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Nanotechnologie bringt Arzneistoffe sicher ans Ziel : bessere Wirkung bei reduzierter Nebenwirkung
(2006)
Für die geplanten Untersuchungen wurde eine eigene Methode für die Kultur primärer humaner Bronchialepithelzellen etabliert. Die Bronchialepithelzellen wurden aus Lungenteilresektaten durch eine cytologische Bürstung gewonnen. Die verwendeten Kulturschalen wurden mit Kollagen beschichtet. Als serumfreie Kulturmedien wurden ein Expansionsmedium und ein Differenzierungsmedium verwendet. Dabei enthielt das Expansionsmedium proliferationsfördernde Supplemente, was zu einer deutlich gesteigerten Zellausbeute gegenüber der Verwendung handelsüblicher Medien führte. Im Differenzierungsmedium wurden Supplemente verwendet, die für die Differenzierung und Ziliogenese bronchialer Epithelzellen erforderlich sind. Die Kultur erfolgte an einer Luft-Medium-Grenzfläche, die für Bronchialepithelzellen eine physiologische Umgebung darstellt. Die Charakterisierung der Kulturen zeigte keine Verunreinigungen mit Fibroblasten, Muskelzellen oder Zellen mesenchymalen Ursprungs. Das charakteristische kopfsteinplasterartige Erscheinungsbild, sowie der immunhistochemische Nachweis von Cytokeratin 18 belegten den bronchoepithelialen Charakter der Kulturen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit der RT-kompetitive Multiplex-PCR (RCMP) eine Technik entwickelt, mit deren Hilfe die Expression von Genen in niedriger Kopienzahl oder aber in Proben mit geringer RNA-Menge nachgewiesen werden kann. Geringe Ausgangsmengen an RNA wiesen vor allem die Primärkulturen von humanem Bronchialepithel, als auch frische Gewebebürstungen des Bronchial- und Nasenepithels auf. Die RCMP basiert auf einer kompetitiven PCR und kombiniert eine exogen interne und endogen interne Standardisierung. Damit wurde die mRNA-Expression von bis zu vier Genen in einem Ansatz analysiert. Die RCMP löst dabei mehrere Probleme herkömmlicher PCR-Verfahren: 1. mRNAs mit hoher oder niedriger Kopienzahl können in einem Ansatz koamplifiziert werden. 2. Die semiquantitative Quantifizierung ist unabhängig von den Syntheseeffizienzen von Target und Referenzgenen. 3. Die RCMP kontrolliert Schwankungen der initialen RNA-Menge. 4. Die Unabhängigkeit der RCMP von der Kenntnis der initialen RNA Menge erlaubt auch die Bestimmung von Probenmaterial in dem nur geringe mRNA-Mengen vorhanden sind. Damit eignet sich die RCMP besonders für Expressionsstudien Materialien wie Bioptaten, Nasal- oder Bronchialbürstungen, sowie den Kulturen primärer Bronchialepithelzellen. Mit Hilfe der RCMP wurden erstmals die mRNA der Osmolyttransporter BGT-1, SMIT und TAUT in Bronchialepithelzellen nachgewiesen. Nach Behandlung mit hyperosmotischen Medien wurde die mRNA-Expression dieser Transporter stark induziert. Bronchialepithelzellen perzeptieren osmotische Belastungen und versuchen, ihnen entgegenzuwirken. Hyperosmotische Belastungen können in Bronchialepithelien zu einer Inflammation ohne zugrunde liegende Infektion führen. Dabei wird zeit- und dosisabhängig sowohl die Sekretion als auch die Expression von IL-8 induziert. An dieser Induktion ist die p38 MAP-Kinase beteiligt. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind sowohl an der Induktion der IL-8 Sekretion und Expression beteiligt, als auch an der Aktivierung der p38 MAPKinase. Weiterhin zeigte sich, dass die Induktion der Sekretion von IL-6 und IL-8 abhängig von osmotisch bedingten Änderungen des Zellvolumens ist. Auch hier wird bereits die p38 MAP-Kinase durch das Zellvolumen reguliert. Die Ergebnisse legen ein mögliches Modell für die initialen Vorgänge in der CF-Lunge nahe. Die Veränderungen des Ionenhaushalts bei der cystischen Fibrose, sowie die eingeschränkte Zellvolumenkontrolle bei CF-Zelllinien, weisen darauf hin, dass ein defektes CFTR-Protein zu einer von neutrophilen Granulozyten dominierten Inflammation führen kann, ohne das die Lunge bereits mit Erregern besiedelt wurde.
