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Die Rolle der löslichen Guanylatzyklase in der Signaltransduktion durch Superoxidanionradikale
(2005)
Im kardiovaskulären System ist die lösliche Guanylatzyklase (soluble guanylyl cyclase, sGC) ein Schlüsselenzym der •NO/cGMP-Signaltransduktion. Stickstoffmonoxid (•NO) aktiviert durch direkte Anbindung an das Häm-Eisen die Produktion von zyklischem 3’,5’-Guanosinmonophosphat (cGMP). In glatten Muskelzellen führt ein erhöhter cGMP-Spiegel zur Aktivierung von cGMP-abhängigen Proteinkinasen (cGK) und letztendlich zur Vaso-dilatation. Superoxidanionradikale (•O2-) sind an der Entstehung und Progression von Herz-Kreis¬lauferkrankungen beteiligt. Im vaskulären Gewebe stellt •O2- einen Gegenspieler zum •NO dar. So führt eine vermehrte Produktion von •O2- zu einer eingeschränkten Bioverfügbarkeit von •NO (•O2- + •NO -> ONOO-) (Ohara et al., 1993a). Im Rahmen dieser Arbeit sollte aufgeklärt werden, ob bei einer vaskulären Störung des •NO-Systems die Funktion der sGC durch •O2- auch direkt betroffen ist. Damit könnte dem Superoxid eine weit größere biologische Bedeutung zukommen als bisher angenommen, nämlich die Funktion als Signaltransduktionsmolekül mit der sGC als definiertem Rezeptor und Effektor. Die sGC-Aktivitätsuntersuchungen mit gereinigter sGC zeigten eine konzentrationsab¬hängige Hemmung der basalen und der YC-1- (100 µM) stimulierten (•NO-unabhängigen) sGC-Aktivität durch das •O2--generierende System Xanthinoxidase/Hypoxanthin (XO/HX) (IC50 (basal) = 0,0031 vs. IC50 (YC-1) = 0,022 mU/ml). Die Aufhebung dieser Hemmung durch Superoxiddismutase (SOD, 100 U/ml) deutete auf eine spezifische und schnell-reversible Hemmung der sGC-Aktivität durch •O2- hin. Die in-vitro gezeigte Hemmung der sGC-Aktivität durch •O2- konnte auch in-vivo nach¬gewiesen werden. Die Produktion von •O2- in kultivierten glatten Muskelzellen der Rattenaorta (VSMC) konnte mit Elektronenspinresonanz (ESR) und Lucigenin-abhängiger Chemilumineszenz gezeigt werden. Dabei wurde mit ESR eine ca. 5-fache Steigerung der basalen •O2--Produktion mit dem intrazellulären Redoxcycler Dimethoxynaphtochinon (DMNQ, 10 µM) beobachtet. Auch die Aktivierung membranständiger NADPH-Oxidasen durch die physiologischen Aktivatoren Angiotensin II (Ang II, 100 nM) und platelet-derived growth factor (PDGF, 50 ng/ml) führten zu einer ca. 2-fach gesteigerten •O2--Produktion. Die Hemmung der cGMP-Produktion durch •O2- in kultivierten VSMC konnte in-vivo mittels Enzym-Immuno-Assays (cGMP-EIA) [YC-1 (100µM) = 100 % vs. YC-1 + DMNQ (10 µM) = 21 % vs. YC-1 + PDGF (50 ng/ml) = 76,6 %] nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die Auswirkung von •O2- auf die cGMP-abhängige Signaltransduktion mit Immu¬noblotting (Western-Blot) von phosphoryliertem Vasodilator-stimulierten Phosphoprotein (VASP, vasodilator-stimulated phosphoprotein) gezeigt. Intrazelluläre •O2--Produktion durch Redoxcycling (DMNQ, 10 µM) reduzierte die YC-1-stimulierte Phosphorylierung von VASP um 44,4 %. In weiteren Untersuchungen sollte der molekulare Mechanismus der schnell-reversiblen Hemmung der sGC durch •O2- auf Ebene der sGC aufgeklärt werden. Dabei wies die direkte Detektion von Sulfinyl-Radikalen auf eine Oxidation von Proteinthiolen durch •O2- hin. Der spezifische Austausch von Cysteinen der sGC mittels Punktmutation und die Expression der sGC-Mutanten in COS1-Zellen zeigte, dass Thiol-Gruppen der sGC mit •O2- interagieren. Dabei stellte sich heraus, dass die sGC-Mutanten a1/b1C541S und a1C238S/b1 viel sensitiver auf •O2- (XO 3 mU/ml) reagieren als die Wildtyp-sGC (WTa1/WTb1 = -62 % vs. WTa1C238S/WTb1 = -93,7 % vs. WTa1/b1C541S = -90,2 %). Um zu untersuchen, ob das Häm-Eisen der sGC an der Aktivitätshemmung durch •O2- beteiligt ist, wurde einerseits das Häm entfernt (Tween 20), andererseits das Häm-Fe2+ zum Häm-Fe3+ oxidiert (NS2028). Beide Behandlungen führten zu einer weitgehend YC-1-insen¬sitiven sGC. Die mit Protoporphyrin IX (PIX) aktivierte Häm-freie sGC und die mit HMR3448 aktivierte Häm-oxidierte sGC wurden durch XO/HX wesentlich weniger potent gehemmt als die YC-1-sensitive sGC. Dieser Befund deutet auf eine Beteiligung des Häm-Eisens bei der Aktivitätshemmung der sGC durch •O2- hin. Die in dieser Arbeit gezeigte direkte und schnell-reversible Hemmung der sGC-Aktivität durch •O2- weist der löslichen Guanylatzyklase eine neue biologische Funktion zu. Die sGC könnte als Rezeptor- und Effektorenzym die Signaltransduktion des Signalmoleküls •O2- vermitteln.
