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Boswelliasäuren (BAs) sind pentazyklische Triterpene, die als biologisch aktive Komponenten des Weihrauchharzes aus Boswellia serrata identifiziert wurden. Weihrauchpräparate werden seit langer Zeit in der indischen Medizin zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen angewandt. Klinische Untersuchungen an Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und peritumoralen Hirnödemen zeigen ebenfalls vielversprechende Effekte. Bislang wurde die 5-Lipoxygenase (5-LO) als Schlüsselenzyms der Leukotrien(LT)-Biosynthese und die Elastase als molekulare Targets der BAs identifiziert und in direkten Zusammenhang mit der antiinflammatorischen Wirkung gebracht. LTs sind wirksame Mediatoren entzündlicher und allergischer Reaktionen, die von Leukozyten freigesetzt werden und ihre Effekte über spezifische G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) vermitteln. Unter den verschiedenen getesteten BAs ist 3-O-Acetyl-11-Keto-BA (AKBA) der potenteste 5-LO Inhibitor, wohingegen 11-Keto-BA (KBA) etwa 3-fach weniger aktiv ist und BAs ohne 11-Keto-Funktion (ß-BA und A-ß-BA) kaum wirksam sind. Darüber hinaus lassen AKBA und KBA eine wesentlich potenterer Hemmung der 5-LO Aktivität in intakten Zellen als in zellfreien Systemen erkennen. Die Hemmung der 5-LO bzw. der LT-Biosynthese als antiinflammatorisches Wirkprinzip der BAs wird derzeit sehr kontrovers diskutiert und ist aufgrund der Diskrepanz zwischen den erreichbaren Blutspiegeln und den IC50-Werten für die 5-LO Hemmung eher unwahrscheinlich. Ziel der Arbeit war es die molekularen Grundlagen der pharmakologischen Eigenschaften von BAs aufzuklären. Der Schwerpunkt lag bei der Identifizierung und Charakterisierung zentraler Signaltransduktionsmechanismen, die von BAs in menschlichen Blutzellen (polymorphkernigen Leukozyten (PMNL), Thrombozyten) vermittelt werden. Daneben sollten funktionelle Zellantworten untersucht und in einen kausalen Zusammenhang mit der Signaltransduktion und einer Rezeptoraktivierung gebracht werden. Parallel dazu wurde die Wirkung der BAs auf eukaryontische Zelllinien (MM6 Zellen, HL60 Zellen) untersucht. Überraschenderweise konnte festgestellt werden, dass KBA und AKBA in Konzentrationen > 10 µM potente Aktivatoren von PMNL sind, während BAs ohne 11-Keto-Gruppe kaum aktiv sind. Vergleichbar mit chemotaktischen Stimuli (z.B. fMLP, PAF), erhöhen AKBA und KBA die intrazelluläre Ca2+-Konzentration und aktivieren die Mitogenaktivierten Proteinkinasen p38 MAPK und p42/44MAPK. Untersuchungen der proximalen Signaltransduktionswege ergaben, dass die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI 3-K), nicht jedoch die Proteinkinase C, in die AKBA-induzierte MAPK Aktivierung involviert ist. In Analogie zu chemotaktischen Liganden von GPCR (z.B. fMLP, PAF) kommt es durch Zellstimulation mit BAs zu funktionellen Zellantworten in Leukozyten, Es konnte gezeigt werden, dass 11-Keto-BAs in der Lage sind, die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, die Freisetzung von Arachidonsäure (AA) und ihre anschließende Metabolisierung durch 5-LO in PMNL zu induzieren, Dies ist einleuchtend, da diese Prozesse u.a. durch Ca2+ Mobilisierung und MAPK Aktivierung vermittelt werden können. Die pharmakologische Charakterisierung der zugrundeliegenden Signalwege liefert Hinweise auf eine Abhängigkeit von Ca2+, die Beteiligung der PI 3-K und der p42/44MAPK. Im Gegensatz zu AKBA und KBA sind BAs ohne 11-Keto-Gruppe (ß-BA und A-ß-BA) potente Agonisten für Thrombozyten und stimulieren, in ähnlichem Ausmaß wie Thrombin, die Ca2+ Mobilisierung und die Aktivierung von MAPK. Auch funktionelle Zellantworten wie die Bereitstellung von AA sowie deren Metabolisierung durch 12-LO werden durch BAs ohne Keto-Funktion induziert. Zusammenfassend sind also BAs in hohen, pharmakologisch nicht-relevanten Konzentrationen als multifunktionelle Agonisten inflammatorischer Prozesse aufzufassen. Es ist jedoch denkbar, dass BAs in niedrigen Konzentrationen eine antagonistische Wirkung an bestimmten Rezeptoren gegenüber chemotaktischen Faktoren (z.B. PAF, LTB4) ausüben. Dies könnte eine plausible Erklärung für die entzündungshemmenden Wirkungen der Boswelliasäuren sein.