In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Allergie gegen Süßkirsche untersucht. Zunächst wurde die Leistungsfähigkeit eines professionellen Tests mit re-kombinanten Allergenen aus Süßkirsche untersucht. Hierzu wurden rPru av 1, 3 und 4 einzeln eingesetzt, um die Sensibilisierungsmuster von Kirschallergikern aus Mitteleuropa und Spanien zu untersuchen. Vor allem die Untersuchung LTP-sensibi-lisierter Patienten aus diesen Regionen in einer Zahl, die einen statistischen Ver-gleich ermöglichte, offenbarte neue Aspekte des Phänomens schwerer Reaktionen bei solchen Patienten. Die drei rekombinanten Kirschallergene wurden auch kombiniert in einem einzigen Test eingesetzt, um schwer standardisierbare Proteinextrakte als Hilfsmittel zur in vitro Diagnose zu ersetzen. Um die Leistungsfähigkeit dieses Tests umfassend beurteilen zu können, wurde sie mit der des SPT in Birkenpollenallergikern mit und ohne Kirschallergie verglichen. Die mögliche Bedeutung unbekannter Allergene oder Isoformen wurde durch die Abschätzung des Beitrags der bekannten Kirschallergene zum IgE-Bindungsanteil von Kirschextrakt untersucht. Mit dem ImmunoCAP konnten die bereits veröffentlichten regional unterschiedlichen Sensibilisierungsmuster bestätigt werden. Die dominierende Rolle des Bet v 1-Homologen Pru av 1 in Patienten aus Mitteleuropa und damit die Bedeutung der Birkenpollenassoziation in dieser Region, konnte ebenso bestätigt werden wie die überragende Relevanz von Pru av 3 für Kirschallergiker aus Spanien. Der Vergleich der größten bisher publizierten und für statistische Untersuchungen ausreichend großen Gruppe LTP-sensibilisierter Patienten aus Mitteleuropa mit solchen Patienten aus Spanien, legte im Gegensatz zu früheren Studien keine ausschließlich auf die molekularen Eigenschaften von Pru av 3 beschränkte Assoziation von sys-temischen Reaktionen und einer Sensibilisierung gegen LTPs nahe. Die Assoziation scheint eher zwischen der Herkunft LTP-sensibilisierter Patienten und systemischen Reaktionen zu bestehen. Diese Schlussfolgerung konnte gezogen werden, da bei keinem der LTP-sensibilisierten Patienten aus Mitteleuropa systemische Reaktionen auftraten. Weder eine Co-Sensibilisierung gegen Pollen noch eine Allergie gegen andere Nahrungsmittel wie zum Beispiel Pfirsich korrelierten mit dem Auftreten sys-temischer Reaktionen. Eine Erklärung für dieses Phänomen konnte aus den vor-liegenden Daten daher nicht abgeleitet werden. Die Leistungsfähigkeit des rMix-ImmunoCAP mit rPru av 1, 3 und 4 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche war exzellent. Weder der kommerziell erhältliche Extrakt-ImmunoCAP noch der ImmunoCAP, der einen optimierten Extrakt an der Festphase trug konnte mit diesem Test konkurrieren. Die klinische Sensitivität des rMix-ImmunoCAP war mit ≥95% hervorragend, und der Test stimmte in 92% der Fälle mit dem SPT überein. Eine Unterscheidung zwischen Birkenpollenallergikern ohne Allergie gegen Süßkirsche und Kirschallergikern war hingegen weder mit dem rMix-ImmunoCAP noch mit dem SPT möglich. Die Spezifität beider Tests war von klinisch insignifikanter IgE-Reaktivität gegen Pru av 1 beeinträchtigt und auch die Konzentration spezifischen IgEs erlaubte keine Unterscheidung zwischen beiden Gruppen auf der Ebene einzelner Patienten. Der rMix-ImmunoCAP ist aber sehr gut geeignet eine Sensibilisierung bei einem Verdacht einer Allergie gegen Süßkirsche nachzuweisen, ohne auf weitere Allergene wie Pru av 2 oder Isoformen von Pru av 1 zurückgreifen zu müssen. Damit wurde zum ersten Mal ein diagnostischer Test ein-gesetzt, der einen Proteinextrakt aus Früchten vollständig ersetzen kann Die quantitative Abschätzung des Beitrages der bereits bekannten Allergene aus Süßkirsche zur IgE-Bindung mittel EAST-Inhibition hat gezeigt, dass bei einem Großteil der untersuchten Seren erhebliche Anteile des IgEs gegen Süßkirsche nicht erfasst werden. Die Ursache für dieses Phänomen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend aufgeklärt werden, aber es ist als sehr wahrscheinlich anzu-sehen, dass die neu identifizierte Isoform von Pru av 1 zumindest bei einem Teil der Seren hierfür verantwortlich ist. Darüber hinaus waren im Immunoblot bei Seren bei denen die IgE-Bindung nicht vollständig zu inhibieren war IgE-Reaktivität gegen noch unbekannte Strukturen zu erkennen. Neben der Beteiligung glykosilierter Proteine war auch eine Beteiligung von Pru av 2 nicht vollständig auszuschließen, wenngleich im Verlauf dieser Arbeit keine Hinweise auf eine Relevanz dieses Allergens in dem untersuchten Patientenkollektiv gefunden werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Grundlagen gelegt, um die Allergenität von Süßkirsche in einem in vitro Modell zu reduzieren. Es wurden Isoformen von Pru av 1 mit einer Kombination aus molekularbiologischen und proteinchemischen Methoden untersucht. Es wurden hierzu Techniken gewählt, die eine weitgehend um-fassende und zuverlässige Identifizierung von Isoformen ermöglichten. Ferner wurde der Gehalt an Pru av 1 von verschiedenen Kirschsorten verglichen, das Splice-Intron von Pru av 1 sequenziert, um die Herstellung eines spezifischen und wirksamen RNAi-Konstruktes zu ermöglichen, sowie die Eignung in vitro regenerierter Kirschpflanzen als Zielorganismus durch den Nachweis von Pru av 1 in den Blättern solcher Pflanzen geprüft. Die in dieser Arbeit verwendeten Methoden haben sich als geeignet erwiesen