Es wurden Antidepressiva verschiedener Klassen bezüglich ihrer Hemmung von Pgp in zwei Zellsystemen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Calcein-AM) untersucht. Die untersuchten Substanzen zeigen alle in höheren Konzentrationen eine Hemmung von Pgp. Da diese Konzentrationen nach Applikation therapeutisch relevanter Dosen in-vivo nicht erreicht werden, lässt sich die These, dass ein Teil der antidepressiven Wirkung dieser Substanzen durch Normalisierung der HPA-Achse zu Stande kommt, durch die Ergebnisse dieser Arbeit nicht bestätigen. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die Hemmung von Pgp eine Eigenschaft ist, die Antidepressiva von anderen zentral-wirksamen Substanzklassen unterscheidet. Ausgehend von der Annahme, dass die Hemmung von Pgp zur antidepressiven Wirksamkeit beiträgt, wäre die Schlussfolgerung naheliegend, dass andere Gruppen, wie z.B. Antipsychotika diese Eigenschaft nicht aufweisen. Daher wurden drei verschiedene Antipsychotika bezüglich der Modulation der Aktivität von Pgp im Calcein-AM Assay untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Antipsychotika ebenfalls Pgp in höheren Konzentrationen – ähnlich der hemmenden Konzentrationen von Antidepressiva - inhibieren. Von daher ist die Hemmung von Pgp keine substanzklassenabhängige Eigenschaft der Antidepressiva, sondern eher eine unspezifische Eigenschaft, die verschiedene ZNS-wirksame Wirkstoffklassen aufweisen. Des Weiteren wurde die Modulation der Expression von Pgp durch Antidepressiva untersucht. Denn beide Veränderungen, zum einen bezüglich der Aktivität von Pgp und zum anderen bezüglich der Expression von Pgp, können zu klinisch relevanten Arzneimittelinteraktionen führen. Der Hauptuntersuchungsgegenstand dieser Arbeit ist Johanniskrautextrakt, daher wurde in-vitro der Extrakt selbst und die aus dem Calcein-Assay als potenteste Modulatoren anzusehenden Inhaltsstoffe bezüglich der Expression untersucht. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass der Extrakt selbst und auch Hyperforin die Expression von Pgp induzieren. Die Induktion durch Hyperforin entspricht der durch den Gesamtextrakt, so dass man sagen kann, dass Hyperforin der Inhaltsstoff von Johanniskrautextrakt ist, der die Expression von Pgp induziert. Diese Wirkung kommt über eine Aktivierung des PXR zu Stande, der seinerseits die Expression von Pgp moduliert. Hyperforin ist als starker PXR Ligand charakterisiert. Die Induktion konnte ebenfalls im Gehirn von Mäusen nach 14tägiger oraler Applikation von Johanniskrautextrakt gesehen werden. Für die Versuche bezüglich der Expression von Pgp im Gehirn von Mäusen und für das nächste Untersuchungsziel, die Untersuchung der Verteilung von Corticosteron in Mäusen, wurden Behandlungsstudien durchgeführt. Es wurden männliche, 2-3 Monate alte NMRI-Mäuse oral durch Schlundsondierung mit den entsprechenden Substanzen behandelt. Es wurden akute (einmalige Applikation und Tötung der Tiere 1h später) und subchronische (14tägige Applikation, Tötung an Tag 15) Studien durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob Antidepressiva die Verteilung von Glucocorticoiden im Körper (Gehirn/Plasma) modulieren können. Diesbezüglich wurde der Effekt von Johanniskrautextrakt, Mirtazapin, Amitriptylin und Fluoxetin nach akuter Einmalgabe und nach subchronischer 14tägiger oraler Applikation der Substanzen untersucht. Amitriptylin zeigt keinen Effekt auf die Konzentration und/oder Verteilung von Corticosteron, weder nach akuter noch nach subchronischer Gabe. Fluoxetin erhöht die Corticosteronlevel in Gehirn und Plasma sowohl nach Einmalgabe als auch nach subchronischer Applikation signifikant. Mirtazapin erhöht akut ebenfalls Corticosteron in Gehirn und Plasma, nach subchronischer Applikation nivelliert sich dieser Effekt jedoch wieder. Nach 14tägiger Gabe ist kein signifikanter Unterschied mehr zur Kontrolle zu erkennen. Johanniskrautextrakt verhält sich ähnlich wie Fluoxetin. Es erhöht im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle Corticosteron in Plasma und Gehirn sowohl nach akuter als auch nach subchronischer Applikation. Keine der untersuchten Substanzen verschiebt die Verteilung von Corticosteron zwischen Gehirn und Plasma im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Konzentration von Corticosteron im Körper wird über 5-HT2 Rezeptoren gesteuert. Indirekte Agonisten wie Fluoxetin und Johanniskrautextrakt erhöhen sie, Antagonisten wie Mirtazapin und Amitriptylin verändern sie nicht. Zusammenfassend kann man bezüglich des Hauptuntersuchungsgegenstandes Johanniskrautextrakt sagen, dass der Extrakt selbst, Hyperforin und Quercetin in der Lage sind, die Transportaktivität von Pgp konzentrationsabhängig zu modulieren. Nach längerer Inkubation induziert der Extrakt durch die Wirkung von Hyperforin als PXR-Aktivator die Expression von Pgp. Darüber hinaus verändert Johanniskrautextrakt die Corticosteronausschüttung bei Mäusen, die oral mit dem Extrakt behandelt wurden, ohne die Verteilung zwischen Gehirn und Plasma zu verändern.
