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FPP und GGPP sind Intermediate des Mevalonat-Weges und fungieren als post-translationale Modifikation kleiner GTPasen. Die Prenylierung kleiner GTPasen erfolgt katalysiert von spezifischen Prenyltransferasen und ist notwendig um die kleinen GTPasen in Membranen zu verankern, wo ihre Aktivierung stattfindet. Zu den intrazellulären Funktionen der GTPasen gehören unter anderem der Aufbau des Cytoskeletts, das neuronale Zellwachstum, die Leitung und Ausläuferbildung von Axonen, das Dendritenwachstum, die Synapsenformation, die synaptische Plastizität und die Apoptose. Diese Funktionen spielen in der Gehirnalterung sowie in neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer Demenz (AD) und auch bei der Glioblastoma multiforme (GBM) eine wichtige Rolle.
Im Zuge einer in vivo Studie an C57BL/6 Mäusen konnten in der vorliegenden Arbeit altersbedingte Veränderungen der Lokalisation verschiedener Rho- und Rab-GTPasen in Membran- und Cytosol-Präparationen sowie der GGTase-I in Gehirnen gealterter Tiere gezeigt werden. Die zelluläre Lokalisation der Rho GTPasen Rac1, RhoA und Cdc42 verschiebt sich im Alter zu reduzierten Membran-gebundenen und erhöhten cytosolischen Gehalten. Dies ist mit einer Reduktion der Protein- und mRNA- Gehalte des Enzyms GGTase-Iβ assoziiert, der Untereinheit der GGTase-I, die die Bindung des Isoprenoids GGPP an die Rho-GTPasen reguliert. Diese wiederum korrelieren direkt mit der altersbedingten Reduktion der relativen GGTase-Aktivität. Die in vitro Inhibition der GGTase-I mittels GGTI-2133 an SH-SY5Y Zellen erwies sich als Modell, welches die gleichen Effekte wie die gealterten Gehirne in vivo zeigt.
7, 8-Dihydroxyflavon (7, 8-DHF) ist ein natürlich vorkommendes Flavon, welches als hoch affiner selektiver TrkB-Rezeptor-Agonist fungiert und hierdurch wie das Neurotrophin BDNF das Überleben von Neuronen, deren Differenzierung, synaptische Plastizität und Neurogenese vermittelt. In vivo verursacht die orale Gabe von 7, 8-Dihydroxyflavon in Gehirnen alter Tiere eine Abnahme des Isoprenoids GGPP, die Zunahme der prenylierten Membran-gebundenen GTPase Rac1 und eine Reduktion des Gehaltes an Membran-gebundenem Rab3A auf das Niveau der Gehalte in den Gehirnen der jungen Kontroll-Tiere. Das Neurotrophin BDNF interagiert mit dem TrkB-Rezeptor und ist in der Lage direkt an den Rac1-spezifischen GEF Tiam1 zu binden, wodurch dieser aktiviert wird und Veränderungen der zellulären Morphologie der betroffenen Neurone induziert. Während das Alter und die orale Gabe von 7, 8-Dihydroxyflavon in vivo keine Effekte auf die Proteingehalte von BDNF und TrkB in der Tierstudie aufzeigten, konnte eine alterbedingte Reduktion von Tiam1 im Hirngewebe detektiert werden, die wiederum durch 7, 8-Dihydroxyflavon aufgehoben werden konnte.
Die Isoprenoide FPP und GGPP, sowie die Regulation kleiner GTPasen spielen auch eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit Veränderungen der APP-Prozessierung in der molekularen Pathogenese der AD. Bei der APP-Prozessierung sind die beiden Sekretasen β- und γ-Sekretase für die Bildung des β-Amyloid-Peptids verantwortlich. In vitro Studien mit dem β-Sekretase-Inhibitor IV und dem γ-Sekretase-Inhibitor DAPT an untransfizierten und APP-transfizierten HEK293 Zellen (HEK293-APP695wt und HEK293-APPsw Zellen) konnten zeigen, dass sowohl die β- als auch die γ-Sekretase an der Regulation der Isoprenoide FPP und GGPP beteiligt sind. FPP und GGPP liegen in APP-transfizierten HEK293 Zellen erhöht vor. Die Inhibition der β-Sekretase führt zur Reduktion von FPP und GGPP. Durch die Inhibition der γ-Sekretase wird ausschließlich FPP reduziert. Weiterhin liegen in APP-transfizierten HEK293 Zellen die Membran-gebundenen prenylierten Rho-GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA erhöht vor. Das Membran-gebundene prenylierte H-Ras kommt jedoch in APP-transfizierten Zellen im Vergleich zu untransfizierten HEK293 Zellen in deutlich niedrigeren Mengen vor. Die Inhibition der β-Sekretase bedingt die Reduktion von Membran-gebundenem prenylierten Rac1 und auch von Membran-gebundenem H-Ras in HEK293-APPsw Zellen.
