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Ausgangspunkt dieser Dissertation ist die Frage: „Was ist fundamentaler als die Raum-Zeit?“ Nach Immanuel Kant sind aber Raum & Zeit als reine Formen der sinnlichen Anschauung „a priori“ aller Erfahrung und allen Denkens und konstituieren somit die „Bedingungen, unter denen Erfahrung erst möglich ist“. Im Jahre 1941 hat Konrad Lorenz diese Apriori biologisch interpretiert und damit das Konzept einer Evolutionären Erkenntnislehre formuliert. Deren Hauptthese lautet: „Unser Erkenntnis-Apparat ist ein Ergebnis der Evolution. Die Subjektiven Erkenntnisstrukturen passen auf die Welt, weil sie sich im Laufe der Evolution in Anpassung an eben diese reale Welt herausgebildet haben. Sie stimmen mit den realen Strukturen (teilweise) überein, weil nur eine solche Übereinstimmung das Überleben ermöglichte.“ Wendet man dies auf die Erfahrung von Raum & Zeit an, so gelangt man zur Kognitionswissenschaft von Raum & Zeit. Das Ergebnis der Analyse der Kognition von Raum & Zeit lässt sich wie folgt zusammenfassen. Im Kognitiven System des Menschen gibt es mehrere Informationsrepräsentationssysteme. Ein Sprachlichlogisches Repräsentationssystem, ein Nonverbales Repräsentationssystem zur Speicherung von Multimodalen Spatiotemporalen Informationen und ein Internes Repräsentationssystem zur Speicherung von Subjektiven Informationen über interne Körperzustände. Das Multimodal-Spatiotemporale Repräsentationssystem lässt sich dann weiter in Modalitätsspezifische Repräsentationssysteme für die einzelnen Sinnesmodalitäten und ein Amodales Repräsentationssystem für Spatiotemporale Information untergliedern. Letzteres ist weiter in Amodale Repräsentationssysteme für Reinräumliche Informationen, Spatiotemporale Informationen & Reinzeitliche Informationen untergliedert. Mit dem Reintemporalen Repräsentationssystem hat dieses Amodale Repräsentationssystem auch Anteil am Internen Körperrepräsentationssystem. Für die Kognition der Zahlen kommt nur noch ein Zahlenrepräsentationssystem für die Zahlen 1-3 als eigenständiges Repräsentationssystem hinzu. Alle anderen Zahlenrepräsentationen benutzen das Räumliche oder das Sprachlichlogische Repräsentationssystem. Alle diese Repräsentationssysteme sind das Ergebnis von Phylogenetischen, Ontogenetische & Psychogenetischen Entwicklungsprozessen. Aus diesen Erkenntnissen wird anschließend untersucht, naturphilosophische Konsequenzen für die Raum-Zeit-Physik ergeben. Insbesondere geht es um die Frage von Gerhard Vollmer, die lautet: „Nach der Evolutionären Erkenntnistheorie sind die subjektiven Strukturen des Erkenntnis-Apparates für die Erkenntnis konstitutiv. Gilt dies für alle Stufen des Erkenntnis-Prozesses?“ Das Ergebnis dieser Analyse ist, dass das Visuospatiotemporale Informationsrepräsentationssystem die Kognitive Basis der Physikalischen Theorien mit Klassischem Materiekonzept bildet, mit dessen Hilfe das Visuell-Nonverbale Sensomotorische System diese Theorien mit Hilfe von Kognitionsprozessen aus Interaktionen mit der Physikalischen Außenwelt konstruiert hat. Darüber hinaus beruhen diese Theorien auch auf dem Sprachlichlogischen Informationsrepräsentations-System als Kognitiver Basis und sind das Produkt von Kognitiven Math. Basisfähigkeiten, mit deren Hilfe sie ebenfalls aus Interaktionen mit der Physikalischen Außenwelt abgeleitet wurden. Dabei dominiert das Visuospatiotemporale Informationsrepräsentationssystem in der Kognitiven Basis gegenüber dem Sprachlichlogischen Informationsrepräsentationssystem eindeutig! Auch die Quantenmechanik hat diese beiden Informationsrepräsentationssysteme als Kognitive Basis. Allerdings dominiert hier das Sprachlichlogische Informationsrepräsentationssystem gegenüber dem Visuospatiotemporalen Informationsrepräsentationssystem! Da das Sprachlichlogische Informationsrepräsentationssystem aber ein Symbolisches Informationsrepräsentationssystem ist, bedarf es zu seiner Funktionsfähigkeit der Abbildung seiner Symbole auf Informationsstrukturen des Multimodalen Spatiotemporalen Informationsrepräsentationssystems, damit die mit seiner Hilfe repräsentierten Sprachlichlogischen Informationen überhaupt Teil des Informationellen Modells der Außenwelt des Kognitiven Systems sein können. Damit lässt sich die oben gestellte Frage wie folgt beantworten: Ja, diese Kognitiven Strukturen sind nicht nur für die Ebenen der Wahrnehmungs- & Erfahrungserkenntnis konstitutiv, sondern für alle Stufen des Erkenntnisprozesses. Das heißt: „Auch die Wissenschaftliche Erkenntnis ist biologisch/genetisch determiniert!“