Synthese und in vitro-pharmakologische Charakterisierung von dualen PPARalpha/gamma-Agonisten
(2005)
Die Behandlung von Hypertriglyceridämien und Insulinresistenz erfolgt heute vor allem durch den Einsatz der Fibrate und Thiazolidindione (TZDs). Eine neue Wirkstoffklasse stellen die vor der Zulassung stehenden Glitazare dar, die als duale PPARalpha/gamma-Agonisten die lipidsenkenden Eigenschaften der Fibrate und die insulinsensitivierenden Eigenschaften der TZDs in einer Molekülklasse vereinen. Peroxisomen Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPARs) gehören zur Klasse der nukleären Rezeptoren, von denen drei Subtypen (PPARalpha, beta und gamma) bekannt sind. PPARalpha fungiert als molekulares Target für die Klasse der Fibrate, welche als Lipidsenker eingesetzt werden, wohingegen die Thiazolidindione (TZDs) bei Typ 2 Diabetes indiziert sind und ihre Wirkung als selektive PPARgamma-Aktivatoren (Insulinsensitizer) entfalten. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten wie Muraglitazar und Tesaglitazar stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, deren Zulassung beantragt ist und die zukünftig zur Behandlung von Typ 2 Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung am selektiven PPARalpha-Agonist Pirinixinsäure (WY 14643) mit Hilfe subtypspezifischer Reportergenassays durchgeführt. Dabei wurde wurde zunächst eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha-Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand im Allgemeinen in einer vierstufigen Reaktionsfolge. Die PPAR-Modulatoren 18-25, 30, 53-59, 62, 65, 69, 71, 73 und 74-77 wurden in vitro-pharmakologisch unter Anwendung Subtyp-selektiver Reportergen-Assays (mPPARalpha, hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich (Substanzen 18-25) der Leitstruktur WY 14643 (EC50 (hPPARalpha) = 39.8 mikroM, EC50 (hPPARgamma) = 53.7 mikroM) konnte im Falle der 4-Halogenaryl-substituierten Liganden 18 (Br) und 20 (Cl) eine signifikante Steigerung der hPPARalpha-Aktivität um den Faktor 4 (18) bzw. den Faktor 3 (20) erzielt werden. Die Inaktivität der Precursorverbindungen 74-77 demonstriert den für PPAR-Aktivität essentiellen terminalen hydrophoben Molekülrest, welcher dem 2,3-Dimethylphenyl-Rest von WY 14643 entspricht. Die alpha-alkylsubstituierten Derivate 53-57 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Die EC50-Werte (hPPARalpha) der Carbonsäuren 53-57 und 62 liegen zwischen 1.2 und 8.8 mikroM, wobei sich das alpha-Hexyl-Derivat 57 und das alpha-Butyl-Derivat 56 mit EC50-Werten von 1.2 mikroM (57) bzw. 1.3 mikroM (56) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um Faktor 33 (57) bzw. Faktor 30 (56) als besonders potent erwies. Am hPPARgamma präsentieren ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 56 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 57 mit EC50-Werten von 3 mikroM (56) bzw. 3.6 mikroM (57) und einer Steigerung der Bindungsaktivität gegenüber WY 14643 von ~Faktor 18 (56) bzw. ~Faktor 15 (57) die Verbindungen mit der höchsten PPARgamma-Aktivität. Im Rahmen dieser Dissertation gelang somit die Auffindung neuartiger Leitstrukturen 56 und 57. Die alpha-butyl- und alpha-hexylsubstituierten Liganden 56 und 57 besitzen dualen hPPARalpha/gamma-Charakter. Die PPARalpha/gamma-agonistischen Eigenschaften der neuentwickelten alpha-alkylsubstituierten Pirinixinsäurederivate werden durch ein von Pirard et al etabliertes Pharmakophor- und Selektivitätsmodell, welches die Ligandenbindungsdomäne (LBD) der PPARs durch fünf Bindungstaschen beschreibt, unterstützt. Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt offensichtlich zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY 14643 stärkeren Bindung an die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors.
Die Rho-Kinase gehört zur Familie der Serin/Threonin Kinasen und wird durch verschiedene vasoaktive Mediatoren, wie Katecholamine, UII, Thromboxan und Serotonin aktiviert. Sie spielt eine Schlüsselrolle in der Gefäßkontraktion des glatten Muskels. Die Rho-Kinase induzierte Kontraktion ist in allen Gefäßbetten der verschiedenen untersuchten Tierspezies (Ratte, Maus, Kaninchen, Schwein) induzierbar und durch selektive Rho-Kinase Inhibitoren konzentrationsabhängig hemmbar. Die Rho-Kinase Inhibitoren induzieren in vitro eine Gefäßrelaxation und führen in vivo zu einer Blutdrucksenkung. In akuten invasiven Blutdruckmessungen und chronischen telemetrischen Untersuchungen wurde für Rho-Kinase Inhibitoren eine Senkung des peripheren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen. Der vasorelaxierende Effekt von Rho-Kinase Inhibitoren in vitro und in vivo ist gleichermaßen in normotensiven und hypertensiven Tiermodellen messbar und hängt nicht von der Endothelfunktion ab. Es wurden keine Unterschiede in der Sensitivität gegenüber Rho-Kinase Inhibitoren zwischen hypertensiven Tieren und normotensiven Tieren gemessen. In der Proteinexpressionsanalyse zeigte sich eine tendenziell, aber nicht signifikante Erhöhung der Rho-Kinase II-Expression im arteriellen glatten Gefäßmuskel der hypertensiven Tiere. Im Tiermodell der pulmonalen