zuverlässig Isoformen von Allergenen zu identifizieren. Es konnte mit Hilfe einer syn-ergistischen Kombination aus einer cDNA-Bibliothek, PCR, und 2-D-PAGE / MS mit Pru av 1.02 eine neue Isoform von Pru av 1 identifiziert werden. Die mit den molekularbiologischen Methoden erzielten Ergebnisse stimmten dabei mit den Re-sultaten der proteinchemischen Untersuchungen sehr gut überein. In beiden Fällen wurden zwei Pru av 1 Isoformen nachgewiesen und lediglich die eine Variante von Pru av 1.02 mit sehr hoher Sequenzidentität konnte nicht als Protein nachgewiesen werden. Die auf Protein- und DNA-Ebene übereinstimmenden Ergebnisse bezüglich der beiden IgE-bindenden Isoformen, lassen darüber hinaus auf eine weitgehend vollständige Erfassung der Pru av1 Isoformen schließen. Pru av 1.02 besteht aus drei Varianten und zeigte ein anderes IgE-Bindungs-verhalten als das bereits bekannte Pru av 1.0101. Diese Isoform ist daher sowohl für eine zukünftige gentechnische Reduzierung der Allergenität von Süßkirsche als auch für diagnostische Zwecke bedeutsam. Für eine erfolgreiche Reduzierung der Aller-genität von Süßkirsche muss die Expression aller IgE-reaktiven Isoformen des in Mitteleuropa dominierenden Allergens Pru av 1 unterdrückt werden. Wenngleich Pru av 1.0201 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche nicht not-wendig erscheint, könnte sie jedoch sowohl einen Einfluss auf die Höhe der gemes-senen IgE-Werte und die Ausbildung von Symptomen haben, als auch besser ge-eignet sein zwischen Birkenpollenallergikern mit und ohne Allergie gegen Süßkirsche zu unterscheiden. Abschließend wurden dann die Grundlagen für die gentechnische Redu-zierung der Allergenität von Süßkirsche geschaffen. Der Gehalt an Pru av 1 war in allen elf Kirschsorten sehr ähnlich, und erlaubt daher alle untersuchten Kirschsorten als Ausgangsmaterial einzusetzen. Die Sequenzierung des Splice-Introns aus Pru av 1 ermöglicht es jetzt ein intron-spliced hairpin RNAi-Konstrukt herzustellen. Dieses Konstrukt könnte dann eingesetzt werden, um die Reduktion der Allergenität von Süßkirsche experimentell in einem in vitro Modell zu zeigen. Mit dem Nachweis von Pru av 1 in den Blättern in vitro regenerierter Kirschpflanzen konnte gezeigt werden, dass die Voraussetzungen hierzu gegeben sind.
Beim Übergang vom Wachstum zur Entwicklung entsteht in Dictyostelium discoideum aus einzelnen vegetativ wachsenden Zellen ein multizellulärer Organismus, der in der Lage ist ausdauernde Sporen zu bilden. Während der im multizellulären Verband stattfindenden morphologischen Veränderungen und Zelldifferenzierung nimmt die Proteinkinase A (PKA) eine Schlüsselfunktion ein. Der C-Modul bindende Faktor A (CbfA), ursprünglich aufgrund seiner spezifischen Bindung an eine regulatorische DNA-Sequenz des Non-LTR Retrotransposons TRE5-A.1 in D. discoideum entdeckt, ist für den Übergang vom Wachstum zur Differenzierungsphase essentiell. Zellen der CbfA-Mangelmutante JH.D2 weisen im Vergleich zu denen des Wildtyp-Stamms AX2 ein verlangsamtes Wachstum und eine verzögerte Einleitung der Aggregation und der Entwicklung auf. Charakteristisch für diese CbfA-Mutante ist die Unterexpression der mRNA für die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A (PkaC). Da die Expression der PkaC sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene reguliert ist, wurde in dieser Arbeit ein monoklonaler Antikörper gegen die katalytische Untereinheit hergestellt, um den Proteingehalt an PkaC in Zellen der CbfA-Mutante zu untersuchen. Dabei konnte eine starke Unterexpression der PkaC in den CbfA-depletierten Zellen nachgewiesen werden. Demnach scheint es einen mittelbaren Zusammenhang zwischen der Menge an CbfA und dem sich selbst verstärkenden cAMP-abhängigen Signaltransduktionssystem der Zellen zu geben, da ein Mangel an cAMP eine fehlende Aktivierung der sich selbst induzierenden PKA nach sich zieht. Für D. discoideum konnte erstmals eine reproduzierbare 2D-gelelektrophoretische Trennmethode etabliert werden, mit der es gelang, differentiell exprimierte Proteine im Stadium der frühen Entwicklung zwischen den untersuchten D. discoideum-Stämmen AX2 und JH.D2 aufzufinden. Die Anwendung der DIGE-Technologie ermöglichte dabei die Detektion von ca. 30-40 differentiell exprimierten Proteinen. Durch die massenspektrometrische Untersuchung dieser Proteine unter Verwendung der MALDI-TOF Methode in Kombination mit dem Peptid-Massen-Fingerabdruck konnten insgesamt ca. 30% der differentiell exprimierten Proteine identifiziert werden. Dabei stellte sich heraus, daß vor allem Proteine mit essentiellen Funktionen im zellulären Stoffwechsel in der CbfA-Mangelmutante JH.D2 auf geringerem Niveau exprimiert wurden als im Wildtyp-Stamm AX2. Dies könnte eine Erklärung für die letalen Auswirkungen eines vollständigen knockouts von CbfA in D. discoideum liefern. Zusätzlich wurde mit Hilfe der DIGE-Technologie die Funktion der C-terminalen Domäne des CbfA-Proteins untersucht. Für diese Experimente wurde eine CbfA-Mutante verwendet, die den C-Terminus konstitutiv überexprimiert. Die daraus resultierenden Proteinmuster haben gezeigt, daß die C-terminale Domäne unabhängig vom Rest des Proteins sowohl induzierenden als auch reprimierenden Einfluß auf die Proteinexpression nimmt. Diese Ergebnisse zeigen eine unerwartet komplexe Funktion des Proteins CbfA in der Regulation von Genen während der untersuchten Lebensphasen von D. discoideum.
