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This study addresses the structure-function relationships of three essential membrane proteins: Porin from Paracoccus denitrificans, Porin OmpG from Eschericia coli and BetP from Corynobacterium glutamicum using Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy and Attenuated Total Reflection (ATR) techniques. The structure of porin from P. denitrificans is known for more than a decade; however, the mechanism for loss of functionality together with the monomerization was not clear. In this study we have addressed the role of lipids for the functionality of porin using FT-IR. OmpF porin was found to interact with the lipid molecules via the aromatic girdles surrounding the protein for functionality. In this study, molecular bonds and groups of the lipids were established as reporter groups probing at different depths of the bilayer in order to understand the interaction partner of the aromatic girdles of porins. Monomerization of the trimeric assembly of OmpF porin reconstituted in lipids is induced by increasing the temperature. Porin (OmpF) was found to be extremely stable: The secondary structure of the protein was unaltered up to the temperature-induced main transition, around 80-90 °C, above which it is denatured. However, the interaction of the aromatic girdle with the lipid molecules exhibited distinct changes at much lower temperature values (40 - 50°) where, according to the previous functional studies, monomerization and the loss of function occurs. The results are compared with OmpG porin from E.coli, for which the functional unit is a monomer. The aromatic girdle-lipid interaction was monitored by the tyrosine aromatic ring C=C vibrational mode, a universal marker for the protein stability and interaction. We have also found that the aromatic girdles of porins are interacting with the interfacial region of the lipid bilayer instead of lipid headgroups. Lipid-protein interaction was found to be not only essential for the structural stability, but also for the functionality of OmpF porin. We have also studied the structural properties of OmpG from E.coli. The structure of OmpG at two pH values has been resolved using X-ray crystallography and the channel has been proposed to attain different states at different pH values as closed (pH < 5.5) and open (pH >7.5). This study, using IR spectroscopy, revealed that the pH-induced opening and closing of the channel is reflected by the frequency shifts of the ? sheet structure. OmpG has more rigid ? barrel properties upon opening of the channel. IR spectral analysis revealed multiple ? sheet signals with different hydrogen bond strengths. This enabled us to monitor the formation of hydrogen bridges between the extracellular loops upon opening of the channel. The conclusion that OmpG porin having two states at different pH values was also confirmed by the three mutants where the role of the histidine pair (H231 & H261) and loop 6 has been addressed. Temperature-profiling of the wild type (WT) protein and the mutants did not show pH dependent structural stability differences in detergent solution. However, the WT protein was found to be more stable in the open form in 2D crystals than the closed form. Reconstitution into lipids has increased the transition temperature value by ~20 °C in the closed state and ~25 °C in the open state. Therefore we conclude that the open and closed state of OmpG has structural stability differences that are only revealed in the lipid environment. A comparison of the transition temperature values of OmpG WT and the mutants suggested that the hydrogen bond network among S218-H231-H261-D267, together with the formation of 12 residue-long ?-sheet contributes to the structural stability of the open channel. In the process of closing and opening of the channel, the globular structure of the protein remains mainly unchanged, while there are changes in the side chain moieties. In addition to the role of the histidine pair and the loop L6, in situ opening/closing experiments showed that the negatively charged amino acids, i.e. Asp and Glu, and Arg residues also play an active role; possibly by interacting with each other inside the pore lumen. Therefore it could be concluded that the closure of the channel at acidic pH values is not only via closing the channel entrance by loop 6, but also via changing the electric potential inside the lumen due to the different states of charged amino acids in order to effectively block the gateway. BetP from C.glutamicum attains an active and inactive state in order to adjust its glycine betaine uptake rate to the osmotic conditions that the cell encounters. The structure of BetP is not yet available. The WT protein exhibited structural differences in the presence of excess K+, which is one of the activation conditions. In 2D crystals, increasing the ionic strength to 700 mM K+ was shown to induce changes in the ?