Transdermale Therapeutische Systeme (TTS) sind Arzneiformen, die über einen längeren Zeitraum eine kontrollierte Arzneistoffabgabe durch die Haut ermöglichen. Um ausreichende Permeationsraten zu erreichen, sind häufig hohe Arzneistoffkonzentrationen im Reservoir notwendig. In TTS, deren Arzneistoffkonzentration über der Sättigungskonzentration der Matrix liegt, neigen die Wirkstoffe dazu auszukristallisieren. Die Kristallisation stellt ein wichtiges Stabilitätsproblem bei der Entwicklung solcher Systeme dar, da die Bioverfügbarkeit negativ beeinflusst werden kann. Diese Studie zeigt, dass Kristallisationsprozesse in TTS mithilfe der isothermen Wärmeleitungsmikrokalorimetrie über eine Messzeit von 7 Tagen mit hoher Empfindlichkeit erfasst werden können, denn die Kristallisation stellt einen exothermen Prozess dar. Die mikrokalorimetrische Messkurve zeigte sowohl bei Placebo- als auch bei wirkstoffhaltigen Zubereitungen einen starken initialen, exothermen Wärmefluss, der über einige Tage langsam abfiel bis ein konstantes Wärmeflussplateau erreicht wurde. Der hohe initiale Wärmefluss entstand durch das Ausstanzen der Laminate und die damit verbundene mechanische Beanspruchung. Die Kristallisation wurde von den Stanzrändern ausgehend initiiert und war damit an den Schnittkanten auch stärker ausgeprägt als im Inneren der Laminate. An den Schnittstellen des TTS waren mikroskopisch wesentlich mehr Kristalle nachweisbar als in den nicht mechanisch beanspruchten Bereichen. Die messbare Arzneistoff-immanente Wärmemenge stieg mit erhöhtem Arzneistoffgehalt an, war aber über 7 Tage bei den E2-haltigen und NEA-haltigen TTS-Laminaten nicht proportional zum Arzneistoffgehalt, da die Kristallisation nach dieser Messzeit nicht beendet war. Dieses Ergebnis konnte durch die mit steigender Übersättigung beschleunigte Kristallisation erklärt werden, die für alle untersuchten Messreihen beobachtet wurde. Je höher die Arzneistoffkonzentration in den Laminaten war, desto stärker war auch die Triebkraft für Kristallisationsvorgänge. Das Kristallisationsende war rascher erreicht. War die Kristallisationsgeschwindigkeit dagegen über einen gewissen Konzentrationsbereich konstant oder war der Kristallisationsprozess während der Messzeit bereits beendet, so stieg die Arzneistoff-immanente Wärmemenge proportional zur erhöhten Arzneistoffkonzentration. Eine konstante Kristallisationsgeschwindigkeit wurde für NEA im Bereich von 4 bis 10 % beobachtet. Bei höherer Übersättigung verlief der Kristallisationsprozess allerdings ebenfalls beschleunigt. Die Kristallisationsgeschwindigkeitskonstante sowie der Avrami-Exponent als Parameter für den Kristallisationsmechanismus konnten anhand der mikrokalorimetrischen Daten berechnet werden, ebenso wie die Kristallisationsenthalpien in Höhe von -23,3 ± 1,2 kJ/mol für E2-hemihydrat, -22,8 ± 2,6 kJ/mol für NEA sowie -7,9 ± 0,95 kJ/mol für die 1:3- Mischung. Alle Kristallisationsvorgänge waren durch die hohe Viskosität der Matrix diffusionskontrolliert und zeigten ein eindimensionales Kristallwachstum. Bei der Mikrokalorimetrie handelt sich um eine unspezifische Methode, bei der der Ursprung der Wärmeeffekte durch zusätzliche Methoden aufgeklärt werden muss. Als weitere Untersuchungsmethoden bei der Kristallisation in transdermalen Systemen boten sich die Polarisationsmikroskopie und die Pulverröntgenbeugung an. Die DSC war ungeeignet. Im Vergleich zur Mikrokalorimetrie war die polarisationsmikroskopische Untersuchung von Kristallisationsprozessen jedoch wesentlich zeitaufwendiger, wobei sich die Empfindlichkeit als höher erwiesen hat. Die Mikrokalorimetrie detektierte im Vergleich zur Mikroskopie erst eine Kristallmenge von ungefähr 0,5 % zuverlässig. Die Pulverröntgenbeugung stellte im Vergleich zu Mikroskopie und Mikrokalorimetrie eine weniger empfindliche analytische Methode für die Erkennung von kristallinem organischen Material in einer polymeren amorphen Matrix dar. Während kleine Kristalle in den Polymerfilmen bereits mit bloßem Auge zu sehen waren, traten zum Teil keine Reflexe im Pulverdiagramm auf. Die Detektionsgrenze lag im Vergleich zur Mikroskopie bei ungefähr 1 bis 1,5 % Kristallen in der polymeren Umgebung. Dagegen ist die Pulverröntgenbeugung für verschiedene Kristalltypen sehr spezifisch. Sie erlaubt die Aufklärung von Strukturen sowie eine quantitative Auswertung der Kristallmengen in Mischungen, sofern die Kristalltypen bekannt sind. Mithilfe der Polarisationsmikroskopie und Pulverröntgenbeugung wurden die Kristallstrukturen der Arzneistoffe in der polymeren Matrix der TTS untersucht. Für Systeme, die nur einen der Arzneistoffe enthielten, wurde eine unveränderte Kristallisation in der Matrix in Form von E2-hemihydrat bzw. NEA beobachtet. Die Kombination von E2-hemihydrat und NEA veränderte die Kristallstruktur der gebildeten Kristalle im Vergleich zu den reinen Arzneistoffen und führte zur Ausbildung einer neuen Kristallstruktur in der Matrix, die sich in den Reflexlagen auch von der aus Ethylacetat kristallisierten unterschied. Sogar geringe E2-Konzentrationen führten zu einer deutlichen Veränderung der Kristallform und des Röntgenbeugungsmusters der NEA-Kristalle. Außerdem wurde der Kristallisationsprozess durch die Kombination der Hormone stark beschleunigt. Bei der neuen Kristallform handelte es sich um eine thermodynamisch weniger stabile Struktur, da die Kristallisationsenthalpie geringer war, allerdings war die Kristallisation kinetisch bevorzugt. Trotz der Unterschiede in der Empfindlichkeit der Methoden, die zur Bestimmung der Sättigungslöslichkeit angewendet wurden, stehen die erhaltenen Ergebnisse entsprechend den Detektionsgrenzen in guter Übereinstimmung, wobei es sich bei den ermittelten Werten von 1,5 % für E2-hemihydrat und 4 % für NEA unter Umgebungsbedingungen um die Sättigungslöslichkeit unter Kristallisationsbedingungen und nicht um die wahre Sättigungslöslichkeit handelt. Hohe Feuchtigkeit in der polymeren Matrix fördert die E2-hemihydrat- sowie NEA-Kristallisation durch die geringe Wasserlöslichkeit der