LC-MS/MS-Systeme haben sich in den vergangenen Jahren trotz der hohen Anschaffungskosten von mehreren hunderttausend Euro zu einer Standardmethode in analytischen Laboratorien entwickelt und bieten im Vergleich zu herkömmlicher HPLC mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren eine höhere Sensitivität und bessere Selektivität. Aufgrund dieser Vorteile war es das Ziel dieser Arbeit, verschiedene LC-MS/MS-Methoden zu entwickeln, mit der Eicosanoide sensitiv und selektiv in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten quantifiziert werden können und diese Assays dann in biologischen Fragestellungen einzusetzen. Ein Problem der Eicosanoidanalytik mittels LC-MS/MS besteht in der Strukturähnlichkeit vieler Prostaglandine, die große Schwierigkeiten während einer Methodenentwicklung verursachen. Zwei sehr wichtige Prostaglandine, PGE2 und PGD2, besitzen das gleiche Fragmentspektrum und können nicht über das Selektionsprinzip des Tandem-Massenspektrometers quantifiziert werden, sondern müssen vor der Detektion chromatographisch getrennt werden. Die chromatographischen Bedingungen, die für eine Trennung von PGE2 und PGD2 nötig sind, gehen allerdings mit einem erheblichen Empfindlichkeitsverlust des Massenspektrometers einher. Die beste Empfindlichkeit wurde mit einem neu entwickelten Säulenmaterial, Synergi Hydro-RP, erreicht, was in allen entwickelten Methoden verwendet wurde. Zur Quantifizierung von PGE2 und PGD2 in Mikrodialysaten (max. Volumen 75 µl) musste eine Empfindlichkeit von mindestens 40 pg/ml PGE2 erreicht werden. Nach der Validierung des Systems konnte eine Quantifizierungsgrenze von PGE2 und PGD2 von 25 pg/ml bzw. 50 pg/ml erreicht werden. Bei Formalin-behandelten Ratten stieg PGE2 innerhalb von 15 Minuten auf 380 pg/ml an, womit frühere Ergebnisse, die auf der Verwendung von Immunoassays basieren, bestätigt werden konnten. Für PGD2 konnte kein Unterschied zu Kontroll-Ratten festgestellt werden und ist deswegen im Gegensatz zu PGE2 nicht an der Nozizeption im untersuchten Modell beteiligt. Mit Hilfe des mPGES-1-Enzym-Assays wurde mPGES-1 als ein weiteres Target für die drei COX-Inhibitoren Celecoxib, R- und S-Flurbiprofen identifiziert. Da mit Celecoxib ab einer Konzentration von 100 µM keine weitere Hemmung der mPGES-1 erreicht werden kann, hemmt Celecoxib die mPGES-1 wohl nicht kompetitiv und bindet nicht im katalytischen Zentrum der mPGES-1. Für Rofecoxib und Paracetamol konnte keine Hemmung der mPGES-1 festgestellt werden. Während der Methodenentwicklung wurde ein Störpeak zwischen PGE2 und PGD2 beobachtet, der in den Versuchen immer im gleichen Verhältnis zu PGE2 gebildet wurde. Mit Hilfe eines Fingerprints wurde dieser Störpeak als 5-trans-PGE2 identifiziert, welches ein bisher nicht beschriebenes Nebenprodukt der mPGES-1 zu sein scheint. In der letzten Methode sollte eine Methode entwickelt werden, mit der PGE2, PGD2, PGF2alpha, 6-keto-PGF1alpha und TXB2 in Humanplasma bestimmt werden können. Im direkten Vergleich war die validierte LC-MS/MS-Methode einem handelsüblichen Immunoassay überlegen. Zum einem waren die Standardabweichungen der LC-MS/MS-Methode wesentlich niedriger und zum anderen waren die Basalwerte des Immunoassays unphysiologisch hoch. In einer Studie wurde der Einfluss einer Mutation (-765G -> C) im Promotor der COX-2 auf die COX-2-Aktivität untersucht, für die eine reduzierte COX-2-Expression um den Faktor 2 in Monozyten beschrieben wurde. Zwischen den 2 Gruppen konnten weder in den Prostaglandin-Konzentrationen, der COX-2-mRNA-Expression noch in der COX-2-Protein-Expression statistische Unterschiede festgestellt werden und stehen damit im Widerspruch zu bisherigen Veröffentlichungen. Die entwickelten LC-MS/MS-Methoden ermöglichen eine bessere Sensitivität und schnellere Analysenzeiten im Vergleich zur HPLC und durch ihre gute Sensitivität kann der Einsatz von problematischen Immunoassays vermieden werden. Im Falle der Mikrodialysemethode, wo PGE2 in einer relativ einfachen Matrix bestimmt werden sollte (ACSF), liefert die LC-MS/MS-Methode die gleichen Ergebnisse. Im Falle von Humanplasma ist der Immunoassay allerdings unbrauchbar. Ein weiterer Vorteil der LC-MS/MS-Methoden gegenüber Immunoassays besteht darin, dass mehrere Prostaglandine in einer einzigen Probe bestimmt werden können. Gegenüber GC-MS und GC-MS/MS-Methoden fehlt den LC-MS/MS-Methoden zwar einiges an Empfindlichkeit, allerdings wird hierfür keine Derivatisierung benötigt.