-helical moiety with contributions from the ester groups and one Tyr residue using ATR-FTIR. An increase in ionic strength to 220 mM K+ was found to be the threshold value of potassium concentration ([K+]) where the protein exhibits structural alterations in detergent solution. The determined [K+] values are in good agreement with the previous functional studies. However, there are differences in the activation profile of BetP in 2D crystals and in detergent solution, which points out that the lipids are involved in the conformational transition from the inactive to the active state and their absence can lead to different structural properties. BetP WT was found to have ~65% alpha-helix, ~25% random coil and ~10% turn structure in detergent solution. In the presence of excess K+, the WT protein is found to adapt more unordered structure. Secondary structure analysis of the mutants revealed that both the N- and C-terminus are in ?-helical conformation. Reconstitution of WT protein in 2D crystals increased the main transition (denaturation) temperature value from ~62 °C to ~85 °C, a clear indication that the protein is more stable in lipid environment. Temperature-profiling of the two forms of the WT protein revealed that the structural breakdown is preceeded by monomerization of the trimeric assembly. Comparing the two forms of the WT protein and the mutant BetA, we conclude that the oligomeric status is stabilized via the interactions among hydrophilic regions involving the N terminus. H/D exchange and activation with excess K+ in D2O-buffer revealed that activation of the protein involves the interaction of Arg and Asp/Glu residues in the cytoplasmic region of the protein. BetP WT and the two mutants tested, i.e. BetA and BetP?C45, showed differences in protein packing upon activation. The WT protein and BetP?C45 mutant also show changes in the hydrogen bonding properties of turns. Since BetA does not show such a property in activation, we conclude that the N-terminus interacts with the loops in the inactive state via the interaction of charged amino acids for the WT protein and that this interaction is altered during the activation. It could be argued that the protein packing is affected via the changes in turns upon activation. We also have found experimental evidence that one Tyr residue has different orientations in the active and inactive state of BetP. Based on the previous functional studies, it could be one of the five Tyr residues in the cytoplasmic region of the protein (in loop 3, 6, 7 or C-terminus). The mutant BetP?C45, on the other hand, showed fewer differences between the active and inactive state conditions and based on the H/D exchange rates, the mutant shows the properties of an active WT protein, proving that the C-terminal truncation impairs the conformational transition between the active and inactive states.
Struktur, Funktion und Dynamik von Na(+)-, H(+)-Antiportern : eine infrarotspektroskopische Studie
(2008)
Die Funktion von Membranproteinen ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Um diese verstehen zu können, ist das Verständnis der Beziehungen zwischen der Struktur, der Dynamik und der Wechselwirkung mit der Umgebung der Membranproteine notwendig. Spektroskopische Methoden, wie beispielsweise FTIR- und CD-Spektroskopie sind in der Lage, diese Informationen zu geben. In der vorliegenden Dissertation haben sie bedeutende Beiträge zum Verständnis der durch die Aktivierung induzierten Konformationsänderungen der Na+/H+ Antiporter geleistet. Die hohe Empfindlichkeit einer selbstkonstruierten FTIR-ATR-Perfusionszelle ermöglichte es, über eine Proteinprobe verschiedene Wirkstoffmoleküle perfundieren zu lassen und die dadurch verursachten strukturellen Änderungen spektroskopisch zu charakterisieren. Die Konformationsänderungen, die den Aktivierungsprozess begleiten, wurden bei zwei verschiedenen Na+/H+ Antiportern, NhaA und MjNhaP1, untersucht. Sie werden bei unterschiedlichen pH-Bereichen aktiviert bzw. deaktiviert. Der Na+/H+ Antiporter NhaA aus E. coli hat seine maximale Transportaktivität bei pH 8,5 und ist bei pH < 6,5 vollständig inaktiv. Trotz bekannter 3D-Struktur dieses Proteins für die inaktive Konformation bei pH 4 bleiben die Konformationsänderungen, die mit der Aktivierung des Proteins einhergehen, immer noch ungeklärt. Die Analyse der FTIR- und CD-Spektren von NhaA ergab in beiden Zuständen Anteile an beta-Faltblatt, an Schleifen und