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Structural biology often employs a combination of experimental and computational approaches to unravel the structure-function paradigm of biological macromolecules. This thesis aims to approach this combination by the application of Pulsed Electron-Electron Double Resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy and structural modelling. In this respect, PELDOR spectroscopy in combination with site-directed spin labelling (SDSL) of proteins is frequently used to gain distance restraints in the range from 1.8 to 8 nm. The inter-spin distance and the flexibility of the spin labelled protein domains are encoded in the oscillation and the dampening of the PELDOR signal. The intrinsic flexibility of the commonly used MTSSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrroline-3-methyl) spin label itself can be an obstacle for structural modelling if the flexibility of the label is large compared to the flexibility of the protein domains. In this thesis the investigation of two multi-domain proteins by the 4-pulse PELDOR sequence is presented. At first, the N-terminal polypeptide transport-associated (POTRA) domains of anaOmp85, a rigid three domain protein, giving well-defined PELDOR distance restraints, is investigated. The experimental restraints are used for structure refinement of the X-ray structure and reveal a strong impact of the intrinsic flexibility of MTSSL on the accuracy of structural refinement. The second example, K48-linked diubiquitin, is a highly flexible multi-domain protein on which the flexibility of MTSSL is of minor impact on structural modelling. In this case, the distance restraints are utilized to determine conformational ensembles. Due to the high intrinsic flexibility already characterizing diubiquitin the recently developed 7-pulse Carr-Purcell (CP) PELDOR sequence was applied to investigate longer ubiquitin chains. This sequence enables to measure dipolar oscillations with an extended time window, allowing a good separation between inter- and intramolecular contributions even for long distance and broad conformational distributions, thereby providing an increased accuracy of the obtained distance distributions.
Die Entwicklung von neuartigen, funktionellen Materialien ist eine komplexe Aufgabe, da die Gesamteffizienz der zu entwickelnden Materialien von einer Vielzahl von Faktoren abhängt. Während die auf einer molekularen Ebene durchgeführte Funktionalisierung via chemischer Reaktionsführung genauso wichtig ist wie die makromolekulare Anordnung, kann die Frage nach einer geeigneten Verbesserung von gegenwärtigen Materialien nicht nur auf einer dieser beiden Ebenen beantwortet werden. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse basieren auf der mirkoskopischen aber auch markoskopischen Betrachtung von neuartigen, funktionellen Nanomaterialien und den daraus gewonnenen Erkenntnissen. Das übergeordnete Ziel ist dabei das Verständnis und die Charakterisierung von Ladungsseparationsprozessen und die daraus resultierende Erzeugung von elektrischen Strömen in organischen photovoltaischen Materialien.
Die relevanten Ladungsseparationsprozesse werden oft im Kontext der Dissoziation von Exzitonen, gebundenen Elektron-Loch Paaren, beschrieben, welche innerhalb der Donordomäne eines beliebigen Donor-Akzeptor-Materials erzeugt werden. Dabei ist der Prozess der Exzitonengenerierung abhängig von der Nanomorphologie des entsprechenden Materials, typischerweise so genannten Bulk-Heterojunctions. Dahingehend ist es notwendig, die Effekte von intermolekularen Wechselwirkungen sowohl mittels quantenmechanischer als auch dynamischer Methoden zu betrachten. Um alle relevanten Zeitskalen und Prozesse zu betrachten ist es weiterhin notwendig, auf sowohl eine deterministische Darstellung im Rahmen von quantendynamischen Methoden als auch statistischen Methoden zurückzugreifen.