arteriellen Hypertonie wurde durch chronische Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren die Progredienz der PAH verbessert. Rho-Kinase Inhibitoren normalisierten die Endothelfunktion und die Hyperkontraktilität der pulmonalen Gefäße. Zusätzlich konnten die Rechtsherzhypertrophie und rechtsventrikuläre Druck verbessert werden. In Untersuchungen am isoliert perfundierten Herzen nach Langendorff führte die Perfusion mit Rho-Kinase Inhibitoren zu einer verbesserten Durchblutung der Herzkranzgefäße. Die kardiale Kontraktilität und die Herzfrequenz wurden durch die akute Rho-Kinase Hemmung nicht beeinflusst. Zusätzlich zur Gefäßfunktion reguliert Rho-Kinase auch die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten. Vasoaktive Mediatoren können eine Rho-Kinase induzierte Aktivierung von Thrombozyten bewirken und so die Atherogenese begünstigen. Die Hemmung von Rho- Kinase bewirkt die Hemmung der Thrombozytenaggregation. Die Aktivierung von Rho- Kinase ist essentiell für zelluläre Transportvorgänge und die Zellmotilität. Dies wird durch Umstrukturierung des Zytoskeletts und mit Hilfe von Stressfaserformierungen realisiert. Rho- Kinase Hemmung verringert die Formierung von Stressfasern und kann somit Transporte von cholesterolsensitiven Transkriptionsfaktoren, z.B. SREBPs, zu ihren Bindungselementen reduzieren. Dadurch wird eine verstärkte Expression SRE-regulierter Gene, wie z.B. Cholesterolsyntheseenzymen, verhindert. Gleichzeitig führt eine Hemmung der Rho-Kinase Aktivität zu einer Senkung der Proliferationsrate von glatten Muskelzellen und Monozyten. Im LDLR defizienten Tiermodell der Atherosklerose wurde durch eine chronische Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren eine signifikante Verbesserung der Endothelfunktion erreicht. Die Behandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren zeigt allen untersuchten Modellen der Hypertonie blutdrucksenkende Effekte. In Modellen der Atherosklerose wurden durch Langzeitbehandlung mit Rho-Kinase Inhibitoren therapeutische Effekte auf die Endothelfunktion erzielt. Durch Reduktion der Risikofaktoren Bluthochdruck, Atherosklerose und endotheliale Dysfunktion senken Rho-Kinase Inhibitioren das kardiovaskuläre Risiko und bieten eine neue Therapiemöglichkeit zur Behandlung und Prophylaxe von Herz- Kreislauferkrankungen.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die möglichen positiven Effekte mediterraner Pflanzenextrakte auf oxidative Stress-Parameter im Gehirn zu untersuchen. Die Extrakte wurden im Rahmen eines EU-Projektes durch in vitro-Screenings aus einer Vielzahl, in Italien, Griechenland und Spanien gesammelten nicht-kulivierten Pflanzen, ausgesucht und hinsichtlich ihres Potentials verschiedene antioxidative Faktoren zu beeinflussen in einem in vivo-Mausmodell geprüft. Insgesamt sind 127 Pflanzen, die von der lokalen Bevölkerung mediterraner Länder traditionell verzehrt werden in 12 in vitro-Test untersucht worden. Darunter waren radikal- und Enzym-beeinflussende Tests und Versuchsansätze um antikanzerogene oder DNA-schädigende Eigenschaften zu überprüfen. Nach Auswahl von 12 potentiellen Extrakten für die Fütterungsexperimente, wurden auf Grund von weiteren Screenig-Tests wie z.B. das Potential der Extrakte eine Rigidisierung der Membranen oder Lipidperoxidation zu verhindern, die möglichen Kandidaten für die in vivo-Versuche weiter eingegrenzt. Zur Auswahl der drei Extrakte Reichardia picroides, Urospermum picroides und Thymus piperella kam es letztendlich durch die guten Ergebnisse in den Vorversuchen und durch den Ausschluss von ebenfalls positiven Extrakten, die toxische Eigenschaften im MTT-Test gezeigt hatten. Zur in vivo-Untersuchung der drei Extrakte wurden weibliche NMRI-Mäuse für drei Monate mit jeweils einem der Pflanzenextrakte gefüttert. Danach wurden sämtliche Parameter in jungen (6 Monate) und alten (21 Monate) NMRI-Mäusen untersucht, um altersbedingte Unterschiede hinsichtlich der Wirkung der Extrakte festzustellen. Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen an Hirnhomogenaten und dissoziierten Neuronen von NMRI-Mäusen, dass es mit zunehmendem Alter zur Aktivierung verschiedener antioxidativer Abwehrmechanismen kommt. Diese dienen dazu ROS-Level auf einem möglichst unschädlichen Niveau zu halten. Hier spielen vor allem die erhöhten Enzym-Aktivitäten eine wichtige Rolle, die die reaktiven Spezies zu einem relativ frühen Zeitpunkt abfangen und so z.B. eine vermehrte Schädigung der Lipidmoleküle verhindern. Bei den in Fütterungsexperimenten untersuchten Extrakten handelte es sich um die mit Ethanol extrahierten Inhaltsstoffe aus den Pflanzen (Reichardia picroides, Urospermum picroides und Thymus piperella). Die drei Extrakte wiesen variierende Polyphenolgehalte und eine unterschiedliche Zusammensetzung ihre Inhaltsstoffe, die Flavonoide betreffend auf. Alle drei Pflanzenextrakte zeigten unterschiedlich starke Effekte auf die gemessenen Parameter und machten deutlich wie wenig eine positive Wirkweise von pflanzlicher Ernährung verallgemeinert werden kann. Die besten Ergebnisse zeigte dabei der Reichardia-Extrakt.
