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The small photoreceptor Photoactive Yellow Protein (PYP) enters a reversible photocycle after excitation with blue light. The intermediate states are formed on timescales ranging from femtoseconds to seconds including chromophore isomerization and protonation as well as large structural rearrangements. To obtain local dynamic information the vibrational label thiocyanate (SCN) can be inserted site-specifically at any desired position in the protein by cysteine mutation and cyanylation. The label's CN stretch vibration is highly sensitive to polarity, hydrogen bonding interactions and electric fields and is spectrally well separated from the overlapping protein absorptions. During the course of this thesis it was impressively demonstrated that the successful incorporation of the SCN label at selected positions in PYP provides a powerful tool to study structure changes and dynamics during the photocycle and enhance the local information that are obtained by infrared (IR) spectroscopic methods. Hence the SCN-labeled protein mutants were studied under equilibrium (steady-state) and non-equilibrium conditions.
Examination of the SCN absorption by FTIR spectroscopy showed the influence of various local environments on the label for different locations in the dark state. The response of the label under illumination with blue light reveals information about structural changes in the signaling state. Additional information for both states were obtained by the vibrational lifetime of the CN vibration measured via ultrafast IR-pump-IR-probe experiments. This observable is particularly sensitive for solvent exposure of the label. Time-resolved IR spectroscopy proved to be an excellent method to follow the protein dynamics throughout most part of the photocycle on a hundreds of femtoseconds to milliseconds timescale. By close inspection of protein and chromophore dynamics in wildtype-PYP over nine decades in time, new insights into the changes leading to the proposed photocycle intermediates were obtained. The investigation of the SCN label allowed to follow the different transient structure changes with high local resolution. Depending on its position within the protein the response of the label provided additional information on the photocycle transitions.
The insights that are obtained by the different observables in the steady-state and by the reaction of the SCN label to formation of the different intermediate states during the photocycle contribute to an improved understanding of local, light-induced structure changes in the photoreceptor PYP. This comprehensive study demonstrated the potential provided by the application of SCN as IR label for investigation of protein dynamics.
Proteine sind die Maschinen der Zellen. Um die Funktionalität von zahlreichen zellulären Prozessen zu gewährleisten, müssen Kommunikationssignale innerhalb von Proteinen weitergeleitet werden. Die Weiterleitung einer Störung an einem Ort im Protein zu einer entfernten Stelle, an welcher sie strukturelle und/oder dynamische Änderungen auslöst, wird Allosterie genannt. Zunächst wurde Allosterie hauptsächlich mit großräumigen Konformationsänderungen in Verbindung gebracht, aber später entwickelte sich ein dynamischerer Blickwinkel auf Allosterie in Abwesenheit dieser großräumigen Konformationsänderungen. Die Idee eines allosterischen Pfades bestehend aus konservierten und energetisch gekoppelten Aminosäuren, welche die Signalweiterleitung zwischen entfernten Stellen im Protein vermitteln, entstand. Diese allosterischen Pfade wurden durch zahlreiche theoretische Studien in Zusammenhang mit Pfaden effizienten anisotropen Energieflusses gebracht. Der Energiefluss entlang dieser Netzwerke verknüpft allosterische Signalübertragung mit Schwingungsenergietransfer (VET - vibrational energy transfer). Die Großzahl der Forschungsarbeiten über dynamische Allosterie basiert auf theoretischen Methoden, weil nur wenige geeignete experimentelle Verfahren existieren. Um diesen essentiellen biologischen Prozess der Informationsübertragung besser verstehen zu können, ist die Entwicklung neuer und leistungsstarker experimenteller Instrumente und Techniken daher dringend erforderlich. Die vorliegende Dissertation setzt sich dies zum Ziel.
VET in Proteinen ist aufgrund der Proteingeometrie inhärent anisotrop. Alle globulären Proteine besitzen Kanäle effizienten Energieflusses, von denen vermutet wird, dass sie wichtig für Proteinfunktionen, wie die schnelle Ableitung von überschüssiger Wärme, Ligandenbindung und allosterische Signalweiterleitung, sind. VET kann mit zeitaufgelöster Infrarot (IR) Spektroskopie untersucht werden, bei welcher ein Femtosekunden Anregepuls eines Lasers Schwingungsenergie in ein molekulares System an einer bestimmten Stelle injiziert und ein, nach einem veränderbarem Zeitintervall folgender, IR Abfragepuls die Ausbreitung dieser Schwingungsenergie detektiert. Ein protein-kompatibler und universell einsetzbarer Chromophor, der die Energie eines sichtbaren Photons in Schwingungsenergie konvertiert, wird als Heizelement benötigt um langreichweitige VET Pfade in Proteinen kartieren zu können. Der Azulen (Azu) Chromophor eignet sich dafür, weil er nach Photoanregung des ersten elektronischen Zustandes durch ultraschnelle interne Konversion fast die gesamte injizierte Energie innerhalb von einer Picosekunde in Schwingungsenergie umwandelt. Eingebettet in die nicht-kanonische Aminosäure (ncAA - non-canonical amino acid) ß-(1-Azulenyl)-L-Alanine (AzAla), kann der Azu Rest in Proteine eingebaut werden. Die Ankunft der injizierten Schwingungsenergie an einer bestimmten Stelle im Protein kann mithilfe eines IR Sensors detektiert werden. Die Kombination aus Azu als VET Heizelement und Azidohomoalanine (Aha) als VET Sensor mit transienter IR (TRIR) Spektroskopie wurde schon erfolgreich an kleinen Peptiden in der Dissertation von H. M. Müller-Werkmeister getestet, die der vorliegenden Dissertation in den Laboren der Bredenbeck Gruppe vorausging.
