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Manche mögen’s salzig : Anpassungsstrategien und Biotechnologie Salz liebender Mikroorganismen
(2008)
Sie lieben extreme Bedingungen: Einige leben in tiefen Gesteinsschichten oder ohne Licht und Sauerstoff an kochend heißen Quellen der Tiefsee, andere bevorzugen die eisigen Temperaturen der Polargebiete, und wieder andere fühlen sich erst richtig wohl in kochender Schwefelsäure. Doch wie passen sich Mikroorganismen an diese extremen Bedingungen an? Die Forschung hat darauf bereits Antworten gefunden, die sich auch biotechnologisch nutzen lassen.
Der Ozean gehört zu den am wenigsten erforschten Regionen unseres Planeten, obwohl er für den Wärme- und Energiehaushalt der Erde und die Gemeinschaft ihrer Bewohner eine wichtige Rolle spielt. Der Mensch fischt und badet vor allem in den Flachmeeren. Dort ist auch die Schifffahrt am dichtesten. Doch obwohl die Flachmeere nur etwa 5 Prozent des Ozeanbodens ausmachen, wirken sich Veränderungen empfindlich auf alle Meeresbewohner aus, bis in die dunkle, kalte und nahrungsarme Tiefsee.
1.) Die A1AO-ATP-Synthase wurde aus Membranen von P. furiosus unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch PEG-Fällung, Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie und Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. 2.) Die neun aus dem Gencluster vorhergesagten Untereinheiten konnten durch Maldi-TOF-Analysen oder MS/MS identifiziert werden. Die molekulare Masse der A1AO-ATP-Synthase wurde durch LILBID-Analysen zu 730+/-10 kDa bestimmt. 3.) Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD und TBT nachgewiesen. Weitere ATP-Synthase spezifische Inhibitoren wie DES, Dienestrol und Hexestrol waren in der Lage, das Enzym zu inhibieren. Die I50-Werte betrugen für DES 0,36 mM, für Dienestrol 0,52 mM und für Hexestrol 0,59 mM. 4.) Die ATPase-Aktivität war bei 100°C und pH 6 optimal. Das Enzym hydrolysierte Mg-ATP als bevorzugtes Substrat mit einer maximalen Geschwindigkeit von 1,7 U/mg und einem KM von 0,63 mM. 5.) Die ATPase-Aktivität war Na+-abhängig. Der KM-Wert betrug 0,6 mM. Li+ konnte Na+ substituieren, K+ war dazu nicht in der Lage. Die Wirkung des Inhibitors DCCD (I50 100 μM) konnte durch Zugabe von 5 mM NaCl bis zu einer Konzentration von 0,25 mM aufgehoben werden. Dies war der erste Nachweis einer Na+-abhängigen A1AO-ATP-Synthase. 6.) Das für die c-Untereinheit kodierende Gen wurde aus chromosomaler DNA amplifiziert und sequenziert. Die Genverdopplung konnte bestätigt werden, ebenso die Vorhersage nur einer Ionenbindestelle (Helix 4). Durch LILBIDAnalysen wurde eine Verdopplung der c-Untereinheit aufgrund der molekularen Masse (15,8 kDa) im gereinigten Komplex nachgewiesen. 7.) Die Bildrekonstruktion aus 7400 Einzelbildern zeigte einen Komplex aus zwei Domänen, die durch einen zentralen und zwei periphere Stiele miteinander verbunden sind. Ausgehend von den Summenbildern wurde erstmals eine D-Rekonstruktonsmappe einer A1AO-ATP-Synthase generiert, mit einer Auflösung von 23 Å. In diese 3D-Rekonstruktionsmappe wurden Untereinheiten gelöster Struktur modelliert. Mit Hilfe dieser Daten konnte die voraussichtliche Stöchiometrie der A1AO-ATP-Synthase von P. furiosus zu A3B3CDFE2H2ac10 bestimmt werden. 8.) Durch LILBID-Analysen mit erhöhter Laserintensität wurde ein Subkomplex mit einer molekularen Masse von 233-236 kDa detektiert. Biochemische Daten weisen auf einen Komplex aus einer Kopie der Untereinheit a und 10 Kopien der Untereinheit c hin. Zusammen mit der 3D-Rekonstruktion wurden unabhängige Evidenzien für einen c-Ring bestehend aus 10 Kopien des Monomers mit je 4 transmembranenen Helices und nur einer Ionenbindestelle erhalten. Dies würde eine Na+/ATP-Stöchiometrie von 3,3 ergeben und erklären, warum die A1AO-ATP-Synthase von P. furiosus trotz der V-Typ artigen c-Untereinheit ATP synthetisiert. 