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Wirkungen von Heilpflanzen, Gewürzen, Tees und Lebensmitteln werden in der Naturheilkunde seit der Antike genutzt. Pharmakologisch wirksam sind in der Regel nur die sekundären Pflanzeninhaltsstoffe. Diese in den oft aus vielen Bestandteilen zusammengesetzten Naturstoffen aufzuspüren und ihren molekularbiologischen Wirkungsmechanismus im Körper aufzuklären, ist das Ziel eines Forschungsnetzwerks am Frankfurter ZAFES (Zentrum für Arzneimittelforschung, -Entwicklung und -Sicherheit). So konnten Pharmazeuten und Kliniker gemeinsam herausfinden, wie ein Bestandteil des Rotweins, das Resveratrol, vor Darmkrebs schützt. Die Inhaltsstoffe von Salbei und Rosmarin bieten vielversprechende Ausgangspunkte für neue Medikamente gegen Altersdiabetes. Weihrauch, Myrte und Johanniskraut enthalten Wirkstoffe, die Schlüsselenzyme für Entzündungsreaktionen – etwa bei rheumatischen Beschwerden – hemmen.
Die Schmelztemperaturen und Schmelzenthalpien verschiedener homologer und isomerer Reihen zeigen Alternanzverhalten. In einem Vergleich von über 140 Datenreihen wurde versucht, einen möglichen Zusammenhang von Molekülstruktureigenschaften und dem Auftreten von Alternanzen der genannten physikalischen Eigenschaften darzulegen.
Ziel der vorliegenden Arbeit sind Strukturuntersuchungen an geplant gezüchteten Einkristallen elektronenreicher Iod- und Schwefel-Verbindungen, ergänzt durch zugehörige Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen. Besonderes Augenmerk gilt insbesondere Molekülen mit Thiophenyl-Substituenten R-S-(C6H5) und ihren isovalenzelektronischen Derivaten vom Typ R-NH-(C6H5) sowie den bisher unbekannten Donator/Akzeptor-Komplexen des Iodanils. Durch optimierte Auswahl jeweils geeigneter Lösungsmittel und Kristallisationsbedingungen gelingt es, zahlreiche unterschiedliche Typen kristalliner Nichtmetall-Verbindungen zu züchten. Die Strukturen der isolierten Einkristalle werden durch Vergleich mit bereits literaturbekannten sowie anhand quantenchemischer Berechnungen diskutiert und vertiefen das Verständnis der experimentellen Befunde wesentlich. ... Insgesamt belegen die in der Dissertation detalliert beschriebenen Ergebnisse, daß Kombinationen von gezielter Kristallzüchtung, anschließender Strukturbestimmung und quantenchemische Berechnungen zahlreiche Informationen über Wechselwirkungen in Kristallen liefern. So verdeutlicht die anschauliche Betrachtung der I2-Komplexe durch zugehörige Einkristallstrukturen sowie quantenchemische Modellrechnungen, daß auch geringe Wechselwirkungen teils beträchtliche Einflüsse auf Stöchiometrien und Strukturparameter in Kristallen ausüben. Das Schlußbeispiel Tris(thiophenyl)methan-Dimer belegt durch alle notwendigen Messungen wie Kristallstrukturanalyse, quantenchemische hochkorrelierte Berechnungen und massenspektrokopische Messungen, wie sich durch das Zusammenwirken moderner Methoden unerwartete Ergebnisse für einen neuartigen Verbindungstyp festigen lassen. Die lohnenden Ergebnisse der Untersuchungen erweitern die Kenntnisse statischer Aspekte bei Selbstorganisations-Phänomenen.