Steroidhormone. Die Trocknungsbedingungen konnten die physikalische Stabilität der Pflaster stark beeinflussen, was eventuell auch durch die Ausbildung einer besser löslichen, wasserfreien Kristallform des Estradiols begründet sein könnte. Die Vorbehandlung der Laminate bei 80°C scheint eine gute Möglichkeit zu sein, die TTS vor Kristallisationsprozessen zu schützen, wobei bei der Lagerdauer ein Kompromiss zwischen der physikalischen Stabilisierung und der chemischen Zersetzung gefunden werden muss. Zusammenfassend wurde festgestellt, dass es sich bei der Mikrokalorimetrie um eine zeitsparende und effektive Methode für die Beurteilung einer Vorbehandlung bei 80°C sowie des Einflusses von verschiedenen Hilfsstoffen auf den Kristallisationsprozess der Arzneistoffe im TTS handelt. Die Mikrokalorimetrie ermöglichte dabei innerhalb von 7 Tagen die Klassifikation verschiedener Zusatzstoffe nach deren Effizienz, die Kristallisation in den Pflastern zu initiieren. Dagegen sind häufig viele Monate nötig, um ähnlich zuverlässige Ergebnisse mit der Polarisationsmikroskopie bzw. der Pulverröntgenbeugung zu erhalten. Die Mikrokalorimetrie stellt demnach eine interessante Methode für ein Hilfsstoffscreening und die Optimierung von Rezepturen dar.
Die Wiederherstellung der Perfusion eines ischämischen Areals, auch Reperfusion genannt, ist vorrangiges Therapieziel bei Herzinfarktpatienten. Durch Thrombolyse oder Ballondilatation eines verschlossenen Koronargefäßes erzielt, kann sie jedoch selbst zum Organschaden beitragen. Dieser so genannte Reperfusionsschaden manifestiert sich je nach vorangegangener Ischämiedauer in funktionellen oder in strukturellen Schäden. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass während der Reperfusion auftretende Entzündungsreaktionen maßgeblich zu einem myokardialen Reperfusionsschaden beitragen. Diese können durch polymorphkernige Neutrophile (PMNs) hervorgerufen werden. Das erste Ziel dieser Arbeit war es, ein Tiermodell zu etablieren, das die präklinische Prüfung von neuen Therapieansätzen erlaubt, die einen PMN-induzierten Reperfusionsschaden pharmakologisch verhindern. In einem Modell des isoliert-perfundierten Rattenherzens nach Langendorff wurde durch die externe Applikation von humanen PMNs eine mögliche Beteiligung dieser Zellen an der Entstehung eines Reperfusionsschadens nach globaler no-flow-Ischämie untersucht. Hierbei wurden unterschiedliche myokardiale Funktionsparameter, das Ausmaß der Zellschädigung und die myokardiale Konzentration der proinflammatorischen Zytokine Interleukin-1ß (Il-1ß) und Tumor-Nekrose-Faktor-á (TNF-á) erfasst. Die Quantifizierung der Zellschädigung erfolgte mittels histologischer Triphenyltetrazoliumchlorid-(TTC)-Färbung. Ferner wurde aus dem koronarvenösen Effluat die Konzentration der Creatinkinase (CK) und der Lactatdehydrogenase (LDH) bestimmt. Die Reperfusion der Herzen mit PMNs führte im Vergleich zur zellfreien Reperfusion zu einer signifikanten Verschlechterung der linksventrikulären Funktion. Ferner wiesen die PMN-reperfundierten Herzen eine signifikant höhere Zytokinkonzentration auf. Dagegen führte die PMN-Reperfusion lediglich zu einer tendenziellen Erhöhung der myokardialen Zellschädigung. Unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Adhäsionsmolekül CD11/18 auf der Zelloberfläche der PMNs wurde das Modell validiert. Hierbei verminderte die Blockade der CD11/18-vermittelten PMN-Adhäsion an das Koronarendothel sowohl die PMN-induzierte myokardiale Dysfunktion als auch die myokardiale Zytokinkonzentration in den PMN-perfundierten Herzen. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, erstmals die pharmakologische Wirkung des neuen eNOS-Transkriptionsverstärkers S803, auf den PMN-induzierten Reperfusionsschaden in isoliert-perfundierten Rattenherzen zu untersuchen. Um einen in diesem Therapieansatz postulierten NO-abhängigen Mechanismus zu bestätigen, erfolgte eine Bestimmung der myokardialen eNOS-Expression mittels Western-Blot- Analyse. Ferner wurde in einem zusätzlichen Modell mit isoliert-perfundierten Rattenherzen die NO-abhängige Dilatationsfähigkeit der Koronarien untersucht. Darüber hinaus diente der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer Simvastatin, der über die Stabilisierung der eNOS-mRNA zu einer erhöhten NO-Verfügbarkeit führt, als Positivkontrolle für einen NO-abhängigen Wirkungsmechanismus. Die subchronische Gabe des eNOS-Transkriptionsverstärkers S803 führte in den isoliert-perfundierten Herzen zu einer signifikanten Besserung der PMN-induzierten linksventrikulären Dysfunktion und verminderte signifikant die myokardiale Zytokinkonzentration gegenüber den PMN-perfundierten Kontrollherzen. Ferner wurde die eNOS-Proteinexpression in den Herzen signifikant erhöht. Diese Ergebnisse deuten auf eine Verbesserung der PMN-induzierten linksventrikulären Dysfunktion über eine Erhöhung der NO-Verfügbarkeit hin. Diese Hypothese wurde durch die therapeutische Wirksamkeit von Simvastatin im Modell des PMN-reperfundierten Herzens bestätigt. Zudem führte Simvastatin zu einer signifikanten Erhöhung der eNOS-Expression. Des Weiteren war die myokardiale Dilatationsfähigkeit während der reaktiven Hyperämieantwort nach S803- und Simvastatin-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollherzen signifikant verbessert. Durch Gabe des NOSynthasehemmers L-NAME wurde diese im Modell der reaktiven Hyperämie unter S803-Behandlung wieder aufgehoben und bestätigte ebenfalls einen NO-abhängigen Mechanismus. Die verbesserte reaktive Hyperämieantwort unter Simvastatin- Behandlung war dagegen nicht ausschließlich NO-vermittelt. S803, ein neuer eNOS-Transkriptionsverstärker, verbesserte in isoliert-perfundierten Rattenherzen sowohl einen PMN-induzierten Reperfusionsschaden als auch die reaktive Hyperämieantwort. Ferner wies die Substanz in der Vergangenheit in Arteriosklerose-Modellen in ApoE-Knock-out-Mäusen antiarteriosklerotische Wirkungen auf. S803 eröffnet somit einen neuen, vielversprechenden Therapieansatz zur Behandlung koronarer Herzkrankheiten.
