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Es ist bekannt, dass Curcumin in einer Vielzahl verschiedener Zellarten die Proliferation hemmt und Apoptose induziert. In der Literatur werden Konzentrationen von 10 bis 150 µM (3.7-55 µg/ml) als dafür notwendig beschrieben. Da Curcumin nach oraler Aufnahme, aufgrund seiner schlechten Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt, eine geringe Bioverfügbarkeit im Organismus aufweist, sind therapeutische Lösungen erforderlich um Curcumin besser nutzen zu können. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Wirkung von geringen Mengen Curcumin, die allein keine Effekte zur Folge haben, in Zusammenwirkung mit Licht untersucht. Es wurde gezeigt, dass bereits Konzentrationen von 0,2-1 µg/ml in Keratinozyten die Proliferation hemmen, wenn sie mit UVA- oder sichtbarer Licht-Bestrahlung kombiniert werden. Desweiteren wurde belegt, dass diese Behandlung Apoptose in HaCaT-Zellen induziert, wobei der mitochondriale Apoptoseapparat aktiviert wird. Dies belegen die Freisetzung von Cytochrom c und die frühe Spaltung der Caspase-9 wohingegen Caspase-8 zeitverzögert aktiviert wurde. Weiterhin wurde dargelegt, dass Erk1/2, PKB/Akt und PKC durch Curcumin/Licht gehemmt werden, wohingegen p38 durch diese Behandlung eine Aktivierung erfährt. Zusätzlich ergab sich ein inhibierender Einfluss auf den EGF-Rezeptor, einem “upstream”-Regulator all dieser Kinasen, und den Transkriptionsfaktor NF-kappaB. Bei in vivo-Studien an immundefizienten Mäusen mit A431-Xenografts hatte eine Behandlung mit i.p. verabreichtem Curcumin und anschließender Bestrahlung mit sichtbarem Licht einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf das Tumorwachstum zur Folge. In diesen Tumoren fand eine Reduktion der Ki-67-Expression sowie eine Induktion von „apoptotic bodies“ statt. Western Blot-Analysen bestätigten die Apoptoseinduktion durch eine verstärkte Aktivierung der Caspase-9. Zusätzlich zeigte sich auch eine Hemmung von Erk1/2 sowie EGF-R nach beschriebener Behandlung in den Tumoren. Die Wirkungsweise des Curcumins in Kombination mit Licht in vitro wie auch in vivo weisen auf einen neuen therapeutischen Ansatz einer photodynamischen Therapie hin. Dabei kann durch die Verwendung von sichtbarem Licht auf den Einsatz der karzinogenen UV-Bestrahlung, wie sie in üblichen Phototherapien angewandt wird, verzichtet werden.
Genetic analysis of salt adaptation in Methanosarcina mazei Gö1 : the role of abl, ota and otb genes
(2008)
1. M. mazei ist ein halotolerantes methanogenes Archäon und akkumuliert kompatible Solute als längerfristige Anpassung an erhöhte Osmolarität in der Umgebung. Bei intermediären Salzkonzentrationen (~ 400 mM NaCl) wird vorzugsweise α-Glutamat gebildet und bei höheren Salzkonzentrationen (~ 800 mM NaCl) wird Nε-Acetyl-ß-Lysin zusätzlich zu Alpha-Glutamat synthetisiert. 2. Eine Analyse der intrazellulären Solutezusammensetzung mittels NMR ergab, dass M. mazei Glycin-Betain als Osmolyt akkumulieren kann. Für die Aufnahme von Glycin-Betain konnten zwei putative Glycin-Betain-Transporter in M. mazei identifiziert werden, Ota und Otb. Ota steht für „osmoprotectant transporter A“ und Otb für „osmoprotectant transporter B“. Das Genom von M. mazei wurde, nachdem es vollstänidg sequenziert war, nach Genen durchsucht, die eine Rolle bei der Aufnhame von Glycin-Betain oder anderen kompabtiblen Solute spielen könnten. Dafür wurde die Sequenz eines Substratbindeproteins eines bekannten bakteriellen Glycin-Betain-Transporters, opuAC aus B. subtillis als Referenzsequenz verwendet. Hierbei konnte ein Homolog, otaC, in M. mazei identifiziert werden. otaC ist Teil eines Genclusters, welches für einen ABC-Transporter kodiert. otb wurde bei einer genomweiten Expressionsanalyse zur Salzadaptation von M. mazei identifiziert. Es wurden Gene eines putativen ABC-Transporters identifiziert, die unter Hochsalzbedingungen leicht induziert waren. Es stellte sich heraus, dass es sich hierbei um einen zweiten putativen Glycin-Betain-Transporter handelte. Otb gehört auch zur Familie der ABC-Transporter. Vergleichsanalysen zeigten, dass die beiden Transporter keine große Ähnlichkeit zueinander aufweisen. Die Funktion und Rolle der beiden ABC-Transporter, vor allem von Otb, war zu Beginn dieser Arbeit unklar. 3. Bei Analysen des intrazellulären Solutepools im Wildtyp von M. mazei stellte sich heraus, dass in Anwesenheit von Glycin-Betain die Konzentration von Glutamat und NE- Acetyl-ß-Lysin verringert war. Bei 400 mM NaCl reduzierte Glycin-Betain die Glutamat- Konzentration um 16% und bei 800 mM NaCl um 29%. Besonders deutlich zeigte sich der Einfluß von Glycin-Betain bei der Akkumulation von NE-Acetyl-ß-Lysin. Bei 400 mM NaCl reduzierte Glycin-Betain die Konzentration an NE-Acetyl-ß-Lysin um 60% und bei 800 mM NaCl um 50%. Der Einfluß von Glycin-Betain konnte auf verschiedenen Ebenen in M. mazei beobachten werden. Es konnte gezeigt werden, dass die relative Transkriptimenge von ota unter Hochsalzbedingungen zunimmt. Glycin-Betain reduzierte die Transkription von ota bei verschiedenen Salzkonzentrationen. Die relative Transkriptmenge an mRNA von ota wurde mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCR) quantifiziert und war bis zu 52% reduziert in Zellen, die in Gegenwart von Glycin-Betain gewachsen waren. Die Transkriptmenge von otb war unter den gleichen Bedingungen nicht beeinflusst und zeigte generell keine Zunahme mit der Salinität des Mediums. Des Weiteren konnte ein Effekt von Glycin-Betain auf Ebene der Transportaktivität von Ota gezeigt werden. Hier zeigte sich, dass Zellen, die bei 400 mM NaCl in Gegenwart von Glycin-Betain gezogen waren, eine geringere Transportaktivität aufweisen, als Zellen, die bei 400 mM NaCl ohne Glycin-Betain gewachsen waren. Die Transportaktivität war um 90% geringer. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass es sich bei den Zellen, die ohne Glycin-Betain gewachsen waren, um eine Nettoaufnahme von Glycin-Betain handelte. Im Gegensatz dazu, ist davon auszugehen, dass Zellen, die in Gegenwart von Glycin-Betain gewachsen waren, eine Austaschreaktion zwischen bereits vorhandenem intrazellulärem und extrazellulär angebotenem Glycin-Betain vornehmen. [Die dem letzten Punkt zugrundeliegenden Daten wurden von Silke Schmidt im Rahmen einer Diplomarbeit erhoben, die von mir mitbetreut wurde. Aus Gründen der vollständigen Darstellung des Projektverlaufes werden diese Daten mitaufgeführt.] 4. Zur weiteren Klärung der Rolle und Funktion der beiden putativen Glycin-Betain- Transporter Ota und Otb war es Ziel, Mutantenstudien durchzuführen. Eine Vorraussetzung für die Generierung von Mutanten ist, dass der Organismus auf Agarplatten wächst und Einzelkolonien von einer einzelnen Zelle ausgehend bildet. Dies ist ein wichtiger Punkt bei Methanosarcina spp., die Zellpakete, sogenannte Sarcinen bilden. Deshalb wurde zunächst nach den optimalsten Plattierungsbedingungen gesucht, unter denen M. mazei keine Sarcinen bildet und die Plattierungseffizienz am höchsten war. Die Plattierungseffizienz betrug im Durchschnitt 54%. Für das Einbringen von DNA in die Zellen wurde eine Liposomen-vermittelte Transformation getestet. Ein ähnliches Vorgehen war bereits für Methanosarcina acetivorans beschrieben, konnte bislang aber noch nicht erfolgreich für M. mazei Gö1 und andere Stämme von M. mazei angwendet werden. Erste Schritte zur Anpassung des Transformations-Protokolles beinhalteten das Testen von DOTAP verschiedener Hersteller, sowie die Konzentration an eingesetzter DNA. Das jeweilige Zielgen/Zieloperon, welches deletiert werden sollte, wurde durch eine pac-Kassette ersetzt. Diese kodiert für eine Puromycin-Transacetylase und verleiht dem Organismus Puromycin- Resistenz. Die pac-Kassette wurde von umgebenden Bereichen des Ziellocus flankiert und integrierte mit Hilfe dieser flankierenden Bereiche über doppelt-homologe Rekombination in das Genom. 5. Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurden ota::pac- und otb::pac-Mutanten erzeugt und über Southern-Blot Analyse verifiziert. Eine erste Charakterisierung der Mutanten mittels qRT-PCR zeigte, dass auf mRNA-Ebene keine Transkripte von ota in M. mazei ota::pac oder otb in M. mazei otb::pac nachweisbar waren. Zusätzlich konnte auf Proteinebene das Substratbindeprotein OtaC in M. mazei ota::pac und OtbC in M. mazei otb::pac nicht über einen Antikörper gegen das jeweilige Substratbindeprotein nachgewiesen, was die erfolgreiche Deletion bestätigte. Erste phänotypische Charakterisierungen zeigten, dass das Wachstum von M. mazei ota::pac und M. mazei otb::pac unter Hochsalzbedingungen nicht beeinträchtigt und vergleichbar mit dem des Wildtyps war. Auch bei kälteren Wachstumstemperaturen von 22°C wuchsen die Mutanten ohne Phänotyp. 6. Radioaktive Transportstudien mit M. mazei otb::pac zeigten, dass diese Mutante, die noch ein funktionelles Ota besitzt, [14C]Glycin-Betain aufnehmen kann. Es stellte sich heraus, dass diese Mutante eine höhere Transportrate für Glycin-Betain aufwies, als der Wildtyp. Die Aufnahmerate war um einen Faktor 2 höher als beim Wildtyp. Zusätzlich konnten qRT-PCR Analysen zeigen, dass die relative Transkriptmenge an ota in der otb::pac-Mutante um einen Faktor 2 höher war, als im Wildtyp. Umgekehrt konnte dieser Effekt nicht beobachtet werden, d.h. eine erhöhte Transkriptmenge an otb in M. mazei ota::pac. Auf Proteinebene konnte beobachtet werden, dass die intrazelluläre Konzentration an OtaC in der Mutatne leicht höher war als im Wildtyp. Jedoch stellte sich heraus, dass die intrazelluläre Glycin-Betain-Konzentration bei 400 mM NaCl in der Mutante nicht erhöht war verglichen mit Wildtyp, sondern die Konzentrationen gleich waren. Bei höheren Salzkonzentrationen (800 mM NaCl) zeigte sich jedoch ein anderes Bild: die intrazelluläre Glycin-Betain-Konzentration war in der Mutante um 60% erhöht. Dies könnte auf die erhöhte Transportaktivität von M. mazei otb::pac zurückzuführen sein. Die Konzentration anderer kompatibler Solute wie Glutamat und NE-Acetyl-ß-Lysin waren in diesen Zellen bis zu 48% reduziert. In vorherigen Studien konnte gezeigt werden, dass heterolog überproduziertes Ota von M. mazei in E. coli MKH13, eine E. coli-Mutante, die keine Glycin-Betain-Transporter mehr besitzt, die Aufnahme von Glycin-Betain wieder herstellen konnte [die Daten von ota in E. coli MKH13 wurden in der bereits oben erwähnten Diplomarbeit von Silke Schmidt erhoben]. Zur Klärung der Funktion von Otb wurde der gleiche Versuch mit otb in E. coli