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Protonenbewegung während des O-E Schrittes im katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase von P. denitrificans. Die Zuordnung der Protonenbewegung zu den einzelnen Schritten des katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase ist immer noch ein Gegenstand zahlreicher Kontroversen. Obwohl von Ruitenberg et al. (2000) durch Spannungsmessungen gezeigt wurde, daß die Reduktion von Häm a während des ersten Elektrontransfers in das oxidierte Enzyme eine schnelle Protonenaufnahme von der gegenüberliegenden Seite der Membran bewirkt, wurden diese Ergebnisse angezweifelt. Daher sollte mit einer unabhängigen und direkten Methode herausgefunden werden, ob Protonen bereits während des ersten Schrittes des katalytischen Zyklus aufgenommen werden. Dazu wurde ns-zeitaufgelöste Blitzlicht-Absorptionsspektroskopie in Kombination mit pH-sensitiven Farbstoffen genutzt, und zwar sowohl mit Fluorescein kovalent an der Proteinoberfläche gebunden als auch mit Phenolrot löslich im Medium vorliegend. Zur kovalenten Kopplung von thiolreaktiven Farbstoffen mußten zuerst die nötigen Voraussetzungen geschaffen werden. Dazu wurde in dieser Arbeit ein Mutagenesesystems für sowohl Untereinheit I als auch Untereinheit II etabliert und eine oberflächencysteinfreie Variante und elf Einzelcystein-Varianten hergestellt, exprimiert und aufgereinigt sowie die Enzymaktivitäten überprüft. Danach wurde ein Protokoll zur Kopplung der Einzelcysteinvarianten mit Iodoacetamidfluoresein ausgearbeitet und die Varianten Fluorescein-markiert. Dabei zeigte es sich, daß nur sieben Varianten erfolgreich mit IAF reagierten. Mittels dieser AF-markierten Varianten konnte die Pufferkapazität an der Oberfläche der Cytochrom-c-Oxidase bestimmt werden. Es zeigte sich, daß die Pufferkapazität des Enzyms in Lösung im Vergleich zu Bakteriorhodopsin dreimal so groß ist, an der Oberfläche sogar 10-15mal so groß. Dies deutet auf eine hohe Anzahl protonierbarer Gruppen um die für die Markierung ausgewählten Aminosäuren im Bereich der Eintrittsstellen der Protonen hin. Die gezielte Übertragung eines Elektrons auf die Cytochrom-c-Oxidase erfolgte durch Licht anregbare Rutheniumkomplexe. In unserem Meßsystem war die Elektronentransfereffizienz von [Ruthenium(2,2‘-bipyridin)2]2quarterpyridin am höchsten. Nach einer sorgfältigen Optimierung der Meßbedingungen wie pH-Wert, Ionenstärke und Energie des Lasers konnte eine 10-15 %ige Reduktion von Häm a mit einer Zeitkonstanten von t = 13,7 ± 2,4 µs nachgewiesen werden. Die Protonenkonzentrationsänderungen im Medium konnten durch Phenolrot verfolgt werden. Durch den Vergleich von Funktionsvarianten, bei denen jeweils einer oder beide Protoneneingangswege blockiert sind, konnte ein Modell für die Protonenaufnahme und -abgabe während der Einelektronen-Reduktion der Cytochrom-c-Oxidase entwickelt werden. Dies konnte durch Messungen an in Liposomen inkorporierter wt Cytochrom-c-Oxidase verifiziert werden. Die Nettoprotonenaufnahme von der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase beträgt somit 0,3 H+ für das im O-E Schritt aufgenommene Elektron. Die Variante CS-I302C-AF wurde dazu genutzt, die Oberflächenladungsdichte an der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase zu bestimmen. Die Oberflächenladungsdichte auf der N-Seite des Enzyms in der Nähe zum Eingang des K-Wegs ist negativ und beträgt 0,5 e-/1000 Å2.
Die Blut-Hirn-Schranke macht das Gehirn zum streng kontrollierten extraterritorialen Raum. Die sensiblen Hirnfunktionen laufen unabhängig und ungestört von den vielfältigen Prozessen der anderen Organe ab. Neben den wichtigen Funktionen dieser Barriere hält sie jedoch auch nötige Medikamente von ihrem Wirkort, dem Gehirn, fern. Die in-vitro-BHS soll Mechanismen aufklären und Tierversuche ersetzen. In den letzten Jahren konnte so das Bild von einem statischen Computer, Gehirn, durch das Bild eines hoch plastischen Arbeitsspeicher-Netzwerkes mit verschiedensten Verbindungen ersetzt werden. Die vorliegende Arbeit ist ein zwei Bereiche gegliedert: 1. Transportstudien von Nanopartikeln und Substanzen im Transwell-System 2. Aufklärung von Transportmechanismen für Nanopartikel an der BHS Die Transportuntersuchungen erfolgten in einem