Niacin ist neben seiner Bedeutung als Vitamin im menschlichen Organismus ein seit langem bekannter Wirkstoff bei der Therapie von Fettstoffwechselstörungen. Sein großer Vorteil gegenüber anderen Lipidsenkern liegt in der positiven Beeinflussung aller bedeutenden Lipid – Bestandteile im Blut. Es wird im menschlichen Organismus sehr rasch metabolisiert. Die beiden Hauptmetaboliten sind das Nikotinamid und die Nikotinursäure. Angesichts der pharmakologischen und therapeutischen Bedeutung von Niacin, spielt die Analytik dieser Verbindung sowie seiner Metaboliten eine wichtige Rolle, zumal Niacin aktuell in immer weiteren Präparaten (unter anderem in Form von Kombipräparaten) weiterentwickelt und eingesetzt wird. Es überraschte daher, dass bislang in der Literatur keine LC-MS Methode zur Bestimmung von Niacin beschrieben war, wo sich doch die LC-MS in den letzten Jahren zur vorherrschenden Analysentechnik für die Analyse von Biomolekülen und Wirkstoffen in biologischen Matrices entwickelt hat, da sie in der Regel geringe Anforderungen an die Probenaufarbeitung stellt und einen hohen Probendurchsatz erlaubt. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch erstmals gezeigt werden, dass LC-MS eine leistungsfähige Methode zur simultanen, quantitativen Bestimmung von Nikotinsäure, Nikotinamid und Nikotinursäure in Humanplasma darstellt. Die vorgestellte Methode beweist hohe Selektivität, Empfindlichkeit, Genauigkeit, Richtigkeit und Reproduzierbarkeit im Konzentrationsbereich von 50.0 – 750 ng/mL Plasma für alle drei Analyten bei relativ kurzer Analysenzeit. Verglichen mit früher entwickelten Methoden ist keine zeitaufwendige Probenaufarbeitung notwendig. Alle drei Analyten konnten in einem Schritt mit einer einzigen Festphasenextraktion ohne zeitaufwendige Derivatisierungschritte aus Plasma extrahiert werden. Die Validierung dieser Methode wurde gemäß aktuell geltender Standards durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte LC-MS Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Innerhalb einer klinischen Bioäquivalenz-Studie zu 1000 mg Niacin Tabletten, die erfolgreich bei AAI Development Services durchgeführt wurde, konnten gute und plausible Ergebnisse erzielt werden. Der validierte Konzentrationsbereich war ausreichend um alle drei Analyten zufriedenstellend zu detektieren. Damit zeigt sich, dass diese entwickelte LC-MS Methode eine leistungstarke Alternative zur simultanen Bestimmung von Niacin und seinen Hauptmetaboliten darstellt, welche erfolgreich in pharmakokinetischen oder toxikokinetischen Studien eingesetzt werden kann. Die in dieser Dissertation vorgestellte Analysenmethode wurde inzwischen in der Fachliteratur publiziert [83]. Eine Kopie dieser Publikation ist dieser Arbeit beigefügt.
Der Qualitätsstandard von Arzneimitteln in Deutschland und anderen Industrienationen ist zum heutigen Zeitpunkt hoch. Dies ist in erster Linie den strengen arzneimittelrechtlichen Anforderungen und Kontrollen zuzuschreiben, denen der Arzneimittelmarkt unterliegt. Es muss allerdings befürchtet werden, dass sich dies in Zukunft ändern könnte. Die Gefahr besteht zum einen in der Legalisierung des Versandhandels von Arzneimitteln und zum anderen in der EU-Osterweiterung. Es besteht die Gefahr, dass aus osteuropäischen Staaten vermehrt qualitativ minderwertige oder gefälschte Arzneimittel auftauchen. In Entwicklungsländern dagegen besteht heute schon ein großes Problem bezüglich der Arzneimittelqualität, die WHO vermutet, dass 25 % aller Arzneimittel in ärmeren Ländern qualitativ minderwertig oder gefälscht sind. Um so wichtiger erscheint die Möglichkeit, einfache, schnelle und zerstörungsfreie Prüfmethoden zur Qualitätskontrolle von Arzneimitteln zur Verfügung zu haben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einsatz der Nahinfrarot-Spektroskopie zur Qualitätskontrolle von Tabletten und Lösungen geprüft. Diese Technik bietet sich besonders an, da sie schnell und zerstörungsfrei ist und keinerlei Probenaufbereitung bedarf. Die NIRS hat sich in den letzten Jahren als geeignete Methode zur Quantifizierung von Wirkstoffen in Tabletten und anderen Arzneiformen erwiesen. Bisher allerdings nur zur Anwendung auf ganz spezielle Präparate, so dass mit den Methoden nur eine bestimmte Spezialität untersucht werden konnte. In dieser Arbeit wurde die NIRS erstmals auf Präparate verschiedener Hersteller mit unterschiedlicher Matrix eingesetzt. Damit konnte eine ganze Präparategruppe mit nur einer Methode untersucht werden. Im ersten Teil konnte gezeigt werden, dass Tablettenpräparate des Deutschen Marktes unterschiedlicher Hersteller, die sich Form, Farbe, Größe und Hilfsstoffmatrix unterschieden, zusammen bezüglich ihres Wirkstoffgehaltes kalibriert werden können. Damit erlauben die Methoden eine Aussage darüber zu treffen, ob der Wirkstoff in der deklarierten Menge enthalten ist. Dies war sogar ohne die simultane Durchführung einer entsprechenden Referenzanalytik zur Erstellung der Kalibrationsmodelle möglich. Alle erstellten Methoden mit ASS-, Atenolol- und Enalapril-Tabletten erlaubten es zu überprüfen, ob der Wirkstoff in einer Konzentration von ± 10 % der Deklaration enthalten ist. Dabei zeigte sich, dass der Kalibrationsdatensatz idealerweise alle möglichen später auftretenden Variationen berücksichtigen sollte, um bei der späteren Analyse falsche Ergebnisse zu vermeiden. Im zweiten Teil sollte überprüft werden, ob mit diesen NIR-Methoden Arzneimittelfälschungen und damit verbundene Qualitätsmängel wie Unterdosierungen, Placebos, falsche Wirkstoffe oder zusätzliche Wirkstoffe erkannt werden. Da uns keine „realen“ Proben zur Verfügung standen, wurden die Tabletten im Rahmen einer Kooperation mit der Pharmazeutischen Technologie der Universität Frankfurt produziert. Die Messungen erfolgten in Transmission, Reflexion und durch verschiedene Blistermaterialien. Im Rahmen der Kalibration und Validierung wurde deutlich, dass die unterschiedlich gewählte Hilfsstoffmatrix einen großen Einfluss ausübt. Die Validierung zeigte, dass die Gehaltsbestimmung in einem Rahmen von ± 15 % der wahren Wirkstoffmenge möglich ist. Dieser Rahmen scheint zunächst sehr groß, allerdings muss bedacht werden, dass im Rahmen der Kalibration eine große Variation in den Datensatz gebracht wurde und die zur Validierung verwendeten Präparate dem Modell völlig unbekannt waren. Die Untersuchung der simulierten Fälschungen ergab für die Transmissions- Reflexions- und Blistermessungen vergleichbare Ergebnisse. Placebos wurden eindeutig identifiziert, ebenso die Tabletten mit falschem Wirkstoff. Dass Unterdosierungen ab 15 % erkannt werden, wurde im Rahmen der Validierung gezeigt. Zusätzliche Wirkstoffe wurden sowohl bei den Reflexions- als auch bei den Transmissionsmessungen erst ab einer Konzentration von 10 % sicher erkannt. Die Methoden mit Messungen durch den Blister lieferten dagegen ab 2 % zusätzlicher Substanz Hinweise auf einen qualitativen Mangel. Im dritten Teil wurde am praxisrelevanten Beispiel der Tilidin-Lösungen eine NIR-Methode erstellt, die zukünftig eine schnelle und sicher anwendbare Möglichkeit zur Überprüfung dieses Arzneimittels auf Manipulation darstellt. Im Vergleich zu einer bisher angewandten zeitintensiven DC, kann die nur wenige Minuten in Anspruch nehmende NIR-Analyse erheblich Zeit einsparen...