MKH13 durchgeführt. Jedoch konnte eine heterologe Produktion von Otb aus M. mazei die Aufnahme von Glycin-Betain in E. coli MKH13 nicht wieder herstellen. Hierbei wurde über Western-Blot Analyse sichergestellt, dass Otb tatsächlich in der Membran vorhanden war. Auch Transportstudien mit der Mutante M. mazei ota::pac zeigten, dass diese Mutante kein [14C]Glycin-Betain mehr aufnehmen konnte. Es konnte auch keine Akkumulation von Glycin-Betain mittels NMR in dieser Mutante gemessen werden. Des Weiteren zeigte sich, dass die intrazellulären Konzentrationen an Glutamat und Nε-Acetyl-ß-Lysin bei 400 mM und 800 mM NaCl in der Mutante unbeeinflusst von der Glycin-Betain-Konzentration im Medium waren. Weitere Transportstudien mit M. mazei ota::pac zur Aufnahme von [14C]Cholin zeigten, dass dieses Molekül weder vom Wildtyp, noch von der Mutante aufgenommen wurde. Dieses Ergebnis wurde durch Messung des Solutepools mittels NMR bestätigt. Somit kann ausgeschlossen werden, dass Otb unter den gemessenen Bedingungen weder ein Glycin- Betain-Transporter noch ein Cholin-Transporter in M. mazei ist. Diese Beobachtungen belegen eindeutig, dass Ota der einzige funktionelle Glycin-Betain-Transporter in M. mazei ist, während die Rolle von Otb bislang noch ungeklärt ist. 7. Nε-Acetyl-ß-Lysin, das dominante kompatible Solut in M. mazei bei 800 mM NaCl, wird durch die Enzyme AblA, einer Lysin-2,3-Aminomutase und AblB, einer ß-Lysin- Acetyltransferase synthetisiert. In dieser Arbeit wurde eine Δabl::pac-Mutante generiert, um die Fragen zu klären, ob die beiden Enzyme vom postulierten abl-Operon kodiert werden und wenn ja, welchen Phänotyp eine Nε-Acetyl-ß-Lysin-freier-Mutante bei Salzstress zeigt. NMR-Analysen zeigten, dass in der abl::pac-Mutante kein Nε-Acetyl-ß-Lysin mehr nachweisbar war. Dies belegt, dass die Gene ablA und ablB und deren Genprodukte für die Synthese von NE-Acetyl-ß-Lysin in M. mazei essentiell sind. Unter Hochsalzbedingungen ist das Wachstum von M. mazei abl::pac im Vergleich zum Wildtyp deutlich verlangsamt. Dieses Ergebnis war unerwartet, da eine abl::pac-Mutante von Methanococcus maripaludis unter Hochsalzbedingungen nicht mehr wachsen konnte. Unter Niedrigsalz und bei intermediären Salzkonzentration war das Wachstum von M. mazei abl::pac nicht eingeschränkt und verhielt sich wie der Wildtyp. In Gegenwart von Glycin-Betain akkumulierte die abl::pac-Mutante von M. mazei unter Hochsalzbedingungen 2,4 mal mehr Glycin-Betain als der Wildtyp, um das Defizit im Solutepool auszugleichen und Wachstum bei Hochsalz zu ermöglichen. Dadurch war sie in der Lage, wieder wie der Wildtyp zu wachsen. 8. Der Verlust von NE-Acetyl-ß-Lysin wurde unter Hochsalzbedingungen durch erhöhte Konzentrationen an Glutamat und einem neuen kompatiblen Solut kompensiert. NMRAnalysen zeigten, dass es sich hierbei um Alanin handelte. Bis jetzt wurde die Verwendung von Alanin als kompatibles Solut noch nie beschrieben. Um sicherzustellen, dass Alanin als kompatibles Solut in M. mazei abl::pac dient, wurde die Konzentration bei verschiedenen Salzkonzentrationen gemessen. Die Konzentration an Alanin nahm mit steigender Salzkonzentration zu. Bei 800 mM NaCl war die Konzentration 12 fach erhöht verglichen mit der Konzentration bei 400 mM NaCl. Außerdem redzierte Glycin-Betain die Alanin- Konzentration bei 800 mM NaCl um 58%. Transportexperimente zeigten, dass M. mazei kein Alanin aus dem Medium aufnehmen kann. 9. Erste Analysen möglicher Synthesewege für Alanin zeigten, dass die Alanin- Dehydrogenase nicht auf Transkriptebene unter Hochsalzbedingungen induziert war und somit keine Rolle in der Synthese von Alanin als kompatibles Solut spielen dürfte. Es könnten jedoch Aminotransferasen eine Rolle bei der Biosynthese von Alanin spielen. Des Weiteren sind die Enzyme, die für die Synthese von Glutamat als kompatibles Solut verantwortlich sind, unbekannt. Dies gilt für alle bis jetzt untersuchten Organismen, die Glutamat als kompatibles Solut nutzen. In dieser Arbeit wurde versucht, mit Hilfe der abl::pac-Mutante, die erhöhte Glutamat-Mengen zum Osmoschutz produziert, der Frage nachzugehen, welche Gene/Enzyme eine Rolle spielen könnten bei der Synthese von Glutamat als kompatibles Solut. Dazu wurden unter Hochsalzbedingungen die Transkriptmengen verschiedener Genen, die an der Glutamat-Synthese beteiligt sein könnten, in der Mutante und im Wildtyp untersucht. Hierbei zeigte sich, dass mehrere Gene verschiedener Enzyme unter Hochsalzbedingungen in der Mutante leicht induziert waren. Eines dieser Enzyme ist die Glutaminsynthetase. Dieses Enzym ist für die Umsetzung von Glutamat zu Glutamin unter Verbrauch von ATP verantwortlich. M. mazei besitzt zwei Gene, die für eine putative Gluaminsynthetase kodieren. In M. mazei abl::pac ist unter Hochsalzbedingungen das Gen glnA2 im Vergleich zum Wildtyp (4,03 ± 1,14) leicht induziert (7,63 ± 2,2). Des weiteren konnte in der Mutante eine leichte Induktion von gltB1, gltB2 und gltB3 unter Hochsalz beobachtet werden. Diese Gene kodieren für die einzelnen Domänen einer Glutamatsynthase. Diese ersten Analysen geben einen Hinweis darauf, dass die Synthese von Glutamat als kompatibles Solut über eine gekoppelte Reaktion der Glutaminsynthetase und der Glutamatsynthase verlaufen könnte.