Zwei-Kammer- Transwell-System. Dieses besteht aus zwei Kompartimenten, die zum einen das Blut-Kreislauf-System und zum anderen das Gehirn darstellen sollen. Diese Kompartimente sind durch eine Membran getrennt, auf welche Gehirn-Kapillar-Endothelzellen ausgebracht werden. Membran und ausgebrachte Zellen stellen die BHS dar. Der Transport von Nanopartikeln oder Substanzen wurde durch den Nachweis von Fluoreszenz im Medium der zwei Kompartimente nachgewiesen. Die fluoreszierenden Nanopartikel oder die fluoreszierende Substanz wurden in das obere Donor-Kompartiment gegeben und zu den Zeitpunkten 2, 4, 6 und 24 Stunden wird die Fluoreszenz in Donor- und Akzeptor-Kompartiment gemessen und beurteilt. Bei diesen Transportstudien konnte gezeigt werden, dass dieses System für den Nachweis von Nanopartikel-Transport ungeeignet ist. So benötigen die Nanopartikel zur Überwindung der Membran ohne Zelllayer schon über 24 Stunden. Die Menge der ankommenden Nanopartikel im Akzeptor-Kompartiment war sehr gering. Substanz-Transport und BHS-charakteristische Eigenschaften lassen sich in diesem Modell jedoch gut nachweisen. So konnte die Aktivität der Efflux-Pumpe PgP anhand des Transportes von Rhodamin, einem PgP-Substrat, belegt werden. Während der Transport von Rhodamin nach Zugabe des PgP-Substrates nur eingeschränkt beobachtbar war, konnte der Transport des Rhodamins vom Donor-Kompartiment in das Akzeptor-Kompartiment nach Zugabe des PgP-Hemmers Verapamil innerhalb 4 Stunden nachgewiesen werden. Auch die TEER-erhöhende Wirkung von Hydrokortisol und somit verbesserter Barriereeigenschaften der Zellschicht konnte an diesem Modell nachgewiesen werden. Zur Aufklärung des Mechanismus eines erfolgreichen Nanopartikel-Transports über die Blut-Hirn-Schranke wurde zunächst der rezeptor-vermittelte Transport über den LDL-Rezeptor untersucht. Der LDL-R ist ein Mitglied der LDL-R-Familie welche neben anderen Organen vermehrt in Gehirn und BHS lokalisiert sind. Als Ligand fungiert bei dieser Rezeptorfamilie und insbesondere bei dem LDL-R das ApoE. Mittels ApoE-modifizierter HSA-Nanopartikel sollte eine spezifische Bindung der Transportsysteme über den gebundenen Liganden ApoE an zielspezifische Transport-Mechanismen wie den LDL-R nachgewiesen werden. Über diesen könnten die Nanopartikel endocytiert und der Arzneistoff an seinen Wirkort gebracht werden. Untersuchungen zu diesem Transport-Mechanismus erfolgten in verschiedenen Arbeitsschritten. So wird erst eine Optimierung des LDL-R-Nachweises auf den Zellen durchgeführt. Eine Leberzelllinie wurde auf LDL-R hin untersucht und die Rezeptorkonzentration durch Mehrfachkultivierung der Zellen optimiert. Nach 2-tägiger Kultivierung in lipidfreiem Serum und dem zweimaligen Sorten der Zellen mit einem Antikörper gegen den LDL-Rezeptor konnte ein Nachweis des Rezeptors von 70-90% erreicht werden. Nächster Schritt war die Untersuchung der Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln an verschiedenen Zelllinien mit unterschiedlichem LDL-R-Nachweis, gefolgt von Untersuchungen zur Bindungsspezifität. In diesen Untersuchungen sollte die Spezifität dieser Bindung durch Präinkubationen mit einen Antikörper gegen die Liganden-Bindungsstelle und freiem ApoE nachgewiesen werden. Eine Bindung der ApoE-modifierten HSA-Nanopartikel konnte an Endothelzellen des Gehirns nachgewiesen werden. Sowohl die primär isolierten porcinen brain capillary endothelial cells (pBCEC), als auch die Maus-Gehirn-Endothelzelllinie bEnd3 wiesen eine prozentuale Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln von über 70% auf. Eine Bindung dieser Partikel an andere getestete Zelllinien mit BHS-Eigenschaften oder einem hohen Nachweis an LDL-R konnte nicht gezeigt werden. Eine Hemmung der Bindung von ApoEmodifizierten Nanopartikeln an Gehirn-Endothelzellen war nicht oder nur geringfügig möglich. So konnte durch eine Präinkubation mit dem Antikörper keine Reduktion der Bindung erreicht werden. Die Präinkubation mit freiem ApoE führte hingegen zu einer sehr geringen Erniedrigung der Bindungsaffinität der ApoE-modifizierten Nanopartikel. Zu beachten war hierbei noch die geringe nachweisbare Bindung von freiem ApoE an die Zellen. In Versuchen zur Bindung von freiem ApoE war eine prozentuale Bindung von freiem ApoE an die Zellen von nur