Veränderungen von Signaltransduktionswegen, die durch kleine GTPasen vermittelt werden, haben sich auch bei der GBM als zentraler Teil der molekularen Pathogenese herausgestellt. Hierbei ist die Prenylierung durch FPP und GGPP die Voraussetzung für die Membran-Insertion und onkogenen Funktion der Ras- und Rho-Proteine über die Stimulierung des Ras-Raf-MEK-ERK Signalweges. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der HMG-CoA-Reduktase Inhibitor Lovastatin die Bildung der beiden Isoprenoide FPP und GGPP in U87 und U343 Glioblastoma Zellen verringert und hierdurch die Isoprenylierung von H-Ras und Rac1 reduziert. Das natürlich vorkommende Monoterpen Perrilylalkohol hingegen inhibiert die Prenyltransferasen FTase und GGTase und verändert dadurch die post-translationale Prenylierung der GTPasen Rac1 und H-Ras in U87 und U343 Zellen ohne die Isoprenoide FPP und GGPP signifikant zu beeinflussen. Jedoch bewirkt Perillylalkohol in U343 Zellen eine Erhöhung des GGPPs. Beide Substanzen bewirkten die Reduktion der ERK-Phosphorylierung und der Migration, Invasion und Proliferation der untersuchten U87 und U343 Glioblastoma Zellen.
Obesity is considered as a type of chronic inflammation. It enhances the risk of developing cardiovascular disease, diabetes, and some cancers. The key players in the induction of inflammation in adipose tissue are macrophages. However the mechanism of macrophage activation in obese fat tissue is still not fully understood. Elevated level of saturated fatty acids in adipose tissue promotes inflammation and insulin resistance. Exposure of macrophages to saturated fatty acids stimulates pro-inflammatory c-Jun N-terminal kinase (JNK), nuclear factor kappa B (NF-kB) signaling, and production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-6, IL-8, IL-1β, and TNFα. Palmitate is a major saturated free fatty acid released by adipocytes. It activates inflammatory pathways through Toll-like receptors (TLR) 2 and 4, provokes endoplasmic reticulum (ER) stress and increases levels of diacylglycerols (DAGs) and ceramides. Saturated fatty acids also affect cellular oxidative metabolism. Thus, mitochondrial fatty acid oxidation reduces ER-stress and expression of inflammatory cytokines in palmitate-treated macrophages. On the other hand mitochondrial reactive oxygen species (ROS) promote palmitate-mediated pro-inflammatory cytokine production. Recently, mitochondrial functions were linked to their morphology. Mitochondrial fission has been reported in β-cells and myocytes in response to high levels of glucose and free fatty acids, and was associated with disruption of mitochondrial functions, increased ROS level, and cell death. The aim of this study was to investigate the role of mitochondrial fragmentation in palmitate-induced inflammation in human macrophages. In our settings fatty acids, independently of their saturation, affected mitochondrial morphology. Mixtures of long chain saturated and unsaturated fatty acids as well as triglyceride-rich lipoprotein lipolysis products promoted mitochondrial fission. Mitochondrial fragmentation in palmitate-treated macrophages revealed a time- and concentration-dependent character, and was reversible upon palmitate removal. This observation, together with unaltered levels of mitochondrial protein and DNA content, and intact mitochondrial respiration, suggested that mitochondria were not damaged and were functionally active. Mechanistically, palmitate-induced mitochondrial fragmentation was not regulated by ER stress or loss of mitochondrial membrane potential. However, inhibition of palmitate incorporation into mitochondrial membrane phospholipids decreased mitochondrial fragmentation. Other approach to prevent mitochondrial fission was the inhibition of dynamin-related protein 1 (DRP1) activity, which drives mitochondrial fission by forming ring- like structures around mitochondria and constricting mitochondrial membranes. Palmitate altered mitochondrial membrane lipid composition and promoted DRP1-oligomerization. The inhibition of palmitate-induced mitochondrial fragmentation enhanced mitochondrial ROS production, c-Jun phosphorylation, and upregulated expression of pro-inflammatory cytokines. Taken together, these results suggest that mitochondrial fragmentation is a protective mechanism attenuating palmitate-induced inflammatory responses. Future experiments will be required to investigate the role of mitochondrial fragmentation in obesity-associated diseases in vivo.
Ausgangspunkt der Studie ist die These, dass sprachlich und kulturell heterogene Lerngruppen, an denen Studierende mit und ohne spanischsprachigen Familienhintergrund gemeinsam teilnehmen, als eine günstige Lernsituation betrachtet werden können. Voraussetzung dafür ist, dass die unterschiedlichen sprachlichen und kulturellen Gegebenheiten als Ressourcen für den Unterricht verstanden werden.
Mit dem Fokus auf Sprachveranstaltungen in Spanisch, die von Studierenden an der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main besucht werden, und die im Rahmen ihres Lehramtsstudiums im Fach Spanisch stattfinden, wurden in dieser Studie folgende Forschungsfragen verfolgt:
1. Wie entstehen und entwickeln sich Sprachlernprozesse in sprachlich und kulturell vielfältigen Lernkontexten?
2. Wie zeichnet sich das Lernen in sprachlich und kulturell vielfältigen Lernkontexten aus?
3. Welche sprachlichen und kulturellen Ressourcen können für die sprachliche und kulturelle Förderung genutzt und bewusst eingesetzt werden?
Wichtigste Forschungsergebnisse:
Es wurde festgestellt, dass Sprachlernprozesse bei Studierenden mit und ohne spanischsprachigen Familienhintergrund sowohl im kognitiven als auch im emotionalen Bereich qualitativ unterschiedlich verlaufen und, dass in sprachlich und kulturell vielfältigen Lernkontexten individuelle und überindividuelle Sprachlern-prozesse stattfinden, die einander bedingen.