ungeordneten Strukturen, wobei die alpha-helikale Struktur dominiert. Die FTIR Spektren des inaktiven und aktiven Zustands zeigen zwei Komponenten, die auf die Präsenz zweier alpha-Helices mit unterschiedlichen Eigenschaften abhängig vom Aktivitätszustand hindeuteten. Die temperaturinduzierten strukturellen Änderungen und die Reorganisation des Proteins während des Entfaltungsprozesses bestätigten, dass die Aktivierung des Proteins eine Änderung in den Eigenschaften der alpha-Helices zur Folge hat. Aktivierung führt zu einer thermischen Destabilisierung dieser Struktur. Auch für die beta-Faltblattstruktur, welche den Hauptkontakt zwischen den Monomeren bildet, wurde ein unterschiedliches thermisches Verhalten zwischen dem inaktiven und aktiven Zustand beobachtet. Daraus konnte gefolgert werden, dass Aktivität nur dann möglich ist, wenn NhaA als Dimer vorliegt. Die Ergebnisse des (1)H/(2)H Austauschs zeigen, dass die Lösungsmittelzugänglichkeit des Proteins sich mit der Aktivierung ändert. Die Aktivierung des Proteins induziert eine offene, für die Lösung zugänglichere Konformation, in welcher die Aminosäureseitenketten in der hydrophilen Region des Proteins schneller Wasserstoff durch Deuterium austauschen, und in welcher zusätzliche Aminosäureseitenketten, die sich im inaktiven Zustand in der hydrophoben Region des Proteins befinden, mit der Aktivierung der Lösung exponiert werden. Die Aufnahme reaktionsinduzierter Differenzspektren ergab eindeutige spektroskopische Signaturen für die Zustände „inaktiv“ und „aktiv“. Die Differenzspektren der pH-Titration zeigten, dass der pH-Wert einen dramatischen Effekt sowohl auf die Sekundärstruktur als auch auf den Protonierungszustand der Aminosäureseitenketten hat. Die pH- und Na+-induzierte Aktivierung des Proteins führt zur Umwandlung der transmembranen alpha-helikalen Struktur bezüglich Länge, Ordnungsgrad und/oder Anordnung und zur einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Glutaminsäure oder Asparaginsäure. Die pD induzierten Sekundärstrukturänderungen lieferten zusätzlich Informationen über die Umgebungsänderung der Aminosäureseitenkette des Tyrosins mit der Aktivierung. Der Vergleich der durch die Bindung des Natriums und des Inhibitors induzierten Differenzspektren zeigte, dass die Bindungsstellen des Natriums und des Inhibitors unterschiedlich sind. Die FTIR- und CD-Ergebnisse für den Na+/H+ Antiporter MjNhaP1 aus M. jannaschii, der im Gegensatz zu NhaA bei pH 6 aktiv und bei pH Werten > 8 inaktiv ist, zeigten, dass ähnlich wie NhaA das Protein im aktiven Zustand bei pH 6 hauptsächlich aus alpha-Helices aufgebaut ist. Es bestand die Möglichkeit, zwei verschiedene Probenpräparationen (Protein in Detergenz bzw. in 2D-Kristallen) zu untersuchen und miteinander zu vergleichen. Die Erhöhung des pH-Werts bei der in Detergenz solubilisierten Probe führte zu einer Abnahme der alpha-helikalen und einer Zunahme der ungeordneten Strukturen. Das äußerte sich auch in den Untersuchungen zur thermischen Stabilität und im (1)H/(2)H Austauschexperiment. Die thermische Stabilität der alpha-Helices nahm mit der Inaktivierung dramatisch ab. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass bei der Aktivierung von MjNhaP1 die beta-Faltblattstruktur nicht involviert ist, aber diese von fundamentaler Bedeutung für die Gesamtstabilität des Proteins und wahrscheinlich für den Hauptkontakt zwischen den Monomeren verantwortlich ist. Im Gegensatz zu NhaA ist die Monomer Monomer Wechselwirkung nicht für die Aktivität von MjNhaP1 notwendig. Aufgrund des höheren Anteils von ungeordneter Struktur im inaktiven Zustand der in Detergenz solubilisierten Probe beobachtet man in diesem Zustand einen höheren (1)H/(2)H Austausch. Der Vergleich mit den Ergebnissen des (1)H/(2)H Austausches von 2D-Kristallen ermöglichte die Lokalisation der ungeordneten Struktur an der Außenseite des Proteinmoleküls im inaktiven Zustand. Die pH-induzierten Differenzspektren zeigten, dass die Aktivierung zu einer Helikalisierung des Proteins und einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Asparaginsäure und/oder Glutaminsäure unabhängig von der Probenpräparation führt. Der Vergleich von NhaA und MjNhaP1 zeigt, dass die Aktivierung in beiden Fällen mit einer Konformationsänderung und Änderung der Protonierung oder der Umgebung von einer oder mehreren Seitenketten von Asparaginsäure oder Glutaminsäure verbunden ist. Dabei sind die Strukturänderungen der beiden Proteine während der Aktivierung ähnlich, bei Inaktivierung jedoch deutlich unterscheidbar. Die pH-induzierten Strukturänderungen wurden bei NhaA und MjNhaP1 durch die Mutanten G338S und R347A, die keine pH-Abhängigkeit der Aktivität zeigen, bestätigt.