Die Schwingungsfrequenz chemischer Bindungen ist hochempfindlich auf selbst kleine Änderungen der Konformation und Dynamik in der unmittelbaren Umgebung und kann mit IR Spektroskopie gemessen werden, z. B. mit Fourier Transform IR (FTIR) Spektroskopie. IR Spektroskopie bietet eine außergewöhnlich gute Zeitauflösung, die es ermöglicht, dynamische Prozesse in Molekülen auf einer Zeitskala von wenigen Picosekunden zu beobachten, wie z. B. die ultraschnelle Weiterleitung von Schwingungsenergie. Mit zweidimensionaler (2D)-IR Spektroskopie können die Relaxation von schwingungsangeregten Zuständen und strukturelle Fluktuationen um die schwingende Bindung untersucht werden. Allerdings geht die herausragende Zeitauflösung mit limitierter spektraler Auflösung einher. In größeren Molekülen mit zahlreichen Bindungen überlagern sich die Schwingungsbanden und die Ortsauflösung geht verloren. Um diese Limitierung zu überwinden, können IR Marker benutzt werden, chemische Gruppen, die in einer spektral durchsichtigen Region des Protein/Wasser Spektrums (1800 bis 2500 cm-1) absorbieren. Als ncAA können sie kotranslational in Proteine an einer gewünschten Stelle eingebaut werden und so ortsspezifische Informationen aus dem Proteininneren liefern. Aufgrund ihrer geringen Größe, eines relativ großen Extinktionskoeffizientens (350-400 M-1cm-1) und einer hohen Empfindlichkeit auf Änderungen in der lokalen Umgebung sind organische Azide (N3) wie zum Beispiel Aha besonders geeignete IR Marker. Aha kann als Methionin Analogon ins Protein eingebaut werden.
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Während den ersten Mikrosekunden nach dem Urknall glaubt man, dass unser Universum aus einer heißen, dichten und stark wechselwirkenden Materie bestanden haben soll, welche man das Quark-Gluonen-Plasma (QGP) nennt.
In diesem Medium sind die elementaren Bausteine der Materie, die Quarks und die Gluonen, nicht mehr in Hadronen gebunden, sondern können sich stattdessen wie quasi-freie Teilchen verhalten.
Für die ALICE Kollaboration an CERN's Large Hadron Collider (LHC) ist die Untersuchung dieses Mediums eines der Hauptziele. Um dieses Medium im Labor zu erzeugen, werden Protonen und Nukleonen auf nahezu Lichtgeschwindigkeit beschleunigt und anschließend zur Kollision gebracht. Dabei werden Schwerpunktsenergien von bis zu 13 TeV bei Proton-Proton (pp) Kollisionen und bis zu 5.02 TeV bei Blei-Blei (Pb--Pb) Kollisionen erreicht.
Bei solchen hochenergetischen Kollisionen werden die kritischen Werte der Energiedichte und Temperatur von jeweils ungefähr 1 GeV/c und undgefähr 155 MeV überschritten, welche mithilfe von "lattice QCD" bestimmt wurden. Sie bieten daher die perfekten Voraussetzungen für einen Phasenübergang von normaler Materie zu einem QGP.
Die Entwicklung eines solchen Mediums, beginnend bei der eigentlichen Kollision, gefolgt von der Ausbildung des Plasmas und der letztendlichen Hadronisierung, kann jedoch nicht direkt untersucht werden, da das Plasma eine extrem kurze Lebensdauer hat.
Die Studien die das QGP untersuchen möchten, müssen sich deshalb auf Teilchenmessungen und deren Veränderung aufgrund von Einflüssen durch das Medium beschränken.
Es ist noch nicht definitiv geklärt, ob sich ein QGP nur in Kollisionen schwerer Ionen bildet, oder ob dies auch in kleineren Kollisionssystemen wie Proton-Proton oder Proton-Blei der Fall ist.
Damit in dieser Thesis Einschränkungen bezüglich einer möglichen Erzeugung eines mini-GQP in kleinen Kollisionssystemen gemacht werden kann, wird der Fokus auf Messungen von neutralen Pionen und Eta Mesonen mit dem ALICE Detektor am CERN LHC gesetzt. Hierfür wird in einem Referenzsystem von Proton-Proton Kollisionen bei sqrt(s)=8 TeV und in einem Proton-Blei (p--Pb) System bei sqrt(sNN)=8.16 TeV, welches eine nukleare Modifikation erfährt, gemessen und die Ergebnisse verglichen.