Was das gemeinsame Lernen angeht, konnte festgestellt werden, dass Studierende ohne spanischsprachigen Familienhintergrund widersprüchliche Erwartungen an die Studierenden mit spanischsprachigem Familienhintergrund haben: Einerseits schätzen sie die Präsenz ihrer Kommilitonen und sehen sie als Mittler zwischen dem Unterricht und der Realität außerhalb des Unterrichts, weil sie die „echte“ Sprache und Kultur in den Klassenraum bringen. Anderseits fühlen sie sich durch ihre Anwesenheit im Unterricht verunsichert, was ihre sprachliche Entwicklung zum Teil hemmt. Bei den Studierenden mit spanischsprachigem Familienhintergrund konnten unterschiedliche Phasen in ihrem Sprachlernprozess beobachtet werden, die ihre Lernattitüde und ihre Haltung zu den Kommilitoninnen und Kommilitonen konditionieren.
Entscheidend für die Konstruktion gemeinsamer Sprachlernprozessen ist, dass die Studierenden ihre Positionierung als peer ihrer Kommilitoninnen und Kommilitonen bewusst wahrnehmen, was nicht immer der Fall ist. Auch die Bewusstwerdung der eigenen Funktion als Mittler zwischen Sprachen und Kulturen insbesondere (aber nicht nur) bei Studierenden mit spanischsprachigem Familienhintergrund soll im Unterricht durch die Reflexion über die eigene sprachliche und kulturelle Identität gefördert werden.
Im Umgang mit solchen Lerngruppen haben Dozentinnen und Dozenten unterschiedliche Erwartungen. In der Regel werden aber Lerninhalte vermittelt, die die sprachliche und kulturelle Vielfalt im Unterricht nicht berücksichtigen. Für die Leistungsbewertung beider Studierendengruppen werden oft unterschiedliche Kriterien angewendet, woraus Konflikte zwischen den Veranstaltungsteilnehmerinnen und -teilnehmern entstehen.
Die Rolle der Dozentinnen und Dozenten selbst ist in der Gestaltung gemeinsamer Lernkontexte, in denen die Interaktion der Studierenden gefördert werden, grundlegend. Damit dies gelingt, sollen sie einerseits für Mehrsprachigkeit als Phänomen der Gesellschaft, das den Sprachunterricht im besonderen Maße betrifft, sensibilisiert sein. Andererseits soll ihnen bewusst werden, dass das Sprachenlernen aus einer kognitiven und einer emotionalen Seite besteht, die in engem Zusammenhang mit mehrsprachigen und mehrkulturellen Identitätskonstruktionen stehen. Beide Seiten sollen im Unterricht gefördert werden.
The Dodd Frank Act of 2010 (DFA) was the legislative response by the US Government to the Global Financial Crisis of 2007. DFA’s rescission of Rule 436 (g) of the Securities Act of 1933 - the exemption from liability clause - was the response to the post-crisis perception that credit rating agencies were insufficiently constrained by reputational risk considerations and consistently failed to provide high quality and accurate credit ratings as a consequence of the immunity they enjoyed and the regulatory reliance placed on ratings, as well as the conflicts of interest that they faced. This paper investigates whether the market failure event that occurred in the Asset Backed Securities market immediately after DFA was signed into law on July 21, 2010 was due to real economic concerns held by rating agencies about operating under a liability regime or whether it was merely an act of brinkmanship on the part of the rating agencies. The paper also predominantly examines US case law to identify the dilution of the freedom of speech defence in state courts, the conflict of interest issues and the legal challenges faced by plaintiffs when bringing a lawsuit against credit rating agencies, and proposes a novel co-pay and capped liability model to address the concerns of both credit rating agencies and investors.
Das Prinzip der endovaskulären Therapie von Aneurysmen mit Platinspiralen hat sich seit seiner Einführung durch Guglielmi 1991 immer mehr als alternatives Verfahren zum neurochirurgischen Clipping etabliert. Insbesondere bei Aneurysmen, die durch den neurochirurgischen Zugang nur schwer zu erreichen sind, hat sich diese Therapieoption bewährt. Neben der Lage spielen auch Größe und Form bei der Entscheidung für das Coiling eine wichtige Rolle. Es ist technisch anspruchsvoll, breitbasige oder besonders kleine Aneurysmen durch dieses Verfahren auszuschalten. Angesichts der aktuellen Datenlage ist es nicht immer möglich, eine zweifelsfreie Entscheidung zu treffen, ob und wie betroffene Patienten bestmöglich behandelt werden sollten. Insbesondere Fragen zur Behandlung und zu Komplikationen bei Aneurysmen ≤ 3 mm sind nicht hinreichend beantwortet, da diese nur in wenigen Studien Gegenstand der Analyse sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, klinische und bildgebende Ergebnisse von Patienten, die im Institut für Neuroradiologie des Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main durch eine endovaskuläre Intervention behandelt wurden, retrospektiv zu analysieren. Insbesondere wurde ein Schwerpunkt auf die Untersuchung der Komplikationsraten und der Aneurysmarupturen gelegt. Dies dient einer erweiterten Einschätzung von Risiko und Nutzen dieser Therapieoption, um eine bestmögliche Beratung und Behandlung der betroffenen Patienten zu gewährleisten.