"Ciaglia Blue Rhino Punktionstracheotomie" : perioperative Komplikationen und Langzeitergebnisse
(2009)
Im klinischen Alltag der Intensivstationen haben sich in den letzten Jahren verschiedene Verfahren der perkutanen Tracheotomie aufgrund ihrer einfachen Durchführbarkeit und dem geringen Komplikationsrisiko gegenüber dem chirurgischen Verfahren durchgesetzt. Die Blue Rhino Technik nach Ciaglia ist eine Methode, bei der zur Anlage des Tracheostomas nur ein einzelner Dilatationsschritt mittels eines, mit einer speziellen hydrophilen Beschichtung versehenen, gebogenen Dilatators notwendig ist. Die vorliegende Arbeit zeigt die Auswertung der Daten von 50 Patienten, die nach dieser Methode tracheotomiert wurden. Die Evaluation beinhaltet neben der Auswertung der peri- und postoperativen Komplikationen, die Ergebnisse einer telefonischen Befragung von 19 Patienten anhand eines standardisierten Fragebogens, hinsichtlich ihrer subjektiven Einschätzung bezüglich Veränderungen der Stimme, Luftnot, Schluckbeschwerden sowie dem kosmetischen Ergebnis des verschlossenen Tracheostomas. Die Ergebnisse wurden mit den in der Literatur vorhandenen Daten der verschiedenen perkutanen Verfahren verglichen, um potentielle Vorund Nachteile der Blue Rhino Technik zu eruieren. Es konnte gezeigt, dass bei der Blue Rhino Methode im Vergleich zu anderen Verfahren keine signifikant höhere perioperative Komplikationsrate auftrat. Die in verschiedenen Arbeitenbeschriebene Häufung an Trachealspangenfrakuren konnten auch wir in unserem Patientengut finden. Einen Beweis für die klinische Relevanz dieser Beobachtung wurde aber bisher in keiner Studie erbracht. Im Gegensatz dazu kann es als gesichert angesehen werden, dass ein höherer BMI ein Risikofaktor ist, der mit einer Erhöhung der perioperativen Komplikationsrate einhergeht. Auch in unserer Untersuchung traten die beiden einzigen schwerwiegenden Komplikationen bei Patienten mit einem BMI deutlich über 30 kg/m2 auf. Postoperative Komplikationen wie Blutungen oder Infektionen des Stomas konnten wir in unserem Patientenkollektiv nicht beobachten. Nach allgemeiner Studienlage treten diese Komplikationen bei den perkutanen Verfahren auch nur in Einzelfällen auf. Die bei der Befragung ein Jahr nach der Tracheotomie gefundenen Veränderungen der Stimme, Heiserkeit und das Vorliegen von Luftnot in verschiedenen Ausprägungen lassen sich bei den meisten Patienten auf ihre Vorerkrankungen zurückführen oder sind Ausdruck einer Schädigung der Stimmbänder durch die vorangegangene orotracheale Intubation. Nur bei 2 Patienten konnten wir eine Trachealstenose nicht sicher ausschließen. Einen schlüssigen Nachweis, dass eine Stenose bei Patienten nach Tracheotomie ursächlich auf die Tracheotomie alleine zurückzuführen ist, konnten wir bei Durchsicht der Literatur nicht finden. Das kosmetische Ergebnis beurteilten die meisten unserer Patienten (79%) als sehr gut bis gut. Unter Beachtung der absoluten Kontraindikationen, die für alle perkutanen Verfahren gültig sind, erfüllt die Blue Rhino Methode nach Ciaglia hinsichtlich der leichten Durchführbarkeit und der niedrigen peri- und postoperativen Komplikationsraten alle Anforderungen, die an ein perkutanes Verfahren gestellt werden.
Mit ihren so genannten Linsenkästen gelang Mary Bauermeister Anfang der 1960er-Jahre der Durchbruch auf dem New Yorker Kunstmarkt. Bis heute sind die fragilen, leuchtenden Objekte aus Holz, Glas, Leinwand und Papier das Alleinstellungsmerkmal der Künstlerin. Die hier vorliegende Dissertationsschrift erläutert die konsequente Entwicklung der Linsenkästen aus dem Frühwerk und unternimmt erstmals eine stilistische Einordnung in den Kunstkontext der 1960er-Jahre. Dabei wird deutlich, dass Bauermeister mehr den Künstlern der Klassischen Moderne (Duchamp, Schwitters, Klee, Kandinsky) verpflichtet ist denn ihren Zeitgenossen im Rheinland oder in der Kunstmetropole New York.