Antigen-präsentierende Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer Kontaktallergie. Ziel dieser Arbeit war es, frühe Mechanismen der Signaltransduktion zu identifizieren, die an der Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen durch Kontaktallergene beteiligt sind. · Monocyten und dendritische Zellen wurden auf ihre Eignung als Modell für epidermale Langerhanszellen hin untersucht. Die Aktivierbarkeit von Monocyten und dendritischen Zellen konnte durch den Anstieg der Tyrosinphosphorylierung nach Stimulation mit verschiedenen Kontaktallergenen gezeigt werden. Die durch Kontaktallergene induzierte TNF-alpha-Produktion von dendritischen Zellen belegt die funktionelle Relevanz des Modellsystems. · Ausgehend von der Bedeutung von Cytokinen für die Differenzierung von myeloiden Zellen wurde untersucht, ob Kontaktallergene die mit Cytokin-Rezeptoren assozierten Signalwege des Jak/STAT-Systems aktivieren. Es konnte keine Aktivierung von STAT-Moldekülen (STAT1, 3, 4, 5, 6) durch Kontaktallergene nachgewiesen werden. Daher ist davon auszugehen, daß Kontaktallergene die üblichen Jak/STAT-Signalwege nicht direkt aktivieren, weder durch Bindung an Jak-assoziierte Cytokin-Rezeptoren noch über deren downstream-Elemente. · Die Aktivierung der MAP Kinasen ERK und p38 durch verschiedene Kontaktallergene wurde charakterisiert. MCI/MI und TNCB aktivieren ERK und p38. Nicht alle Kontaktallergene bewirken die gleichen Aktivierungsmuster. Die Phosphorylierung von ERK durch MCI/MI wurde im Vergleich zur Aktivierung von p38 als früher Mechanismus der Signaltransduktion charakterisiert. Die Beteiligung von ERK und p38 an der TNF-alpha-Induktion durch MCI/MI belegt die Relevanz dieser MAP Kinasen für die Aktivierung von dendritischen Zellen. · Weiterhin wurden eine Reihe von upstream-Elementen von ERK untersucht. Die Aktivierung von ERK durch MCI/MI und TNCB verläuft nicht über den klassischen Ras-c-Raf-MEK-ERK Signalweg. Während MEK1/2 an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI und TNCB beteiligt ist, werden c-Raf und Ras nicht aktiviert. · Die intrazelluläre Calcium-Konzentration ist wichtig für die ERK-Aktivierung durch MCI/MI und TNCB, extrazelluläres Calcium dagegen ist nicht erforderlich. Das Modellallergen MCI/MI bewirkt die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium. Der Anstieg von [Ca2+]i allein jedoch löst keine Aktivierung von ERK aus. Das durch MCI/MI induzierte Calcium-Signal wird nicht durch Calmodulin vermittelt. · Durch Inhibition von Proteinkinase C konnte nachgewiesen werden, daß vorwiegend klassische Calcium-abhängige Isoformen der PKC an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI beteiligt sind. Die Translokation von cPKC-Isoformen weist auf deren Aktivierung durch MCI/MI und TNCB hin. Die Inhibition von PI3-Kinase hingegen lieferte keinen Hinweis auf Beteiligung an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte auf der Grundlage der aktuellen Literatur ein möglicher Signalweg der Aktivierung von ERK durch Kontaktallergene entwickelt werden. Auslöser der Signalmechanismen wäre die Kopplung von Haptenen an ein heterodimeres (an die tTG siehe Zahn 2002) oder heterotrimeres G-Protein. Eine wichtige Rolle bei der Signalweiterleitung spielen die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, klassische Isoformen der Proteinkinase C und die MAPK Kinase MEK1/2. Sowohl ERK als auch p38 sind an der Induktion der TNF-alpha-Produktion durch Kontaktallergene in dendritischen Zellen beteiligt. Damit liefert diese Arbeit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der molekularen Mechanismen bei der Aktivierung von dendritischen Zellen durch Kontaktallergene.