Um die oft ultraschnellen und kohärenten Exzitonendissoziationsprozesse zu untersuchen wurde eine Kombination aus high-level ab initio Methoden und zeitabhängiger Dichtefunktionaltheorie (TDDFT) angewandt, um geeignete Modellhamiltonians zu parametrisieren, welche schließlich mittels der Multi-Configurational Time-Dependent Hartree (MCTDH) und der Multilayer (ML-MCTDH) variante propagiert wurden. Die MCTDH Methode hat sich als geeignete Methode erwiesen um eine voll quantendynamische Beschreibung von bis zu 100 Freiheitsgraden durchzuführen; die ML-MCTDH Methode erlaubt gar bis zu 1000 Freiheitsgrade quantendynamisch zu behandeln. Die Parametrisierung der Modellhamiltonians, auf welchen die quantendynamische Behandlung basiert, wurde dabei für kleine, jedoch repräsentative Fragmente durchgeführt. Die geeignete Wahl dieser Fragmente sollte sicherstellen, dass zum einen alle relevanten intermolekularen als auch intramolekularen Wechselwirkungen enthalten sind, jedoch gleichzeitig eine möglichst akkurate Beschreibung mittels high-level elektronenstrukturtheoretischer Methoden in gegebener Zeit möglich ist.
Mit Hilfe dieser Methodenkombination wurden zwei Arten von funktionellen organischen Materialien untersucht. Das erste untersuchte System ist ein neuartiges Donor-Akzeptor System, bestehend aus selbstorganisierenden Oligothiophen-Perylenediimid Dimeren, welche in der Gruppe von S. Haacke und S. Mery der Universität Straßburg synthetisiert und spektroskopisch untersucht wurden. Die quantendynamischen Simulationen an diesem System sollten die Ergebnisse der experimentellen, zeitaufgelösten pump-probe Spektroskopie validieren und die dürftige Effizienz im Hinblick auf eine effektive Ladungstrennung erklären. Dabei konnte gezeigt werden, dass nach der Exzitonendissoziation Elektron und Loch auf räumlich benachbarten Donor- und Akzeptorfragmenten lokalisiert werden, was schließlich zu einem Rekombinationsprozess führen wird. Das zweite untersuchte System ist eine Kombination von Poly(3-Hexylthiophen-2,5-diyl) (P3HT) als Elektronendonor und [6,6]-Phenyl-C61 Butansäure Methyl-Ester (PCBM) als Elektronenakzeptor, welches schon hinreichend stark in diversen theoretischen und experimentellen Studien untersucht wurde. Aufbauend auf einem Gittermodell, welches in unserer Gruppe entwickelt wurde, wurde das Modellsystem um Charge Transfer Exzitonen in der Donordomäne erweitert. Die Bedeutung von solchen Charge Transfer Exzitonen in regioregulären Oligothiophenaggregaten ist ein aktuelles Thema in der Wissenschaft, sowohl in experimentellen aber auch theoretischen Abhandlungen. Neben der theoretischen Beschreibung zur Entstehung solcher Charge Transfer Exzitonen liegt ein besonderes Augenmerk auf dem Einfluss dieser predissoziierten Elektron-Loch Paaren auf die Ladungsseparationsdynamik zwischen Donor und Akzeptor sowie die Generierung von freinen Ladungsträgern. Dieser Aspekt der Ladungsseparation in einem P3HT-PCBM System wurde in dieser Art und Weise in dieser Arbeit zum ersten mal untersucht.
Neben dem zuvor erwähnten Donor-Akzeptor System erster Generation der Universität Straßburg wurde eine zweite Variante dieses Systems entwickelt, welches sich bei bisherigen experimentellen Untersuchungen als wesentlich effizienter erwies. Der interessante Prozess der Ladungsseparation ist dabei allerdings auf einer Zeitskala von mehreren hundert Pikosekunden angesiedelt, sodass kinetische Monte Carlo Methoden verwendet werden mussten um diese Prozesse zu modellieren. Dazu wurde ein Fortran90 Code entwickelt, welcher den First Reaction Method Algorithmus verwendet und explizite Delokalisationsprozesse behandelt, welche in dieser Form in kommerziellen Programmpaketen nicht enthalten ist. In vorangehenden Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Delokalisation von Exzitonen zu einer effektiven Herabsetzung der energetischen Barriere der Ladungsseparation führt und somit die Effizienz zur Stromumwandlung gesteigert werden konnte. Erste Simulationen mit diesem Code an idealisierten und zufällig generierten Donor-Akzeptor Morphologien lieferten realistische Werte für makroskopische Observablen wie Ladungsträgermobilitäten. Weiterhin wurden Simulationen einer coarse-grained Struktur zur zweiten Generation des Donor-Akzeptor Systems durchgeführt, ebenfalls mit Hinblick zur Untersuchung der Ladungsträgermobilität.
