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Lentiviral vectors mediate gene transfer into dividing and most non-dividing cells. Thereby, they stably integrate the transgene into the host cell genome. For this reason, lentiviral vectors are a promising tool for gene therapy. However, safety and efficiency of lentiviral mediated gene transfer still needs to be optimised. Ideally, cell entry should be restricted to the cell population relevant for a particular therapeutic application. Furthermore, lentiviral vectors able to transduce quiescent lymphocytes are desirable. Although many approaches were followed to engineer retroviral envelope proteins, an effective and universally applicable system for retargeting of lentiviral cell entry is still not available. Just before the experimental work of this thesis was started, retargeting of measles virus (MV) cell entry was achieved. This virus has two types of envelope glycoproteins, the hemagglutinin (H) protein responsible for receptor recognition and the fusion (F) protein mediating membrane fusion. For retargeting, the H protein was mutated in its interaction sites for the native MV receptors and a ligand or a single-chain antibody (scAb) was fused to its ectodomain. It was hypothesised that the retargeting system of MV can be transferred to lentiviral vectors by pseudotyping human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) derived vector particles with the MV glycoproteins. As the unmodified MV glycoproteins did not pseudotype HIV vectors, two F and 15 H protein variants carrying stepwise truncations or amino acid (aa) exchanges in their cytoplasmic tails were screened for their ability to form MV-HIV pseudotypes. The combinations Hcd18/Fcd30, Hcd19/Fcd30 and Hcd24+4A/Fcd30 led to most efficient pseudotype formation with titers above 10exp6 transducing units /ml, using concentrated particles. The F cytoplasmic tail was truncated by 30 aa and the H cytoplasmic tail was truncated by 18, 19 or 24 residues with four added alanines after the start methionine in the latter case. Western blot analysis indicated that particle incorporation of the MV glycoproteins was enhanced upon truncation of their cytoplasmic tails. With the MV-HIV vectors high titers on different cell lines expressing one or both MV receptors were obtained, whereas MV receptor-negative cells remained untransduced. Titers were enhanced using an optimal H to F plasmid ratio (1:7) during vector particle production. Based on the described pseudotyping with the MV glycoprotein variants, HIV vectors retargeted to the epidermal growth factor receptor (EGFR) or the B cell surface marker CD20 were generated. For the production of the retargeted vectors MVaEGFR-HIV and MVaCD20-HIV, Fcd30 together with a native receptor blind Hcd18 protein, displaying at its ectodomain either the ligand EGF or a scAb directed against CD20 were used. With these vectors, gene transfer into target receptor-positive cells was several orders of magnitude more efficient than into control cells. The almost complete absence of background transduction of non-target cells was e.g. demonstrated in mixed cell populations, where the CD20-targeting vector selectively eliminated CD20-positive cells upon suicide gene transfer. Remarkably, transduction of activated primary human CD20-positive B cells was much more efficient with the MVaCD20-HIV vector than with the standard pseudotype vector VSV-G-HIV. Even more surprisingly, MVaCD20-HIV vectors were able to transduce quiescent primary human B cells, which until then had been resistant towards lentiviral gene transfer. The most critical step during the production of MV-HIV pseudotypes was the identification of H cytoplasmic tail mutants that allowed pseudotyping while retaining the fusion helper function. In contrast to previously inefficient targeting strategies, the reason for the success of this novel targeting system must be based on the separation of the receptor recognition and fusion functions onto two different proteins. Furthermore, with the CD20-targeting vector transduction of quiescent B cells was demonstrated for the first time. Own data and literature data suggest that CD20 binding and hyper-cross-linking by the vector particles results in calcium influx and thus activation of quiescent B cells. Alternatively this feature may be based on a residual binding activity of the MV glycoproteins to the native MV receptors that is insufficient for entry but induces cytoskeleton rearrangements dissolving the post-entry block of HIV vectors. Hence, in this thesis efficient retargeting of lentiviral vectors and transduction of quiescent cells was combined. This novel targeting strategy should be easily adaptable to many other target molecules by extending the modified MV H protein with appropriate specific domains or scAbs. It should now be possible to tailor lentiviral vectors for highly selective gene transfer into any desired target cell population with an unprecedented degree of efficiency.