Das pro-inflammatorische Zytokin Tumornekrose-Faktor alpha (TNFalpha) kann, abhängig vom zellulären Kontext, sowohl Wachstum als auch Apoptose in Säugerzellen induzieren. Diese gegensätzlichen Effekte sind zurückzuführen auf die Fähigkeit von TNFalpha verschiedene Signalwege in der Zelle zu aktivieren. Nach einer vorübergehenden Aktivierung eines antiapoptotischen Genexpressionsprogrammes über einen membranständigen TNF-Rezeptor-Multiproteinkomplex und den Transkriptionsfaktor NF-KB, kommt es zur Modifikation des Signaltransduktionskomplexes. Dieser ist nun in der Lage andere Adapterproteine und Caspasen zu rekrutieren, was letztendlich zur Einleitung der Apoptose führt. Ziel dieser Arbeit war es neue Überlebensgene zu identifizieren, die nach TNFalpha-Behandlung transient aktiviert werden, da diese Gene in Tumorzellen möglicherweise dazu beitragen, apoptotischen Prozessen entgegenzuwirken. Langfristig könnten ihre Genprodukte als diagnostische Marker oder als Angriffspunkte für neue Therapieansätze dienen. Um TNFalpha-induzierte Überlebensgene zu identifizieren wurde als Modellsystem die menschliche Cervixkarzinomzellinie HeLa eingesetzt, welche resistent gegenüber TNFalpha ist. Allerdings wird bei Blockade der Translation, zusätzlich zu der Zytokinbehandlung, Apoptose ausgelöst. Dies zeigt, dass bei der alleinigen Zugabe von TNFalpha die Transkription von Überlebensgenen induziert wird, deren Aktivität apoptotische Signalwege blockiert. Zur Identifizierung dieser transient aktivierten Gene wurde eine Strategie benutzt, welche auf einer Kombination von Genfallen-Mutagenese und Cre/loxP-spezifischer Rekombination beruht. Zunächst wurde eine HeLa-Reporterzellinie mit einem stabil integrierten, Creabhängigen, molekularen Schalter generiert. Dieser besteht aus einer Kassette mit einem konstitutiv aktiven Promotor, der die Expression eines "gefloxten", selektionierbaren Markergens antreibt. 3’ hierzu befindet sich ein zweites Markergen, das in dieser Konfiguration transkriptionell inaktiv ist. Die Reporterzellinie wurde mit einer retroviralen Genfalle transduziert, die ein Cre-Rekombinasegen trägt, aber keine cis-regulatorischen DNA-Elemente besitzt, so dass die Cre-Expression vollständig von den zellulären Sequenzen in der Nachbarschaft der Integrationsstelle des Genfallen-Provirus abhängig wird. Eine transkriptionelle Aktivierung der Cre-Genfalle, auch wenn diese nur transient ist, führt zu einer Deletion des 5'-gelegenen Markergens in dem Selektionssystem und damit zur Expression des 3'-Markers. Diese irreversible Rekombination, die ein Indikator für eine transkriptionelle Aktivierung der Genfalle ist, wurde zur Selektion einer Zellpopulation mit Genfallen-Integrationen in TNFa-induzierten Genen genutzt. Aus einer aus 2 x 106 unabhängigen Insertionen bestehenden Genfallen-Integrationsbank wurde in einem zweistufigen Selektionsverfahren 50 HeLa-Zellinien mit Genfalleninsertionen in TNFalpha induzierbaren Genen isoliert. Die Sequenzierung Genfallen-flankierender genomischer Sequenzen und anschließender Datenbankanalyse ergab folgende Verteilung der Genfallen-Integrationen: 45 % lagen in annotierten Genen, 19 % in Genen mit unbekannter Funktion, 19 % in hypothetischen Genen, 5 % in ESTs (expressed sequence tags), 6 % in repetitiven Elementen und 6 % in nicht-annotierten Regionen. Neben bekannten TNFalpha-regulierten Genen wurde eine Reihe von neuen Genen identifiziert, welche bisher noch nicht mit der TNFalpha-Signaltransduktionskaskade assoziiert worden waren. Die Validierung der so gefundenen Gene in Northern-Blots machte deutlich, dass der Expressionsanstieg nach TNFalpha-Stimulation insgesamt nicht sehr stark ausgeprägt war, zeigte aber eine klare Induktion zweier Gene (rhobtb3, atf-1) nach Zytokin-Stimulation. Interessanterweise erfolgten die Genfalleninsertionen in 50 % aller Fälle in umgekehrter Orientierung zum annotierten Gen, was darauf hindeutet, dass mit Hilfe der gewählten Strategie nicht-kodierende RNAs identifiziert werden können. Obwohl der Nachweis dieser Transkripte und ihre biologische Relevanz noch aussteht, können sie in zwei Kategorien eingeteilt werden. Integrationen