Kraftfelder sind ein vielseitiges Werkzeug zur schnellen Berechnung vielfältiger Moleküleigenschaften. Die Qualität der damit erhaltenen Vorhersagen ist auch ein Maß, wie gut die wichtigen Einflussgrößen verstanden und vor allem in das Kraftfeld-Modell integriert sind. Bei der Parametrisierung müssen viele Effekte gegeneinander ausbalanciert werden, da die Kraftfeldterme nicht unabhängig voneinander betrachtet werden können. Umfangreiche Testrechnungen sind erforderlich, um die notwendige Qualität der Parameter sicher zu stellen. Eine Automatisierung dieses Prozesses bringt nicht nur eine enorme Zeitersparnis, sie zwingt auch zur sorgfältigen Definition von Vorgaben und Qualitätskriterien. Die Formulierung einer Strategie in einem Programm anstelle von „intelligentem Raten“ fördert zudem ein tieferes Verständnis. Bei einer Änderung der Strategie muss nur das entsprechende Programm geändert werden, dem Entwickler bleibt der manuelle Test erspart. Automatische Methoden zur Plausibilitätsprüfung vermeiden Probleme durch Fehler bei der Dateneingabe von Hand. Die programmgesteuerte Erstellung aussagekräftiger Protokolle und Grafiken macht die Fülle der bei der Parametrisierung und Evaluierung eines Kraftfeldes anfallenden Informationen für den Benutzer überschaubar. Probleme und deren Zusammenhang können so leichter erfasst werden. Für das MOMO-Kraftfeld konnten auf diese Weise verbesserte und neue Parameter für Wasserstoffbrücken abgeleitet werden, zwei empirische Punktladungsmodelle und deren Verträglichkeit mit zwei quantenchemischen Modellen verbessert und prinzipielle Probleme bei deren Vereinbarkeit erkannt werden sowie die automatische Parametrisierung von Bindungslängen, Bindungswinkeln und Torsionswinkeln ermöglicht werden. Bei Letzterem konnte jedoch keine Verbesserung gegenüber den Originalparametern erreicht werden, was nicht weiter verwunderlich ist, da diese seit Jahrzehnten entwickelt worden sind, wohingegen Wasserstoffbrücken und Partialladungen erst später hinzugekommen sind und nicht so umfangreich wie die bindenden Kraftfeldterme getestet wurden. Voraussetzung für die hier gewählte Vorgehensweise, alle Arbeiten weitgehend zu automatisieren und Strategien immer in Programme umzusetzen, waren sehr umfangreiche Programmierarbeiten. Ziel war es, auf einfache Weise die Steuerung des Kraftfeldes aus kleineren Programmen, die spezielle Probleme bearbeiten, zuzulassen. Durch die Nutzung zahlreicher Open-Source-Projekte, die gemeinsam die gewünschte Funktionalität zur Verfügung stellen, konnte der Aufwand auf die dazu passende Implementierung des MOMO-Kraftfeldes und das Verbinden mit der von diesen Projekten bereitgestellten Software beschränkt werden. Der Kern des MOMO-Kraftfeldes wurde aus Geschwindigkeitsgründen in der Compilersprache C geschrieben, Datenein- und -ausgabe und die Programme zur Parametrisierung und Auswertung wurden in Python geschrieben.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, narrative Identitätsformationen jüdischer Jugendliche in Deutschland zu rekonstruieren. Aufgrund der Analyse des empirischen Materials und anhand des erwähnten Forschungsinteresses wurden in der Arbeit drei unterschiedliche – dennoch zueinander in Beziehung stehende – zentrale Typologien der narrativen Identität jüdischer Jugendlicher erarbeitet.46 Während sich die erste Typologie allein auf die Migrationserfahrung beschränkt, werden in der zweiten und dritten Typologie beide – zugewanderte und ‚alteingesessene‘ – Befragtengruppen in den Blick genommen: (i) Typologie der Akkulturationsnarrative, die der Frage nach der Auseinandersetzung der zugewanderten Jugendlichen mit kulturellen Vorstellungen und Vorbildern im Verlauf des Migrationsprozesses nachgeht. (ii) Typologie der Identitätsentwicklung im Spannungsfeld des Mehrheits-Minderheits-Verhältnisses, welche die Bedeutung der Fähigkeit zur Rollendistanzierung und Ambiguitätstoleranz in der Interaktion mit der Mehrheitsgesellschaft untersucht. (iii) Typologie der jüdischen, religiösen und ethnischen Sozialisation, die danach fragt, woran die Jugendlichen ihre Zugehörigkeit zum jüdischen Kollektiv festmachen und welche Identitätsentwürfe sich dabei feststellen lassen. ....
