Refine
Year of publication
- 2006 (1)
Document Type
- Doctoral Thesis (1)
Language
- German (1)
Has Fulltext
- yes (1)
Is part of the Bibliography
- no (1)
Keywords
- response patterns (1) (remove)
Institute
Induktion verschiedener Aktivitätsmuster über differentielle Rezeptor-Rekrutierung von Typ I IFN
(2006)
Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Proteine, welche von Leukozyten sekretiert werden und von großer Bedeutung für die Stimulierung des angeborenen Immunsystems sind. Hierbei bewirken die Typ I Interferone (Interferone, IFN) durch ihre antivirale, immunmodulatorische, antiproliferative und antiflammatorische Wirkung. Zudem stellen sie eine Verbindung zu der zellulären Immunantwort dar, wirken bei antionkogenen Prozessen mit und aktivieren eine Vielzahl an weiteren Funktionen in der Zelle. Bekannt sind bisher eine Vielzahl verschiedener humaner Interferone (verschiedene IFNa-Subtypen, b, w und e), die über einen gemeinsamen Rezeptor wirken, der sich aus den Untereinheiten ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt. Auffallend ist, dass verschiedene Interferone unterschiedliche zelluläre Aktivitätsmuster induzieren. Mit dieser Arbeit sollte daher ein möglicher Zusammenhang zwischen der differentiellen Rezeptor-Rekrutierung verschiedener Interferone und der Induktion verschiedener Aktivitäten geklärt werden. Voraussetzung hierfür war die Aufreinigung verschiedener Interferone (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNb), Mutanten sowie Cystein-Mutanten zur selektiven Fluoreszenzmarkierung in ausreichender Menge und Reinheit. Um den Einfluss der Bindungsaffinität auf die Aktivität zu untersuchen, wurden Aminosäuren innerhalb der Bindungsstellen zu den Rezeptoruntereinheiten ausgetauscht. Die Änderung der Bindungsaffinität sowie deren Effekt auf die Aktivität wurden überprüft. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten an der Position a2S136C / a/wS137C konnte eine ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Interaktion wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über einen Deka-Histidin-tag immobilisiert wurden. Die Interaktion wurde in Echtzeit mit der markierungsfreien reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) und der totalinternen Reflektions-Fluoreszenzspektroskopie (TIRFS) detektiert. Hierzu wurden die Stöchiometrie, die Kinetik der Interaktion sowie die Bindungsstelle durch Kompetition zu den Rezeptoruntereinheiten charakterisiert. Dabei zeigten sich in der Stöchiometrie (binärer/ternärer Komplex), den Bindungsstellen oder der Konformationsänderung durch ifnar1 keine Unterschiede zwischen den IFN. Als einziges Unterscheidungsmerkmal konnten signifikant unterschiedliche Bindungsaffinitäten an die Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 nachgewiesen werden. Dabei war die Rezeptoruntereinheit ifnar2 gegenüber ifnar1 stets die höher affine Komponente mit deutlichen Affinitätsunterschieden von bis zu drei Größenordnungen. Ebenfalls wurde die Assemblierung eines ternären Komplexes untersucht, für den eine 1:1:1-Stöchiometrie für alle IFN beobachtet wurde. Für Assemblierung ternärer Komplexe konnte ein Einfluss durch die Bindungsaffinitäten sowie den relativen sowie absoluten Konzentration der Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Für die Untersuchung verschiedener zellulärer Aktivitäten, die durch die IFN induziert werden, wurde die Assemblierung des Transkriptionsfaktors ISGF3 (Interferon stimulierten Genfaktors 3), die antivirale Aktivität gegen vesikuläre Stomatitis Viren (VSV) sowie die antiproliferative Aktivität überprüft. Für die ISGF3-Aktivität konnten große Unterschiede für die effektiven Konzentrationen (EC50) zwischen den IFN beobachtet werden (pM- bis nM-Bereich). Für eine antiproliferative Aktivität wurde Konzentrationen im nM-Bereich benötigt. Insbesondere konnten Unterschiede zwischen den Aktivitätsmustern beobachtet werden. Durch die Korrelation der Bindungsaffinitäten mit den jeweiligen Aktivitäten konnte ein deutlicher Zusammenhang beobachtet werden. So wurde für die Induktion der ISGF3-Assemblierung eine Abhängigkeit zu der ifnar2-Affinität nachgewiesen. Bei niedrigen IFN-Konzentrationen wird über die ifnar2-Affinität die Verweildauer der Interferone auf der Oberfläche beeinflusst, wodurch Einfluss auf die Anzahl an ternären Komplexen genommen wird. Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die antiproliferative Aktivität eine Korrelation zu der Affinität an ifnar1. Auffällig war zudem die Korrelation der differentiellen antiproliferativen Aktivität zu der relativen Bindungsaffinität von ifnar1 zu ifnar2. Dies lässt sich durch eine mögliche Adaption der Zellen gegenüber IFN erklären, die eine Regulation der Rezeptorkonzentration auf der Membran bewirkt. Durch die Modulation der Bindungsaffinität zu ifnar2 und ifnar1 konnte der Einfluss auf die Aktivität bestätigt werden. In der Medizin könnte dies für eine verbesserte therapeutische Anwendung von Bedeutung sein, da der Einsatz von Interferonen zurzeit durch eine Vielzahl an Nebenwirkungen eingeschränkt ist.