etwa 20% nachweisbar. Bei einer solch geringen Bindung des freien Liganden kann also auch nicht von einer hohen Hemm-Wirkung ausgegangen werden. Es muß nach diesen Untersuchungen davon ausgegangen werden, dass ein ApoE- und Gehirn-Endothelzell-spezifischer Mechansimus am Transport von ApoEmodifizierten Nanopartikeln beteiligt ist. Der untersuchte LDL-R spielt hierbei keine oder nur eine sehr untergeordnete Rolle. Abschließend wurden noch Nanopartikel mit gebundenen ApoE-Mutanten auf ihre Bindung an Zellen getestet. Die modifizierten ApoE-Liganden unterschieden sich in dem Austausch von Aminosäuren in der Ligand-Bindunsdomäne. In Bindungsuntersuchungen konnte bei diesen ApoE-Varianten kein Unterschied in deren Affinität zu Zellen aufgezeigt werden. Dieser Austausch von Aminosäuren in der Liganden-Bindungsstelle hatte keinerlei Auswirkung auf deren Bindung an die Zellen, was wiederum für einen LDL-R unabhängigen Transport-Mechanismus spricht. Am Ende der vorliegenden Arbeit wurde noch ein alternativer Transport-Mechanismus untersucht. Das Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) als alternativer Mechansimus weist Heparin-Bindungsdomänen auf, die der LDL-R Bindungsdomäne sehr ähnlich sind und bekannterweise in der Lage sind, LDL-Partikel zu internalisiseren. Heparinase I kann die anionischen Heparansulfat-Seitenketten entfernen und somit den Internalisierungsmechanismus über das HSPG beeinträchtigen. Untersuchungen zum HSPG und eine Vorinkubation mit verschiedenen Konzentrationen an Heparinase I deuteten auf eine wichtige Rolle des HSPG im Bindungs- und Internalisierungsmechanismus für ApoE-PEG-HSA-NP hin. Die Affinität der ApoE- modifizierten Nanopartikel konnte durch einen Heparinase-Enzymverdau deutlich erniedrigt werden. Auch führte der Einsatz unterschiedlicher Heparinase I-Konzentrationen zu der Annahme, dass es sich um eine konzentrationsabhängige Beeinträchtigung des Mechanimus handelte. So erreichten 10 Units/ml eine weitaus größere Hemmung der ApoE-PEG-HSA-NP-Bindung als Konzentrationen von 2-5 Units/ml. Strukturelle Ähnlichkeiten des ApoEs mit zellpenetrierenden Peptiden sprechen dafür, dass neben dem HSPG noch andere Translokationsmechanismen von Bedeutung sein könnten.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine wirksame synthetische und spektroskopische Methode entwickelt, um Abstände in DNA- und RNA-Duplexen mittels Elektronen-Paramagnetische-Resonanz (EPR) zu messen und um in Zukunft die dreidimensionale Struktur biologisch relevanter RNAs bestimmen zu können. Die Synthese von iodierten Nukleotid-Bausteinen für die Oligonukleotidsynthese, an denen mit Hilfe der Palladium katalysierten Sonogashira-Kreuzkupplung sich EPR-aktive Nitroxid-Acetylene einführen lassen, wurde erfolgreich durchgeführt. Diese Phosphoramidite sollten die folgenden Kriterien erfüllen: Alle vier Basen (A, C, G und U) sollten modifiziert werden und das eingeführte Spinlabel 2,2,5,5- Tetramethyl-3-ethinyl-pyrrolin-N-oxyl (TPA) sollte entweder in die minor oder die major groove hineinragen. Im Falle der Pyrimidine (U und C) war nur die Orientierung in die major groove möglich, da das Iodid nur am C5 eingeführt werden kann. Obwohl 5-Iodo-desoxyuridin- und 5-Iodo-uridin-phosphoramidit käuflich sind, wurden diese Bausteine selber hergestellt, wobei die iodierten Bausteine mit hohen Ausbeuten erhalten wurden. Die Synthese von 5-Iodo-cytidin erfolgte aus Cytidin, insbesondere durch die Iodierung mit Iod, Iodsäure in Essigsäure und Tetrachlorkohlenstoff. Die einzige Möglichkeit, dass das Nitroxid eine Orientierung innerhalb der minor groove annimmt, war die Derivatisierung am C2 der Purine. Der Austausch von Iodo gegen eine Aminofunktion für Guanosin war wegen des Verschwindens einer potentiellen Wasserstoffbrücke ungünstig, im Gegensatz zu Adenosin. Die Synthese von 2-Iodo-adenosin-phosphoramidit wurde durchgeführt, wobei die Amino-Gruppe am C2 eines modifizierten Guanosins durch Iod mittels einer radikalischen Reaktion mit Iod, Iodmethan und Kupferiodid substituiert wurde. Die Synthese von 7-Deaza-adenosin (7-Iodo-tubercidin) und von 7-Deaza-guanosin wurde durch eine Lewissäure katalysierte Vorbrüggen-Glykosylierung zwischen der geschützen Nukleobase und der acetylierten Ribofuranose erzielt. Die Iodierung erfolgte