Da in Proton-Proton Kollisionen die Bildung eines QGP, aufgrund zu geringer Energiedichte, nicht erwartet wird, dient eine Messung in diesem System als Messbasis, um Effekte der Kollision selbst von Effekten nach der Kollision zu separieren, welche die Teilchenproduktion beeinflussen.
Teilchen können zusätzlich zu dem QGP auch mit kalter Kernmaterie interagieren, was sich in asymmetrischen Proton-Blei Kollisionen testen lässt. In diesem Kollisionssystem wird größtenfalls ein vergleichsweise kleines QGP gebildet, wohingegen das Blei Ion selbst als kalte Kernmaterie agieren kann.
Zusätzlich zu den Mesonenmessungen wird in dieser Thesis auch die Erzeugung von direkten Photonen bei niedrigen Transversalimpulsen (pT) in multiplizitätsabhängigen p--Pb Kollisionen bei einer Schwerpunktsenergie von sNN=5.02 TeV gemessen, welche als direkte Probe, sowie als charakteristisches Signal des QGP gilt.
Die neutralen Pionen, welche in dieser Thesis gemessen werden, kann man als einen Überlagerungszustand der zwei leichtesten Quarksorten, dem "up" (u) und dem "down" (d) Quark, sowie deren entsprechenden Anti-Teilchen verstehen.
Das eta meson hingegen hat einen zusätzlichen Anteil des "strange" Quarks und eine resultierende höhere Masse.
Quarks sind Teil des Standardmodells der Teilchenphysik, welches die Elementarteilchen und die zwischen ihnen wirkenden Elementarkräfte, ausgeübt durch Bosonen, beschreibt.
Das Modell umfasst insgesamt sechs Quarks, welche sich durch ihre Masse und Ladung unterscheiden und als Grundbestandteil von gebundenen Zuständen, sogenannten Hadronen, fungieren.
Die "up" und "down" Quarks gelten hierbei als die leichtesten Quarks und kommen daher am häufigsten in der Natur vor. Das bekannteste Beipiel stellen hier die allgemein bekannten Protonen (uud) und Neutronen (udd) dar, welche die Grundkomponenten von Nukleonen sind.
Die restlichen Quarks tragen eine deutlich höhere Masse und haben daher eine große Tendenz, sich in leichtere Quarks umzuwandeln, wodurch ihre Lebensdauer sehr gering ist. Die "top" und "bottom" Quarks, welche die Schwersten sind, können daher nicht in gewöhnlicher Materie gefunden werden.
Sie können jedoch experimentell durch hoch energetische Teilchenkollisionen erzeugt werden und indirekt über ihre Zerfallsprodukte nachgewiesen werden.
Quarks tragen eine elektrische Ladung von entweder 1/3 oder 2/3, sowie eine Farbladung, wobei Letztere verantwortlich für ihre Bindung in Hadronen ist.
Hadronen bestehen entweder aus drei Quarks, dann werden sie Baryonen genannt, oder aus einem Quark-Antiquark Paar, welches Meson genannt wird.
Diese gebundenen Zustände erfüllen eine insgesamt neutrale Farbladung, sowie eine vollzählige elektrische Ladung.
Des Weiteren gibt es auch exotische Penta-Quark Zustände, welche aus vier Quarks und einem Antiquark bestehen und bereits experimentell nachgewiesen wurden.
Aufgrund der starken Wechselwirkung, welche durch Gluonen vermittelt wird, können Quarks nicht einzeln beobachtet werden.
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Background: Previous studies have demonstrated that CF (Cystic Fibrosis) prognosis is dependent of three major parameters: FEV1 (Forced Expiratory Pressure in one second), BMI (Body Mass Index) and need of intravenous antibiotic therapy. The CF centres of Frankfurt, Germany, and Moscow, Russia, care for cystic fibrosis patients. We decided to investigate and compare both centers from 1990 to 2015. No comparable study has been published so far.
Method: German patient data was collected from the national cystic fibrosis database “Muko.web”. Missing values were extracted from the Hospital Information System. Russian patient data were taken directly from the medical records in Moscow. In a descriptive statistical analysis with Bias and R Studio the values were compared.
Result: A total of 428 patients from Moscow (217 male, 211 female; 348 (81,3%) were P. aeruginosa positive) and 159 patients from Frankfurt (92 male, 67 female; 137 (86,2%) with P. aeruginosa positive) were compared with regard to P. aeruginosa positivity, BMI, FEV1 and need of intravenous antibiotic therapy. CF patients in Moscow stratified by age groups had lower BMI than CF patients in Frankfurt (age 16-18: p=0,003; age 19-22: p=0,004; age 23-29: p<0,001; age 30-35: p<0,001; age 36-66: p=0,024). In a matching pairs analysis including 100 patients from Frankfurt and 100 patients from Moscow for the year 2015 FEV1 was significantly lower in Moscow patients (p<0,001).