Die LC/MS/MS Methoden zur Quantifizierung des selektiven COX-2-Hemmers Celecoxib und des selektiven COX-1-Hemmers SC-560 wurden auf einem Sciex API 3000 Tandem Massenspektrometer mit einer TurboIon Spray Quelle entwickelt und validiert. Für Celecoxib wurden zwei Assays mit internem Standard für die Quantifizierung aus Plasmaproben und ein Assay ohne internen Standard für die Quantifizierung aus Microdialysaten entwickelt. Die Plasmaproben wurden mittels Festphasenextraktion über C18 Material extrahiert. Für die Methode CLX-1 wurde über eine RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Methanol/Wasser/NH4OH 20% 80:20:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 10-1000 ng/ml für Humanplasma und 10-500 ng/ml für Rattenplasma validiert. Für die Methode CLX-2 wurde die Chromatographie mit einer RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 85:15:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml für Humanplasma validiert. Für die Methode CLX-Microdialysate wurde die Elution über eine RP-C18 Säule (70 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 65:25:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min durchgeführt. Das Assay wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml validiert. Die Analytik von SC-560 mittels LC/MS/MS wurde für den Nachweis in Microdialysaten entwickelt. Die Microdialysate wurden mit dem Äquivalenten Volumen Acetonitril verdünnt, um den Analyten vollständig in Lösung bringen zu können. Eine RP-C18 Säule (60 x 1 mm) wurde verwendet und die chromatographische Trennung mit einem Gradientenprogramm durchgeführt. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,5-20 ng/ml für Microdialysate validiert. Die Assays wurden für pharmakologische Untersuchungen zur Wirkung und zum molekularen Wirkmechanismus von selektiven Cyclooxygenasehemmern eingesetzt. Die Rolle der Cyclooxygenase-Isoformen bei der nozizeptiven Transmission im Rückenmark wurde in der ersten Studie untersucht. SC-560 reduzierte das Schmerzverhalten der Tiere und hemmte die spinale Prostaglandinproduktion. Celecoxib hatte auf die Effekte keinen Einfluss. Die Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass die Wirksamkeit von Celecoxib bei Trauma-bedingten Akutschmerzen der Wirksamkeit unselektiv wirkender NSAIDs unterlegen ist. In der zweiten Studie wurden Die Effekte hoher Dosen von Celecoxib untersucht. In Tierversuchen mit Zymosan-induzierten Entzündungen der Hinterpfoten konnte Celecoxib bei 50 mg/kg das Ödem in der Hinterpfote reduzieren, aber nicht bei Dosierungen größer gleich 100 mg/kg. In Zellkultur konnte an Mesangiumzellen der Ratte gezeigt werden, dass eine Dosis von 50 µM Celecoxib den Transskriptionsfaktor NF-_B aktiveren kann. In einer dritten Studie wurde der Einfluss COX-abhängiger und -unabhängiger Mechanismen auf die antiproliferative Wirkung von Celecoxib untersucht. SC-560 und Celecoxib verursachten einen Zellzyklus-Block. Celecoxib beeinflusste die Expression Zellzyklus-regulierender. Celecoxib induzierte Apoptose unabhängig vom COX-2 Status der Zellen. In vivo wurde das Wachstum von COX-2 defizienten Tumoren durch Celecoxib und SC-560 reduziert. Die in vitro und in vivo Daten deuten auf COX-2 unabhängige Mechanismen der antiproliferativen Wirkung von Celecoxib hin.
In den letzten Jahren gewann die Photodynamische Therapie deutlich an Bedeutung bei der Behandlung von Neoplasien. Für die nächsten Jahren werden weitere Zulassungen für neue Indikationen erwartet. Diese Neuzulassungen werden einerseits durch neue Photosensibilisatoren und andererseits durch neue Ansätze beim Drug Targeting ermöglicht. Zur Zeit wird der Ansatz forciert, die Sensibilisatoren an einen tumorspezifischen Antikörper zu knüpfen. Eine weitere Möglichkeit für das Drug Targeting besteht darin, den Photosensibilisator an tumorspezifische Rezeptorliganden zu binden. In der vorliegenden Dissertation wird der Versuch einer Kopplung eines Photosensibilisators über einen Spacer an ein nicht steroidales Antiprogestin erarbeitet. Der Progesteron-Rezeptor wurde als Target ausgewählt, da zahlreiche Tumorarten, wie beispielsweise das Mammakarzinom, den Progesteron-Rezeptor überexprimieren. Als Leitstruktur für die Synthese der Antiprogestine wurde ein mariner Naturstoff ausgewählt. Das Cyclocymopol-Derivat besitzt den Vorteil einer im Vergleich zu Mifepriston verbesserten Selektivität für den Progesteron-Rezeptor und eines einfacheren synthetischen Zugangs. Für die Erstellung einer Bibliothek von Progesteron-Antagonisten, die auf den Cyclocymopol-Derivaten aufbauen, sind hinsichtlich der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei Merkmale zu beachten. Der aromatische Ring muss eine elektronenziehende Gruppe, der aliphatische Ring eine exocyclische Methylengruppe aufweisen, da diese Gruppen essentiell für die Rezeptorbindung sind. Bei der Synthese des Progesteron-Antagonisten wird zunächst ein Benzaldehyd-Derivat mit dem gewünschten Spacer verknüpft, der in der Folge mit dem Phototherapeutikum verknüpft werden kann. Im nächsten Schritt wird die Aldehydfunktion mit Natriumborhydrid zur Alkoholfunktion reduziert. Die so erhaltenen Alkohole werden anschließend mit Hilfe einer Appelartigen Reaktion in das Bromid überführt. Die Benzylbromide wurden mit Isophoron und Buthyllithium zu dem Naturstoff-Analoga umgesetzt. Durch Variieren der Reaktionsbedingungen konnten die aus der Literatur bekannten Ausbeuten erhöht werden. Für die Einführung der exocyclischen Methylengruppe in die Naturstoff-Derivate mussten zunächst verschiedene Synthesenmethoden untersucht werden. In der Literatur wurde für diesen Synthesewege bisher das Tebbe Reagenz eingesetzt, welches bei den hier eingesetzten Edukten zu keiner Reaktion führte. Es kann vermutet werden, dass die sterische Hinderung durch den Spacer die Umsetzung blockiert. In weiteren Experimenten wurde versucht, über eine Simmons-Smith-ähnliche Reaktion die gewünschte Funktionalität zu erhalten. Da auch bei dieser Reaktion das gewünschte Produkt nicht erhalten werden konnte, wurde in weiteren Ansätzen die Peterson-Olefinierung ausgewählt. Mit dieser Methode gelang es schließlich, geringe Mengen des gewünschten Produktes herzustellen. Als Nebenreaktion kam es dabei jedoch zu einer Methylierung des aromatischen Rings. Durch Anwendung der Horner-Emmons-Reaktion konnte schließlich das Antiproestin in ausreichender Menge und Reinheit erhalten werden. Es war jedoch nicht möglich, das in Abb. 7 erläuterte Zielmolekül aus dem Photosensibilisator, Spacer und Antiprogestin darzustellen.