Hodgkin-Lymphom-Biopsien und abgeleitete Zelllinien sind charakterisiert durch die konstitutive Aktivität verschiedener Komponenten des JAK/STAT-Signalweges. Dennoch ist die Bedeutung dieser Signalvermittler für die Pathogenese des klassischen Hodgkin-Lymphoms nicht vollständig geklärt. Gegenstand dieser Arbeit war die Bedeutung der JAK/STAT-Signalkaskade, sowie insbesondere die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen. Zu diesem Zweck kamen zwei verschiedene synthetische Kinase-Inhibitoren (AG490, Cucurbitacin I) zum Einsatz. Beide Substanzen blockieren die Kaskade auf Ebene der Kinasen und sind als JAK2/STAT3-spezifische Inhibitoren beschrieben. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit beiden Substanzen das Wachstum der malignen Zellen hemmte. Gelretardierungsexperimente ergaben jedoch, dass beide Inhibitoren in allen HL-Zelllinien immer mehr als nur ein STAT-Molekül hemmten. Somit konnte keine Aussage über die Bedeutung einzelner STATs getroffen werden. Um die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen wurden daher spezifische siRNAs mittels lentiviraler Vektoren exprimiert. Die Rolle von STAT3 bei der Entstehung verschiedenster Krebsarten ist bereits gut charakterisiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass STAT3 auch in HL-Zellen ein wichtiger Regulator von Proliferation und Apoptose ist. Darüber hinaus konnte auch STAT6 als Vermittler proliferations-fördernder, anti-apoptotischer Signale identifiziert werden. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine alleinige Hemmung von STAT6 ausreicht um Apoptose in einigen HL-Zellen auszulösen. Diese Induktion von Apoptose wurde durch Caspasen vermittelt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und um STAT6-Zielgene zu identifizieren, die anti-apoptotisch wirken, wurde eine Microarray-Analyse durchgeführt. Eine weitere Möglichkeit die Aktivierung der JAK/STAT-Signalkaskade zu beeinflussen bieten die SOCS-Proteine. Diese sind direkte Zielgene der STATs und regulieren die Signalvermittlung in einer negativen Rückkopplung. In vielen unterschiedlichen Krebsarten ist diese Negativregulation ausgefallen oder fehlerhaft. Das kann zu einer konstitutiven Aktivierung des JAK/STAT-Signalweges beitragen. Die Bedeutung der SOCS-Proteine im klassischen Hodgkin-Lymphom ist noch unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Es wurden unterschiedliche Mengen endogenes SOCS1 und SOCS3 in verschiedenen HL-Zelllinien und in HL-Biopsien detektiert. In Überexpessionsexperimenten mit SOCS1 und SOCS3 konnte gezeigt werden, dass sowohl SOCS1, als auch SOCS3 nur in Zellen, die wenig endogene SOCS besitzen, die Aktivität von STAT3 und STAT6 inhibieren konnten. Die Überexpression resultierte in einem Wachstumsarrest und einem erhöhten Anteil toter Zellen. In Zellen, die bereits viel SOCS besaßen, konnten weder STAT3 noch STAT6 inhibiert werden. In diesem Zusammenhang wurde ein Modell, das potentielle Möglichkeiten zum Umgehen einer Negativregulation durch die SOCS-Proteine darstellt, diskutiert. Darüber hinaus konnte in Gelretardierungsexperimenten gezeigt werden, dass SOCS3 zusätzlich zu STAT3 und STAT6 in Zellen, die wenig SOCS besaßen, auch NF?B-Aktivierung hemmte. Da NF?B bereits als wichtiger Überlebensfaktor für HL-Zellen beschrieben wurde, trägt dessen Inhibition wahrscheinlich zu einer Hemmung des Wachstums bei. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit STAT3 und STAT6 als potentielle Ziele für therapeutische Ansätze für das klassische Hodgkin-Lymphom identifiziert werden. Einen weiteren Angriffspunkt für zukünftige Strategien liefern die SOCS-Proteine, die eine signalweg-übergreifende Hemmung von Transkritionsfaktoren erlauben.