Conclusion: BMI, FEV1 and need of intravenous therapy have significant impact on survival and on quality of life of CF patients. A lower BMI and a lower FEV1 result in a worse survival and determine the prognosis. This study showed a significant difference in prognostic parameters between Frankfurt and Moscow in the crosssectional analysis for the year 2015. A further study should evaluate this difference to show whether this difference will be found over a longer period of time.
Two main types of methods are used in gene therapy: integrating vectors and nuclease-based genome engineering. Nucleases are site-specific and are efficient for knock-outs, but inefficient at inserting long DNA sequences. Integrating vectors perform this task with high efficiency, but their insertion occurs at random genomic positions. This can result in transformation of target cells, which leads to severe adverse events in a gene therapy context. Thus, it is of great interest to develop novel genome engineering tools that combine the advantages of both technologies. The main focus of this thesis is on generating such a targetable integrating vector.
The integrating vector used in this project is the Sleeping Beauty (SB) transposon, a DNA transposon characterized by high activity across a wide range of cells. The SB transposase was combined with an RNA-guided Cas9 nuclease domain. This nuclease component was meant to direct transposase integration to specific targets defined by RNAs. The SB transposase was fused to cleavage-inactivated Cas9 (dCas9) to tether it to the target sites. In addition, adapter proteins consisting of dCas9 and domains non-covalently interacting with SB transposase or the SB transposon were generated. All constituent domains of these fusion proteins were tested in enzymatic assays and almost all enzymatic activities could be verified.
Combining the fusion protein dCas9-SB100X with a gRNA binding a sequence from the AluY repetitive element resulted in a weak, but statistically significant enrichment around sites bound by the gRNA. This enrichment was ca. 2-fold and occurred within a 300 bp window downstream of target sites, or within the AluY element.
Targeting with adapter proteins and targeting of other targets (L1 elements or single-copy targets) did not result in statistically significant effects. Single-copy targets tested included the HPRT gene and three specifically selected GSH targets that were known to be receptive to SB insertions. The combination with a more sequence-specific transposase mutant also failed to increase specificity to a level allowing targeting of single-copy loci. Genome-wide analysis of insertions however demonstrated, that dCas9-SB100X has a different insertion profile than SB100X, regardless of the gRNA used.
As low efficiency of retargeting is likely a consequence of the high background activity of the SB100X transposase in the fusion constructs, a SB mutant with reduced DNA affinity, SB(C42), was generated. For this mutant, transposition activity was partly dependent on a dCas9 domain being supplied with a multi-copy target gRNA, specifically a 2-fold increase in the presence of a AluY-directed gRNA. Whether using this mutant results in improved targeting remains to be determined.
In a side project, an attempt was made to direct SB insertions to ribosomal DNA by fusing the transposase to a nucleolar protein. This fusion transposase partially localized to nucleoli and insertions catalyzed by this transposase were found to be enriched in nucleolus organizer regions (NORs) and nucleolus-associated domains (NADs).
The aim of a second side project was increasing the ratio between homology-directed repair (HDR) and non-homologous end-joining (NHEJ) at Cas9-mediated double-strand breaks (DSBs). To achieve this, Cas9 was fused to DNA-interacting domains and corresponding binding sequences were fused to the homology donors. While an increased HDR/NHEJ ration could be observed for the fusion proteins, it was not dependent on the presence on the binding sequences in the donor molecules.
Schätzungen zufolge sind weltweit etwa 71 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) infiziert. Im Jahre 2016 sind rund 400.000 Menschen an einer HCV-bedingten Lebererkrankung gestorben, insbesondere aufgrund der Entwicklung von Leberzirrhose und Lebertumoren. Trotz der großen Unterschiede in den Prävalenzschätzungen und der Qualität der epidemiologischen Daten zeigt die jüngste weltweite Bewertung, dass die virämische Ausbreitung der HCV-Infektion (Prävalenz der HCV-RNA) in den meisten Industrieländern, einschließlich der USA, weniger als 1,0% beträgt (www .cdc.gov / Hepatitis / HCV). In einigen osteuropäischen Ländern wie Lettland (2,2%) oder Russland (3,3%) und bestimmten Ländern in Afrika, Ägypten (6,3%) und Gabun (7,0%) oder im Nahen Osten Syriens (3,0%) ist die Prävalenz bemerkenswert höher. In den USA und den am weitesten entwickelten Ländern gilt die gemeinsame Nutzung von Werkzeugezur Herstellung von Arzneimitteln und zur Injektion von Medikamenten (Nadeln) als die häufigste derzeitige Übertragungsart. Die vorherrschende Übertragungsart in Ländern, in denen die Ausbreitung von HCV-Infektionen im Vergleich zu den Industrieländern höher ist, beruht jedoch auf schlechten Methoden zur Infektionskontrolle und unsicherer Handhabung von Injektionsnadeln.