oberhalb von Genen oder in 5'-UTRs, repräsentieren entweder regulatorische RNAs, die mit Promotorelementen interagieren oder Transkripte, welche unter der Kontrolle von bidirektionalen Promotoren stehen. Die zweite Kategorie, Insertionen auf dem nicht-kodierenden Strang, innerhalb von Introns, legen das Vorkommen natürlicher antisense-Transkripte nahe. Interessanterweise liegen 50 % aller antisense-Integrationen 3' zu potentiellen Transkriptionsstartstellen, die mit verschiedenen Algorithmen vorhergesagt wurden. Dies kann als Hinweis darauf gewertet werden, dass entsprechende genomische Regionen tatsächlich transkribiert werden. Aufgrund neuer Erkenntnisse über die Funktionen von nicht-kodierenden RNA-Molekülen, gerade auch in Zusammenhang zur Tumorprogression, könnte deren mögliche regulatorische Rolle innerhalb der TNFalpha-Signaltransduktionskaskade von großem Interesse sein. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Experimente führten nicht nur zur Identifizierung neuer, potentieller TNFalpha-Zielgene, sondern zeigten auch, dass Genfallen ein nützliches Werkzeug bei der Suche nach nicht-kodierenden RNAs in lebenden Zellen sein können und ihr Einsatz möglicherweise die Methode der Wahl für die Identifizierung derartiger Transkripte darstellt.
Das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) spielt eine essentielle Rolle in der Biosynthese der Leukotriene, bioaktiver Metabolite der Arachidonsäure (AA), die an einer Vielzahl entzündlicher und allergischer Erkrankungen beteiligt sind. Die 5-LO wird bevorzugt in Zellen myeloiden Ursprungs wie Granulozyten, Monozyten oder B-Lymphozyten exprimiert. In die Regulation der zellulären 5-LO-Aktivität in der Epstein-Barr Virus-transformierten B-lymphozytären Zelllinie BL41-E95-A sind Caspasen, Aspartat-spezifische Cysteinproteasen, involviert. Das Passagieren von BL41-E95-A führt zu einer Erhöhung der Proliferationsrate der B-Lymphozyten sowie zu einem deutlichen Verlust der 5-LO-Aktivität, der mit dem Auftreten eines 62 kDa-Spaltproduktes der 5-LO und einer signifikanten Aktivitätserhöhung der Caspase-8 und -6 korreliert. Isolierte humane 5-LO wird durch rekombinante Caspase-6 zwischen Asp170 und Ser171 zu einem 58 kDa-Fragment in vitro gespalten, wobei das Tetrapeptid VEID170 innerhalb der 5-LO als Erkennungsmotiv für den Angriff der Caspase-6 dient. In einigen weiteren untersuchten Zelllinien wie Mono Mac 6 (MM6), RBL-1, PMNL oder HeLa, die nicht den B-Lymphozyten angehören, konnte die 5-LO-Spaltung weder durch das Passagieren von Zellen noch durch die Behandlung mit diversen proapoptotischen Agentien ausgelöst werden. Laut Ergebnissen aus in vitro-Untersuchungen scheinen 5-LO-positive HeLa- bzw. MM6-Zellen einen Faktor zu exprimieren, der die 5-LO direkt oder indirekt vor dem Angriff der Caspase-6 und anschließender Prozessierung schützt. Die in den BL41-E95-A-Zellen beobachtete Aktivierung der Caspasen mit anschließender Prozessierung der 5-LO lässt sich durch zwei Pflanzeninhaltsstoffe supprimieren, das Hyperforin (HP) aus Johanniskraut-Extrakten und das Myrtucommulon (MC) aus Myrte-Blättern. Beide Verbindungen scheinen in B-Lymphozyten zu einer Hemmung der Caspasen-Aktivierung zu führen. Nichtsdestotrotz führt die Behandlung der B-Lymphozyten mit HP bzw. MC zu einem apoptotischen Tod der Zellen. Offensichtlich wird dabei ein (unbekannter) einzigartiger Mechanismus der Apoptose-Induktion ausgelöst. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eine potente Apoptose-induzierende Wirkung des natürlich vorkommenden Myrtucommulons auf Krebszelllinien gezeigt werden. In allen getesteten Krebszelllinien führte Myrtucommulon zum Zelltod, wobei die HL-60-Zellen mit einem IC50-Wert von 3,26 ± 0,51 µM MC am sensitivsten gegenüber MC-Einfluss waren. Zusätzlich konnte in HL-60- und MM6-Zellen nach MC-Behandlung neben einer erhöhten Caspasen-Aktivität und PARP-Spaltung ein signifikanter DNA-Abbau detektiert werden. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die zytotoxische MC-Wirkung eine bemerkenswerte Selektivität für entartete Zelllinien zu besitzen scheint und gegenüber nicht-transfizierten Zellen minimal ist.