Die Funktion biologischer Peptide und Proteine hängt wesentlich von deren intakten molekularen Struktur ab. Krankheiten, wie z.B. Alzheimer oder Diabetes, entstehen durch fehlgefaltete, aggregierte Peptidstrukturen. Die Ausbildung einer nativ gefalteten Konformation wird durch die Formierung von Sekundärstrukturelementen - in charakteristischer Weise angeordnete lokale Strukturen - initiiert und bildet einen geschwindigkeitslimitierenden Schritt in der Proteinfaltung. Die Erforschung und Analyse dieser ersten Faltungsprozesse ist deshalb von grundlegender Relevanz in der biophysikalischen Forschung, auch in Hinblick auf pharmazeutisch-medizinische Anwendungen. Bei der Untersuchung des Faltungsmechanismus kommen vor allem kleine Peptide mit eindeutig ausgebildeten Sekundärstrukturmotiven zum Einsatz. Ihre geringe Größe und strukturelle Eindeutigkeit machen diese kleinen Peptide zu idealen Modellsystemen, um diejenigen Faktoren zu untersuchen, die die Proteinfaltung steuern und beeinflussen. Die zur Untersuchung der Faltungsprozesse verwendeten Techniken müssen dabei sowohl eine Spezifität für die unterschiedlichen Strukturelemente, als auch eine der Faltungsdynamik angemessen Zeitauflösung besitzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden CD- und FTIR-Messungen zur Untersuchung der Strukturstabilität von Polypeptiden unter Gleichgewichtsbedingungen durchgeführt. Durch Variation von pH-Wert und Temperatur wurden damit Stabilitätseigenschaften ausgewählter Peptidsysteme analysiert. Um zeitaufgelöste Faltungsdynamiken von Peptiden detektieren zu können, wurde ein Spektrometer mit Laser-induziertem Temperatursprung (DeltaT ca. 10 °C in 10 ns) und IR-Einzelwellendetektion so modifiziert und optimiert, dass Peptiddynamiken im nanosec bis microsec Zeitbereich gemessen werden konnten. Neben der Modifikation der Temperatursprung-Apparatur, bei der optische Komponenten ersetzt und Störsignale reduziert wurden, konnte auch die Auswertung der kinetischen Daten durch die Entwicklung eines geeigneten Algorithmus verbessert werden. Als notwendige Vorarbeit der Faltungsstudien an Peptiden in wässriger Lösung wurden statische FTIR-Absorptionsmessungen am Lösungsmittel D2O durchgeführt. Dadurch wurden die durch Temperaturvariation erzeugten Absorptionsänderungen des Lösungsmittels ermittelt. Diese wurden zudem zur Kalibrierung des Laser-induzierten Temperatursprunges verwendet. Um Lösungsmittelabsorptionen von strukturellen Änderungen des Peptids zu trennen, wurde ein Auswerteverfahren entwickelt, das die temperaturabhängigen Absorptionsänderungen des Lösungsmittels berücksichtigt. Temperatur- und pH-abhängige Konformationsdynamik wurde am alpha-helikalen Peptid Polyglutaminsäure untersucht. Zunächst wurden CD- und FTIR-Messungen zur Thermostabilität und der Reversibilität der Ent- und Rückfaltung unter Gleichgewichtsbedingungen und bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt. Der thermisch induzierte Strukturübergang von alpha-Helix nach ungeordneter Knäuel-Struktur wurde mit Hilfe der Laser-induzierten Temperatursprung-Technik zeitaufgelöst untersucht und Relaxationsraten bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Weitere Messungen zur Konformationsstabilität und –dynamik wurden an beta- Hairpin-Peptiden durchgeführt, die kleine Modellsysteme für beta-Faltblattstrukturen darstellen. Die in dieser Arbeit untersuchten Trpzip2C Peptide, die aufgrund hydrophober Wechselwirkungen der Tryptophane eine stabile beta-Hairpin-Struktur in wässriger Lösung ausbilden, waren an verschiedenen Positionen innerhalb der Aminosäure-sequenz selektiv isotopenmarkiert. Durch diese Markierungen im Peptidrückgrat werden spezifisch spektrale Änderungen im Infrarotspektrum erzeugt, die Untersuchungen zur Amidbandenkopplung und lokalisierten Strukturdynamik ermöglichen. Diese Ergebnisse stellen die erste Anwendung der Kombination von selektiv isotopenmarkierten alpha-Hairpin-Peptiden und der Temperatursprung-Technik dar, um Konformationsdynamiken ortsaufgelöst zu untersuchen. Für alle untersuchten Trpzip2C-Peptidvarianten konnte gezeigt werden, dass der Faltungsprozess in einem Temperaturbereich unterhalb von ~ 300 K nicht durch ein Zwei-Zustandsmodell beschrieben werden kann, sondern Intermediate gebildet werden. In diesem Temperaturbereich konnten wellenlängenabhängig Unterschiede in Relaxationsraten gemessen werden, die die Hypothese des „hydrophoben Kollaps“ für den Faltungsmechanismus dieser beta-Hairpin-Peptide unterstützen.