1. Der Abgleich der Genprodukte von PA0119, PA0120 und PA0121 ergab, dass PA0119 68%ige Ähnlichkeit mit dem DctA-Transporter von S. meliloti besitzt. Das Genprodukt PA0120 zeigt eine 46%ige Ähnlichkeit mit dem Transkriptionsregulator LctR von E. coli und trägt konservierte Domänen der GntR- sowie der FCDSuperfamilie. Das Genprodukt PA0121 weist eine 44%ige Ähnlichkeit mit einem hypothetischen Transkriptionsregulator von Streptomyces ambofaciens auf. 2. Es konnte gezeigt werden, dass die drei offenen Leserahmen (ORFs) PA0119, PA0120 und PA0121 von P. aeruginosa in mRNA transkribiert werden und somit Gene sind. In den späten CF-Isolaten M25 und M26 ist deren Transkriptmenge im Vergleich zum frühen CF-Isolat M1 sowie zum Referenzstamm P. aeruginosa PAO1 um das 14fache erhöht. 3. Mit Hilfe von RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene PA0119, PA0120 und PA0121 eine Transkriptionseinheit bilden und somit in einem Operon P0119-PA0121 organisiert sind. Die angrenzenden ORFs PA0118 und PA0122 konnten dieser Transkriptionseinheit nicht zugeordnet werden. 4. Analysen der Promotor-Reportergenfusion führten zu dem Schluss, dass die Strukturgene PA0119, PA0120 und PA0121 des Operons von einer stromaufwärts von PA0119 lokalisierten Promotorsequenz transkribiert werden. Der Promotor liegt ca. 237 bp vor dem Start von PA0119. Darüber hinaus konnte eine FadR-ähnliche Bindestelle in der Promotorregion P119-121 abgeleitet werden. 5. Der Promotor P119-121 zeigt in mit Dicarboxylaten supplementiertem Minimalmedium M9 eine 2-3fach erhöhte Promotoraktivität gegenüber dem mit Glukose supplementierten Minimalmedium M9. In Gegenwart von Dicarboxylaten erfährt der Promotor P119-121 somit eine Induktion bzw. durch Glukose eine Repression. 6. Der Promotor P119-121 wird wachstumsphasenabhängig reguliert. Die Abhängigkeit der Promotoraktivität von RhlI, RhlR und RpoS indiziert eine Quorum Sensingsowie RpoS-abhängige Regulation des Promotors P119-121. 7. Eine mit PA0119 durchgeführte heterologe Komplementation einer DctA-Mutante von S. meliloti führte zu einer partiellen Wiederherstellung der Fähigkeit der DctAMutante, auf den Dicarboxylaten Succinat und Fumarat wachsen zu können. Dieser Befund indiziert zusammen mit den vier konservierten Motiven, die bisher in charakterisierten Dicarboxylat-Transportern gefunden wurden, dass PA0119 potentiell einen Dicarbonsäure-Transporter in P. aeruginosa darstellt. 8. Mutantenstudien mit den generierten Mutanten ΔPA0119Ω, PA0120Ω und ΔPA0121Ω zeigten im Vergleich zum Wildtyp allerdings kein abweichendes Kulturwachstum; weder in den nährstoffreichen Medien ASM und LB noch im Minimalmedium M9, das jeweils mit 40 mM Succinat bzw. Glutamat supplemiert wurde. Dies wurde durch MicroArrayTM-Analysen mit den Biolog-Platten PM1 und PM2 bestätigt. Daraus wird deutlich, dass keine der hier angebotenen C-Quellen (siehe Anhang) ausschließlich von PA0119 transportiert wird. Auch die Verwertung dieser C-Quellen wird nicht durch die in den Mutanten PA0120::Ω und ΔPA0121::Ω ausgeschalteten Genprodukte beeinflusst. 9. In der Biolog-Platte PM10a schien ΔPA0119::Ω gegenüber PAO1 in den Kavitäten C1 (pH5.5, Methionin) und C10 (pH 5.5, Ornithin) eine leicht abweichende Stoffwechselaktivität zu besitzen. Dies indiziert eine mögliche pH-Abhängigkeit des potentiellen PA0119-Transporters. 10. Im Minimalmedium M9, supplemiert mit Glutamat, zeigt die Mutante ΔPA0119::Ω unter unter erhöhten osmotischen Bedingungen gegenüber dem Wildtyp PAO1 eine reduzierte Wachstumsrate. Dies indiziert, dass PA0119 unter erhöhten osmotischen Bedingungen am Transport von Dicarboxylaten, wie Glutamat, in die Zelle beteiligt sein könnte. 11. Biofilmbildung stellt die bevorzugte Wachstumsform von P. aeruginosa in der CF-Lunge dar. Das Genprodukt PA0120 zeigt zudem eine Ähnlichkeit mit dem Regulator LctR, und es wurde gezeigt, dass eine LctR-Mutante von E. coli in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt ist. Die Untersuchung der ΔPA0119::Ω- und der PA0120::Ω-Mutanten zeigt im Vergleich zum Wildtyp im LB-Medium eine Beeinträchtigung in der Anheftung an Mikrotiterplatten. Dies indiziert, dass sowohl der potentielle Transporter PA0119 als auch der potentielle Transkriptionsregulator PA0120 an der Biofilmbildung von P. aeruginosa beteiligt sind. 12. Die Messung der Promotoraktivität in der ΔPA0119::Ω-Mutante zeigt eine Repression des Promotors an. In der PA0120::Ω-Mutante dagegen findet sich eine zweifache Induktion des Promotors vor PA0119-PA0121. Dies Ergebnis wird durch die Ergebnisse der Real-Time-PCR-Analysen untermauert, da in der PA0120::Ω-Mutante signifikant erhöhte Transkriptmengen des PA0119-Gens detektiert wurden. Bei der ΔPA0121::Ω-Mutante liegt die Promotor-Aktivität im Bereich von PAO1. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das Genprodukt von PA0119 auf den Promotor P119-121 aktivierend wirkt, während das PA0120-Genprodukt die P119-121- Promotoraktivität negativ reguliert. 13. Zur Identifizierung weiterer PA0120-regulierter Gene wurde eine Transkriptomanalyse der PA0120::Ω-Mutante durchgeführt. Diese ergab, dass neben PA0119 vier weitere Gene, und zwar PA0656, PA0810, PA1852 und PA5261, signifikant hoch reguliert wurden. Vermutlich sind diese Genprodukte zusammen mit dem Regulator PA0120 Teile eines regulatorischen Netzwerks zur Anpassung von P. aeruginosa an die CF-Lunge.
Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit betrifft die Rolle der spezifisch gegen Adenovirus Typ 5 und 7 sowie gegen das humane Herpesvirus 6 reagiblen CD4+ T-Lymphozyten als Surrogatmarker der virusspezifischen zellulären Immunität bei lungentransplantierten Patienten. Adenoviren und auch das humane Herpesvirus 6 sind wichtige Pathogene nach der Transplantation von soliden Organen und Knochenmark. Bei lungentransplantierten Patienten sind Adenovirusinfektionen mit einer hohen Mortalität verbunden. Die Reaktivierung des humanen Herpesvirus 6 ist ein Risikofaktor für die Entwicklung von CMV-vermittelten Erkrankungen bei Patienten unter immunsuppressiver Therapie. Bei nierentransplantierten Patienten kann die durchflusszytometrische Quantifizierung von spezifisch gegen Adenoviren und gegen CMV reagiblen CD4+ T-Zellen dazu beitragen, Patienten mit einem hohem Risiko für eine unkontrollierte Virusreplikation zu identifizieren. Die zelluläre Immunantwort bezüglich des humanen Herpesvirus 6 bei lungentransplantierten Patienten ist bisher kaum untersucht worden. Zur Klärung der Frage, inwieweit die durchflusszytometrische Analyse der de-novo-Zytokinsynthese von CD4+ T-Zellen Aussagen über die virusspezifische zelluläre Immunantwort zulässt, wurde bei 22 Patienten nach Lungentransplantation während 12 Monaten regelmäßig venöses Blut mit Adenovirus Typ 5 (Ad5)- und 7 (Ad7)- sowie humanem Herpesvirus 6 (HHV-6 )-Antigen inkubiert und der Anteil [%] von CD4+ TLymphozyten welche eine de-novo-Synthese von Interferon (INF)-γ und CD69 durchführten durchflusszytometrisch bestimmt. Bei n=6 Ad5 positiven Patienten ohne Infekt im Beobachtungszeitraum reagierten im Median 0,31% (Spannweite: 0,09-1,47%), bei n=5 Ad7 positiven Patienten ohne Infektion (kein Nachweis von Adenovirus 5-DNA [copies/ml]) im Beobachtungszeitraum im Median 0,34% (Spannweite: 0,08-1,58%) der CD4+ Lymphozyten, bei n=16 Ad5 negativen Patienten reagierten im Median 0,06% (Spannweite: 0,01-0,25%), bei n=16 Ad7 negativen Patienten 0,05% (Spannweite: 0,01-0,28%) der CD4+ T-Lymphozyten auf die Stimulation mit dem entsprechenden Virus-Antigen mit einer de-novo-Synthese von INF-γ und CD69. Im Gegensatz dazu konnte nach Stimulation mit HHV-6-Antigen bei n=4 HHV-6 positiven Patienten ohne Infektion im Beobachtungszeitraum keine INF-γ- und CD69-Neusynthese nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die durchflusszytometrische Untersuchung Adenovirus-spezifischer CD4+ T-Zellen bei lungentransplantierten Patienten möglich ist. Es hat sich im Verlauf dieser Studie gezeigt, dass die Ergebnisse Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen der virusspezifischen zellulären Immunantwort bei Transplantationspatienten sein können. In diesem Sinn ist die Untersuchung einer größeren Patientengruppe bei einer zentralen Durchführung der Methode sinnvoll. Im Bezug auf das humane Herpesvirus 6 bleibt es zu klären, ob auf der Basis von Modifikationen des von uns verwendeten durchflusszytometrischen Verfahrens Aussagen zur virusspezifischen Immunität von lungentransplantierten Patieten möglich sind.