Die Onkogenese geht mit einer Deregulation des Zellzyklus einher. Dabei spielt unter anderem die Regulation verschiedener krebsrelevanter Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle. Ein Interaktionspartner und Regulator vieler dieser Faktoren ist das LIM-only Protein FHL2. Es ist bereits bekannt, dass sich der FHL2-Status zwischen normalen und entarteten Zellen in allen bisher untersuchten Geweben unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass dies auch im Brustgewebe der Fall ist. FHL2 wird in fast allen aggressiven Mammakarzinomen überexprimiert, nicht aber im Normalgewebe und nur schwach in nicht-invasiven "DCIS". Dies weist darauf hin, dass die FHL2-Menge mit der Aggressivität des Tumors korreliert. Weiterhin konnte hier zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass FHL2 in die Zellzyklusregulation involviert ist. Am G1/S-Übergang kann FHL2 die Cyclin D1-Expression induzieren, was letztendlich zu einer Phosphorylierung des RB-Proteins und zum Eintreten der Zelle in die S-Phase führt. Wichtiger aber ist die hier gezeigte FHL2-abhängige Induktion von p21CIP/WAF, ein Zellzyklusinhibitor, der unter anderem auch in der G2/M-Kontrollpunkregulation involviert ist und normalerweise über p53 reguliert wird. Diese Induktion resultiert dort in einem verlangsamten Kontrollpunktübergang, wogegen eine Reduktion des FHL2-Gehalts einen beschleunigten G2/M-Übergang zur Folge hat. Zusätzlich zeigten Expressionsanalysen mit synchronisierten Brustkrebszellextrakten dass FHL2 zellzyklusabhängig exprimiert wird, mit einem Maximum am G2/M-Kontrollpunkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die p21-Expression in den hier verwendeten Brustkrebszelllinien p53-unabhängig ist und ausschließlich von FHL2 abhängt. Hierbei wird die FHL2-abhängige p21 Expression wahrscheinlich über die Aktivierung des c-jun-Transkriptionsfaktors im MAPK-Signaltransduktionsweg induziert. In vivo und in vitro Interaktionsstudien haben eine Interaktion von FHL2 mit c-jun gezeigt, wobei die Interaktion über die ersten beiden LIM-Domänen vermittelt wird. Der FHL2-c-jun-Komplex bindet an die AP-1-Sequenz innerhalb des p21-Promotors und induziert dadurch p21. Dies führt zu einer Inhibition verschiedener CDE/CHR-regulierter Proteine wie CDC25C oder Plk1 und zu einer verzögerten Zellzyklusprogression. In diesem Zusammenhang konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die FHL2-Expression nicht nur zu einer verlangsamten Proliferation führt, sondern auch zur Fähigkeit der Zelle zum zellmatrixunabhängigen Wachstum beisteuert. Es scheint auf den ersten Blick widersprüchlich, dass FHL2 für einen intakten G2/M-Kontrollpunkt und eine geringere Proliferationsrate sorgt, gleichzeitig aber zur Tumorentwicklung beiträgt. Es ist allerdings bekannt, dass Tumore ihr Wachstum verlangsamen bevor sie metastasieren. Auch führt ein erhöhter p21-Gehalt im Cytosol zu einer Inhibition der Apoptose, einer weiteren Eigenschaft von Tumoren. FHL2 ist daher ein signifikanter Faktor in der Onkogenese des Mammakarzinoms und aufgrund der differentiellen Expression in vielen Tumoren ein interessantes Ziel für Krebstherapien.
Stressorinduzierte ökotoxikologische Effekte und Genexpressionsveränderungen bei Chironomus riparius
(2008)
Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgewählte 5’- und 3’-untranslatierte Regionen (UTRs) von mRNAs aus H. volcanii bestimmt. Dieses Datenset wurde verwendet um (1) haloarchaeale UTRs zu charakterisieren, (2) Konsensuselemente für die Transkrikptionsinitiation und -termination zu verifizieren und (3) den Einfluss haloarchaealer UTRs auf die Initiation und Regulation der Translation zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Transkripte nichtprozessierte 3’-UTRs mit einer durchschnittlichen Länge von 45 Nukleotiden besitzen. Darüber hinaus konnte ein putatives Transkriptionsterminationssignal bestehend aus einem pentaU-Motiv mit vorausgehender Haarnadelstruktur identifiziert werden. Die Analysen der Regionen stromaufwärts der experimentell bestimmten Transkriptionsstarts führten zur Identifizierung dreier konservierter Promotor Elemente: Der TATA-Box, dem BRE-Element und einem neuen Element an Position -10/-11. Überraschenderweise bestand die TATA-Box nur aus vier konservierten Nukleotiden. Die Untersuchung der UTRs ergab, dass die größte Anteil der haloarchaealen Transkripte keine 5’-UTR besitzt. Falls eine 5’-UTR vorhanden ist, besitzen unerwarteterweise nur 15% der 5’-UTRs aus H. volcanii eine Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass verschiedene native und artifizielle 5’-UTRs ohne SD-Sequenz sehr effizient in vivo translatiert werden. Außerdem hat die Sekundärstruktur der 5’-UTR und die Position struktureller Elemente offenbar einen entscheidenden Einfluss auf die Translatierbarkeit von Transkripten. Die Insertion von Strukturelementen nahe des Startkodons führte zu einer vollkommenen Repression der Translation, während die proximale Insertion des Motivs an das 5’-Ende der 5’-UTR keinen Einfluss auf die Translationsseffizienz hatte. Zusammenfassend kann sowohl der eukaryotische Scanning-Mechanismus als auch die bakterielle Initiation der Translation über die SD-Sequenz für haloarchaeale Transkripte mit 5’-UTR ohne SD-Sequenz ausgeschlossen werden. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Identifizierung eines entsprechenden dritten Mechanismus zur Initiation der Translation in H. volcanii. Eine aktuelle Studie zur globalen Analyse der Translationsregulation zeigte, dass der Anteil translational regulierter Gene in H. volcanii genauso hoch ist wie bei Eukaryoten (Lange et al., 2007). Um die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Regulation der Translation zu charakterisieren, wurden die UTRs zweier ausgewählter translationsregulierter Gene untersucht. Es stellte sich heraus, dass nur die Anwesenheit beider UTRs, 5’- und 3’-UTR, zu einer Wachstumsphasen-abhängigen Regulation der Translation führt. Dabei hat die 3’-UTR allein keinen Einfluss auf die Translationseffizienz, während die 5’-UTR die Translationseffizienz in beiden Wachstumsphasen reduziert. Es zeigte sich außerdem, dass die 3’-UTR für die „Richtung“ der Regulation auf Translationsebene verantwortlich ist und putative Strukturelemente möglicherweise in den Regulationsmechanismus involviert sind. Zusammengefasst ergibt sich folgendes Modell der Translationsregulation in H. volcanii: Strukturierte 5’-UTRs führen zu einer Herabsetzung der konstitutiven Translationseffizienz. Dies kann differentiell durch regulatorische Faktoren kompensiert werden, welche spezifische Elemente der 3’-UTR binden. Sowohl natürliche als auch artifizielle Aptamere und allosterische Ribozyme stellen effektive Werkzeuge zur exogen kontrollierten Genexpression dar. Daher wurde die Anwendbarkeit eines Tetracyclin-induzierbaren Aptamers und eines konstitutiven Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii untersucht. Es stellte sich allerdings heraus, dass das Aptamer bereits ohne Tetracyclin starke inhibitorische Sekundärstrukturen ausbildet. Als Alternative wurden Reportergenfusionen mit einem selbstspaltenden Hammerhead-Ribozym konstruiert. Die selbstspaltende Aktivität des Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii konnte erfolgreich in vivo demonstriert werden, was die Grundlage zur Entwicklung konditionaler Expressionssysteme basierend auf dem Hammerhead-Ribozym in H. volcanii bildet.
