösung keine bedeutenden Veränderungen auf.
Im Bizepsmuskel kam es infolge der hypertonen NaCl Injektionen zu einem signifikanten Anstieg der Glutamat Konzentration im Dialysat (50 ± 3 µM, p = 0.003), wobei diese im Kontrollmuskel konstant blieb. Die Injektionen hatten aber keinen Einfluss auf die Werte von Glucose, Laktat, Glycerol, NO, PGE2, des Muskelumfangs und der PPT.
Möglicherweise ist ein inflammatorischer Prozess an den peripheren Mechanismen der Muskelschmerzentstehung beim DOMS Modell beteiligt. Die Injektion von hypertoner NaCl Lösung löst den Muskelschmerz vermutlich direkt durch die hohe extrazelluläre Natrium Konzentration aus, wobei es zu einer Depolarisation der Nozizeptormembran mit einer nachfolgenden Glutamat Freisetzung aus den aktivierten Nozizeptoren kommt. Die Vorteile dieses Modells sind die Wiederholbarkeit und die kurze Dauer des Muskelschmerzes. Die dem ausgelösten Schmerz zugrundeliegenden Mechanismen ähneln jedoch nicht den Mechanismen die dem klinischen Muskelschmerz zugrunde liegen. Deshalb könnte es sein, dass die Bedeutungen der Ergebnisse aus diesem Modell relativ beschränkt sind und die Nützlichkeit insbesondere für pharmakologische Studien damit auch eingeschränkt ist.
Der Neurotransmitter Glutamat ist an den peripheren Mechanismen der Muskelschmerzentstehung beteiligt, da die Glutamat Freisetzung direkt mit dem Muskelschmerz beim DOMS Modell und beim Hypertonen NaCl Modell assoziiert war. Die beim DOMS Modell erhöhten Konzentrationen von Laktat, PGE2, sowie die Änderungen von Substanz P und die erniedrigten NO Konzentrationen könnten auch zu der Entstehung von Muskelschmerz beitragen.
Der beobachtete Rückgang der Schmerzintensität bei wiederholter Stimulierung lässt auf eine Art „Gewöhnung“ schließen, die bei Anwendung des DOMS Modells für pharmakologische Untersuchungen einen Nachteil darstellen könnte.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung, Aufbau und Inbetriebnahme eines Funnelsystems zur Zusammenführung zweier Teilchenstrahlen, bestehend aus zwei Injektionssystemen, zwei RFQ-Beschleunigern, Hochfrequenz-Deflektoren und Diagnoseeinheiten. Die Aufgabe des Experiments ist die praktische Umsetzung eines neuartigen Verfahrens zur Strahlstromerhöhung bei im Idealfall gleichbleibender Emittanz und steigender Brillanz. Notwendig wird dies durch die benötigten hohen Strahlströme im niederenergetischen Bereich einiger zukünftiger geplanter Beschleunigeranlagen. Hier kann der Strahlstrom nicht mehr konventionell von einer einzigen Ionenquelle erzeugt werden. Nur durch die Parallelerzeugung mehrerer Teilchenstrahlen sowie mehrfachem Zusammenführen (Funneling) der Teilchenstrahlen ist es möglich, die notwendigen Strahlströme bei der geforderten kleinen Emittanz zur Verfügung zu stellen. Das Frankfurter Funneling-Experiment ist die skalierte erste HIDIF-Funneling-Stufe als Teil eines Fusionstreibers. Hier werden zwei möglichst identische Helium-Teilchenstrahlen von zwei Ionenquellen erzeugt und in zwei RFQ-Beschleunigern beschleunigt. Der Deflektor biegt die Teilchenstrahlen reißverschlussartig auf eine gemeinsame Strahlachse. Am Anfang der Arbeit stand die Optimierung des Betriebs der Beschleunigerkomponeten und die Entwicklung und der Aufbau eines Einzellendeflektors. Erste erfolgreiche Strahlexperimente zur Strahlvereinigung werden im Kapitel 7.5 vorgestellt. Die Phasenraumellipse des zusammengeführten Strahls zeigt starke bananenförmige Deformierungen, die auf eine schlechte Anpassung des RFQ an den Funnel-Deflektor zurückzuführen sind. Das Elektrodendesign des RFQ ist in zwei unabhängige Bereiche unterteilt. Die erste Zone dient der Beschleunigung der Teilchen. In der zweiten Zone soll erstmals ein sogenannter 3D-Fokus der Strahlradien der x- und y-Ebene und einer longitudinaler Fokussierung erreicht werden. Der zweite Abschnitt bestand für erste Strahltests aus zunächst unmodulierten Elektroden. Zur besseren Anpassung des RFQ an den Funneldeflektor wurde dann das letzte Elektrodenteil erneuert. Der Umbau erfolgte zunächst nur bei einem der beiden RFQ-Beschleuniger. Somit war der direkte Vergleich zwischen altem und neuen Elektrodendesign im Strahlbetrieb möglich. Mit diesem neuen Elektrodenendteil wurde eine Reduktion der Strahlradien der x- sowie y-Ebene, eine bessere longitudinalen Fokussierung sowie eine höhere Transmission erreicht (Kapitel 8). Damit ist es erstmals gelungen mit einer speziellen Auslegung der RFQ-Elektroden eine direkte Anpassung an nachfolgende Elemente zu realisieren. Untersuchungen zur Strahlzusammenführungen werden seit einigen Jahren am Institut durchgeführt. Mit der Entwicklung des 3D-matchers wurde ein weiteres der kritischen Probleme gelöst. Der Umbau des zweiten Beschleunigers findet zur Zeit statt. Nach der Inbetriebnahme werden Funneling-Experimente mit dem Einspalt- und einem neuem Vielspaltdeflektor folgen.