für das geschützte Tubercidin mit N-Iodsuccinimid, während sie für Guanosin trotz zahlreicher Versuche leider scheiterte. Da natürlich vorkommende DNA und RNA nicht paramagnetisch sind, müssen sie durch die Einführung eines Spinlabels EPR-fähig gemacht werden. Dafür wurde das Spinlabel TPA ausgewählt, da es sich mit einer hohen Stabilität und Starrheit auszeichnet. Dafür wurde zuerst die Palladium(II) katalysierte Sonogashira-Kupplung in DNA-Strängen wärend der Oligonukleotidsynthese für 5-Iodo-desoxy-uridin optimiert: Sehr reine Proben mit einem oder zwei Spinlabels in einem Strang konnten hergestellt werden. Diese Methode wurde anschließend erfolgreich auf RNA mit geringfügigen Änderungen für U, C und A übertragen, um die Ausbeute der Kupplung zu verbessern. Die benutzte Chemie hat sich als entscheidend erwiesen, da es zu berücksichtigen gilt, wie sich die Reagenzien, die bei der RNA-Festphasensynthese eingesetzt werden, auf das Spinlabel auswirken. Es wurde festgestellt, dass die Oxidationsstufe des klassischen TBDMS-Festphasenzyklus mit Iod, Pyridin und Wasser für die Reduktion eines beträchtlichen Teils des Nitroxids verantwortlich ist, insbesondere im Falle von 2-Iodo-adenosin. Deshalb wurde beschlossen, die patentierte ACE-Chemie zu verwenden, in der das Phosphor-Atom während des Festphasenzyklus mit tert-Butylperoxid in Toluol oxidiert wird. Die Synthese der geeigneten Bausteine wurde hierfür durchgeführt, 5-Iodo-uridin-phosphoramidit ist bei Dharmacon kommerziell erhältlich. Leider scheiterte die Synthese von 7-Iodo-tubercidin-phosphoramidit auf der Stufe der Einführung des Orthoesters. Auf diese Weise wurden sehr reine doppelgelabelte DNA und RNA Duplexe erhalten, deren Stabilität durch UV-Spektroskopie überprüft wurde. Der Unterschied in den Tm-Werten überstieg nicht 3,2°C für DNA und 5,1°C für RNA im Vergleich zu den unmodifizierten Duplexen. CD-Spektren wurden ebenso aufgenommen und zeigten, dass die B- bzw. A-Form erhalten blieb. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prisner wurden die Abstände zwischen den zwei Nitroxiden in den synthetisierten fünf DNA- und sechs RNA-Duplexen mit Puls-Elektron-Doppel-Resonanz (PELDOR) gemessen. Diese experimentellen Werte wurden mit den theoretischen Werten verglichen, die mit Molecular Dynamics Simulationen erhalten wurden (Arbeitskreis Stock). Die mit beiden Methoden erhaltenen Ergebnisse stimmen überein. Erfolgreich wurde auch die Synthese von reinen spingelabelten biologisch relevanten RNAs wie TAR-RNA, der vier-Wege Kreuzung IIIa,b,c des Hepatitis C Virus und dem U4-U6 Komplex des Spleißosoms im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Die größte synthetisierte RNA betrug 65 Nukleobasen. Leider konnten wegen zu hoher Flexibilität oder nicht richtiger Faltung der RNA keine definierten Abstände gefunden werden.
ATP-binding cassette (ABC) Transporter sind ubiquitäre Membranproteine, die die Hydrolyse von ATP in der Regel an die Translokation unterschiedlichster Substrate über biologische Membranen koppeln. Sie bilden eine der größten Familien von aktiven Transportern, werden in allen drei Reichen des Lebens gefunden und sind an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Vorgänge beteiligt. Auf Grund ihrer zentralen Bedeutung für viele zelluläre Prozesse wurden in der hier vorliegenden Arbeit ausgewählte ABC-Transporter bzw. ihre Komponenten strukturell untersucht, mit dem Ziel einen Beitrag zur Aufklärung ihrer molekularen Mechanismen zu leisten. Das erste untersuchte System war der MDR-ABC-Transporter LmrA aus L. lactis, der auf Grund seiner funktionalen Austauschbarkeit mit dem humanen P-Glykoprotein ein geeignetes Modellsystem zur strukturellen Untersuchung dieser medizinisch relevanten Klasse von ABC-Transportern darstellte. In einem ersten Schritt zu seiner Kristallisation wurde durch die Analyse von 43 Protein-Detergens-Kombinationen eine für strukturbiologische Untersuchungen geeignete Proteinpräparation etabliert. Unter Verwendung von FOS-CHOLINE-16 wurde eine bis zur Homogenität gereinigte, monodisperse und stabile Proteinlösung zur Kristallisation gewonnen, mit der eine breit angelegte Analyse des n-dimensionalen Kristallisationsraums von LmrA durchgeführt wurde. Im Zuge der Analyse von insgesamt 9600 Bedingungen wurden