In der vorliegenden Arbeit wurden 637 endovaskuläre Interventionen betrachtet, die am Institut für Neuroradiologie des Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität zwischen Februar 1999 und März 2011 durchgeführt wurden. In diesem Untersuchungszeitraum von 12 Jahren konnten 47 Patienten mit einem Aneurysma ≤ 3 mm in die Studie eingeschlossen werden. Es erfolgte eine retrospektive Datenerhebung mit Hilfe von Krankenakten, radiologischen Befunden und Angiographie-Dokumentationsprotokollen. Die Zusammensetzung des Patientenkollektivs war vergleichbar mit der der bisherigen Literatur. Das Durchschnittsalter des Patientenkollektivs betrug 55 Jahre. 85 % der Patienten waren Frauen. Bei der Häufigkeit des Auftretens an bestimmten Gefäßlokalisationen konnte ein geringer Unterschied festgestellt werden. Während bei ähnlichen Studien der Großteil der Aneurysmen an der ACI gefunden wurde, war in der vorliegenden Arbeit die AcomA am häufigsten betroffen, gefolgt von der ACI. In Bezug auf die Fehlschlagraten sind die Ergebnisse heterogen. In der vorliegenden Studie war es bei 17 % der behandelten Patienten nicht möglich, das Einbringen einer Platinspirale erfolgreich abzuschließen. Ein kompletter Aneurysmaverschluss erfolgte bei 55 % der Patienten. Bei 28 % der Fälle blieb nach der Intervention ein minimaler Halsrest bestehen. Die allgemeine Komplikationsrate betrug 12,8 %. Zu einer durch die Intervention ausgelösten Ruptur kam es in zwei Fällen (4,3 %), wobei dieser Anteil im mittleren Bereich der in der aktuellen Literatur beschriebenen Rupturraten von 0 % bis 11,7 % liegt. Für die Beurteilung des Therapieerfolgs spielt die Verfügbarkeit von Nachkontrollen eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit war es möglich, in 87 % der Fälle Verlaufskontrollen durchzuführen, was Ergebnissen der Literatur entspricht. Die Wiederbehandlungsrate war mit 4,3 % vergleichsweise niedrig. Die Bildung eines Rezidivaneurysmas konnte in einem Fall beobachtet werden. 59 % der Patienten wiesen präoperativ einen Hunt und Hess Grad von 0 bis 2 auf, während es in anderen Arbeiten bis zu 87 % der Patienten waren. Grad 3 lag bei 15 % der Patienten vor, schwer betroffen waren 15 % mit einem Hunt und Hess Grad von 4 und 11 % mit einem von Grad 5. 55,3 % der in der vorliegenden Studie betrachteten Patienten konnten am Ende des Beobachtungszeitraums nach Einschätzung mittels mRS ihren Alltag ohne fremde Hilfe bewältigen (Stadien 0, 1 und 2). 34,0 % der Patienten benötigten fremde Hilfe und 10,9 % verstarben an den Folgen der SAB. Im Gegensatz dazu konnte in anderen Arbeiten ein mRS-Grad von 0-2 in mehr als 75 % gefunden werden. Dies bestärkt die Annahmen, dass ein primär niedriger Hunt und Hess Grad mit einem besseren und ein hoher Hunt und Hess Grad mit einem schlechteren klinischen Verlauf assoziiert sein könnte.
Durch die geringe Größe der Stichprobe und die retrospektive Datenanalyse der vorliegenden Arbeit ist es nicht möglich, zuverlässige allgemein gültige Behandlungsempfehlungen abzuleiten. Hier wurde das eigene Patientenkollektiv detailliert analysiert und die Ergebnisse wurden mit ähnlichen Publikationen verglichen. Weitere prospektiv geplante Studien sind sinnvoll.
Aus der zusammenfassenden Betrachtung der Ergebnisse lässt sich schließen, dass mit den momentan verfügbaren Mitteln bei ausreichender Erfahrung des behandelnden Neuroradiologen eine relativ sichere endovaskuläre Behandlung von sehr kleinen Aneurysmen möglich ist. Neben der Erfahrenheit des interventionellen Neuroradiologen kann die Weiterentwicklung der eingesetzten Materialien wie Coils, Stents, Ballons und Mikrokatheter zur Minimierung des Komplikationsrisikos beitragen.
In dieser Arbeit wurden mittels Fragebogen chronobiologische - hier als Chronobiologika bezeichnet -, biologische und soziale Parameter von Patienten mit einer definierten Malignomerkrankung (Mamma-Karzinom, Kolon-Karzinom, Lymphom) bestimmt und auf Zusammenhänge überprüft. Die Chronobiologika wurden für die Zeit vor der Erkrankung sowie für den Zeitpunkt der Befragung erhoben und die Veränderungen berechnet. Die Parameter vor der Erkrankung wurden bei der Gruppe der Patienten mit Mamma-Karzinom mit einer repräsentativen Referenzgruppe (Gesundheitsmonitor des Jahres 2013 der Bertelsmann Stiftung) auf Unterschiede verglichen. Es wurde insbesondere untersucht, ob Zusammenhänge zwischen den Veränderungen der Chronobiologika und der unter der Chemotherapie empfundenen Belastung (= Distress) bestehen.
Dazu wurden im Rahmen einer multizentrischen Studie bei 378 Personen anhand eines Fragebogens auf Basis des Munich ChronoType Questionnaires (MCTQ) Angaben zu ihrem Schlaf-Wach-Rhythmus, ihrer Malignomerkrankung, deren Therapie, der darunter empfundenen Belastung und dem Lebensstil ausgewertet. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf den Chronotyp, den Social Jetlag und das Schlafdefizit gelegt.
Es ließen sich nur wenige Unterschiede in den Chronobiologika zum Zeitpunkt vor der Erkrankung und dem aktuellen pathologischen Zustand, zwischen den Malignomgruppen, zwischen den Gruppen mit und ohne Chemotherapie sowie zwischen den Gruppen mit geringem und hohem Distress finden.