9.) Mit dem gereinigten Enyzm wurde eine 3D-Kristallisation durchgeführt. Die resultierenden Kristalle hatten tetraedrische Gestalt, waren 10 x 5 nm groß und wuchsen über einen Zeitraum von 30 Tagen. Die Kristalle beugten Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von 15 Å. 10.) Zum Nachweis einer möglichen Na+-Abhängigkeit der ATP-Synthase von M. jannaschii wurde ein Na+-armer Puffer mit Sulfit hergestellt, da bereits eine Sulfitabhängigkeit der ATPase-Aktivität nachgewiesen wurde. Es konnte für die A1AO-ATP-Synthase keine Na+-Abhängigkeit der ATPase- Aktivität zwischen 0,07-400 mM nachgewiesen werden. 11.) Ein Subkomplex konnte durch mehrmaliges Auftauen und Einfrieren der A1AO-ATP-Synthase-haltigen Proteinlösung erhalten werden. Der Komplex enthielt die Untereinheiten ABFDacx. Die Untereinheiten C, E und H fehlten dem Komplex, was zu einem Zerfall in hydrophile und hydrophobe Domäne während der Präparation führte. Es konnten in der elektronenmikroskopischen Untersuchung nur Kopfteile detektiert werden. 12.) Die heterolog produzierte A1AO-ATP-Synthase aus M. mazei Gö1 wurde durch das Detergenz Dodecylmaltosid am besten aus der Cytoplasmamembran von E. coli solubilisiert. 13.) TBT ist ein potenter Inhibitor der heterolog produzierten A1AO-ATP-Synthase (I50=60 μM). Der Wirkort konnte durch Vergleichsmessung mit der heterolog produzierten A1-Domäne identifiziert werden. TBT interagiert mit der AODomäne archäeller ATP-Synthasen und ist daher geeignet, die Kopplung der heterolog produzierten A1AO-ATP-Synthase nachzuweisen.
Es ist bekannt, dass Curcumin in einer Vielzahl verschiedener Zellarten die Proliferation hemmt und Apoptose induziert. In der Literatur werden Konzentrationen von 10 bis 150 µM (3.7-55 µg/ml) als dafür notwendig beschrieben. Da Curcumin nach oraler Aufnahme, aufgrund seiner schlechten Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt, eine geringe Bioverfügbarkeit im Organismus aufweist, sind therapeutische Lösungen erforderlich um Curcumin besser nutzen zu können. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Wirkung von geringen Mengen Curcumin, die allein keine Effekte zur Folge haben, in Zusammenwirkung mit Licht untersucht. Es wurde gezeigt, dass bereits Konzentrationen von 0,2-1 µg/ml in Keratinozyten die Proliferation hemmen, wenn sie mit UVA- oder sichtbarer Licht-Bestrahlung kombiniert werden. Desweiteren wurde belegt, dass diese Behandlung Apoptose in HaCaT-Zellen induziert, wobei der mitochondriale Apoptoseapparat aktiviert wird. Dies belegen die Freisetzung von Cytochrom c und die frühe Spaltung der Caspase-9 wohingegen Caspase-8 zeitverzögert aktiviert wurde. Weiterhin wurde dargelegt, dass Erk1/2, PKB/Akt und PKC durch Curcumin/Licht gehemmt werden, wohingegen p38 durch diese Behandlung eine Aktivierung erfährt. Zusätzlich ergab sich ein inhibierender Einfluss auf den EGF-Rezeptor, einem “upstream”-Regulator all dieser Kinasen, und den Transkriptionsfaktor NF-kappaB. Bei in vivo-Studien an immundefizienten Mäusen mit A431-Xenografts hatte eine Behandlung mit i.p. verabreichtem Curcumin und anschließender Bestrahlung mit sichtbarem Licht einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf das Tumorwachstum zur Folge. In diesen Tumoren fand eine Reduktion der Ki-67-Expression sowie eine Induktion von „apoptotic bodies“ statt. Western Blot-Analysen bestätigten die Apoptoseinduktion durch eine verstärkte Aktivierung der Caspase-9. Zusätzlich zeigte sich auch eine Hemmung von Erk1/2 sowie EGF-R nach beschriebener Behandlung in den Tumoren. Die Wirkungsweise des Curcumins in Kombination mit Licht in vitro wie auch in vivo weisen auf einen neuen therapeutischen Ansatz einer photodynamischen Therapie hin. Dabei kann durch die Verwendung von sichtbarem Licht auf den Einsatz der karzinogenen UV-Bestrahlung, wie sie in üblichen Phototherapien angewandt wird, verzichtet werden.