vier verschiedene Kristallformen erhalten. Die Datenaufnahme lieferte für die Kristallform 2 unter Verwendung von Synchrotronstrahlung eine schwache Streuung bis zu einer Auflösung von 20 Å. In einem weiteren Projekt wurden die molekularen Grundlagen der Substratspezifität des ABC-Importers Ehu aus S. meliloti untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur seines Substratbindeproteins EhuB im Komplex mit den kompatiblen Soluten Ectoin bzw. Hydroxyectoin mit einer Auflösung von 1,9 Å bzw. 2,5 Å gelöst. Die beiden erhaltenen Strukturen zeigten einen für Substratbindeproteine der Gruppe II typischen Aufbau aus zwei globulären Domänen, die durch zwei Segmente der Polypeptidkette verbunden wurden. Die Substratbindungsstelle von EhuB war, wie für Substratbindeproteine erwartet, in der Spalte zwischen den beiden globulären Domänen lokalisiert. Ihre Analyse zeigte eine Interaktion des Proteins mit der negativ geladenen Carboxylat-Gruppe der Substrate durch die Bildung von Salzbrücken mit der Seitenkette von Arg85 sowie mittels Wasserstoffbrückenbindungen mit den Hauptketten-Stickstoffatomen von Phe80 und Thr133. Im Unterschied dazu waren für die Bindung des kationischen Anteils der Substrate wesentlich seine Wechselwirkungen mit den aromatischen Resten Phe24, Tyr60 und Phe80 verantwortlich, die durch ihre räumliche Anordnung eine optimale Bindungsstelle für die delokalisierte positive Ladung der Substrate bildeten. Die Bedeutung dieser wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhenden Wechselwirkungen für die Substratbindung konnten – aufbauend auf der Kristallstruktur – in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. E. Bremer (Universität Marburg) bestätigt werden. Neben den beschriebenen Interaktionen wurde der kationische Anteil der Substrate durch zwei Salzbrücken mit der Seitenkette von Glu21 sowie durch eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Hauptketten-Carbonyl-Funktion von Gly78 gebunden. Bei der Bindung des Substrats Hydroxyectoin wurde im Vergleich zu Ectoin eine zusätzliche Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Seitenkette von Glu134 und der lediglich in diesem Substrat vorhandenen Hydroxyl-Gruppe beobachtet, die für die dreieinhalbfach höhere Bindungsaffinität von EhuB für Hydroxyectoin gegenüber Ectoin verantwortlich zu sein scheint. Der Vergleich der an der Substratbindung beteiligten Interaktionen in EhuB mit den ebenfalls für kompatible Solute spezifischen Substratbindeproteinen ProX aus E. coli, ProX aus A. fulgidus und OpuAC aus B. subtilis enthüllte gemeinsame Prinzipen der untersuchten Proteine zur Bindung dieser Klasse von Substraten. Von besonderer Bedeutung waren dabei die von bestimmten aromatischen Resten ausgehenden Wechselwirkungen mit dem kationischen Anteil der Substrate, die wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhen. Im Detail zeigten die Substratbindungsstellen der untersuchten Proteine jedoch signifikante Unterschiede, die eine Anpassung an die für ihre Aufgabe benötigte Bindungsaffinität und das zu bindende Substrat zu sein scheinen.
Struktur und Bindungsverhalten der N-terminalen p85-src-homology-2-Domäne mittels NMR-Spektroskopie
(2006)
Die Cytochrom c Oxidase von Paracoccus denitrificans katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser und „pumpt“ zusätzlich vier Protonen von der cytoplasmatischen Seite auf die periplasmatische Seite der Cytoplasmamembran. Die Spaltung des molekularen Sauerstoffes im binuklearen Zentrum erfolgt im katalytischen Zyklus des Enzyms bei der Umwandlung des Intermediates A, in welchem molekularer Sauerstoff an das Häm a3 Eisen gebunden ist, in das Intermediat PM durch spontane elektronische Umorganisation. Drei der dazu benötigten vier Elektronen werden von den Metallzentren geliefert. Das vierte Elektron wird sehr wahrscheinlich von einer Aminosäure in der Nähe des binuklearen Zentrums durch Bildung eines Aminosäureradikals beigesteuert. Dieses Radikal sollte in den Intermediaten PM und F• des katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase vorhanden sein. Durch Reaktion von stöchiometrischen Mengen an Wasserstoffperoxid mit dem vollständig oxidierten Enzym lassen sich PM; F• und F-Intermediate künstlich erzeugen und durch ihre Maxima in Absorptionsdifferenzspektren