Im Rahmen der Malignomerkrankung kam es zu Veränderungen im Schlaf-Wach-Rhythmus der Teilnehmer: So wurden Einschlaf- und Aufwachzeit sowie der Chronotyp früher in den Tagesverlauf verlegt. Der Social Jetlag und das Schlafdefizit verminderten sich. Die Einschlaflatenz wurde länger. Diese Veränderungen fanden sich bevorzugt bei Patienten mit Mamma-Karzinom, Chemotherapie und hohem Distress. Der Distress war bei Frauen und jüngeren Personen stärker ausgeprägt.
Die Studienpopulation zeigte im Vergleich zur vorgenannten Referenzgruppe in allen Altersgruppen einen späteren Chronotyp, einen höheren Social Jetlag und einen höheren Anteil an Berufstätigen.
Die beschriebenen Veränderungen im Schlaf-Wach-Rhythmus ließen sich im Wesentlichen mit der veränderten Berufstätigkeit und dem subjektiven Distress im Rahmen der Erkrankung und ihrer Therapie erklären. So fanden sich die stärksten Veränderungen in den Chronobiologika bei Patienten mit hohem Distress und einer Aufgabe der Berufstätigkeit. Die Unterschiede zwischen der Referenzgruppe und der Gruppe der Patientinnen mit Mamma-Karzinom lassen sich tatsächlich mit einer Krankheitsprädisposition oder durch soziokulturelle Besonderheiten in der Studienpopulation gegenüber der Normalbevölkerung (Referenzgruppe) erklären.
Um molekulare Mechanismen in biologischen Prozessen zu verstehen, ist es unerlässlich biologisch aktive Verbindungen zu kontrollieren. Dabei spielt besonders die Aktivierung bzw. Desaktivierung von Genabschnitten eine zentrale Rolle in der gegenwärtigen chemischen, biologischen und medizinischen Forschung. Nukleinsäuren sind dabei offenkundige Zielmoleküle, da sie die Genexpression auf unterster Ebene regulieren und auf vielfältige Art und Weise an biologischen Prozessen beteiligt sind. Um solch eine genaue Steuerung zu erreichen, werden Nukleinsäuren häufig photolabil modifiziert und unter die Kontrolle von Licht gebracht. Da hochentwickelte Technologien es erlauben Photonen bestimmter Energie unter präziser räumlicher und zeitlicher Auflösung zu dosieren, ist Licht als nicht invasives Triggersignal ein besonders geeignetes Werkzeug um molekulare Prozesse zu kontrollieren.
Die Verwendung photolabiler Schutzgruppen („cage“) ermöglicht es, diese lichtaktivierbaren Nukleinsäuren („caged compound“) herzustellen. Üblicherweise werden Oligonukleotide damit an funktionsbestimmenden Stellen versehen, woraufhin die Funktion der Oligonukleotide unterdrückt wird. Die biologische Aktivität kann durch Bestrahlung mit Licht wieder hergestellt werden, da die photolabile Schutzgruppe durch den Lichtimpuls abgespalten wird. Neben der zeitweiligen Maskierung der Nukleinsäureaktivität existiert auch eine Methode, die als „photoaktivierbarer Strangbruch“ (‘‘caged strand break‘‘) bezeichnet wird. Dabei werden mit Hilfe von photolabilen Linkern (‘‘Verknüpfer‘‘) lichtinduzierte Strangbrüche in Oligonukleotiden ausgelöst, um so beispielsweise die Struktur eines Nukleinsäurestrangs zu zerstören. Die Idee der photoaktivierbaren Strangbrüche ist nicht neu, dennoch werden photolabile Schutzgruppen überwiegend nach der erstgenannten Strategie verwendet. Im Rahmen dieses Promotionsvorhabens wurden neue photosensitive Linkerbausteine für Oligonukleotide entwickelt und hergestellt, welche sich vor allem im Hinblick auf die Anwendbarkeit in lebenden biologischen Systemen von den bisherigen photolabilen Linkern unterscheiden.
Im ersten Projekt wurde ein nicht-nukleosidischer, photolabiler Linker, basierend auf dem Cumaringrundgerüst, entwickelt. Das Ziel war hier, vor allem, einen zweiphotonenaktiven Linker für biologische Anwendungen und Zweiphotonen-Fragestellungen nutzbar zu machen. Bisherige Zweiphotonen-Linker konnten hauptsächlich nur für Proteinverknüpfungen bzw. Neurotransmitter verwendet werden oder mussten chemisch umständlich (z.B. Click-Chemie) und postsynthetisch in Oligonukleotide eingeführt werden. Der neu entwickelte Zweiphotonen-Linker wurde als Phosphoramiditbaustein für die Oligonukelotid-Festphasensynthese synthetisiert, was einen problemlosen und automatisierten Einbau garantiert. Mit einem modifizierten Oligonukleotid konnten die photochemischen Eigenschaften des Linkers bestimmt und mit Hilfe eines fluoreszenzbasierten Verdrängungsassays und Lasertechniken der Zweiphotonen-Effekt visualisiert werden. Dazu wurde ein Hairpin-DNA-Strang hergestellt, welcher eine Linkermodifikation im Bereich der Loopregion enthält. Durch eine Thiolmodifikation am 5‘-Ende des Oligonukleotidstranges war es möglich, diesen in einem Maleimid-funktionalisierten Hydrogel zu fixieren. Ein DNA-Duplex mit einem Fluorophor/Quencherpaar und einer korrespondierenden Sequenz zum modifizierten Hairpin-Strang wurde ebenfalls dem System zugegeben, allerdings wurde dieser nicht fixiert, um Diffusion zu ermöglichen. Durch die räumliche Nähe des Fluorophors zum Quencher konnte im unbelichteten Zustand zunächst keine Fluoreszenz gemessen werden. Mit einem (Femtosekunden-)gepulsten Laser und dem damit verbundenen Bindungsbruch im Hairpin-Strang durch Zweiphotonen-Effekte wurde es dem fluoreszierenden Strang des DNA-Duplex ermöglicht, sich vom Quencher-Strang zu lösen und an den fixierten Strang zu hybridisieren. Das Photolyse-Ereignis konnte so in ein lokales Fluoreszenzsignal übersetzt und detektiert werden.