Die Hyperhomocysteinämie wird als unabhängiger Risikofaktor atherosklerotischer Gefäßerkrankungen angesehen. Viele Studien haben eine deutliche Korrelation zwischen Hyperhomocysteinämie, koronarer Herzkrankheit, cerebrovaskulären und peripheren thromboembolischen Erkrankungen aufgezeigt. Aus diesem Grund hat natürlich die Homocysteinbestimmung in die diagnostischen Maßnahmen, die bei Verdacht auf Arteriosklerose durchgeführt werden, Eingang gefunden. Mit der Zielsetzung, ein zuverlässiges und standardisiertes Verfahren für die Routinediagnostik bereitzustellen, wurde im Rahmen dieser Dissertation eine quantitative HPLC-Methode zur Bestimmung von Homocystein im Blut etabliert. Weiterhin erfolgte auch eine Homocysteinbestimmung mit dem ELISA und im Anschluß daran ein Methodenvergleich zwischen HPLC und ELISA. Der Methodenvergleich ergab, daß die ELISA-Homocysteinwerte immer um etwa 4,77% niedriger lagen als die HPLC-Homocysteinwerte. Dies bestätigte auch die Literatur. Die wichtigste Aufgabenstellung dieser Doktorarbeit war allerdings die Suche nach einer neuen genetischen Mutation auf dem MTHFR-Gen mittels Probenscreening von Patienten mit Hyperhomocysteinämien. Die katalytische Domäne der MTHFR liegt im N-terminalen Bereich des Proteins. Dieser Bereich entspricht Exon 1 bis Exon 6 des MTHFR-Gens. Folglich wurde für diese Exonbereiche 1,2,3,4,5 und 6 das Mutationsscreening etabliert. Dieses ließ sich mit der Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) erfolgreich durchführen, wobei für jeden Exonbereich 300 Proben aus der Luric-Studie durchgemessen worden sind. LURIC steht für LUdwigshafener RIsikofaktor- und Cardiovaskuläre Gesundheits-Studie. Das Ziel dieser Untersuchungen ist das Erkennen neuer Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere die zum Herzinfarkt führen. Für alle Probenwerte erhielten wir Angaben über Geschlecht, Geburtsdatum, Größe, Gewicht, KHK-Status, Hypertonie, Diabetes mellitus, Homocystein, Vitamin B6, Vitamin B12 und Folsäure. Nach eingehender Betrachtung ließen sich nun drei Kollektive mit unterschiedlichen Homocystein-/ Folsäurewerten ermitteln, welche dann durchgescreent wurden: Das erste Kollektiv erfaßt Homocysteinwerte, welche größer als 16µmol/l sind und zwar unabhängig von den Folsäurewerten. Das zweite Kollektiv enthält Homocysteinwerte, welche größer als 10µmol/l sind und Folsäurewerte, welche ebenfalls größer als 10 µmol/l sind. Das dritte Kollektiv ist das größte und enthält die übrigen Werte, welche negativ auf schon bekannte Mutationen auf Exon 4 und Exon 7 sind. Dieses Kollektiv wurde hier zunächst betrachtet und enthält etwa für jeden Exonbereich 200 Proben. Bei jeder Art von Korrelationsuntersuchungen in den einzelnen Kollektiven (1. Kollekiv, 2. Kollektiv, 3. Kollektiv, homozygotes Kollektiv, heterozygotes Kollektiv und Referenzkollektiv) konnte zwischen Homocystein und Folsäure, zwischen Homocystein und Vitamin B12, zwischen Homocystein und Vitamin B6 und Homocystein und dem Alter keine Korrelation festgestellt werden. Die Korrelationen lagen alle unter -0,5 und 0,3. Einen negativen Korrelationskoeffizienten weisen die Parameter Homocystein/Folsäure, Homocystein/Vitamin B12 und Homocystein/Vitamin B6 auf. Einen positiven Korrelationskoeffizienten weisen Homocystein und das Alter auf. Bei den Signifikanzuntersuchungen ergab sich, daß fast alle Mittelwerte der einzelnen Kollektive signifikant unterschiedlich sind. Die Mittelwerte aller Kollektive von Folsäure/Homocystein, Vitamin B12/Homocystein und das Alter/Homocystein sind signifikant unterschiedlich Nur bei dem Vergleich Vitamin B6/Homocystein ist bei den meisten Kollektiven keine Signifikanz festgestellt worden. D. h. diese Mittelwerte sind annähernd gleich, sie sind nicht bedeutend unterschiedlich. Nur das 1. Kollektiv und das homozygote Kollektiv sind bei dem Vergleich der Mittelwerte Vitamin B6/Homocystein signifikant unterschiedlich. Mit Hilfe der TGGE und anschließender Sequenzierung konnten drei verschiedene Mutationen identifiziert werden: Auf Exon 4 ließ sich eine bekannte Mutation und zwar die (C-677-T) mit dem Basenaustausch Alanin gegen Valin an Patient 540 und Patient 786 feststellen. Dies ließ sich auch durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Hinfl bestätigen. Auf Exon 6 konnte eine stille Mutation mit dem Basenaustausch (T-1068-C) an zwei Patienten (762 und 624) identifiziert werden. Die Aminosäure Serin bleibt hierbei erhalten (AGT-AGC). Auf Exon 5 ließ sich eine interessante Mutation erkennen, welche weitere Messungen wie Enzymaktivität und Familienanamnesen erfordert. Am Patient 569 entsteht hier durch einen Basenaustausch (C-844-T) aus der Aminosäure Glutamin (CAG) ein Stopcodon (TAG). Dies ließ sich weiterhin durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Mae III bestätigen. Erhöhte Homocysteinspiegel und reduzierte MTHFR-Aktivitäten erklären ebenfalls das Mutationsergebnis. Auch die Familienanamnese ergab eine interessante Entdeckung. Die gleiche Mutation (C-844-T) vom Patienten 569 ließ sich auch bei seinem Bruder feststellen. Damit wurde die Mutation vererbt und ereignete sich nicht spontan.