In der retroviralen Gentherapie von Gliomen ist die effiziente und spezifische Transduktion von Gliomzellen ausschlaggebend für den Therapieerfolg. Als besonders schwierig erwies sich in diesem Zusammenhang [1]: (i) die ausreichende Distribution retroviraler Vektoren im Tumorgewebe (ii) die Transduktion einzelner, infiltrierender Tumorzellen und (iii) die Transduktion von Tumorbereichen mit geringer Zellzeilungsaktivität. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Strategien angewandt, um diese Ziele zu erreichen. Lentivirale Vektoren wurden mit Glykoproteinen des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV-GP) und des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV-G) pseudotypisiert. Lentivirale Vektoren vermitteln anders als gammaretrovirale Vektoren einen effizienten Gentransfer in ruhende Zellen [2]. Auf diese Weise können auch Tumoranteile mit geringer Zellteilungsaktivität transduziert werden. Allerdings sollte dabei die Transduktion des ebenfalls mitotisch inaktiven Hirngewebes vermieden werden. Vergleichende Tropismusstudien mit den oben genannten Pseudotypvektoren zeigten, dass LCMV-GP Pseudotypen einen effizienten und spezifischen Gentransfer in Gliomzellen in vitro und in vivo vermitteln. Auch einzelne, infiltrierende Tumorzellen wurden von LCMV-GP Pseudotypvektoren transduziert. Normale Hirnzellen, insbesondere Neurone, wurden von LCMV-GP Pseudotypen dagegen kaum infiziert. Im Gegensatz dazu transduzierten VSV-G Pseudotypen Neurone in vitro und in vivo mit hoher Effizienz, während Gliomzellen von VSVG Pseudotypen weniger stark transduziert wurden als von LCMV-GP Pseudotypen. Das Suizidgen hsv-tk (Herpes Simplex Virus Thymidinkinase) wurde anschließend durch lentivirale LCMV-GP Pseudotypvektoren in Gliome in vivo eingebracht werden. Diese Suizidgentherapie bewirkte einen starken Antitumoreffekt und führte zu einer kompletten Eliminierung des Tumors bei 90% der behandelten Ratten. Ergebnisse dieser Studien verdeutlichen, dass LCMV-GP-pseudotypisierte lentivirale Vektoren ein hoch effizientes und spezifisches Vektorsystem zum Gentransfer in maligne Gliomzellen darstellen.
Der lentivirale Gentransfer in humane blutbildende Stammzellen ist in Hinblick auf eine kurative Gentherapie von angeborenen und erworbenen Erkrankungen des hämatopoetischen Systems und er Krebstherapie von Bedeutung. Die Fähigkeit, sowohl zu proliferieren als auch in alle hämatopoetische Linien zu differenzieren, macht die pluripotenten CD34 - Stammzellen zu einem idealen Ziel für die dauerhafte Präsenz von Transgenen. Der Erfolg einer Gentherapie ist nicht nur abhängig von der Effizienz des Transfers des therapeutischen Gens in hämatopoetischen Stammzellen, sondern auch von der dauerhafte Expression des Transgens. Ein Modell zur Entwicklung einer somatischen ex vivo Gentherapie in hämatopoetischen Stammzellen ist die chronische Granulomatose (CGD). Die Krankheit beruht auf der genetisch bedingten Fehlfunktion der NADPH-Oxidase und ist mit wiederkehrenden, schweren und lebenslang auftretenden Infektionen verbunden. Eindringende Mikroorganismen wie Pilze und Bakterien werden aufgenommen, können jedoch in den phagozytierenden Vakuolen nicht abgetötet werden, da keine Sauerstoffradikale, Wasserstoffperoxid oder Folgeprodukte gebildet werden. Eine somatische Gentherapie, die eine autologe Knochenmarktransplantation mit genetisch modifizierten Zellen vorsieht, könnte CGD-Patienten die Möglichkeit einer kurativen Therapie eröffnen. Als Grundlage für die Entwicklung einer lentiviralen Gentherapie wurden zunächst lentivirale Vektoren konstruiert und mit diesen die Bedingungen der transienten Transfektion im Hinblick auf einen hohen Virustiter optimiert. Diese Vektoren wurden auf Basis des humanen Immundefizienzvirus (HIV) konstruiert und waren alle aufgrund von Deletionen in 3´ LTR selbst-inaktivierend. Das bedeutet, daß nach der reversen Transkription kein viraler