Untersuchung der Wirkung von Cyclooxygenase-Inhibitoren auf die Entstehung der Arteriosklerose
(2006)
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der COX-2-selektiven NSAIDs Celecoxib und Rofecoxib sowie des traditionellen nichtselektiven NSAIDs Naproxen auf die Entstehung und Entwicklung von Arteriosklerose in ApoE-defizienten Mäusen untersucht. Befunde über kardiovaskuläre Risiken dieser Medikamentengruppe sowie die Beobachtung, dass COX-2 in arteriosklerotischen Plaques exprimiert wird, ließen sowohl die Hypothese von pro- als auch von antiatherogenen Wirkungen zu. Zunächst wurde die Funktionsfähigkeit des Versuchsdesigns nachgewiesen. In den Aorten von Diätgefütterten ApoE-defizienten Mäusen entwickelten sich im Alter von 22 Wochen Plaques, in denen typische atherogene sowie proinflammatorische Proteine exprimiert wurden. Die Effektivität und Selektivität der jeweiligen NSAIDs wurde durch Messung der Urinkonzentration relevanter Metabolite nachgewiesen, die aus der COX-2-vermittelten PGI2- und der COX-1-vermittelten TXA2-Synthese stammten. Erwartungsgemäß hemmten sowohl die Coxibe als auch Naproxen die Synthese von PGI2, während die TXA2-Produktion nur unter Naproxen reduziert wurde. Im Vergleich zu Kontrolltieren führte die chronische Behandlung mit Celecoxib und Rofecoxib tendenziell zu kleineren Plaques in der Aorta von diätgefütterten ApoE-defizienten Mäusen. In den Plaques wurde die Proteinexpression von COX-2 durch die Behandlung mit den NSAIDs nicht beeinflusst. Dies deutet darauf hin, dass die Reduktion der Plaques in den Aorten eher durch eine Hemmung der COX-2-Aktivität oder durch COX-unabhängige Effekte als über eine Inhibition der COX-2-Proteinexpression zustande kommt. Die Blutfettwerte wurden durch die eingesetzten NSAIDs nicht verändert, was den Daten aus der Literatur entspricht. ApoE-defiziente Mäuse, die normales Futter erhalten hatten und mit Celecoxib oder Rofecoxib behandelt wurden, entwickelten vereinzelt intimale Läsionen, während Kontrolltiere oder Naproxen-behandelte Mäuse in keinem Fall Plaques zeigten. Diese Ergebnisse könnten einen Hinweis dafür liefern, dass durch Coxibe COX-unabhängige Effekte ausgelöst werden, welche die Arteriogenese einleiten. Die umfangreichen Untersuchungen lassen auf eine unterschiedliche Beteiligung von NSAIDs bei der Arteriogenese schließen. Dabei scheinen die selektiven COX-2-Inhibitoren Celecoxib und Rofecoxib eine andere Rolle als Naproxen, dem nichtselektiven COX-2-Inhibitor, zu spielen. In ApoEdefizienten Diät-Mäusen wurde die Arteriosklerose durch Celecoxib und Rofecoxib über COX-2-abhängige Mechanismen inhibiert, wobei der Effekt vermutlich durch den stärker ausgeprägten Effekt der Hypercholesterinämie überlagert war. In den Kontroll-Mäusen (mit Normalfutter) dagegen könnte die Arteriogenese unter Celecoxib und Rofecoxib durch COX-unabhängige Mechanismen eingeleitet worden sein. Dabei scheint das Stadium der Arteriosklerose eine wichtige Rolle zu spielen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse daraufhin, dass Coxibe die Initiation der Arteriosklerose eher begünstigen, während bei weiter fortgeschrittenen Plaques tendenziell antiatherogene Effekte zu beobachten waren, die möglicherweise auf die entzündungshemmenden Eigenschaften der Substanzen zurückzuführen sind. Nachdem jedoch diese Effekte bisher nur in Maus-Modellen beobachtet und untersucht wurden, bleibt die Frage, wie NSAIDs thrombotische Ereignisse im Patienten auslösen, weiterhin offen. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass unter Rofecoxib schon nach kurzer Behandlungsdauer Herzinfarkte ausgelöst werden können (Levesque et al. 2006). Weitere Daten deuten daraufhin, dass NSAIDs über COX-unabhängige Mechanismen dazu führen, dass sogar nach dem Absetzen des Medikament auf lange Sicht ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung kardiovaskuläre Erkrankungen bestehen bleibt (Merck, APPROVe Report 2006; unter www.merck.com). Die genauen Mechanismen dieser Langzeiteffekte von NSAIDs auf das vaskuläre System sind zurzeit nach wie vor unklar. Abschließend kann jedoch aufgrund der aktuellen Datenlage vermutet werden, dass Coxibe eine Schädigung von vaskulären Zellen verursachen können und das Risiko für kardiovaskuläre Effekte eher erhöhen als antiatherogene Effekte zu erzeugen und die Arteriosklerose zu verbessern.