charakterisieren. Mit paramagnetischer Elektronenresonanzspektroskopie (EPR-Spektroskopie) können Struktur und Dynamik paramagnetischer Zentren in Proteinmolekülen untersucht werden. Mit dieser Methode konnte in mit Wasserstoffperoxid generierten PM und F•-Intermediaten ein Tyrosinradikal nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Identifikation dieses Tyrosins mittels einer Mutagenesestudie. Dazu wurden Tyrosinvarianten (Y35F, Y167F, Y267F, Y280H, Y328F und Y414F) aus Untereinheit I, die einen maximalen Abstand von 25 Angström vom binuklearen Zentrum aufweisen, mit Hilfe von Absorptions- und EPR-Spektroskopie charakterisiert. Auf diese Weise konnte nachgewiesen werden, dass Tyrosin 167 eindeutig der Ursprungsort des Tyrosinradikals ist, das bei der Generierung von PM- und F•-Intermediaten der Cytochrom c Oxidase mit Wasserstoffperoxid entsteht. Da die Variante Y167F jedoch eine hohe katalytische Aktivität aufwies und in der Lage war, die Oxoferrylintermediate PM; F• und F zu bilden, konnte gleichzeitig gezeigt werden, dass dieses Tyrosin nicht der primäre Donor des vierten Elektrons sein kann, das im katalytischen Zyklus des Enzyms für die Spaltung der Sauerstoffbindung benötigt wird. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, dass Tyrosin 167 eine thermodynamische Senke darstellt, in die das von einem unbekannten kurzlebigen Elektronendonor bei der Wasserstoffperoxidreaktion gebildete Radikal verschoben wird. Als Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung kommt auch Tryptophan 272 infrage. Daher wurde auch die Variante W272M spektroskopisch charakterisiert. Diese Variante war katalytisch inaktiv und nicht in der Lage in Reaktion mit Wasserstoffperoxid die Intermediate PM, F• und F zu bilden. Es ließen sich weder das Tyrosin-167-Radikal noch ein anderes Radikal nachweisen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Tryptophan 272 möglicherweise der ursprüngliche Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase sein könnte. Während des PM zu F-Übergangs im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase werden zwei Protonen gepumpt. Diese können vom Enzym entweder über den D-Weg oder den K-Weg aufgenommen werden. Eine Untersuchung des PM zu F-Übergangs von D-Weg- und K-Weg-Varianten der Cytochrom c Oxidase kann Aufschluss über die Beteiligung der beiden Protonenaufnahmewege des Enzyms an diesem Schritt des katalytischen Zyklus geben. Daher wurde die Reaktion der D-Weg Varianten D124N, N131D, Y35F und E278Q und der K-Weg Variante K354M mit Wasserstoffperoxid absorptionsspektroskopisch untersucht. Durch diese Experimente konnte die zentrale Bedeutung des D-Weges für die Protonentranslokation im PM zu F-Übergangs bestätigt, aber auch ein gewisser Einfluss des K-Weges nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurde der PM zu F-Übergang der Variante R437N, die eventuell Teil des noch nicht konkret identifizierten Protonenaustrittsweg der Cytochrom c Oxidase ist, untersucht.
An den Folgen von AIDS sind bisher fast 20 Millionen Menschen gestorben. Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte erstmals die Viruslast bei gleichzeitiger Erhöhung der CD4-Lymphozytenzahl effizient erniedrigt werden. Dadurch konnte zwar eine Kontrolle der Virusreplikation und damit verbunden eine längere Überlebenszeit erreicht werden, jedoch ist eine vollständige Eradikation des Virus bisher nicht möglich. Hohe Behandlungskosten, Nebenwirkungen der antiviralen Substanzen, ihre unzureichende Wirkung in manchen Körperkompartimenten und die rasche Verbreitung resistenter Viren schränken die Effektivität von HAART ein. Alternative Therapieformen zielen in den letzten Jahren verstärkt auf die HIV-Eintrittshemmung durch Inhibition der Membranfusion von Virus und Wirtszelle („Fusionsinhibitoren“). Peptide, die sich aus der „heptad repeat“ Region 2, HR2, des gp41 ableiten (C-Peptide), sind äußerst wirksame antivirale Substanzen. 