Die maligne Transformation von Zellen beruht auf der Mutation von Genen, die entartete Zellen der regulierenden Wachstumskontrolle entziehen, ihre Versorgung sicher stellen und sie unempfindlich gegen apoptoseinduzierende Signale machen (Hanahan und Weinberg, 2000). Klassische Behandlungsmethoden wie Strahlen- und Chemotherapie wirken häufig über die Aktivierung apoptotischer Signalwege, die jedoch in behandlungsresistenten Tumorzellen blockiert sein können. Das selektive Einbringen proapoptotischer Proteine in Tumorzellen stellt daher eine vielversprechende Strategie zur Umgehung solcher Blockaden dar. In dieser Arbeit wurden tumorspezifische Antikörperfusionsproteine generiert, die humane Zelltod auslösende Proteine als Effektorfunktion enthalten. Das mitochondriale Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) wird durch diverse Apoptosesignale in das Zytoplasma freigesetzt. AIF leitet nach der Translokation in den Zellkern Chromatinkondensation und Degradation der nukleären DNA ein (Cande et al., 2004b). Zur selektiven Einschleusung von zytoplasmatischem AIF (AIF!100) in ErbB2 exprimierende Tumorzellen wurde es an das ErbB2-spezifische „single chain“ Antikörperfragment scFv(FRP5) fusioniert, welches von dem monoklonalen Antikörper FRP5 abgeleitet ist (Wels et al., 1992b). Daneben enthält ein zunächst generiertes AIF!100-DT183-378-5 Fusionsprotein eine Translokationsdomäne aus Diphtherietoxin (AA 183-378) als mögliche „endosome escape“ Aktivität. Diese Domäne sollte der Effektordomäne nach rezeptorvermittelter Aufnahme den Übergang in das Zytoplasma erlauben. Die Expression dieses Moleküls in E. coli und der Hefe Pichia pastoris führte jedoch nicht zu funktionellen AIF!100-DT183-378-5 Proteinen. Daher wurde für nachfolgende Arbeiten ein ähnliches AIF-Fusionsprotein (5-E-AIF!100) aus früheren Arbeiten unserer Gruppe eingesetzt und sein Wirkmechanismus eingehend untersucht. Im Gegensatz zu AIF!100-DT183-378-5 enthält 5-E-AIF!100 die Translokationsdomäne aus Pseudomonas Exotoxin A. Bakteriell exprimiertes, gereinigtes und renaturiertes 5-E-AIF!100 zeigte eine hohe Spezifität für ErbB2 exprimierende Tumorzellen. Im Gegensatz zu unfusioniertem AIF!100 induzierte 5-E-AIF!100 nach Mikroinjektion in das Zytoplasma der Zielzellen keine Apoptose. Dies deutet darauf hin, dass möglicherweise die N-terminale Antikörperdomäne die proapoptotische Aktivität der AIF-Domäne blockiert. Erst die rezeptorvermittelte Aufnahme von 5-E-AIF!100 in Anwesenheit von Chloroquin resultierte in einer hohen Zytotoxizität. Auf diesem Weg wird sehr wahrscheinlich durch proteolytische Spaltung der innerhalb der Translokationsdomäne vorhandenen Furin-Schnittstelle der N-terminale Bereich des Fusionsproteins entfernt. Die eigentliche Translokation der AIF-Domäne findet jedoch ohne die Zugabe endosomolytischer Reagenzien nicht statt, was für eine unzureichende Aktivität der Translokationsdomäne spricht. Die vollständige Entfernung der Translokationsdomäne führte dennoch zu einem AIF-Fusionsprotein, das weder in Abwesenheit noch in Gegenwart von Chloroquin zytotoxisch aktiv ist (Dälken, 2005). Somit ist die in der Translokationsdomäne enthaltene Furin- Schnittstelle sehr wahrscheinlich für die Aktivierung von 5-E-AIF!100 von entscheidender Bedeutung. Im Fall des natürlichen Exotoxin A ist zusätzlich zu der in 5-E-AIF!100 verwendeten Translokationsdomäne ein C-terminales ER-Retentionssignal für einen effizienten Übertritt der katalytisch aktiven Toxindomäne ins Zytoplasma notwendig (Jackson et