Seit der erstmaligen Beschreibung der MALDI (Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionisation) durch Michael Karas und Franz Hillenkamp, welche die massenspektrometrische Analyse auch großer Proteine über 100 kDa erlaubt, fand diese Technik sowohl unter den Massenspektrometrie-Gruppen als auch in Biochemischen Laboratorien rasche Verbreitung. MALDI kann inzwischen auf eine breite Palette von Biomolekülen angewendet werden und stellt heute - neben Elektrospray (ESI) -eine der beiden gebräuchlichsten massenspektrometrischen Methoden überhaupt dar. In ähnlicher Weise erlangte das Gebiet der Proteomics, der "systematischen Erforschung der zahlreichen und unterschiedlichsten Eigenschaften von Proteinen in paralleller Weise mit der Zielsetzung einer detaillierten Beschreibung der Struktur, Funktion und Steuerung biologischer Systeme im gesunden und krankhaften Zustand" eine Schlüsselstellung in der Biologie und damit einen erheblichen Einfluss auf alle Gebiete der Biologie, der Pharmazie und medizinisch verwandter Bereiche. In der Tat sind Proteine an allen biologischen Aktivitäten beteiligt und weisen die vielfaltigsten Eigenschaften auf, die in ihrer Gesamtheit zu unserem Verständnis biologischer Systeme beitragen. Die systematische Untersuchung dieser Eigenschaften macht das Gebiet der Proteomics aus und beinhaltet die Erforschung der Sequenz, Menge, Modifikationen, Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, der biologischen Aktivität, sub-zellulären Verteilung und dreidimensionalen Struktur. .... Letztlich wäre es für den Analytiker wünschenswert, aiie Schritte der MS-basierten Proteomics im Detail zu verstehen und damit vollständig zu beherrschen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb die drei entscheidenden Probenvorbereitungsschritte der MALDI-MS - gestützten Pmteomics näher untersucht. Proteinverdau: Der gebräuchliche Ansatz der MS-basierten Proteomics beinhaltet im ersten Schritt den (enzymatischen) Verdau der Proteinprobe, meist mit Trypsin aufgrund seiner sauber definierten Schnittstellen auf der C-terminalen Seite der basischen Aminosäuren Arginin (R) und Lysin (K) bei pH um 8. Dazu wurden in den vergangenen Jahrzehnten etliche Protokolle entwickelt, die auf eine möglichst vollständige Proteolyse und damit hohe Ausbeute an Spaltpeptiden abzielen. Probenaufreinigung: Als Bindeglied zwischen Proteinisolierung und MS-Analyse kommt der Aufieinigung des beim Verdau anfallenden Peptidgemischs entscheidende Bedeutung zu, da die Reinheit der Proben letzten Endes ausschlaggebend für die Qualität der Spektren ist. Auch hier sind kontinuierliche Anstrengungen zur Verbesserung im Gange, wobei in den letzten Jahren insbesondere auch spezielle Aufreinigungsmethoden für den Mikro-Maßstab beschrieben wurden, die den Bedürfnissen der Proteomics besonders entgegenkommen. Probenpräparation: Der letzte entscheidende Schritt vor der MALDI-Analyse besteht im ,,Spotting", dem Auftrag der zu analysierenden Probe zusammen mit der Matrix und deren Co-Kristallisation auf dem Probenteller. Hier bestimmen u.a. die Wahl der Matrix, der verwendeten Lösungsmittel sowie die Zugabe verschiedener Additive das Ergebnis. Obwohl der Einfluss der Matrix und Additiven auf den Desorptionsprozess einleuchtend und aus empirischen Erfahrungen seit langem bekannt ist, fehlt einem rationalen Vorgehen hier insofern die Grundlage, als dass leider noch immer kein Desorptions- und Ionisationsmechanismus gesichert ist. .... Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die vorliegenden Untersuchungen viele interessante Details und neue Ideen lieferten, die zur Verbesserung der MALDI-TOF-Analytik bei Proteomics beitragen können, so etwa: - die Portierung der einfachen, schnelle und preiswerten Probenaufreinigung mittels PVDF- und Nitrozellulosemembranen auf titerplattenbasierte Robotersysteme, bei denen eine automatisierte Zugabe der geeigneten Membranstücke, gefolgt von einfachen Wasch- und Extraktions-Schritten das Probenhandling wesentlich erleichtern sollten, - eine mögliche Verbesserung der Proteinidentifizierung durch Selektion eher hydrophiler Peptide durch neue Materialien wie HILIC, da die Mehrzahl der zur herangezogenen Peptide eher hydrophoben Charakter besitzt, - die weitere Verwendung und Erweiterung der im Rahmen dieser Arbeit erstellten Datenbanken zur Aufklärung der Zusammenhänge zwischen Peptidsequenz, der damit verbundenen physikochemischen Eigenschaften und Selektivitäts- / Unterdrückungseffekten bei der MALDI-MS.