Der eindeutige Beweis, dass es sich tatsächlich um ein Zweiphotonen-induziertes Ereignis handelt, konnte durch die dreidimensional aufgelöste Photolyse und über die quadratische Anhängigkeit des Fluoreszenzsignals von der eingestrahlten Laserleistung erbracht werden.
Die generelle Kompatibilität des Cumarin-Linkers mit biologischen Systemen konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden. Dazu wurde eine Transkriptionsfaktor-DNA Decoy-Strategie entwickelt, in der Linker-modifizierte DNA Decoys an regulatorische Transkriptionsfaktoren binden und diese aber auch photochemisch wieder freisetzen können („catch and release-Strategie“). Zellkulturexperimente, um mit dieser Methode das Transkriptionsfaktor-gesteuerte und endogene Gen für Cyclooxygenase-2 (COX2) zu regulieren, lieferten keine aussagekräftigen Ergebnisse. Daher wurden die verwendeten Zellen dahingehend manipuliert, sodass sie das Protein GFP (grün fluoreszierendes Protein) in Abhängigkeit von der Anwesenheit eines Transkriptionsfaktors exprimieren. Das so durch die Zellen verursachte Fluoreszenzsignal steht in direkter Abhängigkeit zur Decoy-Aktivität. Mit Hilfe modifizierter GFP-Decoys konnte hierbei eine Regulation auf Transkriptionsebene in biologischen Organismen erreicht werden. Mit dem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), einer molekularbiologischen in vitro-Analysetechnik, wurden die Interaktionen zwischen modifizierten Decoys und dem Transkriptionsfaktor untersucht.
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Systemerkrankungen der arteriellen Gefäße stellen eine häufige Todesursache in Deutschland und der westlichen Welt dar. Hierbei sind vor allem die auf Grundlage von Arteriosklerose entstehende Koronare Herzerkrankung sowie der Myokardinfarkt zu nennen. Ursache des Myokardinfarktes ist eine Minderperfusion und damit bedingte Ischämie des Myokardgewebes. Ziel einer jeden Minderperfusion ist die therapeutisch schnellstmögliche Reperfusion. Ischämie- und Hypoxie-bedingt entstehen hierbei durch inflammatorische Prozesse, Ansammlung toxischer Metabolite, veränderter Protein-Expressionsmuster sowie durch das reperfundierende Blut der sogenannte Ischämie-Reperfusionsschaden. Dieser komplexe Effekt lässt sich über dem hinaus auch bei Organtransplantationen beobachten.
Die vorliegende Arbeit beschreibt den Versuch den Ischämie-Reperfusionsschaden durch den Einfluss von mTOR-Inhibition im humanen Gefäßmodel zu quantifizieren. Hierbei wurden die mTOR-Inhibitoren Sirolimus und Everolimus verwendet. Beide Immunsuppressiva finden aktuell unter anderem klinische Anwendung nach Organtransplantationen. Bereits in einigen Studien konnten positive Effekte von Sirolimus als auch Everolimus auf den Ischämie-Reperfusionsschaden nachgewiesen werden. Dieser Versuch sollte nun weitere zielführende Erkenntnisse hinsichtlich mTOR-Inhibition und proinflammatorischer Prozesse sowie der Expression von Zell-Adhäsionsmolekülen im humanen Gefäßmodell liefern. Ebenso sollte die Qualität des Bioreaktors als adäquates Humangefäß-Perfusionsmodell evaluiert werden.
Als Versuchsgrundlage wurde hierbei eine Ischämiezeit der Gefäße von vier bis fünf Stunden festgelegt. Die verwendeten Gefäße wurden in der Folge nach standardisierten Kriterien (Präoxygenierung, Heparinisierung, 37° Grad Celsius Temperatur, Blutgruppe AB Rhesusfaktor negativ, Hämatokritwert 30%) zwei Stunden lang mittels Vollblut im Bioreaktormodel reperfundiert. Unterschieden wurde hierbei eine Gefäßkontrollgruppe (n=7), von einer Sirolimus-Gruppe (n=6, standardisierte Blutkonzentration 10ng/ml) und einer Everolimus-Gruppe (n=7, standardisierte Blutkonzentration 5 ng/ml). Nach standardisierten Zeitpunkten der Reperfusion (0 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten) wurden jeweils Blutproben dem simulierten Kreislauf entnommen. Mittels Blutgasanalyse wurde über die Bestimmung des Sauerstoffpartialdrucks, des Kohlendioxidpartialdrucks sowie des pH-Wertes eine qualitative Evaluierung des Bioreaktors als humanes Gefäßmodel vorgenommen. Des Weiteren dienten die Blutproben zur Erfassung der proinflammatorischer Marker Interleukin-6, TNF-α, sowie VEGF während der unterschiedlichen Zeitpunkte der Blutentnahme. Nach Beendigung der Reperfusion wurden Gefäßproben mittels immunhistochemischen Verfahren auf die Expression der Zell-Adhäsionsmoleküle CD31 sowie CD11b hin untersucht.