The focus of this research was to understand the molecular mechanism that lies behind the insertion of tail-anchored membrane proteins into the ER membrane of yeast cells. State-of-art instruments such as LILBID, and Cryo-EM, combined with the introduction of direct electron detectors, were used to analyze the proteins that capture tail-anchored proteins near the ER membrane and help their releases from a chaperone, an ATPase named Get3. Get3 escorts TA proteins to the ER membrane, where both Get3 and the TA proteins interact sequentially to Get3 membrane bound receptors Get1 and Get2. Get1 and Get2 are homologs of mammalian WRB and CAML.
The native host was used to separately produce Get1, Get2, and the Get2/Get1 single chain constructs. The studies showed that when Get1 is expressed alone, Get1 does not seems to be located in the ER membrane but rather in microbodies like shape organelles (or peroxisome). Interestingly, Get1 seems to be located in the ER membrane when it is linked to Get2 as single chain construct.
The localization study of Get2/Get1 fused to GFP shows from the fluorescence intensity that Get2/Get1.GFP has a tube-like morphology or membrane-enclosed sacs (cisterna), implying that Get2/Get1 is actually targeted to the ER membrane and is likely functional. In other words, Get1 and Get2 stabilize each other in the ER membrane.
The expression of Get2/Get1 was found to be already optimum when expressed as single chain construct because the fluorescence counts did not improve when additives such as DMSO or histidine were added. However, when Get1 and Get2 are expressed separately, additives improve their protein production yield. In 1 liter culture, Get1 yield is increased by about 3 mg and Get2 by 1.8 mg. This can be explained by the space that Get1 and Get2 should occupy within the ER membrane as they must coexist with other membrane components to maintain the homeostasis of the cell. Hence, if there were no gain for single chain construct expression, it meant that Get2/Get1 was already well expressed on its own in ER membrane and has reached its optimum expression without the help of additives. The Get2/Get1 overexpression is more stable, tolerated and less toxic for the cells to express it at a high level.
DDM has proved to be the best detergent from the detergents tested to solubilize Get1, Get2, and Get2/Get1.
Thereafter, Get1, Get2 (data not shown), and Get2/Get1 were successfully purified in DDM micelles.
Furthermore, for the first time using LILBID, the actual study has shown that Get1 and Get2 are predominantly a heterotetramer (2xGet1 and 2xGet2) but higher oligomerization may exist as well.
Get3 binds to Get1 in a biphasic way with a specific strong binding of an affinity of 57 nM and the second of 740 nM nonspecific indicative of heterogeneity within the interaction between Get1 and Get3. This heterogeneity is caused by the presence of different conformation of either protein. However, in order to characterize a high-resolution structure model of a specific target one needs highly homogenous and identical molecules of the target protein or complex in solution. The homogeneity increases the chances of growing crystals during crystallography as the good homogeneity will likely generate a perfect packing of unit cells stack (also known as crystal lattice) in the three-dimensional spaces. The same truth goes for the single particles analysis Cryo-EM, especially for smaller complexes where having less or no conformation alterations of specific targets will enable the researcher to classify the particles in 2D and 3D, therefore improving the signal-to-noise-ratio that will ultimately lead to high-resolution structure determination.
Get1, Get2/Get1 and chimeric variants (tGet2/Get1, T4l.Get2/Get1, T4l.Get2.apocyte.Get1) were crystallized but none of the crystals could diffract due to heterogeneity.
This heterogeneity was not only occurring upon the binding of Get3 to its membrane receptors, but seems to be already present within the receptors themselves through possibly different conformation.
In this Ph.D. thesis, the heterogeneity of purified Get2 and Get1 as complex or individually in detergent is then, so far, the limiting factor for obtaining a high-resolution structure model of Get1 and Get2. As mentioned above, the heterogeneity observed was not due to the quality of the sample preparation but rather to the effect of different conformations that could have been native, or just because of the micelle used, as it was proven by the 3-D heterogeneity classification by Cryo-EM.