Wenn die chronische Infektion unbehandelt bleibt, kann sich im fortschreitenden Verlauf eine Zirrhose oder ein hepatozelluläres Karzinom bilden (Alter H. J. und Seef L. B. 2000). Die Doppeltherapie, bei der es sich um eine Kombination aus pegyliertem Interferon-α (PEG IFNα) und Ribavirin (riba) handelt, war in einigen Ländern der Dritten Welt bis vor kurzem der goldene Standard für die Behandlung von Patienten mit chronischer Hepatitis C und hat eine anhaltende virologische Reaktion erzielt. Mit nur 50% der mit HCV-Genotyp 1 infizierten Patienten (der häufigere) im Vergleich zu 80% mit Genotyp 2 oder 3, obwohl sie kostspielig und langwierig sind (z. B. 24-48 Wochen) und zahlreiche harte Nebenwirkungen aufweisen, die schwer zu bekämpfen sind tolerieren (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002). Die Identifizierung des JFH1 (japanische fulminante Hepatitis Typ 1) -Isolats wurde in einigen in vitro-Studien zu HCV als wichtiger Durchbruch bei der HCV-Behandlung angesehen. Die Verwendung dieses Isolats führte nachfolgend zu einem besseren Verständnis des HCV-Lebenszyklus und der 3D-Strukturen der viralen Proteine. Basierend auf dieser Erkenntnis konnten die ersten direkt wirkenden antiviralen Mittel (DAAs) entwickelt werden, die spezifisch virale Proteine beeinflussen. Die beiden Proteasehemmer (PI) Telaprevir und Boceprevir hemmen die virale NS3-4A-Protease und wurden 2011 als Kombinationstherapie mit PEG IFNα und Ribavirin zugelassen, was die anhaltende virologische Reaktion auf 67-75% erhöhte (Pawlotsky et al. 2015).
Die Optimierung der gegenwärtigen Arzneimittelregime, die Einschränkung des Problems der Mutationsresistenz, die Gestaltung einer individualisierten Therapie, der Zugang zu diesen therapeutischen antiviralen Arzneimitteln und ihr hoher Preis bleiben weiterhin eine Herausforderung (Pawlotsky 2016; Pawlotsky et al. 2015; Sarrazin 2016). Die Entwicklung eines Impfstoffs wird jedoch als größte Herausforderung für die weltweite Kontrolle von HCV angesehen (Bukh 2016). Aus diesem Grund ist es wichtig, weiterhin mehr über den HCV-Lebenszyklus und die Faktoren zu erfahren, die sich auf die Replikation und den gesamten Lebenszyklus auswirken können, um effiziente, qualitativ hochwertige und vor allem leicht zugängliche Behandlungen für alle Menschen weltweit zu entwickeln.
Der Lipidstoffwechsel und insbesondere das Cholesteringleichgewicht werden durch die HCV-Infektion beeinflusst. Die Korrelation zwischen Lipidstoffwechsel und HCV wurde klinisch seit langem beobachtet. In den Leberbiopsien von mit HCV infizierten Patienten wurde ein Anstieg der in den Lipidtröpfchen im Cytosol akkumulierten neutralen Lipide festgestellt (Dienes et al. 1982). Das Hepatitis-C-Virus wurde auch von Hypobetalipoproteinämie, Hypocholesterinämie und Lebersteatose begleitet (Schaefer und Chung 2013). Die Leber ist der primäre Ort für die Synthese, Speicherung und Oxidation von Lipiden und anderen Makromolekülen. Daher ist der Fettstoffwechsel in der Leber für die Aufrechterhaltung der systemischen Nährstoffhomöostase von wesentlicher Bedeutung. Eine Dysregulation des Leberlipidstoffwechsels ist ein Kennzeichen mehrerer Krankheiten wie Diabetes, alkoholische und nichtalkoholische Fettlebererkrankungen sowie parasitäre und virale Infektionen, einschließlich einer HCV-Infektion. (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002; Fon Tacer und Rozman 2011; Chen et al. 2013; Reddy und Rao 2006; Visser et al. 2013; Wu und Parhofer 2014)
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Three types of post-translation modifications (PTMs) containing N-glycosylation, phosphorylation, ubiquitylation were characterized in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) on a global scale using quantitative mass spectrometry based proteomics technology in this study.
DLBCL is the most common type of malignant lymphomas and has a heterogeneous gene expression profiling, phenotype and clinical response to chemotherapy. DLBCL is a good model for the correct classification of cancers into molecularly different subtypes, which benefits for the selection of rational therapeutic strategies. It resulted in two histologically indistinguishable subtypes-activated B-cell-like (ABC) subgroup and germinal center B-cell-like (GCB) subgroup according to gene expression profiling. Signals originating from the B-cell receptor (BCR), the key protein on the surface of B cells, promote growth and survival of DLBCL. Antigen-dependent/independent BCR signaling is found in DLBCL subtypes.