Promotor mehr enthalten war, und damit die Transgen-Expression über einen internen Promotor initiiert wurde. Der pSIN-GFP Vektor enthielt grünes Fluoreszenzprotein (GFP) als Markergen und einen internen Cytomegalievirus(CMV)-Promotor. Durch Austausch der Promotor- /"Enhancer"-Sequenzen in der 5´LTR entstand der pCGWS Vektor, der unabhängig vom Tat- Transaktivator war. Die Expressionsrate konnte durch Insertion des posttranskriptionell regulatorisch wirkende Element (WPRE), das hinter das Transgene kloniert wurde, erhöht werden. Der pCIGWS Vektor wurde durch Einfügen einer multiple Klonierungsstelle und eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) zwischen dem internen Promotor und dem Transgen generiert. Dieser Vektor erlaubte jedoch nicht, wie gewünscht, die gleichzeitige Detektion der Expression eines Transgens und des Markerproteins. Die im Rahmen der Optimierung der Transfektionsbedingungen wurden unterschiedliche Verhältnisse der zur Virusproduktion notwendigen drei Plasmide zueinander ausgetestet. Die beobachteten Schwankungen des Virustiters waren bei den gewählten Verhältnissen nicht signifikant. Mit der Erhöhung der DNA-Menge an Hüllprotein Plasmid konnte auch in diesem Versuch eine vermehrte Bildung von Synzytien beobachtet werden, die sich negativ auf den Titer auswirkte. Die Behandlung der Transfektionsansätze mit Natriumbutyrat (NaBut) ergab eine deutliche Steigerung des Virustiters, wobei die Steigerung nicht mit dem Titer, der ohne NaBut erreicht wurde, korrelierte. Im Experiment zur Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Kulturmedien auf den Titer, wurden für die verwendeten Medien keine großen Unterschiede festgestellt. Bei den Experimenten zur Konzentrierung von infektiösen Viruspartikeln haben sich Ultrazentrifugation, "Low Speed"-Zentrifugation und Anionenaustauschchromatographie als Methoden bewährt. Mit diesen Verfahren konnten konzentrierte Viruslösungen generiert werden, die sehr hohe Transduktionseffizienzen auf Zellinien zeigten. Mit den angereicherten Viruspartikellösungen konnten auch CD34 -Stammzellen erfolgreich transduziert werden. Im Hinblick auf Angaben aus der Literatur konnten vergleichbare Transduktionseffizienzen erzielt werden, wobei hier fast ausschließlich ultrazentrifugierter Virusüberstand verwendet wurde. Mit der Etablierung des chromatographischen Verfahrens zur Anreicherung von Viren konnte ein alternatives System aufgezeigt werden. Am Modell der X-chromosomal gebundenen chronischen Granulomatose (X-CGD) konnte durch lentiviralen Transfer eines therapeutischen Gens (gp91phox) die funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase nachgewiesen werden. Dazu wurden lentivirale Vektoren konstruiert, die gp91phox als therapeutisches Gen enthielten. In molekularbiologischen Untersuchungen konnte zum einen die Integration des Transgens und zum anderen eine hohen Expression des gp91phox-Proteins gezeigt werden. In der durchflußzytometrische Untersuchung konnte für weniger als die Hälfte Zellen einer Modellzellinie (X-CGD PLB-985-Zellen) eine Transduktion nachgewiesen werden. In den funktionellen Untersuchungen wurde eine Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität von 80% und mehr im Vergleich zu PLB-985-Wildtypzellen detektiert. Die hohe funktionelle Rekonstitution bei geringer Transduktionseffizienz war auf eine hohe Expression aufgrund von Mehrfachintegration des Transgens zurückzuführen. Die Untersuchungen mit den lentiviralen gp91phox-Vektoren haben gezeigt, daß diese gute Voraussetzungen für die Entwicklung einer somatischen Gentherapie für CGD-Patienten mitbringen. Studien mit CD34 -Zellen und Stammzellen von X-CGD Patienten sind im weiteren notwendig, um die therapeutische Relevanz zu belegen. Neben der Fortentwicklung des Vektors muß auch die Methodik zur Generierung und Anreicherung der viralen Partikel, sowie das Transduktionsprotokoll der Stammzellen weiter optimiert werden.