Genetic analysis of salt adaptation in Methanosarcina mazei Gö1 : the role of abl, ota and otb genes
(2008)
1. M. mazei ist ein halotolerantes methanogenes Archäon und akkumuliert kompatible Solute als längerfristige Anpassung an erhöhte Osmolarität in der Umgebung. Bei intermediären Salzkonzentrationen (~ 400 mM NaCl) wird vorzugsweise α-Glutamat gebildet und bei höheren Salzkonzentrationen (~ 800 mM NaCl) wird Nε-Acetyl-ß-Lysin zusätzlich zu Alpha-Glutamat synthetisiert. 2. Eine Analyse der intrazellulären Solutezusammensetzung mittels NMR ergab, dass M. mazei Glycin-Betain als Osmolyt akkumulieren kann. Für die Aufnahme von Glycin-Betain konnten zwei putative Glycin-Betain-Transporter in M. mazei identifiziert werden, Ota und Otb. Ota steht für „osmoprotectant transporter A“ und Otb für „osmoprotectant transporter B“. Das Genom von M. mazei wurde, nachdem es vollstänidg sequenziert war, nach Genen durchsucht, die eine Rolle bei der Aufnhame von Glycin-Betain oder anderen kompabtiblen Solute spielen könnten. Dafür wurde die Sequenz eines Substratbindeproteins eines bekannten bakteriellen Glycin-Betain-Transporters, opuAC aus B. subtillis als Referenzsequenz verwendet. Hierbei konnte ein Homolog, otaC, in M. mazei identifiziert werden. otaC ist Teil eines Genclusters, welches für einen ABC-Transporter kodiert. otb wurde bei einer genomweiten Expressionsanalyse zur Salzadaptation von M. mazei identifiziert. Es wurden Gene eines putativen ABC-Transporters identifiziert, die unter Hochsalzbedingungen leicht induziert waren. Es stellte sich heraus, dass es sich hierbei um einen zweiten putativen Glycin-Betain-Transporter handelte. Otb gehört auch zur Familie der ABC-Transporter. Vergleichsanalysen zeigten, dass die beiden Transporter keine große Ähnlichkeit zueinander aufweisen. Die Funktion und Rolle der beiden ABC-Transporter, vor allem von Otb, war zu Beginn dieser Arbeit unklar. 3. Bei Analysen des intrazellulären Solutepools im Wildtyp von M. mazei stellte sich heraus, dass in Anwesenheit von Glycin-Betain die Konzentration von Glutamat und NE- Acetyl-ß-Lysin verringert war. Bei 400 mM NaCl reduzierte Glycin-Betain die Glutamat- Konzentration um 16% und bei 800 mM NaCl um 29%. Besonders deutlich zeigte sich der Einfluß von Glycin-Betain bei der Akkumulation von NE-Acetyl-ß-Lysin. Bei 400 mM NaCl reduzierte Glycin-Betain die Konzentration an NE-Acetyl-ß-Lysin um 60% und bei 800 mM NaCl um 50%. Der Einfluß von Glycin-Betain konnte auf verschiedenen Ebenen in M. mazei beobachten werden. Es konnte gezeigt werden, dass die relative Transkriptimenge von ota unter Hochsalzbedingungen zunimmt. Glycin-Betain reduzierte die Transkription von ota bei verschiedenen Salzkonzentrationen. Die relative Transkriptmenge an mRNA von ota wurde mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCR) quantifiziert und war bis zu 52% reduziert in Zellen, die in Gegenwart von Glycin-Betain gewachsen waren. Die Transkriptmenge von otb war unter den gleichen Bedingungen nicht beeinflusst und zeigte generell keine Zunahme mit der Salinität des Mediums. Des Weiteren konnte ein Effekt von Glycin-Betain auf Ebene der Transportaktivität von Ota gezeigt werden. Hier zeigte sich, dass Zellen, die bei 400 mM NaCl in Gegenwart von Glycin-Betain gezogen waren, eine geringere Transportaktivität aufweisen, als Zellen, die bei 400 mM NaCl ohne Glycin-Betain gewachsen waren. Die Transportaktivität war um 90% geringer. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass es sich bei den Zellen, die ohne Glycin-Betain gewachsen waren, um eine Nettoaufnahme von Glycin-Betain handelte. Im Gegensatz dazu, ist davon auszugehen, dass Zellen, die in Gegenwart von Glycin-Betain gewachsen waren, eine Austaschreaktion zwischen bereits vorhandenem intrazellulärem und extrazellulär angebotenem Glycin-Betain vornehmen. [Die dem letzten Punkt zugrundeliegenden Daten wurden von Silke Schmidt im Rahmen einer Diplomarbeit erhoben, die von mir mitbetreut wurde. Aus Gründen der vollständigen Darstellung des Projektverlaufes werden diese Daten mitaufgeführt.] 4. Zur weiteren Klärung der Rolle und Funktion der beiden putativen Glycin-Betain- Transporter Ota und Otb war es Ziel, Mutantenstudien durchzuführen. Eine Vorraussetzung für die Generierung von Mutanten ist, dass der Organismus auf Agarplatten wächst und Einzelkolonien von einer einzelnen Zelle ausgehend bildet. Dies ist ein wichtiger Punkt bei Methanosarcina spp., die Zellpakete, sogenannte Sarcinen bilden. Deshalb wurde zunächst nach den optimalsten Plattierungsbedingungen gesucht, unter denen M. mazei keine Sarcinen bildet und die Plattierungseffizienz am höchsten war. Die Plattierungseffizienz betrug im Durchschnitt 54%. Für das Einbringen von DNA in die Zellen wurde eine Liposomen-vermittelte Transformation getestet. Ein ähnliches Vorgehen war bereits für Methanosarcina acetivorans beschrieben, konnte bislang aber noch nicht erfolgreich für M. mazei Gö1 und andere Stämme von M. mazei angwendet werden. Erste Schritte zur Anpassung des Transformations-Protokolles beinhalteten das Testen von DOTAP verschiedener Hersteller, sowie die Konzentration an eingesetzter DNA. Das jeweilige Zielgen/Zieloperon, welches deletiert werden sollte, wurde durch eine pac-Kassette ersetzt. Diese kodiert für eine Puromycin-Transacetylase und verleiht dem Organismus Puromycin- Resistenz. Die pac-Kassette wurde von umgebenden Bereichen des Ziellocus flankiert und integrierte mit Hilfe dieser flankierenden Bereiche über doppelt-homologe Rekombination in das Genom. 5. Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurden ota::pac- und otb::pac-Mutanten erzeugt und über Southern-Blot Analyse verifiziert. Eine erste Charakterisierung der Mutanten mittels qRT-PCR zeigte, dass auf mRNA-Ebene keine Transkripte von ota in M. mazei ota::pac oder otb in M. mazei otb::pac nachweisbar waren. Zusätzlich konnte auf Proteinebene das Substratbindeprotein OtaC in M. mazei ota::pac und OtbC in M. mazei otb::pac nicht über einen Antikörper gegen das jeweilige Substratbindeprotein nachgewiesen, was die erfolgreiche Deletion bestätigte. Erste phänotypische Charakterisierungen zeigten, dass das Wachstum von M. mazei ota::pac und M. mazei otb::pac unter Hochsalzbedingungen nicht beeinträchtigt und vergleichbar mit dem des Wildtyps war. Auch bei kälteren Wachstumstemperaturen von 22°C wuchsen die Mutanten ohne Phänotyp. 