Aufgrund durchgeführter Versuche konnte gezeigt werden, dass in der Kontrollgruppe die Interleukin-6- sowie VEGF-Spiegel signifikant im Zuge der Reperfusion anstiegen. Sirolimus als auch Everolimus konnten demgegenüber einen signifikanten Anstieg dieser proinflammatorischen Signalmoleküle verhindern. Im Vergleich des proinflammatorischen TNF-α konnte allerdings ein signifikanter Einfluss der mTOR-Inhibitoren nicht bestätigt werden. Hinsichtlich des Expressionsmusters konnte Sirolimus als auch Everolimus eine signifikante Reduktion von sowohl CD31-positiven als auch CD11b-positiven Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe aufzeigen.
In der Zusammenschau lässt sich aus den erhobenen Daten schlussfolgern, dass der Bioreaktor als humanes Gefäßmodell ein suffizientes Perfusionssystem darstellt. Sirolimus als auch Everolimus können über ihren Wirkungsmechanismus der mTOR-Inhibition einen Anstieg proinflammatorischen Moleküle zum Teil verhindern. Den größten Einfluss auf den Ischämie-Reperfusionsschaden nehmen Sirolimus als auch Everolimus hierbei mittels der Suppression von Zell-Adhäsionsmolekülen CD31 und CD11b.
Unter Web-based Trainings (WBTs) versteht man multimediale, interaktive und thematisch abgeschlossene Lerneinheiten in einem Browser. Seit der Entstehung des Internets in den 1990er Jahren sind diese ein wichtiger und etablierter Baustein bei der Konzeption und Entwicklung von eLearning-Szenarien. Diese Lerneinheiten werden üblicherweise von Lehrenden mit entsprechenden Autorensystemen erstellt. In selteneren Fällen handelt es sich bei deren Umsetzungen um individuell programmierte Einzellösungen. Betrachtet man WBTs aus der Sicht der Lernenden, dann lässt sich feststellen, dass zunehmend auch nicht explizit als Lerneinheiten erstellte Inhalte genutzt werden, die jedoch genau den Bedürfnissen des jeweiligen Lernenden entsprechen (im Rahmen des informellen und selbstgesteuerten Lernens). Zum einen liegt das an der zunehmenden Verfügbarkeit und Vielfalt von „alternativen Lerninhalten“ im Internet generell (freie Lizenzen und innovative Autorentools). Zum anderen aber auch an der Möglichkeit, diese Inhalte von überall aus und zu jeder Zeit einfach finden zu können (mobiles Internet, Suchmaschinen und Sprachassistenten) bzw. eingeordnet und empfohlen zu bekommen (Empfehlungssysteme und soziale Medien).
Aus dieser Veränderung heraus ergibt sich im Rahmen dieser Dissertation die zentrale Fragestellung, ob das Konzept eines dedizierten WBT-Autorensystems den neuen Anforderungen von frei verfügbaren, interaktiven Lerninhalten (Khan Academy, YouTube und Wikipedia) und einer Vielzahl ständig wachsender und kostenfreier Autorentools für beliebige Web-Inhalte (H5P, PowToon oder Pageflow) überhaupt noch gerecht wird und wo in diesem Fall genau die Alleinstellungsmerkmale eines WBTs liegen?
Zur Beantwortung dieser Frage beschäftigt sich die Arbeit grundlegend mit dem Begriff „Web-based Training“, den über die Zeit geänderten Rahmenbedingungen und den daraus resultierenden Implikationen für die Entwicklung von WBT-Autorensystemen. Mittels des gewählten Design-based Research (DBR)-Ansatzes konnte durch kontinuierliche Zyklen von Gestaltung, Durchführung, Analyse und Re-Design am Beispiel mehrerer eLearning-Projekte der Begriff WBT neudefininiert bzw. reinterpretiert werden, so dass sich der Fokus der Definition auf das konzentriert, was WBTs im Vergleich zu anderen Inhalten und Funktionen im Internet im Kern unterscheidet: dem Lehr-/Lernaspekt (nachfolgend Web-based Training 2.0 (WBT 2.0)).
Basierend auf dieser Neudefinition konnten vier Kernfunktionalitäten ausgearbeitet werden, die die zuvor genannten Herausforderungen adressieren und in Form eines Design Frameworks detailliert beschreiben. Untersucht und entwickelt wurden die unterschiedlichen Aspekte und Funktionen der WBTs 2.0 anhand der iterativen „Meso-Zyklen“ des DBR-Ansatzes, wobei jedes der darin durchgeführten Projekte auch eigene Ergebnisse mit sich bringt, welche jeweils unter didaktischen und vor allem aber technischen Gesichtspunkten erörtert wurden. Die dadurch gewonnenen Erkenntnisse flossen jeweils in den Entwicklungsprozess der LernBar ein („Makro-Zyklus“), ein im Rahmen dieser Arbeit und von studiumdigitale, der zentralen eLearning-Einrichtung der Goethe-Universität, entwickeltes WBT-Autorensystem. Dabei wurden die Entwicklungen kontinuierlich unter Einbezug von Nutzerfeedbacks (jährliche Anwendertreffen, Schulungen, Befragungen, Support) überprüft und weiterentwickelt.