Recent researches reveal that glycosylation plays role in human cells via site-specific regulation. Aberrant N-glycosylation in BCR-related effectors, such as, CD79a, immunoglobulin M or G (IgM or IgG), has been found to be associated with lymphoid malignancies. However, accurate quantification of intact glycopeptides and their individual glycan moieties in a cell-wide manner is still challenging. Here we established a site-specific quantitative N-glycoproteomics platform termed SugarQuant. It included a fast sample preparation workflow using Protein Aggregation Capture (PAC), an optimized multi-notch MS3 acquisition workflow (Glyco-SPS-MS3), a self-developed R-based tool (GlycoBinder). The robustness and accuracy of quantitation in SugarQuant were proved in a study using the different amounts of TMT-labelled IgM N-glycopeptides spiked into a background of TMT-labelled yeast peptides. Next, we used SugarQuant to identify and quantify more than 5000 unique glycoforms in Burkitt’s lymphoma cells treated with a series of doses of 2-deoxy-2-fluoro-L-fucose (2FF) and determine the more accurate site-specific glycosylation changes that occurred upon inhibition of fucosylation compared to using MS2 analysis. It revealed that 2FF-sensitive N-glycosylation on key players in BCR-mediated signaling in DG75. Furthermore, 2FF treatment also affects phosphorylation of the key players involving in B cell receptor signaling.
Then we investigated the site-specific quantitative N-glycoproteome in the cell lines of DLBCL subtypes using SugarQuant. More than 7000 unique intact glycopeptides (glycoforms) were quantified in five ABC DLBCL and four GCB DLBCL cell lines. The glycoproteome mapping (intact glycopeptide expressions) in each cell line allows to segregate DLBCL subtypes. The majority of these glycoforms were from the key cell-surface BCR effectors, such as IgM, CD79 and PTPRC. Lastly, we investigated the change of fucosylated glycopeptides in TMD8 cell line upon knockout of the fucosyltransferase FUT8, which is responsible for core-fucose synthesis, and by the treatment with 2FF. The results revealed that FUT8 might also regulate the synthesis of sub/terminal fucose on glycan chain and the inhibition of fucosylation increased the sialyated glycopeptide expression.
Phosphorylation is involved in regulating multiple processes as an important mediator in BCR signaling. Likewise, ubiquitylation plays vital roles in the activation of the nuclear factor-kappaB (NF-κB) pathway in BCR signaling. There are two vital upstream BCR-proximal tyrosine kinases, Bruton’s tyrosine kinase (BTK) and spleen tyrosine kinase (SYK), which regulate the auto-phosphorylation and phosphorylation of other proteins in BCR signaling pathway. Here we investigated the dynamics of downstream phosphorylation and ubiquitylation signaling in ABC DLBCL and GCB DLBCL cell lines upon the inhibitions of BTK and SYK using quantitative proteomics strategy. In the phosphoproteome analysis, a large dataset of quantified phosphorylation sites was obtained in the three ABC and four GCB DLBCL cell lines. BCR signaling in the subtypes of DLBCL cell lines was found to be highly individual in distinct cell lines. These significantly regulated phosphorylation events in each cell line with individual treatment were involved in multiple Reactome pathways, such as, M phase, signaling by Rho GTPases and diseases of signal transduction. Moreover, the gene regulation-related biological processes including chromosome organization and medication, DNA metabolic process, nuclear export, were involved in the DLBCL cell lines. In the ubiquitinome analysis, we identified more than 15,000 ubiquitylation sites in two ABC and one GCB cell lines upon the inhibition of BTK and SYK. The different ubiquitylation events observed in ABC and GCB subtypes revealed distinct BCR signaling pathways in two subtypes. The similar signaling perturbations across each cell line upon BTK and SYK inhibition, which were obtained from the significantly regulated ubiquitylated peptides expression, revealed the cell-type-specific concordance in ubiquitylation regulation upon BTK and SYK inhibition. These ubiquitylation modified proteins who bore the significantly regulated ubi-peptides in the samples were also found to be highly involved in gene regulatory processes.
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Acute lymphoblastic leukemia (ALL), a neoplastic disorder of blood cells of the lymphoid lineage, is the most frequent childhood cancer. In spite of increasing survival rates, the outcome for adults, infants or relapsed patients is still less favorable, highlighting the need for novel treatment options. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules that are involved in a variety of cellular pathways. As high ROS levels lead to oxidative stress and irreversible oxidation of cellular macromolecules, the production and elimination of ROS is tightly controlled. Therefore, cells express several antioxidant molecules and enzymes, including glutathione, catalase and the thioredoxin (Trx) system, to balance ROS levels. As cancer cells were found to have increased ROS levels that could contribute to tumor progression and metastasis, they rely strongly on these antioxidant systems to prevent oxidative damage, making cancer cells especially vulnerable to ROS-inducing treatments. ROS and oxidative stress have been shown to induce programmed cell death via different pathways, however the exact mechanisms that couples oxidative signaling and cell death is not completely understood.
As a disturbance of the cellular redox homeostasis was reported during leukemia development and progression, we wanted to determine the potential of Trx inhibitors for ALL therapy. Additionally, we aimed to further understand the role of ROS and subsequent protein oxidation in the induction and execution of programmed cell death.