al., 1999). Das Anfügen eines KDEL-Signals an den C-Terminus von 5-E-AIF!100 führte jedoch nicht zur Erhöhung der „endosome escape“ Aktivität der Translokationsdomäne. Die ladungsabhängige DNA-Bindungsaktivität von AIF ist für die proapoptotische Funktion des Proteins essentiell. Bindung an DNA wurde auch für 5-E-AIF!100 nachgewiesen, und konnte durch Vorinkubation mit negativ geladenem Heparin inhibiert werden. Die Komplexierung mit Heparin führte zu einer erheblichen Reduktion der zytotoxischen Aktivität von 5-E-AIF!100. Mit großer Wahrscheinlichkeit ist die Abschwächung der Zytotoxizität auf die intrazelluläre Inhibition der AIF/DNA-Interaktion zurückzuführen. Dies bestätigt, dass diese Wechselwirkung für die zelltodinduzierende Eigenschaft von 5-E-AIF!100 von Bedeutung ist. Die Freisetzung Immuntoxin-ähnlicher Proteine, die sich nach rezeptorvermittelter Aufnahme in endosomalen Kompartimenten finden, erfordert häufig die Zugabe endosomolytischer Reagenzien. Um eine von endosomolytischen Reagenzien unabhängige Zytotoxizität der Antikörperfusionsproteine zu erreichen, wurden in dieser Arbeit Möglichkeiten zur Umgehung dieser Abhängigkeit untersucht. Hierzu wurde die Natürliche Killerzelllinie NK-92 eingesetzt. Die Eliminierung von infizierten und transformierten Zellen durch NK-Zellen geschieht hauptsächlich über die Ausschüttung von zytotoxischen Granula, die das porenbildende Protein Perforin und verschiedene Serinproteasen wie Granzym B (GrB) enthalten (Atkinson et al., 1990; Smyth et al., 2001). Dabei ist Perforin für die zytosolische Translokation der Proteasen verantwortlich (Browne et al., 1999). Anhand des Modellproteins Granzym B-scFv(FRP5) (GrB-5) wurde untersucht, ob Antikörperfusionsproteine mit Hilfe von Perforin in das Zytoplasma der Zielzellen gelangen können. GrB-5 wurde in NK-92 Zellen unter Beibehaltung der Spezifität und enzymatischen Aktivität exprimiert. GrB-5 ist wie Wildtyp GrB in zytotoxischen Granula lokalisiert und wird nach der Degranulation sehr wahrscheinlich zusammen mit Perforin sekretiert. Freigesetztes GrB-5 zeigte Bindung an ErbB2 exprimierende Zellen. Zudem wiesen Überstände von aktivierten NK-92 Zellen, die GrB-5 und Perforin enthielten, im Vergleich zu Überständen von Kontrollzellen eine höhere Zytotoxizität gegenüber ErbB2-positiven Tumorzellen auf. Dies lässt darauf schließen, dass GrB-5 in Abwesenheit exogener endosomolytischer Reagenzien durch einen Perforin-vermittelten Mechanismus in die Zielzellen gelangen konnte. Weiterhin wurden NK-92 Zellen generiert, die den GrB-Inhibitor Protease Inhibitor-9 (PI-9) exprimieren. Diese Zellen zeigten im Vergleich zu parentalen Zellen eine höhere Zytotoxizität, die sich auf eine verbesserte Inaktivierung fehlgeleiteter, zytoplasmatischer GrB-Moleküle durch das ektopisch exprimierte PI-9 zurückführen lässt. NK-92-PI-9 Zellen könnten genutzt werden, um größere Mengen von GrB-Fusionsproteinen zu exprimieren, ohne dabei die Zellen durch die Erhöhung der zytoplasmatischen GrB-Konzentration zu gefährden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass AIF für den Einsatz als Effektorfunktion in Immuntoxin-ähnlichen Fusionsproteinen geeignet ist. Die Anwendung von NK-Zellen zur Expression und Sekretion tumorspezifischer Antikörperfusionsproteinen zusammen mit Perforin zeigt einen möglichen Lösungsweg für das generelle Aufnahmeproblem von Immuntoxin-ähnlichen Proteinen. Die erzielten Ergebnisse können nun für die weitere Optimierung humanisierter Antikörperfusionsproteine genutzt werden.