In general, crosslinking is one way to keep the integrity of protein complexes, however it appeared not to improve the sample quality when it was analyzed in micelles. Often the integrity of some membrane proteins is affected when they are solubilized and purified in detergents.
Finally, in this study, the structural map of Get2 and Get1 complex linked with chimeric protein T4 lysozyme and apocytochrome C b562RIL gene was obtained at 10 Å. However, this single chain construct has a density map corresponding to heterodimer species (one Get1 and Get2). Therefore, based on those data the tertiary structure of Get2/Get1 in micelle is poorly defined. It could be that the membrane extraction in DDM and the purification destabilizes the structure of the complex.
Metal ions as novel polarizing agents for dynamic nuclear polarization enhanced NMR spectroscopy
(2017)
High-spin complexes of Gd(III) and Mn(II) were introduced as polarizing agents (PAs) for solid-state dynamic nuclear polarization (DNP) in 2011. This dissertation was undertaken in 2013, with the intention of exploring these PAs further. Major goals of this work were to understand their DNP mechanism(s) and explore their application in biomolecular research. This cumulative thesis details the methods, advantages, and practical implications of using high-spin PAs for MAS DNP. Data from electron paramagnetic resonance (EPR) and NMR spectroscopy are discussed for a complete understanding of DNP mechanisms.
Out of the two main mechanisms − solid effect (SE) and cross effect (CE − active under experimental conditions of solid-state DNP, commonly used nitroxide PAs evoke CE owing to their broad EPR spectra. On the other hand, DNP mechanisms evoked by high-spin metal ions seem non-trivial due to additional features (originating from spin-orbit coupling or zero field splitting) in their EPR spectra. The features of the EPR signal generally influence the shape of enhancement profiles. Therefore, the metal ion with a simpler EPR signal i.e., Gd(III) , is chosen as the starting point for the investigation of DNP mechanisms. Varying concentrations (2, 10, 20 mM) of a water-soluble and stable complex Gd-DOTA was dissolved as the PA in a glycerol-water solution of 13C,15N - urea. Field profiles of DNP enhancement on each nuclear type (1H, 13C, and 15N) establishes SE as the active DNP mechanism at the smallest PA concentration (2 mM). This confirms the theoretical predictions that narrow line width of the Gd(III) EPR signal arising from the central transition (CT, ms = -1/2 +1/2) allows for resolved SE DNP. However, that is no longer the case at higher PA concentrations of 10 and 20 mM. At higher Gd(III) concentrations, the CE mechanism contributes significantly and varies with nuclear Larmor frequency (ωn) of the concerned nuclei. The enhancement maxima shifts towards the EPR resonance as the contribution from CE increases. This shift is evident in the field profiles of 15N and 13C, whereas that of 1H is least influenced. This observation can be explained by combining theoretical estimates with the experimental data; the CE is evoked by increased dipolar coupling (Dee) – a prerequisite for CE – between neighboring Gd(III) spins as the statistical inter-spin distance shortens at elevated concentrations. This finding is important because the knowledge of active DNP mechanisms is essential for accurate interpretation of results from DNP experiments.
From the experiments on Gd-DOTA it becomes clear that concentration, inter-spin distances, and hence induced Dee are intertwined. In order to explicitly address the influence of inter-spin distances on DNP mechanisms we started a collaboration with the group of Adelheid Godt (Bielefeld). In this collaborative project, bis-complexes of the type Gd(III)-spacer-Gd(III) with variable spacer lengths were investigated. These PAs provided an excellent model system where the influence of only inter-spin distances can be determined for a fixed Gd(III) concentration. A small PA concentration of 4 mM is used to ensure absence of significant inter-molecular dipolar interactions. A mono-Gd complex of similar geometry and chemistry is taken as a reference for SE DNP.
The mono-Gd complex yields enhancements arising from SE as expected from negligible inter-molecular Dee. The contribution of CE increases as the inter-spin distances between Gd(III) ions become shorter going from 3.4 nm 2.1 nm 1.4 nm 1.2 nm due to corresponding increase in Dee. The extent of CE on ωn follows the same trend as for Gd-DOTA. Highest CE contribution is observed on nuclei with the smallest ωn 15N because smaller ωn approaches the width of the EPR signal, this is an additional requirement for CE DNP.