First, we demonstrated that the Trx1 inhibitor PX-12 induced cell death in three ALL cell lines. Further analysis of the events leading to PX-12-induced cell death in FADD-deficient (FD) Jurkat cells revealed an increase in ROS levels and oxidation-mediated dimer formation of peroxiredoxin 3 (PRDX3). Interestingly cell death was inhibited by the thiol-containing antioxidant N-acetylcysteine (NAC), but not by non-thiol-containing ROS scavengers. PX-12 treatment further induced cleavage of caspase-9 and -3 and activation of the pro-apoptotic BCL-2 protein BAK, leading us to the conclusion that mitochondria-dependent apoptosis was induced. Interestingly, we could demonstrate an important role for the BH3-only protein NOXA in the mediation of PX-12-induced apoptosis as knock-down of NOXA prevented cell death induction and BAK activation. Our findings give novel insights into the mechanism of PX-12-induced cell death in ALL cell lines and underscores the potential of PX-12 for the treatment of ALL.
To further understand the processes leading to cell death upon inhibition of the Trx system, we analyzed global protein oxidation in Jurkat FD cells upon treatment with the Trx reductase inhibitor Auranofin. In line with previous results, Auranofin induced intrinsic apoptosis that was dependent on BAK and accompanied by increased ROS levels. Using a BIAM Switch Assay followed by mass spectrometry, we demonstrated that Auranofin treatment induced oxidation of over 200 proteins. We identified several proteins whose oxidation upon Auranofin treatment was expected, like Trx1, Trx2 and several peroxiredoxins. Additionally, we verified oxidation of APAF1-interacting protein (APIP) and protein arginine N-methyltransferase (PRMT1) that are both implicated in the regulation of apoptosis. With this analysis we were able to demonstrate that Auranofin treatment leads to changes in global protein oxidation. Whether oxidation of the determined proteins changes their functionality and contributes to apoptosis induction remains to be elucidated.
As we identified BAK as an important player in PX-12- and Auranofin-induced cell death in the previous parts of this study, we wanted to further understand its involvement in ROS-mediated cell death. First analyses in wild-type (WT) and BAK-/- murine embryonic fibroblasts (MEFs) revealed that BAK was essential for Auranofin-induced cell death and that this cell death was caspase-independent in MEFs. Interestingly, BAK oxidation was induced upon treatment with Auranofin, but not upon stimulation with the apoptosis-inducing compound Etoposide. Expression of mutated BAK, with either one or both oxidation-sensitive cysteines mutated to oxidation-insensitive serines, revealed that mutating already one cysteine protected cells from Auranofin , but not Etoposide-induced cell death. Of note, mutation of the BAK BH3 domain rescued MEFs from both, Auranofin- and Etoposide-mediated cell death. The presence of cysteine residues also altered BAK interactions as observed by a mass spectrometric analysis of Auranofin-treated MEFs expressing either WT or cysteine-less BAK. We identified interactions of WT BAK with proteins involved in mitochondrial fission and vesicle transport upon Auranofin treatment. Of note, interaction with proteins involved in apoptosis, like BAX or BCL-XL, was not changed between WT and cysteine-less BAK. Our results demonstrate a critical role for BAK oxidation in Auranofin-induced cell death. Furthermore, we identified novel oxidation-dependent BAK interaction partners.
To conclude, this study highlights the potential of ROS-inducing treatments for ALL therapy and provides novel insights into the redox regulation of programmed cell death.
Inhibitoren der Apoptose (IAP, inhibitor of apoptosis) Proteine spielen eine wichtige Rolle in Bezug auf Zelltodregulation und es ist anzunehmen, dass eine Dysregulation dieser Proteine zu einer Tumorentwicklung und Tumorprogression beiträgt. Erhöhte Expressionslevel von IAP Proteinen verhindern die Aktivierbarkeit des Zelltodprogrammes von Tumorzellen und eine Reihe von Studien konnte bereits erhöhte IAP Level in Tumorzelllinien sowie in primären Tumorproben nachweisen. Des Weiteren korrelieren erhöhte Expressionslevel von IAPs in Tumoren mit Behandlungsresistenzen und schlechten Prognosen für die Patienten.
Das diffuse großzellige B-Zell Lymphom (DLBCL, diffuse large B-cell lymphoma) zählt zu den häufigsten Subtypen der Non-Hodgkin Lymphome (NHL) mit 40 % aller neu diagnostizierten NHL Fälle. DLBCL ist eine sehr heterogene Erkrankung die in drei verschiedene Gruppen klassifiziert wurde: aktivierter B-Zell Typ (ABC, activated B-cell), Keimzentrum B-Zell Typ (GCB, germinal center B-Cell) und Mediastinaler großzelliger B-Zell Typ (PMBL, primary mediastinal B-cell lymphoma). Erhöhte Expressionslevel von zellulärem IAP1 (cIAP, cellular IAP) und cIAP2 wurden ebenfalls in primären Tumorproben von DLBCL Patienten nachgewiesen. Smac mimetics wurden entwickelt, um IAPs zu antagonisieren und stellen damit eine Behandlungsstrategie für DLBCL Patienten dar, denn ca. 40 % aller DLBCL Patienten entwickeln ein Rezidiv oder erreichen gar keine Remission unter Standardtherapie. Jedoch ist der Effekt von Smac mimetics in einer Einzelbehandlung limitiert, weswegen Kombinationstherapien mit Smac mimetics eine vielversprechende Strategie für ihren klinischen Einsatz darstellen. Aus diesem Grund haben wir in dieser Arbeit den Effekt von Smac mimetic in Kombination mit Proteasom-Inhibitoren analysiert und einen speziellen Fokus auf den molekularen Mechanismus des ausgelösten Zelltodsignalweges gelegt.