Dicer and Drosha are the major enzymes involved in microRNA processing. Using siRNA targeting Dicer and Drosha, thereby downregulating a substantial number of microRNAs in EC, we demonstrate a crucial role of both enzymes in angiogenic processes. Interestingly, Dicer inhibition exerts more profound effects on processes like migration and viability of EC in comparison to Drosha inhibition. Moreover, Dicer effects in vivo angiogenesis, a process which is unaffected by Drosha. This discrepancy might be partially due to the involvement of Dicer in other cellular processes like heterochromatin formation and to the fact that Dicer and Drosha target mainly different subsets of microRNAs. In addition, we identified miR-92a as a novel endogenous repressor of the angiogenic program in EC, which impairs their angiogenic functions in vitro and in vivo. Consistent with these data, blocking miR-92a by systemic infusion of antagomirs enhances neovascularization and functional recovery after ischemia in vivo. At first sight, the anti-angiogenic function of miR-92a in EC appears to contradict the previously identified anti-apoptotic and pro-angiogenic activities of the miR-17~92 cluster in tumor cells. However, this apparent discrepancy might be well rationalized by a predominant function of miR-18a and miR-19a in tumor cells, which are responsible for the tumorigenic and non-cell autonomous pro-angiogenic functions of the miR-17~92 cluster. Instead, miR-92a expression is specifically upregulated in ischemic tissues and appears to cell-autonomously repress the angiogenic potential of EC. Among the various targets and verified regulated genes identified by microarray, we confirmed the downregulation of Integrin a5 in vitro and in vivo. The relevance of this miR-92a target is evidenced by severe vascular defects in the absence of Integrin a5. In addition, endothelial miR-92a interferes with the expression pattern of genes controlling key EC functions at various levels, some of which, e.g. eNOS, might be secondarily affected by directly targeted genes. Obviously, our data do not formally exclude effects of antagomir-92a on perivascular and other cell types, but surely include effects on EC. Regardless of this, the capacity of miR-92a to target various downstream effectors might be an advantage of miRNA-based therapeutic strategies and may overcome the limited therapeutic capacity of single growth factor or single gene therapies in ischemic diseases, since the highly organized process of vessel growth, maturation and functional maintenance is well known to require the fine-tuned regulation of a set of genes.
H. salinarum ist einer von zwei archaealen Organismen, die synchronisiert werden können. Die Synchronisations-Methode konnte in dieser Arbeit optimiert werden. Nahezu 100 % aller Zellen teilen sich in einer Zeitspanne von einem Viertel der Generationszeit. Die Analyse zweier aufeinanderfolgender Zellzyklen zeigte, dass die Zellen sich auch im zweiten Zyklus synchron teilen. Die Zellsynchronisation wurde angewendet, um zellzyklusabhängige Vorgänge in H. salinarum auf unterschiedlichen Ebenen zu charakterisieren. Mittels DNA-Mikroarrays wurden Transkriptomänderungen untersucht. Nur 87 Gene zeigten zellzyklusspezifische Regulationen. Dies entspricht 3 % aller vorhergesagten offenen Leserahmen und ist somit im Vergleich zu allen anderen Organismen, deren Transkriptome untersucht wurden, deutlich geringer. Die Transkriptmengen von 15 ausgewählten Genen wurden mit Northern Blot Analysen verifiziert. Die regulierten Gene konnten in sieben Gruppen mit unterschiedlichen Transkriptprofilen eingeordnet werden. Gruppenspezifische DNA-Sequenzmotive wurden gefunden, von denen angenommen wird, dass sie in die zellzyklusspezifische Transkriptionsregulation involviert sind. Überraschenderweise wurden die meisten als Zellzyklusgene annotierten Gene konstitutiv transkribiert. Die Analyse zellzyklusabhängiger Proteomänderungen erfolgte mittels 2D-Gelelektrophorese. 1200 Proteine konnten reproduzierbar detektiert werden. Die meisten Proteine wurden konstitutiv exprimiert. Nur 30 Proteine zeigten eine zellzyklusabhängige Regulation. Dies entspricht 2,5 % der reproduzierbar detektierten Proteine. Es konnten unterschiedliche Expressionsprofile gefunden werden. Aus den Transkriptom- und Proteomanalysen folgt, dass auf Ebene der Genexpression nur wenige zellzyklusabhängige Regulationen existieren. Sekundäre Botenstoffe spielen eine wesentliche Rolle bei Signaltransduktionen und sind an Regulationen von Zellzyklen beteiligt. Eine Methode zur Messung intrazellulärer cAMP-Konzentration in H. salinarum konnte etabliert werden. Die basale cAMP-Konzentration von 200 µM in haloarchaealen Zellen ist bedeutend höher als die von Hefe. Synchrone Kulturen wurden auf die Oszillation des sekundären Botenstoffes hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Konzentration zellzyklusabhängig zweimal kurzfristig signifikant erhöht wird. Die cAMP-Konzentration steigt einmal vor und einmal direkt nach der Zellteilung an. cAMP könnte daher ein wichtiges Signal für das Fortschreiten des Zellzyklusses sein. Es konnte eine Methode zur Analyse der Replikation in H. salinarum entwickelt werden. Hierfür wurde das Basenanalogon BrdU und ein spezifischer Antikörper gegen dieses verwendet. Die Analyse synchroner Kulturen zeigte das überraschende Ergebnis, dass die Zellen ihre DNA während des gesamten Zellzyklusses zu replizieren scheinen. Vor allem die DNA-Synthese in synchronen Kulturen während der Teilungsphase der Zellen stellt einen völlig neuartigen Zellzyklusablauf dar. Für in vivo Analyse von Zellzyklusproteinen können diese mit GFP markiert und fluoreszenzmikroskopisch analysiert werden. Mit dieser Methode konnten wichtige zellzyklusabhängige Aspekte in anderen Arten aufgeklärt werden. Für einen GFP-Modellversuch wurde in dieser Arbeit ein Fusionsgen bestehend aus den offenen Leserahmen von bop (bacterio-opsin) und gfp (green fluorescent protein) erstellt. Die Expression des chromosomalen bop Gens und des plasmidkodierten bop-gfp Fusionsgens wurde mit Northern Blot Analysen nachgewiesen. Die Purpurmembranbiogenese wurde fluoreszenzmikroskopisch in lebenden H. salinarum Zellen untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Bildung der Purpurmembran ca. 15 Stunden nach Eintritt der Zellen in die stationäre Wachstumsphase beginnt. Innerhalb der folgenden sieben Stunden stieg sowohl die Anzahl an Zellen mit fluoreszierenden Signalen als auch die durchschnittliche Anzahl an Signalen pro Zelle gleichmäßig an. Die Ergebnisse zeigen, dass GFP-Fusionsproteine in H. salinarum z. B. zur Charakterisierung von differentieller Genexpression verwendet werden können. Des Weiteren könnten sie für die Untersuchung zellzyklusabhängiger Proteinlokalisation und für die Analyse der intrazellulären Verteilung putativer Cytoskelettproteine eingesetzt werden.
Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are rare neurological disorders that may be of genetic or infectious origin, but most frequently occur sporadically in humans. Their outcome is invariably fatal. The infectious agent has been defined as prion (from proteinaceous infectious only) in 1992 by Stanley B. Prusiner and represent mainly, if not solely, an abnormal, protease-resistant isoform (PrPSc) of a cellular protein, the prion protein or PrPC. According to the “protein only” hypothesis, the prion is devoid of informational nucleic acids and consists of an “infectious” protein that is capable of converting the normal host protein PrPC into a likeness of itself. TSEs can be distinguished from other neurodegenerative diseases because of their infectivity and transmission capability. The only organ system in which severe histopathological damage can be demonstrated as a consequence of infection with prions is the nervous system. The communal lesions are neuronal loss, spongiosis and astrogliosis, accompanied by an intra- and extracellular accumulation of PrPSc, occasionally in form of amyloid plaques. Even if a strong activation of microglia and astrocytes occurs, no immunological response is usually detectable as consequence of prion infection. Despite the considerable attention for its involvement in TSEs, the physiological role of the cellular, nonpathogenic isoform of PrPC, has not yet been determined. In the last years, several putative cellular functions have been attributed to PrPC: its localization in “lipid rafts” is consistent with a possible role in cell adhesion, transmembrane signalling or as a recognition molecule. Furthermore, PrPC has been implicated in protection against oxidative stress, copper metabolism, apoptosis, cell proliferation and in the regeneration of blood precursors stem cells in the adult. It has also been shown that PrPC interacts with the neuronal cell adhesion molecule NCAM, promoting neurite outgrowth. However, both the PrPC-mediated effects and the role of PrPC-dependent pathways on neuronal differentiation are still not elucidated. First objective of this Ph.D thesis was the establishment of a novel in vitro cellular model for the study of the role of PrPC in neuronal differentiation and neurite outgrowth. Furthermore, an additional goal of this project was the indentification of the PrPC domains responsible for the induction of neuronal differentiation. A novel PrPC-depleted cell line (PrP0/0 ML) was derived from murine primary PrP-knockout neuronal cells by SV40 large T antigen-mediated immortalization. A temperature sensitive form of this oncogenic protein was used, allowing a temperature-mediated regulation of its expression. This cell line was then characterised for its growth potential, for the expression of specific cellular markers and for its ability to differentiate. It was found that, under culture conditions promoting the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen, the cells expressed nestin, a specific marker of neuronal precursor cells. Therefore, the PrP0/0 ML cell line was identified as a potential neuronal stem cell line. In fact, under nonpermissive culture conditions when the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen is downregulated, the PrP0/0 ML cells differentiated into neurons. Noteworthy, maintenance of the cells in conditions that promote cell differentiation induced a progressive reduction in the expression levels of nestin, an event that strongly correlated with the appearance of the specific neuronal markers MAP-2b and NeuN. In order to investigate the role of PrPC in the process of neuronal differentiation, the PrP0/0 ML cells were then reconstituted for the expression of either the full-length PrP or a N-terminal truncated PrPC form (PrPdel32-134). The differentiation potential of both reconstituted cell lines under nonpermissive culture conditions was then compared with that of the parenteral PrP0/0 ML cells. This in vitro study clearly highlights that PrPC expression in the PrP0/0 ML cell line accelerates neuronal differentiation and that the N-terminal domain of the prion protein is not necessary for this PrP-mediated function. Prion diseases like BSE, vCJK, Kuru and the majority of iatrogenic cases of CJK are caused by a peripheral infection. Infectious prions accumulate in the central and peripheral nervous system as well as in extracerebral tissues, such as the secondary lymphoid organs and muscles. The prion pathogenesis is a dynamic process which can be defined temporary and spatially in different phases: i) infection and peripheral replication, ii) neuroinvasion, transport of prions from the periphery to the central nervous system (CNS), and iii) neurodegeneration. In the last years, progresses in the elucidation of the peripheral prion pathogenesis were achieved. The identification of the cell types involved in the lymphoreticular prion replication phase and the recognition of the role of the peripheral nervous system in the process of prion spread from the periphery to the CNS have elucidated some of the cellular mechanisms that are involved in prion uptake, replication and propagation. However, relatively little information is available about the mechanism(s) underlying intercellular prion transfer and tissue-to tissue prion spread. Microvesicles (MVs) are submicron vesicles (0,03-1 microm.) with a single membrane and are shed from most eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. The segregation of specific proteins is followed by blebbing of the membrane surface, leading to the formation of MVs and their release in the extracellular environment. MVs can be also secreted upon fusion of multivesicular endosomes with the plasma membrane (exosomes). The secretion of MVs is the result of a complex cellular process involving changes in the metabolism of lipids and proteins. The functional role of MVs is still largely unknown. However, there is evidence showing that they are important modulators of cell-to-cell communication, participate in a variety of intracellular adhesion processes and are able to induce cellular response(s). The release of PrPC and infectious PrPSc by prion infected epithelial, neuroglial and neuronal cells in association with exosomes has recently been highlighted. Furthermore, it has been shown that exosomes can propagate prion infectivity both in vitro and in vivo, suggesting that PrPSc-bearing exosomes may provide a mechanism for intercellular transmission of infectious prions in addition to cell-to-cell contact. Second objective of this Ph.D thesis was to determine the possible role of plasma membrane-derived microvesicles in the propagation and transmission of prions. The release of MVs was first studied in different murine neuronal cell lines. Here it is shown for the first time that neurons also shed plasma membrane derived MVs, in addition to exosomes. Immunoelectron microscopy and immunoblot analyses clearly demonstrated the presence of PrPC on the membrane of MVs released from PrPC-expressing cells. Characterization of lipid rafts components in MVs highlighted the presence of the ganglioside GM2, the tyrosine kinase p59Fyn, flotillin-2 and the neuronal protein GAP-43. In order to investigate whether MVs are involved in the intercellular transmission of prions, MVs were first isolated from two prion infected murine neuronal cell lines, namely the Neuro-2a PK1 and the N2a58 cells, and then used for in vitro and in vivo infection assays. Immunoblot analyses after proteinase K treatment demonstrated the association of PrPSc with the secreted MVs. The PrPSc-bearing MVs were then used to perform infection experiments on noninfected cells. By the use of cell blot assay, a method that allows the detection of PrPSc-amplification and -accumulation in cultured cells, the kinetic of prion infection in the de novo infected cells was followed. Noteworthy, it was found that PrPSc-bearing MVs were capable to transmit prions in vitro and to stably infect the recipient cells. In order to investigate the role of MVs in the transmission of infectivity in vivo, PrPSc-bearing MVs as well as MVs isolated from noninfected cells (as negative control) were injected intracerebrally in PrPC-overexpressing indicator mice (tga20). The development of clinical disease was followed in a time-dependent manner. Clinical symptoms could be observed only in the group of indicator mice inoculated with the PrPSc-bearing MVs, which then succumbed to desease. These findings clearly demonstrated that MVs are biological carriers of both PrPSc and prion infectivity. MVs could therefore participate in vivo in the processes of intercellular prion transmission and propagation.