The field position for maximum DNP enhancement corresponding to Gd-DOTA, is used for DNP experiments on Ubiquitin with an attached Gd-tag as PA. The success of DNP on this sample illustrates the possibility of site-directed DNP with metal ions tags as PAs. As a perspective Gd-tags can be used to examine change in conformation of a protein that would give higher enhancements due to CE if two Gd(III) labeled domains are closer in space. In a separate project, Mn(II) (s=5/2) bound to the divalent site of a hammerhead ribozyme was used as a PA which resulted in the first demonstration of intra-complex DNP using an intrinsically bound metal ion PA.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein integrativer Netzwerkmodellierungsansatz gewählt, um die Rolle des Endothels im Kontext der Arteriosklerose zu untersuchen. Hierbei wurden bioinformatische Analysen, laborexperimentelle Versuche und klinische Daten vereinigt und aus dieser Synthese neue klinisch relevante Gene identifiziert und beschrieben.
Das Endothel trägt maßgeblich zur Homöostase des vaskulären Systems bei und eine Dysfunktion des Endothels fördert die Entstehung der Arteriosklerose. Im Zuge der Atherogenese entstehen vermehrt reaktive Sauerstoffspezies, die Lipide in der Membran von Plasma-Lipoprotein-Partikeln und in der zellulären Plasmamembran oxidieren. Eine Gruppe solcher oxidierter Membranlipide ist oxPAPC, das in erhöhter Konzentration in arteriosklerotischen Plaques und lokal an Orten chronischer Entzündung im vaskulären System vorkommt. Weitherhin findet sich diese Gruppe von oxidierten Phospholipiden in oxidierten LDL-Partikeln, in denen oxPAPC die Bindung an Makrophagen vermittelt und hierdurch maßgeblich zur Bildung der Schaumzellen und damit zum arteriosklerotischen Prozess beiträgt. Die durch oxPAPC verursachte Veränderung der Endothelzelle ist bisher wenig erforscht. Es ist jedoch bekannt, dass oxPAPC die Transkriptionslandschaft in Endothelzellen tiefgreifend verändert. Um der Komplexität der Endothelzellveränderung gerecht zu werden, wurde ein bayesscher Ansatz angewendet.
In einem ersten Schritt wurden Expressionsprofile von humanen Aortenendothelzellen (HAEC) aus 147 Herztransplantatspendern verwendet. Diese Expressionprofile enthalten Transkriptionsinformationen der 147 HAEC, die mit oxPAPC oder Kontrollmedium behandelt worden waren. Es wurden signifikant koexprimierte Gene identifiziert und hiervon Gen-Paare berechnet, die einen differentiellen Vernetzungsgrad zwischen Kontroll- and oxPAPC-Status aufweisen. Dieses Netzwerkmodell gibt darüber Aufschluss, welche Gene miteinander in Verbindung stehen. 26759 Gene-Paare, die differentiell verbunden und signifkant koexprimiert waren, wurden hierarchisch gruppiert. Es wurden neun Gen-Gruppen mit einer erhöhten und elf Gen-Gruppen mit einer verminderten Konnektivität nach oxPAPC identifiziert. Gruppe 6 der erhöhten Konnektvitäts-Gruppen wies hierbei die höchste kohärente Konnektivität von allen Gruppen auf. Eine Analyse signifikant überrepräsentierter kanonischer Gensätze ergab, dass diese Gruppe insbesondere Serin-Glycin-Aminosäuremetabolismus, tRNA- und mTOR-Aktivierung wiederspiegelte. Der hier gewählte Netzwerkmodellierungsansatz zeigte auf, dass der Aminosäuremetabolismus durch oxidizerte Phospholipide massiven Veränderungen unterworfen ist.