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine Superfamilie von plasmamembranständigen Proteinen. Die chemische Vielfalt ihrer Aktivatoren macht sie zu der größten und variantenreichsten Proteinfamilie mehrzelliger Organismen. Moderne Klonierungstechniken sowie der Abschluß der Humangenom-Sequenzierung im Jahr 2001 haben die Existenz von ca. 140 unbekannten GPCR-Sequenzen offengelegt, denen bislang weder ein natürlicher Ligand noch eine physiologische Funktion zugeordnet werden konnte. Sie werden daher als orphan Rezeptoren (engl.: Waisenkind) bezeichnet. Mehr als 30% der auf dem internationalen Pharma-Markt zugelassenen Substanzen sind GPCRWirkstoffe mit einem Jahresumsatz (2000) von 23,5 Mrd. US-$ (Wise et al., 2002). Aufgrund der großen wirtschaftlichen Bedeutung dieser Rezeptorfamilie ist es verständlich, daß die pharmazeutische Forschung mit hohem Aufwand an der Ligandenidentifizierung von orphan GPCRs arbeitet und die Ergebnisse patentrechtlich absichert. Die unter den Begriffen Reverse Pharmakologie und Orphan Rezeptor Strategie zusammengefaßte, praktische Wirkstoffentwicklung an orphan GPCRs vereinigt Techniken aus Bioinformatik, Zell- und Molekularbiologie, Biochemie und Pharmakologie. Im Zentrum dieser Arbeit stehen die humanen orphan Rezeptoren gpr3 (Iismaa et al., 1994), gpr6 (Heiber et al., 1995) und gpr12 (Song et al., 1995). Die Sequenz-Identität beträgt 57-61% auf der Proteinebene, und das deutet auf eine neue GPCR-Subfamilie hin. Aufgrund dominanter Präsenz von gpr3-, 6- und 12-mRNA-Transkripten im ZNS ist bislang ein Ligand mit neuromodulatorischen Eigenschaften vermutet worden. Eggerickx et al., 1995 zeigen, daß gpr3-transfizierte COS-7-Zellen konstitutiv, d.h. Agonist-unabhängig, die Adenylat-Zyklase aktivieren und so zu basal erhöhten cAMP-Spiegeln führen. Die Autoren vermuten die Ursache der Agonist-Unabhängigkeit entweder in einer basalen Aktivierung durch einen ubiquitären Serumfaktor im Kulturmedium oder in einer starken Überexpression im COS-7-Zellmodell. Bioinformatische Analysen im Vorfeld dieser Arbeit (Dr. Gassenhuber, Aventis Pharma, 2000) zeigen große Ähnlichkeiten von gpr3, 6 und 12 zu der Cannabinoid (cb)- und zu der endothelial differentiation gene (edg)-Lipidrezeptorfamilie von 42-44% auf der Proteinebene, und das deutet auf ein Lipid als potentiellen Liganden hin. Die edg-Rezeptoren regulieren über die bioaktiven Lipid-Mediatoren Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Lysophosphatidsäure (LPA) zentrale physiologische Funktionen im Rahmen von Proliferation und Zelldifferenzierung sowie eine Vielzahl kardiovaskulärer Effekte (z.B. Plättchenaktivierung, Schutz des Endothels vor Apoptose, Angiogenese, negative Chronotropie, Entwicklung des Herzens etc.). Aventis Pharma Deutschland GmbH beschäftigt sich u.a. mit der molekularbiologischen und pharmakologischen Charakterisierung dieser kardiovaskulären Effekte. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit besteht darin, zu klären, ob auch die orphan Rezeptoren gpr3, 6 und 12 über bioaktive Lipide und eine zusätzliche Expression in peripheren, Herz-Kreislauf-relevanten Organen eine Rolle spielen. Die Ergebnisse dieser Arbeit identifizieren gpr3, 6 und 12 als eine Familie von konstitutiv aktiven Rezeptoren, wobei die konstitutive Aktivierung unabhängig vom Rezeptor-Subtyp, der Spezies oder dem Zelltyp ist. Die Beobachtung, daß HEK293-Zellen, die mit den potentiellen Lipidrezeptoren gpr3, 6 und 12 transfiziert wurden, in lipidfreiem Medium (Aktivkohle-resorbiertes Serum) reduzierte, basale cAMP-Spiegel zeigen, führt zu der Schlußfolgerung, daß zumindest ein Teil der konstitutiven Aktivität auf ein Lipid des Serums zurückzuführen sein muß. In second messenger-Assays sind die bioaktiven Lipide S1P und Dihydro-S1P (DHS1P) als Modulatoren der konstitutiven gpr3-, 6- und 12-Aktivität identifiziert und funktionell charakterisiert worden. S1P- und DHS1P-Wirkungen an diesen Rezeptoren induzieren in HEK293-Zellen sowohl eine Ca2 -Mobilisierung (EC50 = 50-100nM), eine Stimulation der Adenylat-Zyklase als auch eine funktionelle Internalisierung eines Fusionskonstruktes aus gpr6 mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP). Das im Rahmen dieser Arbeit klonierte gpr3-Homologe der Ratte (Acc.Nr.: AJ427482) läßt sich ebenfalls durch S1P und DHS1P in funktionellen Ca2 - und cAMP-Assays anschalten. Eine Substanz-Bibliothek mit 200 bioaktiven Lipiden bestätigt die Wirksamkeit von S1P und DHS1P und liefert darüber hinaus keinen weiteren Liganden mit agonistischen Eigenschaften an den humanen Rezeptoren gpr3, 6 und 12. Expressionsprofile von gpr3, 6 und 12 sind mittels Nachweismethoden auf mRNA- (RT-PCR, Echtzeit- Taqman-PCR, Northern Blot, RNA-Chip) und Proteinebene (Western Blot) erstellt worden. Sie konnten mit Informationen aus der LifeSpan Bioscience-Datenbank (www.isbio.com) ergänzt werden, die ein immunhistologisches Profil des humanen Rezeptors gpr12 im gesunden und kranken Gewebe zur Verfügung stellt. Der Nachweis von gpr3-, 6- und 12-mRNA-Transkripten und Proteinen in einer Vielzahl humaner peripherer Organe und in isolierten Zellsystemen des Herz-Kreislauf- (Herz, Niere, Endothel- und glatte Gefäßmuskelzellen, Blutplättchen) und Immunsystems (Milz, Thymus, Leukozyten) weist eindeutig auf zusätzliche, periphere Funktionen dieser Rezeptorfamilie hin. Dies untermauert die kardiovaskuläre Relevanz, die bereits aufgrund des Liganden S1P zu vermuten war. In einem endothelialen Funktionsmodell, bei dem der pulsierende Blutstrom im Gefäßlumen simuliert wird (Scherstress), wird der Rezeptor gpr3 um den Faktor 2 auf Proteinebene hochreguliert. Es ist jedoch offen, ob diese Regulation auf eine Schutzfunktion im Endothel oder auf eine funktionelle Gegenregulation zurückzuführen ist. Zur Klärung dieser Frage sind Antisense-Oligonukleotide gegen den Rezeptor gpr3 getestet worden; eine Reduktion des gpr3-Proteinniveaus konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren die humanen orphan Rezeptoren gpr3, 6 und 12 als weitere Mitglieder einer kontinuierlich wachsenden Lipidrezeptorfamilie. Es ist ein wesentlicher Schwerpunkt zukünftiger Studien, diesen für die Herz-Kreislauf-Forschung interessanten Rezeptoren eine physiologische bzw. pathophysiologische Funktion zuzuordnen.
Die exzessive Bildung und Ablagerung von aggregiertem Amyloid beta-Peptid im Gehirn von Alzheimer Patienten wird allgemein als zentrales Ereignis im Rahmen des Neurodegenerationsprozesses der Alzheimer Demenz betrachtet. Der Amyloid-Stoffwechsel ist dabei in sehr vielfältiger Weise mit dem zellulären Cholesterol-Stoffwechsel verknüpft. Hohe Cholesterolspiegel in spezifischen Membrandomänen wie Lipid-Rafts forcieren sehr wahrscheinlich die zelluläre Produktion als auch die Fibrillogenese von Amyloid beta-Peptid. Umgekehrt schützt ein hoher Membrancholesterol-Gehalt aber auch vor den toxischen Effekten von aggregiertem Aß. Durch Modulation des Cholesterolgehalts von Hirnmembranen mit MßCD und seinen Cholesterol-Komplexverbindungen in vitro sowie mit Statinen in vivo konnten wir zeigen, daß beide Substanzklassen verschiedene membranäre Cholesterol-Pools beeinflussen, die gleichfalls an der Vermittlung zytotoxischer Amyloid- Effekte in unterschiedlicher Weise beteiligt sind. Wir konnten weiterhin erstmals nachweisen, daß sowohl hydrophile als auch lipophile Statine in vivo einen unmittelbaren Einfluß auf die zerebrale Membrancholesterol-Homöostase nehmen und dabei vermutlich membranäre Raft- Strukturen im exofacialen Membranblatt verändern, die favorisierte Orte der zellulären APP-Prozessierung bzw- Amyloidbildung sind. Aus diesem Wirkmechanismus leitet sich womöglich der für bestimmte Statine berichtete neuroprotektive Effekt bei AD in retrospektiven Humanstudien ab, der sich durch eine reine Cholesterolsenkung in spezifischen Bereichen des ZNS nicht erklären läßt. Ob einzelne Statine in ausreichender Konzentration direkt ins Gehirn vordringen und dort teilweise Isoprenoid-abhängige Signalkaskaden induzieren, oder ihre zentralen Effekte indirekt an der BHS vermitteln, ist unklar. Unsere Daten stützen nachhaltig die Hypothese, daß die sporadische Alzheimer Demenz vergleichbar der Niemann-Pick Typ C-Krankheit auf einer Dysregulation der zellulären Cholesterolverteilung beruht, die durch spezifische Risikofaktoren wie das Alter oder den apoE4-Genotyp gefördert wird. Substanzen, die gezielt in Mechanismen der fehlgesteuerten zellulären Lipid-Distribution und Kompartimentierung eingreifen, sind somit potentielle Wirkstoffe in der Therapie der Alzheimer Demenz.