LINE-1-Retrotransposons sind für die Entstehung von über 35 % des menschlichen Genoms verantwortlich. Während ihre Aktivität entscheidend zur Evolution von Säugetieren allgemein und des Menschen im Speziellen beigetragen hat, kann die L1-Expression und die L1-vermittelte Retrotransposition schädigende Auswirkungen für die Wirtszelle haben (Goodier und Kazazian, 2008). Die Liste der dokumentierten, durch L1-Aktivität hervorgerufenen Erkrankungen umfasst gegenwärtig ca. 65 Fälle von genetischen bzw. Tumorerkrankungen und wird immer länger. Um die Anzahl schädigender L1-Retrotranspositionsereignisse zu minimieren, hat der menschliche Organismus Strategien entwickelt, um die L1-Retrotransposition zu kontrollieren. Eine dieser Strategien ist die Inhibition der L1-Aktivität durch Mitglieder der APOBEC-Proteinfamilie, wobei deren jeweilige Mechanismen der L1-Inhibition gegenwärtig noch nicht aufgeklärt sind. Es war daher das Ziel dieser Arbeit, Einblicke in die Mechanismen der Hemmung der L1-Retrotransposition durch Mitglieder der Familie der humanen APOBEC3-Proteine zu bekommen, wobei eine Fokussierung auf den durch APOBEC3C vermittelten Mechanismus vorgenommen wurde. Aufbauend auf kürzlich publizierte Daten zur Hemmung der L1-Retrotransposition durch die APOBEC3-Proteine A3A, A3B, A3C und A3F (Bogerd et al., 2006; Chen et al., 2006; Muckenfuss et al., 2006) wurde eine Arbeitshypothese entwickelt, welche die L1-Inhibition durch APOBEC3-vermittelte Deaminierung von Cytosinen der L1-cDNA unter der Beteiligung von Faktoren des „Base Excision Repair“-Weges erklärt. Diese Arbeitshypothese steht im Einklang mit der Abwesenheit nachweisbarer G-zu-A-Hypermutationen von L1-Kopien wie sie für die APOBEC3-spezifische Deaminaseaktivität charakteristisch sind, sowie mit der Existenz 5’-verkürzter genomischer L1-Kopien. Die Ergebnisse aus in silico-Analysen der 5’-Enden von 38 L1-Neuinsertionen aus Zellkulturexperimenten, die in Anwesenheit von endogen exprimiertem A3B, A3C und A3H retrotransponiert waren, sowie von 885 genomischen, endogenen L1-Kopien waren in Übereinstimmung mit unserer Arbeitshypothese, da in beiden Fällen Guanin als erste fehlende L1-Nukleobase am L1-5’-Ende statistisch signifikant überrepräsentiert vorliegt. Während für die Inhibition von L1 durch A3A dessen Deaminaseaktivität notwendig ist, wurde gezeigt, dass A3C die L1-Retrotransposition über einen deaminaseunabhängigen Mechanismus hemmt. Die L1-Inhibition durch A3C erforderte sowohl eine funktionelle Dimerisierungsdomäne als auch eine intakte RNA-Bindedomäne. Die Identifizierung von A3C und L1-ORF1p in derselben Saccharosegradientenfraktion sowie die Kolokalisation beider Proteine im Zytoplasma von HeLa- bzw. 143B-Zellen sprechen für eine Interaktion von A3C mit L1-ORF1p bzw. L1-RNPs. Da eine direkte Interaktion von A3C und L1-ORF1p mittels Immunopräzipitation nicht nachgewiesen werden konnte, spricht dies dafür, dass die Interaktion nicht auf einen direkten Kontakt zwischen A3C und L1-ORF1p beruht. Eine direkte Interaktion zwischen A3A und L1-ORF1p konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Vielmehr spricht die Abhängigkeit der A3C-vermittelten Hemmung von der intakten RNA-Bindedomäne, experimentelle Daten, welche eine Interaktion mit L1-RNPs vorschlagen, sowie die Kolokalisation von A3C und L1-ORF1p im Zytoplasma für eine Sequestrierung der L1-RNPs, die Behinderung des nukleären Imports der L1-RNPs oder aber eine Blockierung der TPRT-Initiation als mögliche Mechanismen der A3C-vermittelten Hemmung der L1-Retrotransposition.
Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.