Um den Mechanismus der Veränderung des Aminosäuremetabolismus näher zu untersuchen, wurden bayessche Netzwerkmodelle verwendet. Dieses Netzwerkmodell enthält im Gegensatz zum differentiellen Koexpresssionsmodell gerichtete Informationen innerhalb des Netzwerkgraphes. Die Gen-Gen Verbindungen sind kausal, wodurch sich eine Hierarchie bildet und Schlüsselfaktoren innerhalb des Netzwerks bestimmt werden können. Durch die Integrierung von Expressionsprofilen und Genomprofilen derselben HAEC-Kohorte und der Inferenz von kausalen Gen-Gen-Verbindungen ergaben sich zwei bayessche Netze: Kontroll- und oxPAPC-Netzwerk. Permutationsuntersuchungen und systematische Beurteilung im Vergleich zu Gen-Gen-Verbindungen in Online-Datenbanken zeigten eine erhöhte Prognosefähigkeit der beiden HAEC bayesschen Netze. Es wurden die Schlüsselfaktoren und deren Teilnetzwerke berechnet und auf biologische Wege hin untersucht. Hierbei wurde das mitochondriale Protein MTHFD2 als ein Schlüsselfaktor für ein Teilnetzwerk des oxPAPC bayesschen Netzes identifiziert. Dieses Teilnetz zeigte eine ähnliche Gensatzanreicherung wie GOC-AA und überlappte mit diesem signifikant.
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The composition of cellular membranes is extremely complex and the mechanisms underlying their homeostasis are poorly understood. Organelles within a eukaryotic cell require a non-random distribution of membrane lipids and a tight regulation of the membrane lipid composition is a prerequisite for the maintenance of specific organellar functions. Physical membrane properties such as bilayer thickness, lipid packing density and surface charge are governed by the lipid composition and change gradually from the early to the late secretory pathway. As the endoplasmic reticulum (ER) is situated at the beginning of the cells secretory pathway, it has to accept and accommodate a great variety and quantity of secretory and transmembrane proteins, which enter the ER on their way to their final cellular destination. Secretory proteins can be translocated into the lumen of the ER co- or posttanslationally and membrane proteins are being inserted and released into the ER membrane. In the oxidative milieu of the ER-lumen, supported by a variety of chaperones, proteins can fold into their native form.
If the folding capacity of the ER-lumen is exceeded, an accumulation of mis- or unfolded proteins in the lumen of the ER occurs, consequently triggering the unfolded protein response (UPR). This highly conserved program activates a wide-spread transcriptional response to restore protein folding homeostasis. In fact, 7 – 8% of all genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) are regulated by the UPR. The mechanism underlying the activation of the UPR by protein folding stress has been investigated thoroughly in the last decades and many of its mechanistic details have been elucidated. Recently, it became evident that aberrant lipid compositions of the ER membrane, collectively referred to as lipid bilayer stress, are equally potent in activating the UPR. The underlying molecular mechanism of this membrane-activated UPR, however, remained unclear.
This study focuses on the UPR in S. cerevisiae and characterizes the inositol requiring enzyme 1 (Ire1) as the sole UPR sensor in S. cerevisiae. Active Ire1 forms oligomers and, collaboratively with the tRNA ligase Rlg1, splices immature mRNA of the transcription factor HAC1, which results in the synthesis of mature HAC1 mRNA and the production of the active Hac1 protein, which binds to UPR-elements in the nucleus and activates the expression of UPR target genes. Here, the combination of in vivo and in vitro experiments is being used, which is supplemented by molecular dynamics (MD) simulations performed by Roberto Covino and Gerhard Hummer (MPI for Biophysics, Frankfurt), aiming to identify the molecular mechanism of Ire1 activation by lipid bilayer stress. This study focuses on the analysis of the juxta- and transmembrane region of Ire1. Bioinformatic analyses revealed a putative ER-lumenal amphipathic helix (AH) N-terminally of and partially overlapping with the transmembrane helix (TMH). This predicted AH contains a large hydrophobic face, which inserts into the ER membrane, forcing the TMH into a tilted orientation within the membrane. The resulting unusual architecture of Ire1’s AH and TMH constitutes a unique structural element required for the activation of Ire1 by lipid bilayer stress.