Einige Teilergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Mahnke K., Schönfeld K., Fondel S. et al (2007), Int. J. Cancer 120; 2723-2733 Depletion of CD4+CD25+ human regulatory T cells in vivo: Kinetics of Treg depletion and alterations in immune functions in vivo and in vitro Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Treg depletierende Wirkung von ONTAK, einem Fusionsprotein aus Interleukin-2 und Diphterietoxin, untersucht. Hierzu wurde ONTAK in Zellkultur auf humanen Lymphozyten getestet und anschließend Melanomapatienten verabreicht. ONTAK konnte sowohl in vitro als auch in vivo eine Depletion von Tregs induzieren, wenngleich der in vivo Effekt nicht vollständig war. Des Weiteren wurde der immunologische Effekt, der auf die Reduktion der Tregs zurückzuführen ist, untersucht. Hierzu wurden die Patienten mit DCP behandelt, welches normalerweise zu einer schwachen Entzündungsreaktion führt. Nach Treg Depletion wurden starke Kontaktekzeme in den Patienten induziert. Aufgrund dieser verstärkten Immunantwort erfolgte eine Applikation der Tumorpeptide MART1 und gp100 in das Kontaktekzem. Anschließend konnten peptidspezifische CD8 T-Zell Populationen detektiert werden, die sowohl INF-γ sekretierten, als auch zytotoxisch aktiv waren. Solche starken Immunantworten wurden bisher nur unter zu Hilfenahme starker Adjuvanzien induziert. ONATK führt bereits nach einmaliger Applikation zu einer Depletion regulatorischer T-Zellen in vivo. Dabei wird der Gehalt von 4 % regulatorischen T-Zellen im Blut auf einen Gehalt von 1 % gesenkt. Diese Depletion der Tregs verstärkt eine Immunisierung mit Peptiden, die eine starke CD8 T-Zell vermittelte Immunantwort induziert. Allerdings kam es zu keiner vollständigen Depletion der Tregs, was durch die geringe in vivo Halbwertszeit von ONTAK, sowie durch unbekannte Mechanismen der Treg Homöostase erklärt werden könnte. Die Wirkweise von ONTAK konnte nur im Blut, aber nicht in anderen Organen wie z.B. Lymphknoten erforscht werden, daher besteht die Möglichkeit, einer unvollständigen Depletion der Zellen in peripheren Organen. In wieweit Tregs im Blut mit anderen Zellen wechselwirken ist weitgehenst unerforscht. Die meisten Untersuchungen zeigen Zell-Zell Interaktionen in den Lymphknoten und im entzündeten Gewebe. Der Ort, an dem die Tregs aber wirklich ihr suppressives Potential auf andere Zellen entfalten, ist noch unbekannt. Hiermit beschäftigt sich der zweite Teil dieser Arbeit. Zur Beantwortung dieser Frage sollten Tregs in vivo in Mäusen in die Haut oder den Lymphknoten geleitet werden. Um das Vorhaben auszuführen, wurden die Zytokinrezeptoren CCR7, CCR9 und CCR10 sowie die Adhäsionsmoleküle PSGL-1, ESL-1 und CD103 kloniert und in zwei Expressionssystemen getestet. Ein lentivirales System zeigte eine schlechte Transduktionseffizienz, so dass ein zweites System mit einer Elektroporationstechnik, der Nucleofection gewählt wurde. Dieses führte zu Expressionseffizienzen von ca. 40 %. Zuerst wurde die Funktionalität der klonierten Moleküle in vitro in der murinen T-Zellline EL-4 in Transwell- und Flowchamberversuchen demonstriert, anschließend wurden murine in vitro expandierte Tregs nucleofiziert. Eine umfassende Analyse der nucleofizierten Zellen zeigte eine Heraufregulation von CD69 und eine Herunteregulation von CD62L, was auf eine Aktivierung der Zellen deutet. Mit einhergehender Aktivierung nahm auch die Apoptoserate der Zellen zu, diese konnte auch durch Modifikationen der Nucleofections- sowie der Kulturbedingungen nicht verringert werden. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden nach der Nucleofection ließen sich noch adhäsive Eigenschaften der exprimierten Moleküle in der Flowchamber nachweisen. Im Suppressionstest, in dem die Zellen über einen Zeitraum von drei Tagen inkubiert wurden, waren die Zellen jedoch nicht mehr suppressiv. Daher wären die in vivo Versuche, die den suppressiven Einfluß der Tregs auf die Ohrschwellung in Abhängigkeit ihrer Lokalisation untersuchen sollten, erfolglos geblieben. Mit der Induktion der Apoptose stießen die hier verwendeten Methoden an ihre Grenzen. Zur Realisierung des Projekts müssten andere Transduktionssysteme oder Tregs aus knock out Mäusen verwendet werden. Regulatorische T-Zellen nehmen eine Schlüsselrolle bei der Suppression von anti-Tumor Immunantworten aber auch bei dem Schutz vor Autoimmunerkrankungen ein. Eine erfolgreiche Manipulation dieser Zellen in vivo oder in vitro bildet eine solide Basis für neuartige Immuntherapien gegen entsprechende Krankheiten. ONTAK ist ein wirkungsvolles Medikament, um die Anzahl der regulatorischen Zellen in vvo zu reduzieren. Es trägt dadurch zu einer verstärkten Immunantwort bei. Eine einmalige Gabe von ONTAK ist sicherlich nicht ausreichend, um Tumore zu bekämpfen, es kann aber Immuntherapien unterstützen. Eine Manipulation von Tregs, durch die Expression von Transgenen um ihr Migrationsverhalten in vivo zu beeinflussen und damit die Suppression von Autoimmunerkrankungen zu bedingen, ist noch nicht ausgereift und bedarf noch weiterer Forschung.