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) verhindert mit ihren engen Zell-Zellverbindungen, selektiven Transportern und einem effizienten Abwehrsystem das Eindringen vieler Stoffe in das Gehirn. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Nanopartikel aus humanem Serumalbumin (HSA-NP) zum Arzneistofftransport in das Gehirn entwickelt. Als Ligand zur Überwindung der BHS wurde Apolipoprotein E (ApoE), ein Ligand des LDL-Rezeptors (LDL-R), der sich auf der Membranoberfläche von Hirnendothelzellen befindet, eingesetzt. Kurze ApoE wurde über Avidin/Biotin-Komplexe oder kovalent an die NP-Oberfläche gebunden. Bei der Avidin/Biotin-Methode wurde über einen heterobifunktionalen Crosslinker (Polyethylenglykol (PEG)-Spacer) die Avidinkomponente an die NP Oberfläche gebunden. Nach erfolgter Bindung der Avidinkomponente wurde die Funktionsfähigkeit des gebundenen NeutrAvidin® untersucht. Dabei wurde in der Suspension der NeutrAvidin®-modifizierten NP das Verhältnis von Biotinbindungsstellen zu Avidinkomponente bestimmt. Das ermittelte Verhältnis in der NeutrAvidin®-modifizierten NP?Suspension lag bei 2,6 : 1. Um ApoE an NeutrAvidin®-modifizierte NP zu binden, wurde das ApoE biotinyliert und anschließend an die NeutrAvidin®-NP gekoppelt. Dabei wurden ca. 3800 ApoE-Molekülen pro NP gebunden. Bei der kovalenten Bindung wurden verschiedene Apolipoproteine mittels PEG-Spacer direkt an HSA-NP gebunden. Hierbei wurden 19 µg ApoE/mg NP gebunden. In Untersuchungen am konfokalen Mikroskop (CLSM) zeigte sich eine moderate Anlagerung von ApoE-PEG-NP an LDL-R-exprimierende Hep G2- und ß.End3-Zellen, die auf eine Aufnahme der ApoE-PEG-NP über den LDL-R hindeuten könnte. Loperamid wurde als Modellwirkstoff in Tierversuchen verwendet. Loperamid bindet im Gehirn Opioidrezeptoren und wirkt analgetisch, überwindet jedoch nicht selbstständig die BHS. Der analgetische Effekt von Loperamid-beladenen ApoE-modifizierten NP (7 mg/kg bzw. 4 mg/kg Loperamid) wurde in Mäusen nach i.v.-Applikation mittels Tail-Flick-Test ermittelt. Loperamid-beladene ApoE-NP verursachten konzentrationsabhängig einen analgetischen Effekt bei den untersuchten Mäusen. Die Kontrollzubereitungen (Loperamid-beladene nicht-ApoE-modifizierte NP, Loperamid-Lösung, unbeladene ApoE-NP) zeigten keine analgetische Wirkung. Mit ApoE modifizierte NP die keine Bindung an den LDL-R zeigen, vermittelten keinen analgetischen Effekt im Tierversuch.