6. Radioaktive Transportstudien mit M. mazei otb::pac zeigten, dass diese Mutante, die noch ein funktionelles Ota besitzt, [14C]Glycin-Betain aufnehmen kann. Es stellte sich heraus, dass diese Mutante eine höhere Transportrate für Glycin-Betain aufwies, als der Wildtyp. Die Aufnahmerate war um einen Faktor 2 höher als beim Wildtyp. Zusätzlich konnten qRT-PCR Analysen zeigen, dass die relative Transkriptmenge an ota in der otb::pac-Mutante um einen Faktor 2 höher war, als im Wildtyp. Umgekehrt konnte dieser Effekt nicht beobachtet werden, d.h. eine erhöhte Transkriptmenge an otb in M. mazei ota::pac. Auf Proteinebene konnte beobachtet werden, dass die intrazelluläre Konzentration an OtaC in der Mutatne leicht höher war als im Wildtyp. Jedoch stellte sich heraus, dass die intrazelluläre Glycin-Betain-Konzentration bei 400 mM NaCl in der Mutante nicht erhöht war verglichen mit Wildtyp, sondern die Konzentrationen gleich waren. Bei höheren Salzkonzentrationen (800 mM NaCl) zeigte sich jedoch ein anderes Bild: die intrazelluläre Glycin-Betain-Konzentration war in der Mutante um 60% erhöht. Dies könnte auf die erhöhte Transportaktivität von M. mazei otb::pac zurückzuführen sein. Die Konzentration anderer kompatibler Solute wie Glutamat und NE-Acetyl-ß-Lysin waren in diesen Zellen bis zu 48% reduziert. In vorherigen Studien konnte gezeigt werden, dass heterolog überproduziertes Ota von M. mazei in E. coli MKH13, eine E. coli-Mutante, die keine Glycin-Betain-Transporter mehr besitzt, die Aufnahme von Glycin-Betain wieder herstellen konnte [die Daten von ota in E. coli MKH13 wurden in der bereits oben erwähnten Diplomarbeit von Silke Schmidt erhoben]. Zur Klärung der Funktion von Otb wurde der gleiche Versuch mit otb in E. coli MKH13 durchgeführt. Jedoch konnte eine heterologe Produktion von Otb aus M. mazei die Aufnahme von Glycin-Betain in E. coli MKH13 nicht wieder herstellen. Hierbei wurde über Western-Blot Analyse sichergestellt, dass Otb tatsächlich in der Membran vorhanden war. Auch Transportstudien mit der Mutante M. mazei ota::pac zeigten, dass diese Mutante kein [14C]Glycin-Betain mehr aufnehmen konnte. Es konnte auch keine Akkumulation von Glycin-Betain mittels NMR in dieser Mutante gemessen werden. Des Weiteren zeigte sich, dass die intrazellulären Konzentrationen an Glutamat und Nε-Acetyl-ß-Lysin bei 400 mM und 800 mM NaCl in der Mutante unbeeinflusst von der Glycin-Betain-Konzentration im Medium waren. Weitere Transportstudien mit M. mazei ota::pac zur Aufnahme von [14C]Cholin zeigten, dass dieses Molekül weder vom Wildtyp, noch von der Mutante aufgenommen wurde. Dieses Ergebnis wurde durch Messung des Solutepools mittels NMR bestätigt. Somit kann ausgeschlossen werden, dass Otb unter den gemessenen Bedingungen weder ein Glycin- Betain-Transporter noch ein Cholin-Transporter in M. mazei ist. Diese Beobachtungen belegen eindeutig, dass Ota der einzige funktionelle Glycin-Betain-Transporter in M. mazei ist, während die Rolle von Otb bislang noch ungeklärt ist. 7. Nε-Acetyl-ß-Lysin, das dominante kompatible Solut in M. mazei bei 800 mM NaCl, wird durch die Enzyme AblA, einer Lysin-2,3-Aminomutase und AblB, einer ß-Lysin- Acetyltransferase synthetisiert. In dieser Arbeit wurde eine Δabl::pac-Mutante generiert, um die Fragen zu klären, ob die beiden Enzyme vom postulierten abl-Operon kodiert werden und wenn ja, welchen Phänotyp eine Nε-Acetyl-ß-Lysin-freier-Mutante bei Salzstress zeigt. NMR-Analysen zeigten, dass in der abl::pac-Mutante kein Nε-Acetyl-ß-Lysin mehr nachweisbar war. Dies belegt, dass die Gene ablA und ablB und deren Genprodukte für die Synthese von NE-Acetyl-ß-Lysin in M. mazei