Abschließend endet der letzte Entwicklungszyklus des DBR-Ansatzes mit der Konzeption und Umsetzung von drei WBT 2.0-Systemkomponenten, wodurch sich flexibel beliebige Web-Inhalte mit entsprechenden WBT 2.0-Funktionalitäten erweitern lassen, um auch im Kontext von offenen Lehr-/Lernprozessen durchgeführte Aktivitäten transparent, nachvollziehbar und somit überprüfbar zu machen (Constructive Alignment).
Somit bietet diese Forschungsarbeit einen interdisziplinären, nutzerzentrierten und in der Praxis erprobten Ansatz für die Umsetzung und den Einsatz von WBTs im Kontext offener Lehr-/Lernprozesse. Dabei verschiebt sich der bisherige Fokus von der reinen Medienproduktion hin zu einem ganzheitlichen Ansatz, bei dem der Lehr-/Lernaspekt im Vordergrund steht (Lernbedarf erkennen, decken und überprüfen). Entscheidend ist dabei, dass zum Decken eines Lernbedarfs sämtliche zur Verfügung stehenden Ressourcen des Internets genutzt werden können, wobei WBTs 2.0 dazu lediglich den didaktischen Prozess definieren und diesen für die Lehrenden und Lernende transparent und zugänglich machen.
WBTs 2.0 profitieren dadurch zukünftig von der zunehmenden Vielfalt und Verfügbarkeit von Inhalten und Funktionen im Internet und ermöglichen es, den Entwicklern von WBT 2.0-Autorensystemen sich auf das Wesentliche zu konzentrieren: den Lehr-/Lernprozess.
In den letzten Jahren findet die Wirkung von Polyphenolen auf den Alterungsprozess oder zur Behandlung von Krankheiten immer mehr Beachtung. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Wirkmechanismen der Polyphenole Gossypol, Curcumin und Quercetin, um Hinweise für neue oder verbesserte Therapieansätze zu erhalten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen lieferten folgende Ergebnisse:
1. Der Ascomycet "P. anserina" eignet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkmechanismen verschiedener Polyphenole, da die bereits aus der Literatur bekannten Effekte auf das Überleben höherer Organismen auch in "P. anserina" beobachtet wurden.
2. Die Mitochondrienfunktion spielt auf unterschiedliche Art eine Rolle in der Kompensation von Dysfunktionen oder Stressbedingungen in der Zelle und wirkt somit positiv auf die Regulation der Lebensspanne von "P. anserina". In der "PaSod3"-Deletionsmutante wurde eine Verschiebung der mitochondrialen Atmung von einer Komplex I-abhängigen hin zu einer vermehrt Komplex II-abhängigen Atmung festgestellt. Die damit verbundene Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials dient neben der bereits bekannten hohen Superoxid-Menge als Signal zur Mitophagie-Induktion. Auch die Anpassung der Mitochondrienfunktion durch die erhöhte Bildung von mtRSCs, wie im Falle von Gossypol oder Quercetin, kann zur Kompensation von Dysfunktionen beitragen bzw. sie abschwächen.
3. Es gibt keinen grundlegenden gemeinsamen Wirkmechanimus der drei untersuchten Polyphenole. Zwar spielt Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Stoffen eine Rolle, aber nicht bei allen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid abhängig von der vorherrschenden Konzentration wirkt und daher auch keine Allgemeingültigkeit des Effektes vorherzusagen ist. In niedrigen Konzentrationen sorgt Wasserstoffperoxid z. B. für eine Induktion der Autophagie und damit einhergehende eine Lebensverlängerung. Im Gegensatz dazu wirken hohe Wasserstoffperoxid-Konzentrationen lebensverkürzend und lösen verschiedene Formen von Zelltod aus.
4. Die Curcumin-vermittelte Langlebigkeit wurde das erste Mal in Verbindung mit einer funktionellen Autophagie gebracht. Im Detail führt die Behandlung mit Curcumin durch eine PaSOD1-abhängige leichte Erhöhung der Wasserstoffperoxid-Menge zu einer Induktion von nicht-selektiver Autophagie. Die induzierte Autophagie ist Ursache der Lebensverlängerung durch Curcumin.
5. Gossypol wirkt in Abhängigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Transitionspore bzw. von ihrem Regulator Cyclophilin D. Hierbei verstärkt die deutlich erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge wahrscheinlich die Induktion von programmiertem Zelltod. Gleichzeitig wird eine cytoprotektive Form von Autophagie und ein scheinbar ATG-unabhängiger Abbau von Mitochondrien induziert.
6. Quercetin wirkt in "P. anserina" abhängig vom Methylierungs-Status. Untersuchungen mit Mutanten der "O"-Methyltransferase PaMTH1 ergaben die Notwendigkeit der Anwesenheit von PaMTH1 für den lebensverlängernden Effekt von Quercetin. Analysen mit dem methylierten Derivat Isorhamnetin verdeutlichten diese Abhängigkeit und zeigten zudem, dass Quercetin sowohl in der methylierten als auch unmethylierten Form Effekte hervorruft. Jedoch sind nur die Effekte des unmethylierten Quercetin unabhängig von der Lebensverlängerung und eher schädlich für die Zelle.