2003 wurde T-20, ein 36 Aminosäure langes C-Peptid, als erster Fusionsinhibitor zugelassen. Sein breiter Einsatz ist jedoch aufgrund rascher Resistenzbildung, mangelnder oraler Verfügbarkeit, einer äußerst kurzen Serumhalbwertszeit sowie daraus resultierender hoher Therapiekosten limitiert. Aufgrund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit mit der Entwicklung von RNA-Aptameren als HIV-Fusionsinhibitoren ein neuer therapeutischer Ansatz etabliert werden. Zur Isolierung dieser RNA-Aptamere wurden zwei hoch komplexe RNA-Bibliotheken in manuellen sowie automatisierten Selektionen gegen verschiedene Zielstrukturen auf dem HIV-1 gp41 mit Hilfe der SELEX-Technologie selektiert. Der Wirkmechanismus der isolierten RNA-Aptamere sollte analog zu den gp41 HR-abgeleiteten Peptiden auf der Hemmung der Ausbildung des Sechs-Helix-Bündels als fusionaktive Struktur beruhen. So sollten die RNA-Aptamere die Ausbildung der zentralen N coiled-coil Struktur verhindern (Selektion gegen HR1-Peptide) oder die Anlagerung der HR-2 Domänen an die konservierten hydrophoben Furchen des zentralen N coiled-coils inhibieren (Selektion gegen HR2-Peptide). Die gewählten Zielstrukturen wurden entweder als freie synthetische Peptide oder membrangebunden auf der Oberfläche von humanen T-Zellen präsentiert. Um die Selektion von serumstabilen Aptameren zu gewährleisten, wurden die RNA-Aptamere unter Einsatz von 2’-F- oder 2’-NH2-modifizierten Pyrimidinen transkribiert. Nach initialen Selektionsrunden wurden die isolierten Aptamerfraktionen in einer „single-round infection“ unter Einsatz von HIV-Pseudotypvektoren auf spezifische Inhibition des Eintritts von HIV in die Zielzellen analysiert. Die isolierten RNA-Aptamere waren in der Lage, den HIV-Eintritt zu inhibieren, ihre Wirksamkeit war allerdings im Vergelich zu der naiven Bibliothek gering. Nach Durchführung von verschiedenen Reifungsstrategien, um die Affinität der vorselektieren RNA-Fraktionen zum jeweiligen Zielepitop zu erhöhen, konnte die inhibitorische Wirkung der gereiften RNA-Fraktionen auf das 10Fache im Vergleich zu der Urspungsbibliothek verbessert werden. Die wirksamste RNA-Fraktion, 435UU, wurde aus einer Selektion einer aminomodifizierten N30 RNA-Bibliothek gegen das membranverankerte Fusionsprotein M435, bestehend aus gp41 C46 und dem membranproximalen HIV-Linker, und anschließender Kompetiton mit dem 2F5 Antikörper gewonnen. Die 435UU RNA-Fraktion konnte den Eintritt von HIV mit einer IC50 ≈ 200 nM spezifisch hemmen. Weiterhin konnte die spezifische Fusionsinhibition der 435UU Aptamerfraktion in einem Zell-Zellfusionsassay unter Einsatz von HIV env exprimierenden Zellen und einer humanen T-Zelllinie demonstriert werden. Die Affinität der 435UU-Fraktion wurde in einem Gelmobilitätsversuch bestimmt. Die moderate HIV-Eintrittshemmung beruhte auf einer schwachen Bindung (Kd ≈ 750 nM) an das Zielepitop auf dem gp41. Die Analyse von Einzelaptameren aus der 435UU RNA-Population ergab keine signifikanten Unterschiede in ihrem HIV-Neutralisationspotential. Des Weiteren konnten nur wenig gemeinsame Primärstrukturmotive bestimmt werden. Der Gehalt an inkorporierten Pyrimidinen in den 435UU-Einzelaptameren war allerdings mit ca. 70% vergleichsweise hoch. Unter Einsatz von randomisierten RNA-Transkripte mit definiertem Pyrimidingehalt konnte festgestellt werden, dass tendenziell ein höherer Gehalt an NH2-Pyrimidinen die HIV-Neutralisation fördert. Allerdings konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Bindung an das C46-HIVLinker Fusionskonstrukt und dem Pyrimidingehalt der Transkripte ermittelt werden. Die Sekundärstukturvorhersage ergab keine strukturelle Verwandtschaft unter den 435UU-Einzelaptameren noch konnten klar definierte Sekundärstrukturmotive gefunden werden. Die Selektion der 435UU-Aptamerfraktion erfolgte deshalb nich allein aufgrund ihres hohen Pyrimidingehaltes. Ein direkter Vergleich der 435UU Aptamerfraktion mit dem bisher einzigen RNA-Eintrittsinhibitor, einem anti-gp120 RNA-Aptamer, ergab zwar eine geringfügig schwächere HIV-Inhibition, jedoch ein wesentlich breiteres Wirkspektrum der isolierten anti-gp41 RNA-Aptamere wahrscheinlich durch ihren hoch konservierten Wirkmechanismus. Schlussendlich könnte die Wahl der Präsentation der Zielstrukturen sowie der Selektionsdurchführung die Gewinnung von RNA-Aptameren mit moderater Affinität fördern und gleichzeitig zum Verlust von hoch affinen RNA-Strukturen führen. In nachfolgenden Selektionen sollte deshalb die Selektionsstringenz erhöht sowie gegen membrangebundene Zielstrukturen selektiert werden, die die tatsächliche native gp41 Konformation darstellen.