essentiell sind. Unter Hochsalzbedingungen ist das Wachstum von M. mazei abl::pac im Vergleich zum Wildtyp deutlich verlangsamt. Dieses Ergebnis war unerwartet, da eine abl::pac-Mutante von Methanococcus maripaludis unter Hochsalzbedingungen nicht mehr wachsen konnte. Unter Niedrigsalz und bei intermediären Salzkonzentration war das Wachstum von M. mazei abl::pac nicht eingeschränkt und verhielt sich wie der Wildtyp. In Gegenwart von Glycin-Betain akkumulierte die abl::pac-Mutante von M. mazei unter Hochsalzbedingungen 2,4 mal mehr Glycin-Betain als der Wildtyp, um das Defizit im Solutepool auszugleichen und Wachstum bei Hochsalz zu ermöglichen. Dadurch war sie in der Lage, wieder wie der Wildtyp zu wachsen. 8. Der Verlust von NE-Acetyl-ß-Lysin wurde unter Hochsalzbedingungen durch erhöhte Konzentrationen an Glutamat und einem neuen kompatiblen Solut kompensiert. NMRAnalysen zeigten, dass es sich hierbei um Alanin handelte. Bis jetzt wurde die Verwendung von Alanin als kompatibles Solut noch nie beschrieben. Um sicherzustellen, dass Alanin als kompatibles Solut in M. mazei abl::pac dient, wurde die Konzentration bei verschiedenen Salzkonzentrationen gemessen. Die Konzentration an Alanin nahm mit steigender Salzkonzentration zu. Bei 800 mM NaCl war die Konzentration 12 fach erhöht verglichen mit der Konzentration bei 400 mM NaCl. Außerdem redzierte Glycin-Betain die Alanin- Konzentration bei 800 mM NaCl um 58%. Transportexperimente zeigten, dass M. mazei kein Alanin aus dem Medium aufnehmen kann. 9. Erste Analysen möglicher Synthesewege für Alanin zeigten, dass die Alanin- Dehydrogenase nicht auf Transkriptebene unter Hochsalzbedingungen induziert war und somit keine Rolle in der Synthese von Alanin als kompatibles Solut spielen dürfte. Es könnten jedoch Aminotransferasen eine Rolle bei der Biosynthese von Alanin spielen. Des Weiteren sind die Enzyme, die für die Synthese von Glutamat als kompatibles Solut verantwortlich sind, unbekannt. Dies gilt für alle bis jetzt untersuchten Organismen, die Glutamat als kompatibles Solut nutzen. In dieser Arbeit wurde versucht, mit Hilfe der abl::pac-Mutante, die erhöhte Glutamat-Mengen zum Osmoschutz produziert, der Frage nachzugehen, welche Gene/Enzyme eine Rolle spielen könnten bei der Synthese von Glutamat als kompatibles Solut. Dazu wurden unter Hochsalzbedingungen die Transkriptmengen verschiedener Genen, die an der Glutamat-Synthese beteiligt sein könnten, in der Mutante und im Wildtyp untersucht. Hierbei zeigte sich, dass mehrere Gene verschiedener Enzyme unter Hochsalzbedingungen in der Mutante leicht induziert waren. Eines dieser Enzyme ist die Glutaminsynthetase. Dieses Enzym ist für die Umsetzung von Glutamat zu Glutamin unter Verbrauch von ATP verantwortlich. M. mazei besitzt zwei Gene, die für eine putative Gluaminsynthetase kodieren. In M. mazei abl::pac ist unter Hochsalzbedingungen das Gen glnA2 im Vergleich zum Wildtyp (4,03 ± 1,14) leicht induziert (7,63 ± 2,2). Des weiteren konnte in der Mutante eine leichte Induktion von gltB1, gltB2 und gltB3 unter Hochsalz beobachtet werden. Diese Gene kodieren für die einzelnen Domänen einer Glutamatsynthase. Diese ersten Analysen geben einen Hinweis darauf, dass die Synthese von Glutamat als kompatibles Solut über eine gekoppelte Reaktion der Glutaminsynthetase und der Glutamatsynthase verlaufen könnte.