Der COX-2-selektive Inhibitor Celecoxib ist zurzeit das einzigste NSAID, das von der FDA für die adjuvante Therapie von Patienten mit der FAP-Erkrankung zugelassen wurde. Die antineoplastischen Mechanismen dieses Wirkstoffes werden nur teilweise verstanden, jedoch spielen COX-2-abhängige, aber auch COX-2-unabhängige Mechanismen eine wichtige Rolle. Um zu untersuchen, in welchem Ausmaß die antikarzinogenen Effekte von Celecoxib von der COX-2-Expression der Tumor-Zelle abhängig sind, wurden humane Caco-2-Kolonkarzinom-Zellen mit pcDNA-Vektoren transfiziert, in denen die humane COX-2-cDNA sowohl in sense- (hCOX-2-sense), als auch in antisense- (hCOX-2-as) Orientierung einkloniert wurde. Die pcDNA-Kontrollzellen wurde nur mit dem leeren pcDNA-Vektor transfiziert. Caco-hCOX-2-s-Zellen zeigten eine starke Überexpression der COX-2, pcDNA-Kontrollzellen nur eine schwache Expression von COX-2 und hCOX-2-as-Zellen waren COX-2-defizient. Die Behandlung dieser Zellen mit steigenden Konzentrationen an Celecoxib (0-100 µM) führte in Proliferationstests zu einer starken Verminderung der Überlebensrate, die durch die Induktion einer G0/G1-Zellzyklusblockade und durch die Auslösung von Apoptose mit Aktivierung von Caspase-3 und -9 sowie Freisetzung von Cytochrom C charakterisiert ist. Sowohl die Verminderung der Überlebensrate, als auch die Induktion von Apoptose waren in COX-2-defizienten hCOX-2-as-Zellen schwächer ausgeprägt als in COX-2-exprimierenden pcDNA- und hCOX-2-s-Zellen. Im Gegensatz hierzu erfolgte die Induktion der G0/G1-Zellzyklusblockade durch Celecoxib unabhängig vom COX-2-Expressionsstatus der Zellen und war durch einen starken Abfall der Expression von Cyclin A und Cyclin B1 sowie eine Induktion der Zellzyklusinhibitoren p21 und p27 gekennzeichnet. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die antikarzinogenen Effekte von Celecoxib sowohl über COX-2-abhängige, als auch COX-2-unabhängige Mechanismen erklärt werden können. Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass Mutationen im APC- oder Beta-Catenin-Gen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von kolorektalen Polypen und Karzinomen spielen. Weiterhin ist der Beta-Catenin/APC-Signaltransduktionsweg ein wichtiger Regulator von Apoptose und Zellzyklusprogression. Daher wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit untersucht, ob Celecoxib einen Einfluss auf den Beta-Catenin/APC-Signaltransduktionsweg in humanen Kolonkarzinom-Zellen besitzt. So wurde nach Behandlung von humanen Caco-2-Zellen mit 100 µM Celecoxib eine schnelle Translokation von Beta-Catenin von seiner überwiegend Membran-assoziierten Lokalisation in das Zytoplasma beobachtet, die durch die Aktivität der GSK-3ß vermittelt wird und somit durch Phosphorylierung von Beta-Catenin stattfinden könnte. Tatsächlich führte die Behandlung von Caco-2-Zellen mit 100 µM Celecoxib bereits nach 2 Stunden Behandlungsdauer zu einer Reduktion des Ser-9-Phosphorylierungsstatus der GSK-3ß und somit zu deren Aktivierung. Die zytosolische Akkumulation von Beta-Catenin war ferner von einem schnellen Anstieg der Beta-Catenin-Spiegel im Zellkern begleitet, der bereits nach 30 Minuten Inkubationsdauer zu beobachten war. Überraschenderweise kam es parallel hierzu zu einem zeitabhängigen Abfall der DNA-Bindungsaktivität von Beta-Catenin. Nach dieser zellulären Reorganisation konnte nach 8 Stunden Behandlungsdauer mit 100 µM Celecoxib ein starker, Proteasom- und Caspase-abhängiger Abbau von Beta-Catenin beobachtet werden. Ein im Vergleich zu Caco-2-Zellen verminderter Beta-Catenin Abbau wurde sowohl in humanen MCF-7-Mammakarzinom-Zellen, die keine funktionale Caspase-3 exprimieren, als auch in humanen HCT-116-Zellen, in denen ein GSK-3ß-abhängiger Abbau von Beta-Catenin aufgrund einer Mutation im Beta-Catenin-Protein nicht stattfindet, beobachtet. Interessanterweise fand ein Abbau von Beta-Catenin weder nach Behandlung der Caco-2-Zellen mit dem stark antikarzinogen wirksamen NSAID R-Fluriprofen, noch mit dem COX-2-selektiven Inhibitor Rofecoxib statt. Die Ergebnisse aus diesem Teil der Arbeit deuten darauf hin, dass der Abbau von Beta-Catenin bei der Auslösung der COX-2-unabhängigen antikarzinogenen Effekte von Celecoxib eine wichtige Rolle spielt. In den letzten Jahren kamen weitere strukturverwandte NSAIDs vom Coxib-Typ auf den Markt, die eine höhere COX-2-Selektivität als Celecoxib besitzen. Die Experimente des dritten Teils dieser Arbeit sollten die Frage klären, ob die antikarzinogene Wirksamkeit einen Klasseneffekt aller Coxibe darstellt, oder nur spezifisch nach Behandlung von Tumor-Zellen mit Celecoxib zu beobachten ist. Mittels Proliferationstests konnte gezeigt werden, dass Celecoxib und Methylcelecoxib (Strukturanalogon von Celecoxib mit schwacher COX-2-inhibitorischer Aktivität) starke wachstumshemmende Effekte (Zellzyklusblockade und Apoptose) in COX-2-überexprimierenden HCA-7-, als auch in COX-2-defizienten HCT-116-Kolon-karzinomzellen verursachen. Unter Behandlung dieser Zellen mit den selektiven COX-2-Inhibitoren Rofecoxib, Etoricoxib, Lumiracoxib und Valdecoxib wurden nur schwache antiproliferative Effekte beobachtet. Die Analyse der Zellzahl in der SubG1-Phase mittels Durchflusszytometrie sowie der Spaltung von PARP mittels Western Blot-Analyse konnte demonstrieren, dass sowohl HCT-116-, als auch HCA-7-Zellen deutlich sensitiver auf die Apoptose-induzierende Wirkung von Methylcelecoxib reagierten als auf Celecoxib. Zudem zeigten COX-2-überexprimierende HCA-7-Zellen nach Behandlung mit Celecoxib und Methylcelecoxib eine höhere Apoptoserate als HCT-116-Zellen, bei denen jedoch die Induktion einer G1-Zellzyklusblockade mit Induktion von p27 und Abbau von Cyclin D1 ausgeprägter als in HCA-7-Zellen war. Eine LC/MS/MS-Analyse der Coxibkonzentrationen in Medium ergab, dass aufgrund der starken Proteinbindungen die freien Coxibkonzentrationen teils deutlich niedriger sind als die totalen eingesetzten Coxibkonzentrationen in Medium mit 10% FCS. Ferner konnte mittels LC/MS/MS demonstriert werden, dass es nach Behandlung von HCT-116- und HCA-7-Zellen mit Celecoxib und Methylcelecoxib zu einer intrazellulären Aufkonzentrierung der Wirkstoffe relativ zur freien Coxibkonzentration im Medium kommt, die nach Behandlung der Zellen mit Rofecoxib, Etoricoxib, Lumiracoxib und Valdecoxib jedoch nicht beobachtet wurde. Die Aufkonzentrierung von Celecoxib in den Kolonkarzinom-Zellen könnte bei der Auslösung der antikarzinogenen Effekte möglicherweise eine Rolle spielen. Die Ergebnisse aus diesem Teil der Arbeit konnten belegen, dass die antiproliferativen Effekte spezifisch und weitgehend COX-2-unabhängig nach Behandlung der Tumor-Zellen mit Celecoxib auftreten und daher keinen Klasseneffekt aller COX-2-selektiven NSAIDs darstellen.