To investigate the function of the AH in the physiological context, different variants of Ire1 were produced under the control of their endogenous promoter and from their endogenous locus. The functional role of the AH was tested, by disrupting its amphipathic character by the introduction of charged residues into the hydrophobic face of the AH. The role of a conserved negative residue between the TMH and the AH (E540 in S. cerevisiae) was tested by substituting it by a unipolar, polar, or positively charged residue. These variants were intensively characterized using a series of assays:
This thesis provides evidence that the AH is crucial for the function of Ire1: Mutant variants with a disrupted (F531R, V535R) or otherwise modified AH (E540A) exhibited a lower degree of oligomerization and failed to catalyze the splicing of the HAC1 mRNA as the Wildtype control. Likewise, the induction of PDI1, a target gene of the UPR, was greatly reduced in mutants with a disrupted or defective AH. These data revealed an important functional role of the AH for normal Ire1 function.
An in vitro system was established to analyze the membrane-mediated oligomerization of Ire1. This system enabled the isolated functional analysis of the AH and TMH during Ire1 activation by lipid bilayer stress. A fusion construct, coding for the maltose binding protein (MBP) from Escherichia coli (E. coli), N-terminally to the AH and TMH of Ire1 was produced. The heterologous production in E. coli, the purification and reconstitution of this minimal sensor of Ire1 in liposomes was established as part of this study. To analyze the oligomeric status of the minimal sensor in different lipid environments, continuous wave electron paramagnetic resonance (cwEPR) spectroscopic experiments were performed. These experiments revealed that the molecular packing density of the lipids had a significant influence of the oligomerization of the spin-labeled membrane sensor: increasing packing densities resulted in sensor oligomerization. The AH-disruptive F531R mutant, in which the amphipathic character of the AH was destroyed, showed no membrane-sensitive changes in its oligomerization status.
Thus, the activation of Ire1 by lipid bilayer stress is achieved by a membrane-based mechanism. According to the current model, the AH induces a local membrane compression by inserting its large hydrophobic face into the membrane. As membrane thickness and acyl chain order are interconnected, this compression simultaneously results in an increased local disordering of lipid acyl chains. Supporting MD simulations performed by Roberto Covino and Gerhard Hummer revealed that the bilayer compression is significantly more pronounced in a densely packed lipid environment, than in a lipid environment of lower lipid packing density. Hence, the energetic cost of the local compression increases with the packing density of the membrane, but is compensated for by the oligomerization of Ire1. This minimization of energetic cost induced by the membrane deformation of Ire1 forms the basis for the activation of Ire1 by lipid bilayer stress.
Gepulste dipolare EPR-Spektroskopie ist eine wertvolle Methode, um Abstände von 1.5 bis 10 nm zwischen zwei Spinmarkern zu messen. Diese Information kann für Strukturbestimmungen hilfreich sein, wo traditionelle Methoden wie Kristallstrukturanalyse und NMR nicht angewendet werden können. Zusätzlich ist es möglich, Änderungen in Konformation und Flexibilität zu verfolgen. Für diese Studien haben sich stabile Nitroxidradikale als Spinmarker etabliert. Diese werden spezifisch durch die site-directed spin labelling Methode (SDSL) kovalent an das zu untersuchende Biomolekül gebunden. In den letzten Jahren wurden weitere Spinmarker für Abstandsbestimmungen mittels EPR-Spektroskopie entwickelt. Besonders interessant sind Triarylmethylradikale (im Folgenden abgekürzt als Trityl) und paramagnetische Metallzentren.