Die Onkogenese geht mit einer Deregulation des Zellzyklus einher. Dabei spielt unter anderem die Regulation verschiedener krebsrelevanter Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle. Ein Interaktionspartner und Regulator vieler dieser Faktoren ist das LIM-only Protein FHL2. Es ist bereits bekannt, dass sich der FHL2-Status zwischen normalen und entarteten Zellen in allen bisher untersuchten Geweben unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass dies auch im Brustgewebe der Fall ist. FHL2 wird in fast allen aggressiven Mammakarzinomen überexprimiert, nicht aber im Normalgewebe und nur schwach in nicht-invasiven "DCIS". Dies weist darauf hin, dass die FHL2-Menge mit der Aggressivität des Tumors korreliert. Weiterhin konnte hier zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass FHL2 in die Zellzyklusregulation involviert ist. Am G1/S-Übergang kann FHL2 die Cyclin D1-Expression induzieren, was letztendlich zu einer Phosphorylierung des RB-Proteins und zum Eintreten der Zelle in die S-Phase führt. Wichtiger aber ist die hier gezeigte FHL2-abhängige Induktion von p21CIP/WAF, ein Zellzyklusinhibitor, der unter anderem auch in der G2/M-Kontrollpunkregulation involviert ist und normalerweise über p53 reguliert wird. Diese Induktion resultiert dort in einem verlangsamten Kontrollpunktübergang, wogegen eine Reduktion des FHL2-Gehalts einen beschleunigten G2/M-Übergang zur Folge hat. Zusätzlich zeigten Expressionsanalysen mit synchronisierten Brustkrebszellextrakten dass FHL2 zellzyklusabhängig exprimiert wird, mit einem Maximum am G2/M-Kontrollpunkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die p21-Expression in den hier verwendeten Brustkrebszelllinien p53-unabhängig ist und ausschließlich von FHL2 abhängt. Hierbei wird die FHL2-abhängige p21 Expression wahrscheinlich über die Aktivierung des c-jun-Transkriptionsfaktors im MAPK-Signaltransduktionsweg induziert. In vivo und in vitro Interaktionsstudien haben eine Interaktion von FHL2 mit c-jun gezeigt, wobei die Interaktion über die ersten beiden LIM-Domänen vermittelt wird. Der FHL2-c-jun-Komplex bindet an die AP-1-Sequenz innerhalb des p21-Promotors und induziert dadurch p21. Dies führt zu einer Inhibition verschiedener CDE/CHR-regulierter Proteine wie CDC25C oder Plk1 und zu einer verzögerten Zellzyklusprogression. In diesem Zusammenhang konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die FHL2-Expression nicht nur zu einer verlangsamten Proliferation führt, sondern auch zur Fähigkeit der Zelle zum zellmatrixunabhängigen Wachstum beisteuert. Es scheint auf den ersten Blick widersprüchlich, dass FHL2 für einen intakten G2/M-Kontrollpunkt und eine geringere Proliferationsrate sorgt, gleichzeitig aber zur Tumorentwicklung beiträgt. Es ist allerdings bekannt, dass Tumore ihr Wachstum verlangsamen bevor sie metastasieren. Auch führt ein erhöhter p21-Gehalt im Cytosol zu einer Inhibition der Apoptose, einer weiteren Eigenschaft von Tumoren. FHL2 ist daher ein signifikanter Faktor in der Onkogenese des Mammakarzinoms und aufgrund der differentiellen Expression in vielen Tumoren ein interessantes Ziel für Krebstherapien.
Stressorinduzierte ökotoxikologische Effekte und Genexpressionsveränderungen bei Chironomus riparius
(2008)
Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.
Ohne das Eingreifen des Menschen wäre Mitteleuropa fast ein reines Waldgebiet. Noch heute beheimaten die Wälder eine große Vielfalt an Pflanzen und Tieren, die für diese Region spezifisch sind. Regionale Besonderheiten gehen aber verloren, je mehr Menschen in die Ökosysteme eingreifen: So unterscheiden sich die Pflanzenarten auf der North Charles Street in Baltimore nur wenig von denjenigen der Mainzer Landstraße in Frankfurt. Gleichzeitig verdrängen zugewanderte und eingeschleppte Arten heimische Tiere und Pflanzen. Allerdings gibt es auch im Frankfurter Stadtgebiet echte Horte der Biodiversität.
The moderate halophile Halobacillus halophilus is the paradigm for chloride dependent growth in prokaryotes. Recent experiments shed light on the molecular basis of the chloride dependence that is reviewed here. In the presence of moderate salinities Halobacillus halophilus mainly accumulates glutamine and glutamate to adjust turgor. The transcription of glnA2 (encoding a glutamine synthetase) as well as the glutamine synthetase activity were identified as chloride dependent steps. Halobacillus halophilus switches its osmolyte strategy and produces proline as the main compatible solute at high salinities. Furthermore, Halobacillus halophilus also shifts its osmolyte strategy at the transition from the exponential to the stationary phase where proline is exchanged by ectoine. Glutamate was found as a second messenger" essential for proline production. This observation leads to a new model of sensing salinity by sensing the physico-chemical properties of different anions.