Die linksventrikuläre Hypertrophie ist einer der stärksten Prädiktoren für die spätere Abnahme der Blutauswurfleistung des Herzens mit einer Gefährdung der Organdurchblutung und drohendem Kreislaufversagen, einem klinischem Syndrom, welches als Herzinsuffizienz bezeichnet wird. Die Herzhypertrophie ist eine Folge vieler verschiedener Herzerkrankungen wie koronarer Herzkrankheit, dilatativer Kardiomyopathie oder Hypertonie. Ein besseres Verständnis dieser Entwicklung auf molekularer Ebene könnte dazu beitragen, mit neu zu entwickelnden Medikamenten gezielt in diese Prozesse eingreifen zu können, sie abzuschwächen, zu verhindern oder gar rückgängig zu machen. Das Ziel dieser Arbeit war, die molekularen Ursachen der Herzhypertrophieentwicklung durch eine globale Genexpressionsanalyse zweier Hypertrophiemodelle näher zu untersuchen und dabei neue Hypertrophiemarker zu identifizieren. Dazu wurde sowohl aus Herzproben PKBgamma1-überexprimierender transgener Mäuse, welche eine massive Herzhypertrophie entwickeln, als auch aus alpha1-adrenerg stimulierten neonatalen Rattenkardiomyozyten RNA isoliert und mit dieser cDNA-Micro-arrays hybridisiert. Die Auswertung der differentiell exprimierten Gene in beiden Modellen ergab keine eindeutigen Hinweise auf universelle Faktoren, die für die Hypertrophieentwicklung verantwortlich gemacht werden könnten. Bei näheren Untersuchungen zeigte sich jedoch, dass die Mehrzahl der regulierten Gene einen Versuch der Kardiomyozyten repräsentiert, die Hypertrophieentwicklung zu kompensieren. Im Modell der PKBgamma1-überexprimierenden Mäuse konnte durch eine „in silico“-Promotoranalyse ein möglicher Einfluss von Transkriptionsfaktoren der Forkhead-Klasse auf die differentielle Expression vieler regulierter Gene gefunden werden. Unter Zuhilfenahme eines Forkhead-Reporter-Systems konnte in verschiedenen Zellkulturmodellen ein funktioneller Zusammenhang zwischen dem konstitutiv-aktiven Transgen und eben diesen Transkriptionsfaktoren gezeigt werden. Darüber hinaus gelang es, anhand zweier Reportersysteme für die wichtigen Hypertrophiemarker ANF und BNP zu zeigen, dass sich diese beiden Gene durch die Koexpression eines Forkhead-Transkriptions-faktors induzieren lassen. Im Modell der alpha1-adrenerg stimulierten neonatalen Rattenkardiomyozyten gelang es, durch eine „in silico“-Promotoranalyse cAMP-abhängige Transkriptionsfaktoren sowie Faktoren der EGR-Klasse als mögliche Auslöser der beobachteten Genregulation zu identifizieren. Dieses Ergebnis passte sehr gut zu den beobachteten transkriptionellen Veränderungen, da sowohl die Transkriptionsfaktoren selbst, als auch viele in den cAMP-Stoffwechsel involvierte Transkripte sehr stark induziert waren. In beiden untersuchten Modellen stimmten nur wenige differentiell exprimierte Transkripte überein und diese bestanden vorwiegend aus den klassischen Hypertrophiemarkern. Als möglicher neuer Hypertrophiemarker wurde das „Cardiac Adriamycin Responsive Protein“ (CARP) identifiziert, welches in beiden Modellen deutlich induziert war. In Kombination mit der Beobachtung, dass viele der jeweils regulierten Gene mit einer antihypertrophen Wirkung in Verbindung gebracht werden, legt den Schluss nahe, dass die transkriptionellen Veränderungen den Versuch der Zellen widerspiegeln, der Hypertrophie entgegenzuwirken, und dass die hypertrophieauslösende Wirkung durch andere, nicht-transkriptionelle Steuerungsmechanismen der Zelle vermittelt wird. Frühere Arbeiten, welche die transkriptionellen Veränderungen in anderen Hypertrophiemodellen untersuchten, sowie neuere Hinweise aus der Literatur und weitere in der Abteilung durchgeführte Untersuchungen lassen darauf schließen, dass die Hypertrophieentwicklung eher auf translationaler Ebene reguliert wird. Unterstützt wird dies durch die Tatsache, dass PKBgamma1-überexprimierende Mäuse die größte jemals beobachtete Herzhypertrophie entwickeln und der PKB/GSK-3beta-Signalweg bekanntermaßen translationelle Vorgänge in der Zelle steuert. Weitere Arbeiten in dieser Richtung könnten somit neue, vielversprechende Therapieansätze eröffnen.