Die Kombination verschiedener Konzentrationen des Smac mimetics BV6 mit dem Proteasom-Inhibitor carfilzomib (CFZ) löst in allen drei getesteten DLBCL Subtypen (ABC, GCB und PMBL) Zelltod aus. Die Kalkulation des Kombinationsindexes (CI, combination index) sowie des Bliss Scores, zwei quantitative Parameter zur Bestimmung eines Synergismus, zeigen, dass fast alle getesteten Kombinationen einen Synergismus aufweisen. Dies verdeutlicht, dass eine Co-Behandlung von BV6 und CFZ eine wirksame Kombination ist um Zelltod in DLBCL Zelllinien auszulösen. Außerdem zeigt eine Kombination von BV6 mit anderen Proteasom-Inhibitoren wie ixazomib (IXA) oder oprozomib (OPR), ebenfalls eine synergistische Reduktion der Zellviabilität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der detektierte Effekt nicht auf eine Substanz limitiert ist, sondern, dass ein genereller Effekt von Smac mimetic und Proteasom-Inhibitoren vorliegt, um Zellviabilität in DLBCL zu reduzieren. BV6 und CFZ induzieren einen apoptotischen Zelltod, da sie die Spaltung und Aktivierung von Initiator- und Effektorcaspasen (Caspasen-3, -7, -8 und -9) initiieren und sich der induzierte Zelltod mit Hilfe des Caspasen-Inhibitors zVAD.fmk verhindern lässt. Die Behandlung mit BV6 und CFZ führt zu einer Akkumulation von NIK, ein Protein welches zur Aktivierung des non-kanonischen NF-kB Signalweges benötigt wird. Weitere Untersuchungen zeigen jedoch, dass NIK nicht an der Zelltodinduktion beteiligt ist, da eine siRNA-basierte Herunterregulierung des NIK Proteins keinen Einfluss auf die Zelltodinduktion nimmt. Ebenfalls ist der Zelltod unabhängig von dem TNFa Signalweg, da weder eine Behandlung mit dem TNFa Inhibitor Enbrel den Zelltod verringern kann noch eine zusätzliche Gabe von TNFa den Zelltod erhöht. Weitere mechanistische Studien zeigen eine kritische Rolle der mitochondrialen Apoptose für den BV6/CFZ-vermittelten Zelltod. Unter Behandlung mit BV6/CFZ wurde eine Aktivierung von BAX und BAK nachgewiesen, welche beide mit verantwortlich für die Porenbildung in der mitochondrialen Membran sind. Eine Herunterregulation dieser beiden Proteine mittels siRNA reduziert signifikant den durch BV6/CFZ-induzierten Zelltod auf ein Minimum. Gleichzeitig löst eine Co-Behandlung mit BV6/CFZ einen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (LOMMP, loss of mitochondrial membrane potential) aus. In Übereinstimmung mit den vorherigen Experimenten, zeigen wir eine Akkumulation von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS; reactive oxygen species), sowie einen generellen Anstieg des allgemeinen ROS Levels. Eine Behandlung mit BV6/CFZ zeigt eine deutliche Akkumulation des pro-apoptotischen Proteins NOXA. Um dessen funktionelle Relevanz zu überprüfen, wurde die Proteinmenge von NOXA mittels siRNA stark reduziert. Eine Behandlung mit der Kombination aus BV6 und CFZ zeigt daraufhin eine signifikant reduzierte Zelltodinduktion, was die funktionelle Relevanz von NOXA für den BV6/CFZ-vermittelten Zelltod unterstreicht. Immunopräzipitationsstudien zeigen, dass in RIVA und U2932 Zellen NOXA konstitutiv an seinen anti-apoptotischen Bindungspartner MCL-1 gebunden ist, was die Zellen bereits darauf vorbereitet Apoptose zu durchlaufen. Dieses sogenannte „primen“ für Apoptose wird durch die Behandlung mit BV6 und CFZ weiter verstärkt, da es die Bindung zwischen NOXA und MCL-1 weiter erhöht. Dadurch wird die Balance zwischen pro- und anti-apoptotischen Proteinen zu Gunsten der pro-apoptotischen Proteine verschoben und die Induktion von Apoptose begünstigt.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass DLBCL Zelllinien sensitiv auf eine Behandlung mit Smac mimetic und Proteasom-Inhibitor reagieren und damit eine mögliche neue Behandlungsstrategie für diese heterogene Tumorerkrankung darstellt.