Im Vergleich zu Nitroxidradikalen hat das Tritylradikal einige Vorteile: Eine höhere Stabilität in einer reduzierenden Umgebung wie im Inneren von Zellen, längere Elektronenspin-Relaxationszeiten bei Raumtemperatur und ein schmaleres EPR-Spektrum. Deswegen ist dieses organische Radikal ein alternativer Spinmarker, der besonders gut für die Forschung von Biomolekülen in einer nativen Umgebung unter physiologischen Bedingungen geeignet ist. Auch paramagnetische Metallzentren sind weniger reduktionsempfindlich als Nitroxidradikale. Zusätzlich sind diese Spinmarker interessant in biologischen Fragestellungen. Zum Beispiel besitzen zahlreiche Enzyme paramagnetische Manganzentren als Cofaktoren. Zudem kann Magnesium, ein wesentlicher Cofaktor in Enzymen, Nukleinsäuren und Nukleotid-Bindungsdomänen der G- und Membranproteine, oft durch das paramagnetische Mangan ersetzt werden. Um Abstandsmessungen an Biomolekülen, die nur ein Metallzentrum besitzen, durchzuführen, können zusätzliche Spinmarker in Form eines Nitroxid-, Tritylradikals oder eines anderen paramagnetischen Metallkomplexes mithilfe der SDSL-Methode kovalent gebunden werden.
Nitroxidradikale, Tritylradikale und Metallzentren haben deutlich unterschiedliche EPR-spektroskopische Eigenschaften, welche oft als orthogonale Spinmarker bezeichnet werden. Solche Spinmarker sind nützlich für die Untersuchung von verschiedenen Untereinheiten bei makromolekularen Komplexen. Somit können die intramolekularen Abstände innerhalb einer Untereinheit sowie intermolekularen Abstände zwischen den unterschiedlichen Untereinheiten mit nur einer einzigen Probe bestimmt werden. Zusätzlich können die orthogonalen Marker sehr effektiv genutzt werden, um Metallzentren in Biomolekülen mithilfe der Trilateration-Strategie genau zu lokalisieren.
Die hier vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Nutzung dieser neuen Spinmarker für Abstandsmessungen. Solche Spinmarker sind noch kaum erforscht, obwohl sie für biologische Anwendungen eine große Rolle spielen könnten.
Das erste Ziel dieser Doktorarbeit war eine Studie über Tritylradikale mithilfe der dipolaren EPR-Spektroskopie. Zu diesem Zweck wurden sowohl double quantum coherence (DQC) und single frequency technique for refocussing dipolar couplings (SIFTER) Experimente als auch Hochfrequenz pulsed electron electron double resonance (PELDOR) Experimente mit einem Trityl-Modellsystem durchgeführt. Dabei wurden die Besonderheiten der unterschiedlichen dipolaren Spektroskopiemethoden mit diesem Spinmarker untersucht, um die Empfindlichkeit und Robustheit für die Abstandsmessungen zu optimieren.
Das zweite Ziel war eine Studie über den Einfluss der Hochspin-Multiplizität des Mangans auf die Abstandsbestimmungen. Für diesen Zweck wurde zuerst ein Modellsystem mit einem orthogonalen Mn2+ Ion und Nitroxidradikal mithilfe der PELDOR-Spektroskopie untersucht. Anschließend wurde ein weiteres Modellsystem mit zwei Mn2+-Ionen untersucht, um PELDOR und relaxation-induced dipolar modulation enhancement (RIDME) Experimente bezüglich ihrer Empfindlichkeit und Robustheit sowie Genauigkeit der Datenanalyse zu optimieren.
Das Trityl-Modellsystem wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Sigurdsson synthetisiert. Die EPR Messungen wurden bei zwei verschiedenen Mikrowellenfrequenzen (34 und 180 GHz) durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die Auswahl der optimalen Methode von den EPR-spektroskopischen Eigenschaften des Systems bei den jeweiligen Mikrowellenfrequenzen abhängig ist. Das EPR-Spektrum des Trityls ist bei 34 GHz so schmal, dass das ganze Spektrum von einem üblichen Mikrowellenpuls angeregt werden kann. In diesem Fall sind die DQC und SIFTER Experimente am besten geeignet. Der mit diesen Methoden bestimmte Abstand von 4.9 nm ist in guter Übereinstimmung mit Werten aus der Literatur. Es wurde festgestellt, dass die SIFTER Messung eine höhere Empfindlichkeit als DQC besitzt, da das Signal-zu-Rausch Verhältnis um den Faktor vier größer ist. Außerdem ist die SIFTER-Methode experimentell weniger anspruchsvoll, da ein deutlich kürzerer Phasenzyklus für die Mikrowellenpulse benötigt wird. ...