Die Maus hat wie die meisten Säugetiere zwei Zapfenopsine, das S-Opsin (UV-empfindlich) und das M-Opsin (grün-empfindlich). Die Zapfen werden nach dem jeweils exprimierten Opsin S-Zapfen oder M-Zapfen genannt. Bei der Maus wird die Zapfenzahl embryonal festgelegt, aber das Opsin-Expressionsmuster entwickelt sich erst postnatal (Szel et al. 1998). In der ersten Postnatalwoche (PWo 1) exprimieren alle Zapfen über die gesamte Retina das S-Opsin. Ab PWo 2 kann das M-Opsin immunzytochemisch nachgewiesen werden. Eine Besonderheit der adulten Maus ist die Koexpression beider Opsine in vielen Zapfen (Dualpigmentzapfen; Lukats et al. 2005). Außer einer geringen Zahl "echter" S-Zapfen exprimieren alle Zapfen das M-Opsin entweder allein oder zusammen mit dem S-Opsin (Szel 1993, Applebury 2000, Haverkamp et al. 2005). Das adulte wildtypische Zapfenmuster besteht aus gegenläufigen dorso-ventralen Gradienten der S- und M-Zapfen (Szel 1993, Applebury 2000). Das M-Opsin wird stärker in der dorsalen Retina exprimiert und die Expression nimmt zur ventralen Retina ab. In der ventralen Retina exprimieren alle Zapfen das S-Opsin, in der dorsalen Retina ist die Zahl der S-Zapfen sehr gering. Das adulte Zapfenmuster entsteht durch einen Wechsel von S- zu M-Opsinexpression in vielen Zapfen. Die Expression der Opsine wird während der postnatalen Entwicklung durch den Schilddrüsenhormonrezeptor beta 2 (TRbeta2) reguliert. Ein Fehlen des TRbeta2 (TRbeta2 -/-) führt zum Verlust des M-Opsins und zur Expression des S-Opsins in allen Zapfen (Ng et al. 2001). Auch das Schilddrüsenhormon und der Retinsäurerezeptor gamma (RXRgamma) sind Regulatoren in der postnatalen Entwicklung der Opsinexpression (Roberts et al. 2005, 2006). Die Pax8 -/- Maus hat durch den Verlust des Pax8-Gens eine mißgebildete Schilddrüse, die kein Schilddrüsenhormon produzieren kann (Mansouri et al. 1998). In der vorliegenden Studie wurde die Auswirkung der postnatalen Hypothyreose von Pax8 -/- auf die Entwicklung des Auges und der Retina im Alter von PWo 3 untersucht. Die Ergebnisse von Pax8 -/- wurden mit Pax8 +/- und +/+ Wurfgeschwistern verglichen. Die Hypothyreose von Pax8 -/- wurde durch Messung der Schilddrüsenhormonwerte im Blut bestätigt. Die Augenparameter unterscheiden sich nicht zwischen Pax8 -/- und den Kontrolltieren. Auch die Entwicklung der Retina ist bei allen drei Pax8-Genotypen gleich. Pax8 -/- zeigt keine Veränderungen in der Schichtung der Retina sowie der Morphologie untersuchter Zelltypen. In allen drei Pax8-Genotypen konnten die Transkripte der S- und M-Opsine und des Stäbchenopsins nachgewiesen werden. Auch die Transkripte des TRbeta2, der Deiodinase 2 und der Deiodinase 3 wurden ermittelt. Anhand dieser Ergebnisse kann die Aussage gemacht werden, daß die Hypothyreose von Pax8 -/- keinen Einfluß auf die generelle postnatale Entwicklung des Auges und der Retina zeigt. Im Gegensatz dazu ist die Auswirkung der Hypothyreose auf die Ausprägung des S- und M-Zapfenmusters gravierend. Sie wurde durch Dichtezählungen der S- und M-Zapfen analysiert. Zunächst wurde das Zapfenmuster der wildtypischen Maus-Stämme C57, Sv129 und Pax8 +/+ untersucht. Alle drei Wildtypen zeigen im Alter von PWo 3 und PWo 22 (adult) ein vergleichbares Zapfenmuster mit gegenläufigem dorso-ventralem Gradienten der S- und M- Zapfen. Auch die heterozygote Pax8 +/- Maus zeigt das wildtypische Zapfenmuster. Pax8 -/- hingegen hat ein verändertes Zapfenmuster. Die S-Zapfendichten sind bei PWo 3 und PWo 22 über die gesamte Retina gleich, so daß kein Gradient ausgebildet ist. Die Veränderung im M-Zapfenmuster von Pax8 -/- ist bei PWo 3 deutlich zu sehen, während das adulte M-Zapfenmuster wieder wildtypisch erscheint, hier scheint also eine verzögerte normale Entwicklung vorzuliegen. Durch eine Substitution mit Thyroxin (T4) ab P2 kann bei Pax8 -/- das wildtypische Zapfenmuster erzeugt werden, somit ist das Schilddrüsenhormon für die Ausprägung des Zapfenmusters während der postnatalen Entwicklung verantwortlich. Weitere Versuche zeigen, daß die Opsinexpression während des ganzen Lebens plastisch und Schilddrüsenhormon-abhängig ist. Eine Unterbrechung der T4-Substitution ab PWo 4 führt bei Pax8 -/- zum Rückgang auf das hypothyreote Zapfenmuster. Auch wenn Pax8 -/- erst im adultem Alter mit T4 substituiert wird, ist eine Veränderung des Zapfenmusters sichtbar. Eine künstlich durch Methimazol erzeugte Hypothyreose in adulten C57-Mäuse führt ebenfalls zu einer Veränderung des Zapfenmusters, das dann mit dem Zapfenmuster von Pax8 -/- identisch ist. Zusammenfassend erlauben die Ergebnisse den Schluß, daß das Schilddrüsenhormon über die Expression der Opsine die Ausprägung des Zapfenmusters sowohl während der Entwicklung reguliert, als auch für eine Aufrechterhaltung des Zapfenmusters während des ganzen Lebens benötigt wird. Dieser Befund hat auch klinische Relevanz. Die nicht seltene Neugeborenen-Hypothyreose beim Menschen wird heute durch eine direkt nach der Geburt beginnende lebenslange Thyroxin-Substitution therapiert. Nach unseren Befunden bei der Maus könnte dies auch für die Aufrechterhaltung einer normalen Zapfenopsin-Expression und damit eines normalen Sehvermögens notwendig sein.